Artykuł metodologiczny

Wielokomórkowy model wyrostka zębodołowego człowieka złożony z komórek nabłonka i pierwotnych komórek odpornościowych do oceny zagrożeń

DOI:

10.3791/61090

⸱

6 maja 2020

 ,  ,  , 
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół pierwotnej izolacji monocytów ludzkiej krwi, jak również ich różnicowania na makrofagi i komórki dendrytyczne oraz łączenia z komórkami nabłonkowymi w wielokomórkowy model ludzkiego płuca. Porównano reakcje biologiczne kokultur złożonych z komórek odpornościowych zróżnicowanych ze świeżo wyizolowanych lub rozmrożonych monocytów, po ekspozycji na bodźce prozapalne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model kokultury ludzkich komórek pęcherzykowych jest tutaj opisany do symulacji bariery tkankowej nabłonka pęcherzyków płucnych składającej się z komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu II i dwóch typów komórek odpornościowych (tj. makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów [MDM] i komórek dendrytycznych [MDDC]). Dostępny jest protokół montażu modelu wielokomórkowego. Komórki nabłonka pęcherzyków płucnych (linia komórkowa A549) są hodowane i różnicowane w warunkach zanurzonych na przepuszczalnych wkładkach w studzienkach dwukomorowych, a następnie łączone ze zróżnicowanymi MDM i MDDC. Na koniec komórki są wystawione na działanie granicy faz powietrze-ciecz przez kilka dni. Ponieważ ludzkie pierwotne komórki odpornościowe muszą być izolowane z ludzkiej kożuchy koralowej, komórki odpornościowe zróżnicowane ze świeżych lub rozmrożonych monocytów są porównywane w celu dostosowania metody do potrzeb eksperymentalnych. Trójwymiarowe modele, złożone z komórek pęcherzyków płucnych ze świeżo wyizolowanymi lub rozmrożonymi komórkami odpornościowymi pochodzącymi z monocytów, wykazują statystycznie istotny wzrost uwalniania cytokin (interleukiny 6 i 8) po ekspozycji na bodźce prozapalne (lipopolisacharyd i czynnik martwicy nowotworu α) w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Z drugiej strony nie ma statystycznie istotnej różnicy między uwalnianiem cytokin obserwowanym w kokulturach. Pokazuje to, że prezentowany model reaguje na bodźce prozapalne w obecności MDM i MDDC zróżnicowanych od świeżych lub rozmrożonych monocytów krwi obwodowej (PBM). Jest to zatem potężne narzędzie do badań nad ostrą reakcją biologiczną na różne substancje, w tym leki w aerozolu czy nanomateriały.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowle komórek płuc in vitro oferują opłacalne, solidne i dobrze kontrolowane platformy do oceny zagrożeń związanych z aerozolami1. Jako modelowy system komórkowy dla ludzkich pneumocytów pęcherzykowych często stosuje się nabłonkową linię komórkową A549 wyizolowaną z gruczolakoraka płuc2. Komórki te reprezentują płaskonabłonkowe komórki nabłonkowe typu II z obszaru pęcherzyka płucnego3 i są szeroko stosowaną linią komórkową płuc do oceny zagrożeń i toksyczności1,4,5,6,7,8,9,10. Linia komórkowa A549 posiada istotne cechy komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu II, takie jak obecność charakterystycznych ciał blaszkowatych zawierających gęsto upakowane fosfolipidy3.

Wykazano, że gdy komórki są hodowane na granicy powietrze-ciecz (ALI), środek powierzchniowo czynny jest uwalniany po wierzchołkowej stronie komórek nabłonkowych narażonych na działanie powietrza, zmniejszając napięcie powierzchniowe11,12,13. Cecha ta jest szczególnie ważna w badaniach zagrożeń dla układu oddechowego i toksyczności nanomateriałów. Gdy wdychane nanomateriały/substancje toksyczne zostaną zdeponowane w okolicy pęcherzyków płucnych, najpierw wchodzą w interakcję z płucnym środkiem powierzchniowo czynnym i są przemieszczane przez siły zwilżające do hipofazy wodnistej, gdzie zachodzi interakcja z komórkami płucnymi14,15. Mimo że komórki A549 tworzą monowarstwę (która może rozrastać się do wielowarstw w późniejszych punktach czasowych, gdy są hodowane w ALI) i wytwarzają środek powierzchniowo czynny, wadą jest ich niewystarczające tworzenie ścisłego połączenia, co skutkuje niskimi wartościami transepitelowego oporu elektrycznego, ale nadal stanowi funkcjonalną barierę przed translokacją międzykomórkowych (nano)cząstek16,17,18.

W płucach znajduje się różnorodność populacji komórek odpornościowych, w tym fagocytarne i profesjonalne komórki prezentujące antygen (tj. makrofagi i komórki dendrytyczne), które bezpośrednio komunikują się poprzez kontakt komórka-komórka lub sygnalizację międzykomórkową w celu kontroli i utrzymania homeostazy. Makrofagi i komórki dendrytyczne są krytycznymi wrodzonymi efektorami immunologicznymi i inicjatorami adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej19. Komórki dendrytyczne znajdujące się wewnątrz lub pod nabłonkiem mogą tworzyć wypukłości w poprzek nabłonka do światła, aby wyłapać antygeny. Makrofagi pęcherzykowe znajdują się na wierzchołkowej powierzchni nabłonka i działają jako komórki wartownicze, stanowiąc pierwszą obronę komórkową przed ciałami obcymi, a także infekcjami bakteryjnymi, wirusowymi i grzybiczymi. Ich plastyczność fenotypowa pozwala na szybką indukcję reakcji prozapalnych w odpowiedzi na takie bodźce, a także przejście do wyzwalania reakcji przeciwzapalnych (tj. hamujących)20.

Aby zasymulować ludzką barierę tkankową nabłonka pęcherzyków płucnych, stworzyliśmy model potrójnej kokultury z komórkami A549 uzupełnionymi makrofagami pochodzącymi z monocytów ludzkiej krwi (MDM) i komórkami dendrytycznymi (MDDC) odpowiednio po stronie wierzchołkowej i podstawnej17. Uprawa tego modelu w ALI była już wcześniej zgłaszana16, nawet do 72 godzin po ekspozycji21. Ostra odpowiedź immunologiczna na ekspozycję na nanorurki węglowe była znacznie wzmocniona w hodowli komórkowej wystawionej na działanie ALI w porównaniu z warunkami zanurzenia22. Model kokultury, hodowany i wystawiony na działanie różnych materiałów w ALI, był wcześniej używany do badania cytotoksyczności, stresu oksydacyjnego i reakcji zapalnych po ekspozycji na tlenek,23 materiały związane z grafenem24, nanocząstki złota25,26, nanorurki węglowe21, oraz pył wulkaniczny i cząstki spalin z silników wysokoprężnych27.

Ponadto, potwierdzono ważną rolę makrofagów i komórek dendrytycznych jako komórek efektorowych układu odpornościowego w modelu ludzkich płuc in vitro. W szczególności zwiększoną odpowiedź prozapalną w modelu zaobserwowano tylko w obecności komórek odpornościowych w porównaniu z systemami monokulturowymi7. Potencjalnymi wadami stosowania pierwotnych komórek odpornościowych pochodzących z monocytów są ograniczona dostępność PBM, a także zmienność między dawcami. Jako rozwiązanie tych potencjalnych wad, przedstawiono tutaj protokół wprowadzający kriokonserwację świeżo wyizolowanych PBM28 do montażu modelu hodowli komórkowej. Celem tego badania jest zademonstrowanie trójwymiarowego modelu tkanki nabłonka wyrostka zębodołowego człowieka, w tym izolacji PBM z ludzkich kożuchów. Reakcję na bodźce prozapalne porównano z modelem złożonym z MDM i MDDC różniących się od świeżych PBM lub zróżnicowanych od zamrożonych/rozmrożonych PBM.

Praca z nieprzetestowanymi próbkami ludzkiej krwi wymaga szczególnej ostrożności, aby zapobiec potencjalnemu przenoszeniu chorób zakaźnych, takich jak HIV (ludzki wirus niedoboru odporności), wirusowe zapalenie wątroby typu B i zapalenie wątroby typu C. Dlatego stosowanie środków ochrony osobistej, takich jak rękawice, fartuchy, maski i ochrona oczu, ma kluczowe znaczenie i musi być zgodne z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej. Zabezpieczenia te zmniejszają ryzyko narażenia skóry lub błon śluzowych na potencjalnie zakaźne płyny. Dodatkowo, dla osób zajmujących się obchodzeniem się z kożuchami i PBM, szczepienie przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu B jest obowiązkowe, a poziom miana przeciwciał przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B we krwi musi przekraczać 100 IU/L (należy spełnić wymagania prawne specyficzne dla danego kraju). Ponadto wszystkie prace muszą być wykonywane w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (należy spełnić wymagania prawne specyficzne dla danego kraju). Podczas realizacji całego protokołu należy przyjąć standardowe środki ostrożności w zakresie zdrowia i bezpieczeństwa związane z pracą w środowisku laboratoryjnym i obsługą hodowli komórek ssaków, w tym obchodzeniem się z odpadami.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca dotycząca pierwotnych monocytów wyizolowanych z ludzkiej krwi została zatwierdzona przez komitet Federalnego Urzędu Zdrowia Publicznego w Szwajcarii (numer referencyjny: 611-1, Meldung A110635/2) dla Instytutu Adolphe'a Merkle'a.

1. Izolacja monocytów krwi obwodowej (PBM) od ludzkich kożuchów

UWAGA: Poniższa sekcja opisuje izolację komórek odpornościowych z jednego worka 50 ml kożucha, zakupionego w Szwajcarskim Centrum Transfuzji w Bernie, Szwajcaria.

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotować 100 ml buforu do separacji magnetycznej na każdą powłokę: 0,5% [w/v] albuminy surowicy bydlęcej (BSA; w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS]) z 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i dostosować do pH = 7,2, sterylny filtr o wielkości porów 0,22 μm). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez cały czas trwania zabiegu.
    2. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych (CCM): RPMI 1640 z 10% [v/v] płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% [v/v] L-glutaminą (tutaj 2 mM L-glutaminy) i 1% [v/v] penicyliną-streptomycyną (tutaj 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny).
      UWAGA: Wymagana ilość każdego odczynnika zależy od liczby komórek, które mają zostać zasiane w poniższych krokach.
  2. Izolacja PBMs
    UWAGA: Wszystkie wyroby szklane i plastikowe należy wysterylizować przed użyciem. Ze względów bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z próbkami krwi ludzkiej zaleca się stosowanie wyrobów z tworzyw sztucznych, aby zmniejszyć ryzyko zranienia naczyniami szklanymi.
    1. Użyj nożyczek, aby rozciąć końcówkę węża torby zawierającej kożuch.
    2. Rozprowadź kożuchową powłokę, wlewając zawartość worka przez kanał worka bezpośrednio do dwóch stożkowych probówek wirówki o pojemności 50 ml (~ 25 ml każda).
    3. Delikatnie wlej lub odpipetuj PBS do probówek, aż osiągniesz objętość 50 ml. Wymieszaj zawartość, delikatnie obracając tubkę do góry nogami 3x.
    4. Podzielić mieszaninę buffy coat-PBS na cztery nowe stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml, pipetując 25 ml mieszaniny do każdej świeżej probówki.
    5. Powoli ułożyć 13 ml pożywki o gradiencie gęstości pod mieszaniną kożuchowo-PBS za pomocą 10 ml pipety serologicznej. Odłącz napełnioną pipetę od uchwytu pipety i natychmiast zatkaj górny otwór pipety kciukiem, aby zapobiec dodatkowemu wyciekowi podłoża o gradiencie gęstości do mieszaniny buffy coat-PBS.
      UWAGA: Przytrzymując kciukiem górny otwór, umieść napełnioną pipetę na dnie stożkowej probówki wirówkowej tak, aby pożywka o gradiencie gęstości powoli przepływała pod mieszaniną pęczków o ciepłowej płaszczu i PBS, pozostawiając około 1 ml pożywki o gradiencie gęstości wewnątrz pipety.
    6. Powtórzyć krok 1.2.5 z pozostałymi trzema probówkami zawierającymi mieszaninę kożuchowca i PBS.
    7. Odwirować wszystkie cztery probówki zawierające mieszaniny przez 20 minut przy 1 000 x g i 25 °C w trybie powolnego hamowania. Do wirowania należy używać uchwytów z pokrywkami ochronnymi.
    8. Otwórz pokrywę każdej probówki, usuń górną warstwę zawierającą osocze i płytki krwi za pomocą pipety serologicznej i wyrzuć do pojemnika na odpady płynne stanowiące zagrożenie biologiczne.
    9. Użyj pipety serologicznej do pobrania warstwy komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, która pojawia się jako biaława, mętna mała frakcja (o grubości ~2-3 mm) między warstwami osocza i pożywki o gradiencie gęstości. Osadek zawiera na dnie czerwone krwinki. Unikaj przenoszenia erytrocytów, które tworzą najniższą warstwę. Powtórz to dla wszystkich czterech tubes.
      UWAGA: Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej składają się z PBM i limfocytów. PBM zostaną oddzielone od limfocytów później podczas magnetycznej separacji CD14+.
    10. Połączyć jednojądrzaste komórki krwi obwodowej z czterech probówek do dwóch probówek o pojemności 50 ml.
    11. Napełnij dwie probówki PBS do 50 ml i przykryj pokrywką.
    12. Wyrzuć resztki erytrocytów i osocza z oryginalnych czterech probówek do pojemnika na odpady płynne stanowiące zagrożenie biologiczne.
    13. Wirować dwie probówki przez 8 minut przy 500 x g i 18–20 °C przy regularnej prędkości wirówki.
    14. Po odwirowaniu usunąć sklarowany osad za pomocą pipety serologicznej i wyrzucić go do pojemnika na odpady ciekłe stanowiące zagrożenie biologiczne.
    15. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml PBS za pomocą pipety serologicznej.
    16. Połączyć zawiesiny komórek w jednej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i napełnić do 50 ml PBS.
    17. Użyć 5 μl zawiesiny komórkowej do policzenia komórek za pomocą licznika komórek przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego (45 μl).
    18. Pobrać pipetą 10 μl roztworu błękitu trypanowego-PBM do komory licznika komórek i policzyć liczbę komórek zgodnie ze standardowym protokołem liczenia. Użyj równania 1, aby obliczyć całkowitą liczbę komórek, CT.
      figure-protocol-1
    19. Po zliczeniu komórek odwirować probówkę o pojemności 50 ml, jak to opisano w kroku 1.2.13.
  3. Selekcja pozytywna CD14
    1. Delikatnie otworzyć wieczko każdej probówki, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety serologicznej, nie naruszając osadu.
    2. Dodać obliczoną ilość (równanie 2) buforu do separacji magnetycznej (tutaj 80 μl buforu na 1 x 107 wszystkich komórek) i ponownie zawiesić osad komórkowy, pipetując roztwór w górę iw dół.
      figure-protocol-2
    3. Oblicz za pomocą równania 3 (tutaj 10 μl na 1 x 107 wszystkich komórek) odpowiednią objętość kulek magnetycznych CD14+ i odpipetuj odpowiednią objętość.
      figure-protocol-3
    4. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół, zamknąć pokrywkę i inkubować roztwór w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
    5. Po inkubacji napełnić probówkę do 50 ml buforem do separacji magnetycznej.
    6. Odwirować zgodnie z instrukcją wykonania kroku 1.2.13.
    7. Odessać i odrzucić supernatant za pomocą pipety serologicznej, nie naruszając osadu komórkowego.
    8. Odpipetować odpowiednią ilość buforu do separacji magnetycznej (równanie 4; tutaj 500 μl buforu na 1 x 108 komórek) i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 3x,
      figure-protocol-4
    9. Zdezynfekuj stację separacji magnetycznej, spryskując ją i przecierając środkiem sterylizującym. Umieścić w okapie z przepływem laminarnym wraz z kolumną w celu separacji magnetycznej.
    10. Umieść kolumnę separacji magnetycznej w polu magnetycznym i umieść pustą stożkową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml bezpośrednio pod kolumną w celu zebrania mytych i nieoznakowanych komórek (tj. odpadów).
    11. Przepłukać kolumnę separacji magnetycznej, pipetując 3 ml buforu do separacji magnetycznej do kolumny. Nie pozwól, aby kolumna wyschła przez cały czas trwania zabiegu.
    12. Przygotować stożkową probówkę wirówkową o pojemności 15 ml i odpipetować 1 ml buforu do separacji magnetycznej.
    13. Nanieść zawiesinę komórek (przygotowaną w kroku 1.3.8) na kolumnę separacji magnetycznej. W stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml pod filtrem zbierz nieoznakowane komórki, które przeszły przez.
      UWAGA: Nie przekraczaj 2 x 109 komórek na kolumnę, aby uniknąć zablokowania kolumny.
    14. Gdy tylko zbiornik kolumny zostanie opróżniony (tj. gdy komórki przejdą przez kolumnę), należy nanieść 3 ml buforu do separacji magnetycznej za pomocą pipety serologicznej i przepuścić go przez kolumnę. Powtórz to 3 razy.
    15. Wyjmij kolumnę separacji magnetycznej z separatora magnetycznego, delikatnie pociągając rękami, a następnie umieść ją w probówce o pojemności 15 ml zawierającej wstępnie odpipetowany 1 ml buforu do separacji magnetycznej (przygotowanego w kroku 1.3.12).
    16. Dodaj 5 ml buforu do separacji magnetycznej do kolumny i wypłucz magnetycznie znakowane komórki, mocno wciskając tłok do kolumny.
  4. Przygotowanie odczynnika do różnicowania MDM i MDDC
    1. Policz komórki za pomocą licznika komórek, stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego, jak to opisano w kroku 1.2.17.
    2. Obliczyć wymagane objętości CCM lub FBS dla dalszych kroków w następujący sposób: albo objętość CCM odpowiadająca gęstości komórek 1 x 106 komórek/ml (krok 1.5.1), albo objętość FBS odpowiadająca gęstości komórek 6 x 106 komórek na 0,9 ml FBS (krok 1.6.3).
      figure-protocol-5
    3. Zamknij pokrywę, umieść probówkę w wirówce i odwiruj, jak w kroku 1.2.13. Usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Przejdź do kroku 1.5 w przypadku wysiewania komórek lub kroku 1.6 w przypadku zamrażania komórek.
  5. Sadzenie PBM i różnicowanie na MDM i MDDC
    1. Zawiesić osad komórkowy w obliczonej objętości CCM, jak obliczono w kroku 1.4.2 (w tym przypadku końcowe stężenie 1 x 106 komórek/ml), pipetując w górę i w dół 3x.
    2. Za pomocą pipety serologicznej należy odpipetować liczbę komórek przeznaczonych do różnicowania się w MDM i MDDC w oddzielnych stożkowych probówkach wirówkowych.
    3. Odpipetuj czynniki różnicujące do CCM za pomocą PBM i dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Czynniki różnicujące stosuje się w następujący sposób:
      1. Dla MDDC: końcowe stężenie 10 ng/ml interleukiny-4 (IL-4) i 10 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF).
      2. Dla MDM: końcowe stężenie 10 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).
    4. Pipetować zawiesiny komórek w CCM z dodanymi czynnikami różnicującymi do płytek 6-dołkowych, rozprowadzając 3 ml zawiesiny na dołek (odpowiada 3 x 106 komórek/basenik, tj. 1 x 106 komórek/ml).
    5. Umieścić 6 dołków w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) i pozostawić je do rozróżnienia przez 6 dni bez odświeżania CCM.
      UWAGA: Różnicowanie waha się od 5 do 8 dni w zależności od lokalnej dostępności kożuchów i konfiguracji eksperymentalnej, pod warunkiem, że skuteczność różnicowania jest określana przy użyciu odpowiednich technik (patrz sekcja dyskusji).
  6. Zamrażanie PBM
    1. Zawiesić osad komórkowy w pożywce krioprotekcyjnej (tutaj FBS i dimetylosulfotlenek [DMSO; cytotoksyczny]) w stosunku 9:1 (v/v) przez pipetowanie objętości wstępnie podgrzanego FBS. Odpowiada to końcowemu stężeniu komórek 6 x 106 komórek/ml, biorąc pod uwagę dalszy dodatek 10% DMSO (v/v).
    2. Zaznacz żądaną liczbę kriowialiów w okapie z przepływem laminarnym (tj. zapisz datę, kod izolacji i liczbę komórek).
    3. Odpipetować 0,9 ml zawiesiny komórek w czystym FBS (tutaj 6 x 106 komórek w 0,9 ml FBS) do każdego kriowialu. Następnie powoli odpipetować 0,1 ml DMSO i dobrze wymieszać zawiesinę, obracając kriowiale 3 razy w górę iw dół.
    4. Przenieś kriowiale do pojemnika do zamrażania komórek i natychmiast ustaw go na -80 °C na 24 godziny.
    5. Po upływie 24 godzin wyjąć kriowiale z zamrażarki i pojemnika o temperaturze -80 °C i umieścić je w zbiorniku ciekłego azotu przeznaczonym do przechowywania komórek.
  7. Rozmrażanie i różnicowanie PBM na MDM i MDDC
    1. Podgrzej wszystkie wymagane odczynniki do temperatury 37 °C w łaźni wodnej (~20–30 min).
    2. Przygotuj odpowiednią liczbę 6 dołków odpowiadającą liczbie rozmrożonych komórek (tutaj jedna płytka na 1,8 x 107 komórek, tj. 3 kriowialia). Odpipetować pipetą 2 ml CCM do każdego studzienki w warunkach aseptycznych. Umieścić płytki w inkubatorze (5 % CO2, 37 °C) na 15 minut, aby umożliwić wyrównanie pH.
    3. Pobrać wymaganą ilość kriowiali z zamrożonymi komórkami ze zbiornika ciekłego azotu i delikatnie zawirować je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (1–2 min), aby zapewnić równomierne rozmrożenie zawiesiny komórek.
    4. Wyjmij kriowial z łaźni wodnej i odkaż środkiem sterylizującym, upewniając się, że środek nie wchodzi w interakcję z pokrywką i O-ringiem.

      UWAGA: W tym przypadku wszystkie kroki należy wykonać w warunkach aseptycznych.
    5. Przygotuj odpowiednią liczbę stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml odpowiadającą liczbie kriowialiów do rozmrożenia (tutaj 6 x 106 komórek/probówkę). Odpipetować 9 ml wstępnie podgrzanego CCM do każdej probówki.
    6. Powoli (kropla po kropli) odpipetować zawartość kriowialu do probówki zawierającej CCM. Zamknij pokrywkę, powtórz dla każdej probówki i odwiruj przy 200 x g przez 5 minut ze zwykłą prędkością wirówki.
    7. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu.
    8. Zawiesić osad z każdej probówki (która zawiera komórki z jednego kriowialu) w 2 ml wstępnie podgrzanego CCM, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej (gęstość komórek odpowiadająca 3 x 106 komórek/ml).
    9. Z każdej probówki odpipetować zawieszone komórki do dwóch dołków (1 ml na studzienkę) 6-dołkowej płytki zawierającej 2 ml wcześniej przygotowanego CCM, aby osiągnąć gęstość komórek 3 x 106 komórek/basenik (odpowiadającą końcowemu stężeniu 1 x 106 komórek/ml). Powtórz to dla wszystkich innych probówek.
    10. Postępuj zgodnie z opisem w sekcji 1.5.3.
    11. Umieścić 6 dołków w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) i pozostawić im różnicowanie przez 6 dni bez odświeżania CCM.

2. Model kokultury trójkomórkowej ludzkiej tkanki nabłonkowej pęcherzyków płucnych

UWAGA: Ta sekcja zawiera instrukcje dotyczące objętości i numerów komórek odpowiadających wkładkom płytek 12-dołkowych. Rysunek 1 podsumowuje proponowany harmonogram montażu modelu.

  1. Wysiewanie komórek nabłonkowych (linia komórkowa A549)
    1. Hoduj komórki nabłonkowe zgodnie z zaleceniami dostarczonymi przez dostawcę (ATTC). Krótko mówiąc, subkulturuj komórki w CCM przy 80% konfluencji komórek (w przybliżeniu 2-3 razy w tygodniu).
      UWAGA: Subkultura A549 przez co najmniej cztery pasaże przed kompozycją modelu kokultury, przy użyciu komórek A549 w zakresie pasaży 5–25.
    2. Odpipetować 1,5 ml wstępnie podgrzanego CCM do 12-dołkowych płytek (liczba dołków odpowiada żądanej liczbie modeli).
    3. Umieść pojedyncze 12-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych w dołkach 12-dołkowej płytki za pomocą wysterylizowanej pęsety.
    4. Odłączyć komórki od kolby zgodnie z protokołem poduprawy (tj. przy użyciu środka oddzielającego, usunąć czynnik przez odwirowanie, jak to uczyniono w kroku 1.2.13). Zawiesić w odpowiedniej objętości CCM odpowiadającej końcowemu stężeniu komórek A549 (tutaj 50 x 104 komórek/ml; 0,5 ml zawiesiny komórek na wkładkę, tj. 25 x 104 komórki/wkładkę, co odpowiada gęstości wysiewu 27,8 x 104 komórek/cm2).
    5. Odpipetować 0,5 ml zawiesiny komórek (tj. 25 x 104 komórek/wkładkę) do wierzchołkowej strony wkładki za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    6. Przykryj płytki pokrywkami i umieść je w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5 % CO2 ) na 4 dni.
      UWAGA: Regularnie sprawdzaj zbieganie się komórek A549 pod mikroskopem z kontrastem fazowym.
  2. Siew MDDC
    1. Odessać CCM z nieprzyłączonymi komórkami w 6 dołkach zawierających MDDC.
    2. Dodaj 1 ml świeżego, wstępnie podgrzanego CCM do każdej studzienki.
    3. Użyj skrobaka do komórek, odłącz (zeskrobuj) przylegające MDDC z każdej studzienki, delikatnie umyj studzienki istniejącymi 1 ml CCM 3x i połącz je w jedną stożkową probówkę wirówkową.
    4. Policzyć komórki za pomocą licznika komórek przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego, używając 10 μl zawiesiny komórek i 10 μl roztworu błękitu trypanowego.
    5. Odwirować zawiesinę komórkową w sposób opisany w kroku 1.2.13.
    6. Obliczyć objętość CCM wymaganą do ponownego zawieszenia (równanie 5):
      Wymagana gęstość MDDC = 42 x 104 komórki/ml; każda wstawka wymaga 6,3 x 104 komórek, co odpowiada gęstości komórek zasianych 7 x 104 komórek/cm2 (tutaj 150 μL dodanych do 0,9 cm2 w kroku 2.2.10.).
      Objętość CCM do ponownego zawieszenia komórek (Vm; równanie 5):
      figure-protocol-8
    7. Delikatnie zassać i wyrzucić CCM z górnej komory 12-dołkowych płytek z rosnącym A549 na wkładkach.
    8. Umieść wkładki z komórkami A549 w pozycji odwróconej do góry nogami na sterylnej szalce Petriego za pomocą wysterylizowanej pęsety. Przygotować stożkową probówkę wirówkową (50 ml) z PBS i wstępnie zwilżyć skrobak do komórek.
    9. Zeskrob komórki A549 z podstawowej powierzchni wkładki (tj. górnej części w pozycji odwróconej), które powinny wyrastać przez pory wkładek.
      UWAGA: Przepłukać skrobak PBS (przygotowanym w probówce) między zeskrobywaniem poszczególnych próbek i utrzymywać go w stanie mokrym przez cały czas trwania procedury.
    10. Po odwirowaniu (krok 2.2.5) odessać i odrzucić supernatant, a następnie ponownie rozproszyć osad MDDC w obliczonej ilości CCM (krok 2.2.6) i pipetować w górę i w dół 3x.
    11. Odpipetować 150 μl zawiesiny komórek na wierzchu każdej wkładki tak, aby cała podstawowa powierzchnia wkładki była równomiernie pokryta płynem i nie zawierała pęcherzyków.
    12. Przykryj naczynie pokrywką i umieść w inkubatorze do hodowli komórkowych na 70 minut. Odessać CCM z płytek do hodowli komórkowych (gdzie początkowo umieszczono wkładki), wyrzucić go do odpadów ciekłych stanowiących zagrożenie biologiczne i odpipetować 1,5 ml świeżego CCM do każdej studzienki. Przykryj płytkę pokrywką i umieść w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2).
      UWAGA: Nie przekraczaj okresu wymienionego powyżej, aby uniknąć wysuszenia komórek.
    13. Po inkubacji należy ostrożnie przytrzymać każdą wkładkę wysterylizowaną pęsetą i umieścić ją na płytkach zawierających CCM w zwykłej pozycji. Przykryj płytkę pokrywką i włóż ją z powrotem do inkubatora komórkowego (37°C, 5% CO2 ).
  3. Wysiew makrofagów (MDM)
    1. Pobrać 6 dołków zawierających wstępnie zróżnicowane MDM. Umieścić je z inkubatora komórkowego w okapie z przepływem laminarnym.
    2. Odessać i wyrzucić CCM z nieprzyłączonymi MDM wyhodowanymi w 6-dołkowych płytkach i odpipetować 1 ml świeżego, wstępnie podgrzanego CCM do każdej studzienki.
    3. Za pomocą skrobaka do komórek delikatnie usuń przylegające MDM z poszczególnych studzienek (jak to zrobiono w kroku 2.2.3 dla MDDC).
    4. Pobrać pipetą 10 μl błękitu trypanowego do studzienki lub probówki i dodać 10 μl zawiesiny MDM do uzyskania końcowego rozcieńczenia 1:1 (v/v). Policz liczbę MDM przy użyciu odpowiedniego protokołu zliczania.
    5. Odwirować zawiesinę komórkową w sposób opisany w kroku 1.2.13.
    6. Oblicz wymaganą objętość (równanie 6):
      Wymagana gęstość MDM = 2,5 x 104 komórki/ml w CCM (tutaj każda wkładka wymaga 1,25 x 104 komórek w 0,5 ml CCM, co odpowiada gęstości komórek zasianych 1,4 x 104 komórek/cm2).
      figure-protocol-9 (6)
    7. Po odwirowaniu odessać i wyrzucić supernatant, ponownie rozproszyć osad MDM w obliczonej ilości CCM (krok 2.3.6) i pipetować w górę i w dół 3x.
    8. Ostrożnie odpipetować 0,5 ml zawiesiny MDM (przygotowanej w kroku 2.3.7) na ściankę wkładek do hodowli komórkowych z A549 i MDDC (nie bezpośrednio na komórki nabłonka) za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Przykryć płytki pokrywkami i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5 % CO2 ) na 24 godziny.
  4. Przeniesienie modelu kokultury na granicę faz powietrze-ciecz (ALI)
    1. Po upływie 24 godzin (±2 godzin) okresu inkubacji zmontowanego modelu w inkubatorze do hodowli komórkowych należy odessać i odrzucić CCM zarówno z wierzchołkowej, jak i podstawowej części wkładek do hodowli komórkowych oraz z dołków.
    2. Za pomocą wysterylizowanej pęsety wyjmij pojedyncze wkładki z dołków i odpipetuj 0,6 ml świeżego, wstępnie podgrzanego CCM do każdego dołka za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Nie należy dodawać CCM do wierzchołkowej strony wkładki.
    3. Przykryć płytki pokrywkami i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5 % CO2 ) na 24 godziny przed dalszym użyciem.

3. Ekspozycja na wybrane kontrole pozytywne (znane bodźce do wywoływania reakcji prozapalnej)

UWAGA: Ekspozycja modeli kokultury na znany bodziec prozapalny endotoksyna lipopolisacharyd (LPS)7 i czynnik martwicy nowotworu cytokin proinzapalnych α (TNF-α)7 służy do zilustrowania responsywności modelu. Ponadto ekspozycja na detergent (Triton X-100) jest wykorzystywana w celu potwierdzenia czułości testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH).

  1. Przygotować roztwory kontroli dodatniej: LPS (1 mg/ml w wodzie destylowanej), TNF-α (100 μg/ml w wodzie destylowanej) i Triton-X 100 (2% [v/v] w PBS).
  2. Po 24 godzinach inkubacji modelu kokultury w warunkach ALI należy odessać i wyrzucić supernatant z komory podstawowej. Za pomocą wysterylizowanej pęsety wyjmij pojedyncze wkładki z dołków i odpipetuj 0,6 ml świeżego, wstępnie podgrzanego CCM do każdej studzienki.
  3. Przygotować indywidualne roztwory robocze kontroli dodatniej, rozcieńczając zapasy CCM w stożkowych probówkach wirówkowych w następujący sposób: 1 μg/ml LPS, 1 μg/ml TNF-α i 0,2% Triton-X 100. Objętości odpowiadają liczbie badanych wkładów (tutaj 100 μL/wkład). Dobrze wymieszaj roztwory, pipetując w górę i w dół 3x.
  4. Nanieść 100 μl każdego roztworu kontroli dodatniej, powoli pipetując na ściankę wkładki do hodowli komórkowej. Przykryć płytkę studzienki pokrywką i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) na 24 godziny. Po inkubacji odessać i wyrzucić płyn po wierzchołkowej stronie wkładki, przytrzymując poszczególne wkładki za pomocą pęsety.
  5. Zebrać CCM w przedziałach podstawowych i przechowywać w temperaturze 1) 4 °C do dalszej analizy LDH, co oznacza cytotoksyczność za pośrednictwem pęknięcia błony komórkowej, i/lub 2) przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszej analizy uwalniania białka za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Uruchom testy zgodnie z zaleceniami dostawcy zestawu.
  6. Po usunięciu CCM umyj wkładki PBS 3x i utrwal komórki na wkładkach do hodowli komórkowych w 4% [w/v] paraformaldehydzie (w PBS, 15 min w temperaturze pokojowej), upewniając się, że obie strony wkładki są dobrze pokryte roztworem PFA. Następnie przemyj 3x PBS, aby usunąć PFA. Próbki należy przechowywać zanurzone w PBS w temperaturze 4 °C w celu dalszego barwienia immunologicznego (przykład tej metody został opisany wcześniej17).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele kokultury płuc ludzkich, składające się z komórek nabłonka pęcherzyków płucnych i komórek odpornościowych, zostały złożone ze świeżych lub mrożonych MDDC i progenitorów MDM (tutaj, ludzkich monocytów pochodzących z krwi obwodowej). Jak przedstawiono w Rysunek 1, komórki A549 zostały wysiane 3 dni po pierwszej sekcji obejmującej izolację/rozmrażanie monocytów. Po 6 dniach różnicowania zróżnicowane MDM wydawały się okrągłe, podczas gdy MDDC tworzyły bardziej wydłużony kształt z widocznymi wypukłościami. Pojawiły się również jako aglomeraty, zwłaszcza gdy odróżniły się od świeżych monocytów (Ryc. 2, Ryc. 3). Komórki nabłonkowe utworzyły gęstą warstwę komórkową komórek po 3 dniach wzrostu na wstawkach błonowych (Ryc. 4), kiedy kokultury zostały złożone. Po 24 godzinach montażu i dodatkowych 24 godzinach poddawania warunkom ALI, kokultury zostały przygotowane do ekspozycji.

Responsywność modeli 3D hodowli komórkowych została zbadana po ekspozycji na znane bodźce prozapalne przy użyciu podejścia pseudo-ALI, jak opisano wcześniej29. Bodźce prozapalne, LPS i TNF-α, dodawano w małych ilościach (100 μl) na wierzchołkową powierzchnię modelu komórkowego wystawionego na działanie powietrza. Równolegle oceniano brak pęknięcia błony jako miarę cytotoksyczności za pomocą testu LDH. Znaczny wzrost uwalniania LDH w CCM w przedziale podstawowym zaobserwowano po ekspozycji na pozytywną kontrolę pęknięcia błony, detergent Triton-X 100 (Ryc. 5). Wyniki te potwierdziły reaktywność modelu na substancję cytotoksyczną, podczas gdy nie zaobserwowano wzrostu uwalniania LDH po stymulacji wierzchołkowej TNF-α lub LPS.

Możliwy powód różnych zmierzonych wartości LDH w próbkach złożonych ze świeżych lub wcześniej zamrożonych PBM można przypisać przechowywaniu próbek. Próbki ze świeżych PBM przechowywano przez dłuższy czas w temperaturze -80 °C; w związku z tym aktywność enzymu LDH może spaść. Warto zauważyć, że LDH jest stabilny tylko do 4 dni w CCM; W związku z tym zaleca się wykonanie testu najpóźniej 2 dni po zebraniu supernatantów. Alternatywnie możliwe jest zamrożenie supernatantów bezpośrednio po pobraniu. Należy jednak wziąć pod uwagę, że zamrażanie może zmniejszyć aktywność enzymatyczną LDH.

Wydzielanie mediatorów prozapalnych (tutaj TNF-α i interleukiny 6 [IL-6] i 8 [IL-8]) do podstawowego CCM zostało określone ilościowo za pomocą testu ELISA. Statystycznie istotny (p < 0,05, jednokierunkowa ANOVA) wzrost uwalniania IL-6 i IL-8 zaobserwowano zarówno w próbkach traktowanych LPS, jak i TNF-α w porównaniu z odpowiednimi komórkami nietraktowanymi, a także w modelach hodowli komórkowych złożonych z dowolnego źródła PBM (Figura 6). Chociaż stężenia (pg/ml) wszystkich badanych cytokin w podstawowym CCM były wyższe w kokulturach złożonych ze świeżych PBM, różnice między tymi dwoma kokulturami i monokulturami nie były statystycznie istotne (p > 0,05) (Rysunek 6). Aby potwierdzić wartość dodaną modeli kokultur w odniesieniu do hodowli komórek nabłonkowych 2D, monokultury A549 poddano również działaniu LPS lub TNF-α. Zgodnie z oczekiwaniami, uwolnienie wszystkich badanych mediatorów z monokultur A549 było niższe w porównaniu z obydwoma modelami kokultur; chociaż różnica między nimi nie była istotna statystycznie (p > 0,05, jednoczynnikowa ANOVA).

Morfologia komórkowa bariery tkankowej ludzkiego pęcherzyka płucnego 3D została oceniona za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (LSM). Aby zobrazować skład każdego modelu, makrofagi w modelach kokultury (MDM) wybarwiono markerem dojrzałych makrofagów 25F9. MDDC zostały wybarwione CD83, który jest ważnym markerem dla aktywowanych komórek dendrytycznych 30. Jeśli chodzi o morfologię komórkową, nie zaobserwowano różnicy między modelami kokultury z wykorzystaniem MDM i MDDC ze świeżych PBM w porównaniu z modelami wykorzystującymi rozmrożone PBM. W kokulturach narażonych na LPS i TNF-α, składających się ze świeżych i zamrożonych komórek odpornościowych, zaobserwowano zakłóconą warstwę nabłonkową w obrazach LSM, co nie miało miejsca w komórkach nieleczonych (Rysunek 7, Rysunek 8).

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny oś czasu protokołu. Prezentacja przygotowania, montażu i aplikacji modelu 3D kokultury (narażenie na działanie badanej substancji). ALI = granica faz powietrze-ciecz, MDDC = komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów, MDM = makrofagi pochodzące z monocytów, PBM = monocyty krwi obwodowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: MDM i MDDC odróżnione od świeżych PBM. Obraz z mikroskopii kontrastowej fazowej zróżnicowanych (A) MDM i (B) MDDC ze świeżych PBM (6 dni po izolacji komórek). MDM mają okrągły kształt, podczas gdy MDDC są często obserwowane jako aglomeraty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: MDM i MDDC w odróżnieniu od zamrożonych PBM. Obraz z mikroskopii kontrastowej fazowej zróżnicowanych (A) MDM i (B) MDDC z rozmrożonych PBM (6 dni po rozmrożeniu). MDM mają okrągły kształt, ale można zaobserwować niektóre wydłużone komórki. MDDC mają również okrągły kształt z wypukłościami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Wzrost komórek nabłonkowych na wstawkach błonowych. Obraz mikroskopii z kontrastem fazowym konfluentu A549 rosnącego na wkładzie membranowym 4 dni po wysianiu, tworzącego gęstą warstwę komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Wyniki cytotoksyczności badane za pomocą testu opartego na pęknięciu błony (LDH). Dane przedstawiono jako krotny wzrost w stosunku do komórek nieleczonych (średnia ± SD, n = 3, gwiazdka oznacza statystycznie istotny wzrost w porównaniu z komórkami nieleczonymi, **p < 0,01, ****p < 0,0001). W modelach zielonych reprezentowane są MDM i MDDC z nowych PBM, a w fioletowych modelach zmontowane z rozmrożonych PBM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Reakcje prozapalne w kokulturach i monokulturach. Mediatory prozapalne (TNF-α, IL-6 i IL-8) uwalniają się w kokulturach po 24-godzinnym prowokowaniu LPS lub TNF-α. Dane przedstawiono w odniesieniu do komórek nieleczonych (średnia ± SD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). W modelach zielonych reprezentowane są MDM i MDDC z nowych PBM, a w fioletowych modelach zmontowane z rozmrożonych PBM. Kolor szary reprezentuje monokultury A549. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rycina 7: Morfologia kokultur złożonych ze świeżych komórek odpornościowych. Obrazy LSM wierzchołkowej i podstawowej strony modelu kokultury z projekcjami xz wierzchołkowych boków modelu przy użyciu MDM i MDDC ze świeżych PBM. Cyjan reprezentuje jądra (DAPI), magenta reprezentuje cytoszkielet (rodamina-falloidyna), biały reprezentuje MDM (25F9), a zielony reprezentuje MDDC (CD 83). Biała strzałka oznacza MDM, a zielona strzałka oznacza MDDC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Morfologia kokultur złożonych z zamrożonych komórek odpornościowych. Obrazy LSM wierzchołkowej strony modelu kokultury z odpowiednimi projekcjami xz oraz podstawowej strony modelu wykorzystującej MDM i MDDC z rozmrożonych PBM. Cyjan reprezentuje jądra (DAPI), magenta reprezentuje cytoszkielet (rodamina-falloidyna), biały reprezentuje MDM (25F9), a zielony reprezentuje MDDC (CD 83). Biała strzałka oznacza MDM, a zielona strzałka oznacza MDDC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawiająca się produkcja nowych materiałów, w tym chemikaliów i leków, stopniowo zwiększa zapotrzebowanie na predykcyjne modele in vitro. Aby zachować zgodność z trzema zasadami zastępowania, redukcji i udoskonalania testów na zwierzętach32, modele komórkowe in vitro stały się potężnymi narzędziami w aspekcie zastępowania i redukcji w celu wyjaśnienia mechanizmów działania leku lub materiału 8,9,10,11. Przedstawiono tutaj szczegółowy protokół składania modelu wielokomórkowego przy użyciu komórek odpornościowych, które są świeżo wyizolowane lub rozmrożone z wcześniej zamrożonych monocytów. Opisana jest również uprawa modelu w ALI. Wreszcie, protokół ilustruje przykład ekspozycji na bodźce prozapalne i porównuje odpowiedź dwóch modeli zawierających świeże lub mrożone monocyty.

Przeprowadzono różne badania w celu potwierdzenia i uzasadnienia wartości dodanej wynikającej ze zwiększonej złożoności modeli uprawianych i narażonych w warunkach ALI w porównaniu z konwencjonalnym narażeniemw zanurzeniu 7,22,31. Obserwacja wyższej odpowiedzi prozapalnej w kokulturach w porównaniu z monokulturami komórek nabłonkowych potwierdza wcześniejsze badanie. W badaniu wykorzystano przedstawiony model kokultury (stymulowany LPS) i wykazano wyższą odpowiedź na poziomie ekspresji genów TNF i IL1B w porównaniu z równoważnym modelem monokultury A5497. Z drugiej strony, oba modele wykazały większe różnice w zmierzonych wartościach uwalniania mediatorów prozapalnych w porównaniu z monokulturami A549. Można to wytłumaczyć wykorzystaniem komórek odpornościowych od różnych dawców (buffy coats) w ramach powtórzeń biologicznych (tj. jedno powtórzenie, jeden dawca), jak pokazano wcześniej7. W razie potrzeby różnice między powtórzeniami można przezwyciężyć poprzez 1) użycie rozmrożonych PBM od tego samego dawcy lub 2) zebranie PBM od różnych dawców przed zamrożeniem komórek, a następnie użycie tej samej puli w każdym powtórzeniu. Zalecane jest również włączenie większej liczby powtórzeń biologicznych.

Technikę zamrażania komórek można uznać za krytyczny krok; Jest to jednak powszechna procedura laboratoryjna służąca do konserwacji komórek do analizy fenotypowej i funkcjonalnej. Różne badania wykazały, że jakość zamrożonych PBM ma kluczowe znaczenie dla ich przeżycia, a odpowiednia technika zamrażania jest kluczem do sukcesu kolejnych testów na tych samych komórkach 28,32. Modyfikacja protokołu może być przeprowadzona poprzez zamrożenie PBM, co zapewnia elastyczność w konfiguracji eksperymentalnej, ponieważ dostępność buffy coats jest zwykle ograniczona. Kolejną zaletą stosowania mrożonych PBM (w kilku fiolkach) w porównaniu ze świeżo wyizolowanymi jest to, że można je stosować w kolejnych eksperymentach nawet po 1 roku. Zmniejsza to potencjalny problem zmienności między dawcami, jeśli jest to pożądany lub wymagany parametr w eksperymencie.

Wyniki porównania międzylaboratoryjnego przeprowadzonego po upływie do 13 miesięcy pokazują, że PBM, jeśli są prawidłowo przechowywane w zbiorniku z ciekłym azotem, mogą być używane przez długi czas bez żadnego wpływu na żywotność komórek lub ich regenerację33. Dłuższy czas przechowywania (ponad 1 rok) może być możliwy po dokładnej walidacji żywotności komórek i reakcji komórek przed przeprowadzeniem eksperymentu. Ponadto temperatura w zbiorniku ciekłego azotu musi być przez cały czas stabilna. Stwierdzono, że głównym czynnikiem wpływającym na żywotność kriokonserwowanych PBM jest stężenie DMSO, przy optymalnym stężeniu 10%–20% (v/v)28. Aby zminimalizować potencjalnie szkodliwe skutki zamrażania, do podłoża zamrażającego często dodaje się różne źródła białek, FBS lub BSA (o szerokim zakresie stężeń od 40% do 100%34) jako naturalne składniki ochronne, które mogą zwiększyć przeżywalność komórek.

Ze względu na wysoki potencjał cytotoksyczny DMSO, zaleca się najpierw dyspersję PBM w FBS, a następnie dodanie DMSO do PBM już zdyspergowanych w FBS. Warto zauważyć, że chociaż wyższe stężenia FBS (>40%) nie wykazały żadnej poprawy żywotności komórek, jednocześnie nie spowodowały uszkodzenia komórek28. Niemniej jednak zamrażanie monocytów jest możliwym podejściem do przezwyciężenia problemów związanych z ograniczoną dostępnością kożuchówki. Jeśli jednak pożądane jest użycie MDDC i MDM ze świeżych PBM, komórki odpornościowe mogą być różnicowane i wykorzystywane 5-8 dni po izolacji 7,16,17,35,36,37. Jeśli pozwala na to planowanie eksperymentalne, zaleca się co najmniej 6 dni różnicowania zarówno w MDDC, jak i MDM. Jednak spójność między różnymi powtórzeniami w tym samym eksperymencie, wraz z rutynowymi kontrolami ich specyficznych wyrażeń znaczników powierzchniowych, ma kluczowe znaczenie. Należy również regularnie sprawdzać reakcję na bodziec prozapalny, taki jak LPS, po czasie różnicowania.

Wiele badań z wykorzystaniem linii komórkowej A549 przeprowadzono w ALI, zarówno jako monokulturę, jak i w połączeniu z innymi typami komórek (makrofagami, komórkami dendrytycznymi lub fibroblastami) w modelu kokultury 3D 22,24,29,38. Korzystając z tego modelu kokultury 3D, badano cytotoksyczność, stres oksydacyjny lub działanie prozapalne (nano)materiałów przez okres do 72 godzin 1,17,21,24,29. Podobieństwo modelu do tkanki in vivo było wcześniej badane na podstawie konfokalnego obrazowania skaningowego za pomocą skaningu laserowego modelu16. Podczas składania modelu ważne jest, aby wziąć pod uwagę zarówno proliferację komórek (która może wpływać na A549 w przedstawionym tutaj modelu), jak i wydajność pierwotnych (nie proliferujących) komórek odpornościowych (w tym przypadku MDDC i MDM). Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że nie wszystkie monocyty CD14-dodatnie różnicują się w MDDC i MDM oraz że komórki mogą być obecne zarówno w formie przyłączonej, jak i zawieszonej. Ze względu na charakter zespołu kokultury (w tym przypadku oba typy komórek muszą przyłączyć się do istniejącej warstwy nabłonka), zaleca się stosowanie tylko przylegających subpopulacji obu typów komórek odpornościowych. Ponadto rutynowe analizy monocytów, reakcji monokultur MDDC i MDM na LPS oraz ekspresji specyficznych markerów powierzchniowych (CD14, CD163, CD86, CD93 lub CD206, dane nie pokazane) sugerują, że 6 i 7 dni różnicowania są optymalnymi punktami czasowymi.

Chociaż realistyczna liczba komórek nabłonka pęcherzyków płucnych w ludzkich płucach odpowiada ~160 000 komórek/cm2, liczba komórek A549 zliczonych w modelu wynosi ~1 000 000 komórek/cm2 po 9 dniach hodowanych na wkładce16,18. W związku z tym należy wziąć pod uwagę ograniczenia tego modelu in vitro. Po pierwsze, gęstość komórek nabłonkowych ustalono na podstawie ich zdolności do tworzenia warstwy zlewającej się na rosnącej błonie. Należy również wspomnieć, że A549 reprezentuje nabłonkową komórkę typu II o prostopadłościennej formie, w przeciwieństwie do komórek nabłonkowych typu I, które są płaskie i rozproszone. Z drugiej strony, wymagana liczba komórek odpornościowych została ustalona na podstawie literatury i przedstawiona w niniejszym protokole jako liczba komórek/powierzchnia 39,40,41. Gęstość komórek MDDC w zakresie 400 komórek/mm2 (4 komórki/cm2)16 jest porównywalna z gęstością komórek w stanie ustalonym wynoszącą 500–750 komórek/mm2 (5-7 komórek/cm2) opisaną w badaniach in vivo39. Gęstość MDM w tym modelu mieści się w tym samym zakresie, co w sytuacji in vivo w ludzkim obszarze pęcherzykowym40.

Barwienie markerami dojrzałych makrofagów (25F9) obserwowano zarówno po stronie wierzchołkowej (gdzie obecne są MDM), jak i po stronie podstawowej (tj. w miejscu komórek dendrytycznych). Translokacja komórek odpornościowych przez pory wstawiania błony jest możliwa i została również zaobserwowana przy użyciu tego modelu16, co może wyjaśniać obserwowane różnice w intensywności barwienia. Jednak innym możliwym wyjaśnieniem jest to, że dojrzały marker makrofagowy może również ulegać ekspresji na komórkach dendrytycznych, ale ekspresja jest wysoce specyficzna dla dawcy42. Ponadto intensywność ekspresji 25F9 jest znacznie wyższa w MDM (Rysunek 7, Rysunek 8). Oba bodźce prozapalne (LPS i TNF-α) wpłynęły na integralność bariery nabłonkowej płuc w obu kokulturach (ryc. 7, ryc. 8). Oczekiwano tego na podstawie wcześniejszych publikacji43,44 pokazujących, że cytokiny prozapalne i produkty bakteryjne zaburzają integralność barier nabłonkowych.

Wielokomórkowy model 3D ludzkiego nabłonka wyrostka zębodołowego, ustalony i scharakteryzowany wcześniej17, posłużył jako potężne i użyteczne narzędzie do oceny odpowiedzi biologicznych (tj. ostrych reakcji prozapalnych, odpowiedzi na stres oksydacyjny, rozmieszczenia cząstek i komunikacji komórkowej) in vitro 21,24,25,45. Wyniki potwierdzają responsywność modeli kokultury na bodźce prozapalne (w tym przypadku LPS i TNF-α). Odpowiedź była nieznacznie zwiększona w przypadku stosowania komórek odpornościowych ze świeżych PBM; jednak nie było statystycznie istotnej różnicy między kokulturami używającymi świeżych i rozmrożonych PBM. Co więcej, reakcje prozapalne w obu modelach kokultury były wyższe niż w monokulturach komórek nabłonka hodowanych w tych samych warunkach (ALI). Podsumowując, protokół opisuje montaż 3D modelu kokultury tkanki nabłonka ludzkich pęcherzyków płucnych przy użyciu świeżych lub rozmrożonych PBM do różnicowania na MDM i MDDC. Wykazano, że oba modele są wysoce wrażliwe na bodźce prozapalne; W związku z tym mogą służyć jako potężne narzędzia do oceny potencjalnych zagrożeń i toksyczności.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Miguelowi Spuch-Calvarowi za schemat kokultury na rysunku 3 oraz dr Bedii Begum Karakocak za krytyczną lekturę. Badanie było wspierane przez projekt PATROLS, program Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 760813, oraz przez Fundację Adolphe'a Merkle'a. B.D. dziękuje fundacji Peter und Traudl Engelhorn za wsparcie finansowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wzorcowy czytnik mikropłyteknie musi być specyficzny, na przykład BioRad, Cressier, Szwajcaria
Inkubator do hodowli komórkowychnie musi być specyficzny
Pojemnik do zamrażania komórek (na przykład Mr. Frosty)nie musi być specyficzny
Wirówkanie musi być specyficzna
Konfokalny skan laserowy mikroskopnie musi być specyficzny, na przykładZeiss LSM 710 meta
Heamatocytometr lub automatyczny licznik komóreknie musi być specyficzny
Laminarny kaptur bezpieczeństwa biologicznego klasy IInie musi być specyficzny
MultiStand Macs (Macs Cell Separator)Miltenyi, Niemcy130-042-303
pH-metrmusi być specyficzny
Mikroskop światła odwróconego z kontrastem fazowymnie musi być specyficzny
Pipeta chłopcze, pipety (różne objętości)nie muszą być specyficzne
Nożyczkinie muszą być specyficzne
Pompa próżniowanie musi być specyficzna
Kąpiel wodnanie musi być specyficzna
Jednorazowy drobny sprzęt/szkłoNumer katalogowy
Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml i 50 mlmuszą być specyficzne
6- i 12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, płaskie dno, pokrywka o niskiej parowaniu, sterylnyFalcon, Szwajcaria353046 i 353043
Wkładki do hodowli komórkowych, przezroczysta membrana PET, 12-dołkowa, 3 μ m wielkość porówFalcon, Szwajcaria353181
Skrobak do komóreknie musi być specyficzny, na przykład VWR, Szwajcaria353085
Kriofialenie muszą być specyficzne
Szklane autoklawizowane szalki Petriegonie muszą być określone
LS KolumnyMiltenyi, Niemcy130-042-401
Sterylny kubek filtracyjny do filtracji próżniowej, 0,2 i mu; m wielkość porównie musi być określona, na przykład VWR, Szwajcaria10040-446
Sterylna butelka laboratoryjna kompatybilna z kubkiem filtracyjnym (min. 100 ml)nie musi być specyficzna
Sterylne pipetynie muszą być specyficzne
Chemicals
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich, SzwajcariaA7030-100g
CD14+ Mikrokulki ludzkie - kulki magnetyczneMiltenyi, Niemcy130-097-052
Środek deattachnig Trypsin-EDTA, 0,05%, czerwień fenolowaGibco, Szwajcaria25300054
Gradient gęstości średni LymphoprepAlere Technologies AS, Norwegia1114547
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma Aldrich, SzwajcariaD2438
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-Aldrich, SzwajcariaE6758-100g
Surowica bydlęca płodu (inaktywowana termicznie)Gibco, Szwajcaria10270-106
Ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), premium klasaMiltenyi, Niemcy130-093-864
Interleukina ludzka 4 (IL-4), klasa premiumMiltenyi, Niemcy130-095-373
Ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), klasa premiumMiltenyi, Niemcy130-096-485
L-glutaminaGibco, Szwajcaria25030-024
Lipopolisacharyd (LPS) z Escherichia coliSigma-Aldrich, Szwajcaria4524-5mg
Paraformaldehydu (PFA)Sigma-Aldrich, Szwajcaria158127
Penicilin-StreptomycinGibco, Szwajcaria15140-122
Bufor fosforanowy Solanka (PBS)Gibco, Szwajcaria10010-015
Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)Gibco, Szwajcaria42401-018
Triton X-100Sigma-Aldrich, SzwajcariaT8787
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)Sigma Aldrich, Szwajcaria
Czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α)Immunotools11343015
Testy stosowane do cytotoksyczności, odpowiedzi (pro)zapalnej
Zestaw do wykrywania cytotoksyczności (LDH)Roche, Szwajcaria11644793001
Ludzki IL-6 DuoSet ELISAR& D, Biotechne, SzwajcariaDY206
Człowiek IL-8/CXCL8 DuoSet ELISAR& D, Biotechne, SzwajcariaDY208
Immunostaining
4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), stężenie 2 μ g/mLSigma-Aldrich, Szwajcaria10236276001
Kozioł anty-mysi IgG (H+L) Alexa Fluor 647 sprzężony, stężenie 20 μ g / mlAbcam, Wielka Brytaniaab150115
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Dylight 488 sprzężone, stężenie 10 μ g/mlAgrisera, SzwecjaAS09 633
Dojrzałe przeciwciało monoklonalne markera makrofagów, stężenie 50 μ g/mleBioScience, Thermo Fischer, Szwajcaria14-0115-82
Rodamina falloidyna, stężenie 0,264 i mikro; MMolecular Probes, Life Technologies, SzwajcariaR415
, rozcieńczenie 1:50Abcam, Wielka Brytaniaab244204
nie nie Rekombinowane przeciwciało anty-CD83

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. In vitro models of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of particulate matter. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (8), 1075-1089 (2008).">Rothen-Rutishauser, B., Blank, F., Mühlfeld, C., Gehr, P. In vitro models of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of particulate matter. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (8), 1075-1089 (2008).
  2. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of National Cancer Institute. 51 (5), 1417-1423 (1973).">Giard, D., et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of National Cancer Institute. 51 (5), 1417-1423 (1973).
  3. Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders, 5e. Grippi, M. A., et al. , McGraw-Hill Education. (2008).">Ochs, M., Weibel, E. R., et al. Ch. 2: Functional Design of the Human Lung for Gas Exchange . Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders, 5e. Grippi, M. A., et al. , McGraw-Hill Education. (2008).
  4. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism. Experimental Cell Research. 243 (2), 359-366 (1998).">Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism. Experimental Cell Research. 243 (2), 359-366 (1998).
  5. Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 9 (6), 582-586 (2016).">Guo, X. Y., Lu, M., Chen, X. Q., He, F. D., Li, A. Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 9 (6), 582-586 (2016).
  6. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS ONE. 11 (10), 0164438(2016).">Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS ONE. 11 (10), 0164438(2016).
  7. The crux of positive controls - Proinflammatory responses in lung cell models. Toxicology In Vitro. 54, 189-193 (2019).">Bisig, C., Voss, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. The crux of positive controls - Proinflammatory responses in lung cell models. Toxicology In Vitro. 54, 189-193 (2019).
  8. A newly developed in vitro model of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of nanoparticles. ALTEX. 25, (2008).">Rothen-Rutishauser, B., et al. A newly developed in vitro model of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of nanoparticles. ALTEX. 25, (2008).
  9. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).">Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  10. Differential regulation of MUC5AC/Muc5ac and hCLCA-1/mGob-5 expression in airway epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (6), 523-530 (2005).">Thai, P., Chen, Y., Dolganov, G., Wu, R. Differential regulation of MUC5AC/Muc5ac and hCLCA-1/mGob-5 expression in airway epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (6), 523-530 (2005).
  11. Characterization of air-liquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 51 (2), 6950(2017).">Wu, J., et al. Characterization of air-liquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 51 (2), 6950(2017).
  12. Phospholipid biosynthesis and secretion by a cell line (A549) which resembles type II aleveolar epithelial cells. Biochimica and Biophysica Acta. 530 (2), 197-207 (1978).">Shapiro, D. I., Nardone, L. L., Rooney, S. A., Motoyama, E. K., Munoz, J. L. Phospholipid biosynthesis and secretion by a cell line (A549) which resembles type II aleveolar epithelial cells. Biochimica and Biophysica Acta. 530 (2), 197-207 (1978).
  13. Synthesis of lung surfactant-associated glycoproteins by A549 cells: description of an in vitro model for human type II cell dysfunction. Experimental Lung Research. 6 (3-4), 197-213 (1984).">Balis, J., Bumgarner, S. D., Paciga, J. E., Paterson, J. F., Shelley, S. A. Synthesis of lung surfactant-associated glycoproteins by A549 cells: description of an in vitro model for human type II cell dysfunction. Experimental Lung Research. 6 (3-4), 197-213 (1984).
  14. Surfactant displaces particles toward the epithelium in airways and alveoli. Respiration Physiology. 80 (1), 17-32 (1990).">Schurch, S., Gehr, P., Im Hof, V., Geiser, M., Green, F. Surfactant displaces particles toward the epithelium in airways and alveoli. Respiration Physiology. 80 (1), 17-32 (1990).
  15. Particle Retention in Airways by Surfactant. Journal of Aerosol Medicine. 3 (1), 27-43 (2009).">Gehr, P., Schurch, S., Berthiaume, Y., Hof, V. I., Geiser, M. Particle Retention in Airways by Surfactant. Journal of Aerosol Medicine. 3 (1), 27-43 (2009).
  16. Dendritic Cells and Macrophages Form a Transepithelial Network against Foreign Particulate Antigens. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (6), (2007).">Blank, F., Rothen-Rutishauser, B., Gehr, P. Dendritic Cells and Macrophages Form a Transepithelial Network against Foreign Particulate Antigens. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (6), (2007).
  17. A three-dimensional cellular model of the human respiratory tract to study the interaction with particles. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 32, (2005).">Rothen-Rutishauser, B. M., Kiama, S. G., Gehr, P. A three-dimensional cellular model of the human respiratory tract to study the interaction with particles. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 32, (2005).
  18. An optimized in vitro model of the respiratory tract wall to study particle cell interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (2006).">Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An optimized in vitro model of the respiratory tract wall to study particle cell interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (2006).
  19. Lipopolysaccharide inhalation recruits monocytes and dendritic cell subsets to the alveolar airspace. Nature Communications. 10 (1), 1999(2019).">Jardine, L., et al. Lipopolysaccharide inhalation recruits monocytes and dendritic cell subsets to the alveolar airspace. Nature Communications. 10 (1), 1999(2019).
  20. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).">Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  21. Repeated exposure to carbon nanotube-based aerosols does not affect the functional properties of a 3D human epithelial airway model. Nanotoxicology. 9 (8), 983-993 (2015).">Chortarea, S., et al. Repeated exposure to carbon nanotube-based aerosols does not affect the functional properties of a 3D human epithelial airway model. Nanotoxicology. 9 (8), 983-993 (2015).
  22. Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model. Toxicology In Vitro. 54, 58-66 (2019).">Hilton, G., Barosova, H., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B., Bereman, M. Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model. Toxicology In Vitro. 54, 58-66 (2019).
  23. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicology and Applied Pharmacology. 242, (2010).">Brandenberger, C., et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicology and Applied Pharmacology. 242, (2010).
  24. Single exposure to aerosolized graphene oxide and graphene nanoplatelets did not initiate an acute biological response in a 3D human lung model. Carbon. 137, 125-135 (2018).">Drasler, B., et al. Single exposure to aerosolized graphene oxide and graphene nanoplatelets did not initiate an acute biological response in a 3D human lung model. Carbon. 137, 125-135 (2018).
  25. Carbon nanodots: Opportunities and limitations to study their biodistribution at the human lung epithelial tissue barrier. Biointerphases. 13, (2018).">Durantie, E., et al. Carbon nanodots: Opportunities and limitations to study their biodistribution at the human lung epithelial tissue barrier. Biointerphases. 13, (2018).
  26. Quantitative evaluation of cellular uptake and trafficking of plain and polyethylene glycol-coated gold nanoparticles. Small. 6 (15), 1669-1678 (2010).">Brandenberger, C., et al. Quantitative evaluation of cellular uptake and trafficking of plain and polyethylene glycol-coated gold nanoparticles. Small. 6 (15), 1669-1678 (2010).
  27. Combined exposure of diesel exhaust particles and respirable Soufrière Hills volcanic ash causes a (pro-)inflammatory response in an in vitro multicellular epithelial tissue barrier model. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 67(2016).">Tomašek, I., et al. Combined exposure of diesel exhaust particles and respirable Soufrière Hills volcanic ash causes a (pro-)inflammatory response in an in vitro multicellular epithelial tissue barrier model. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 67(2016).
  28. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 1 (2), 88-93 (2012).">Nazarpour, R., et al. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 1 (2), 88-93 (2012).
  29. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), (2014).">Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), (2014).
  30. The Analysis of CD83 Expression on Human Immune Cells Identifies a Unique CD83+-Activated T Cell Population. Journal of Immunology. 197 (12), 4613-4625 (2016).">Ju, X., et al. The Analysis of CD83 Expression on Human Immune Cells Identifies a Unique CD83+-Activated T Cell Population. Journal of Immunology. 197 (12), 4613-4625 (2016).
  31. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface: A Comparison with Conventional, Submerged Cell-Culture Conditions. BioMed Research International. , 12(2013).">Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface: A Comparison with Conventional, Submerged Cell-Culture Conditions. BioMed Research International. , 12(2013).
  32. Standardized serum-free cryomedia maintain peripheral blood mononuclear cell viability, recovery, and antigen-specific T-cell response compared to fetal calf serum-based medium. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 229-236 (2011).">Germann, A., Schulz, J. C., Kemp-Kamke, B., Zimmermann, H., von Briesen, H. Standardized serum-free cryomedia maintain peripheral blood mononuclear cell viability, recovery, and antigen-specific T-cell response compared to fetal calf serum-based medium. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 229-236 (2011).
  33. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (8), 1176(2009).">Weinberg, A., et al. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (8), 1176(2009).
  34. Culture of animal cells: a manual of basic technique. Freshney, R. I. , Wiley-Liss Inc. 321-334 (2005).">Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. Freshney, R. I. , Wiley-Liss Inc. 321-334 (2005).
  35. Alternatives to animal testing. Yarmush, M. L., Langer, R. S. , Artech House. 239-260 (2010).">Lehmann, A. B. C., Blank, F., Gehr, P., Rothen-Rutishauser, B. Alternatives to animal testing. Yarmush, M. L., Langer, R. S. , Artech House. 239-260 (2010).
  36. Reduction in (pro-)inflammatory responses of lung cells exposed in to diesel exhaust treated with a non-catalyzed diesel particle filter. Atmospheric Environment. 81, 117-124 (2013).">Steiner, S., et al. Reduction in (pro-)inflammatory responses of lung cells exposed in to diesel exhaust treated with a non-catalyzed diesel particle filter. Atmospheric Environment. 81, 117-124 (2013).
  37. Transcriptional Profiling of the Human Monocyte-to-Macrophage Differentiation and Polarization: New Molecules and Patterns of Gene Expression. The Journal of Immunology. 177 (10), 7303(2006).">Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional Profiling of the Human Monocyte-to-Macrophage Differentiation and Polarization: New Molecules and Patterns of Gene Expression. The Journal of Immunology. 177 (10), 7303(2006).
  38. Profibrotic activity of multi-walled carbon nanotubes upon prolonged exposures in different human lung cell types. Applied In Vitro Toxicology. 5 (1), (2019).">Chortarea, S., et al. Profibrotic activity of multi-walled carbon nanotubes upon prolonged exposures in different human lung cell types. Applied In Vitro Toxicology. 5 (1), (2019).
  39. Pulmonary Dendritic Cells in Local Immunity to Inert and Pathogenic Antigens in the Respiratory Tract. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (2), 116-120 (2005).">Holt, P. G. Pulmonary Dendritic Cells in Local Immunity to Inert and Pathogenic Antigens in the Respiratory Tract. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (2), 116-120 (2005).
  40. Comparative Biology of the Normal Lung (Second Edition). Parent, R. A. , Academic Press. 105-117 (2015).">Pinkerton, K. E., Gehr, P., Castañeda, A., Crapo, J. D. Comparative Biology of the Normal Lung (Second Edition). Parent, R. A. , Academic Press. 105-117 (2015).
  41. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).">Crapo, J., Barry, B., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  42. CD163 positive subsets of blood dendritic cells: The scavenging macrophage receptors CD163 and CD91 are coexpressed on human dendritic cells and monocytes. Immunobiology. 211 (6), 407-417 (2006).">Maniecki, M. B., Møller, H. J., Moestrup, S. K., Møller, B. K. CD163 positive subsets of blood dendritic cells: The scavenging macrophage receptors CD163 and CD91 are coexpressed on human dendritic cells and monocytes. Immunobiology. 211 (6), 407-417 (2006).
  43. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (6), 1083-1090 (2000).">Chignard, M., Balloy, V. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (6), 1083-1090 (2000).
  44. Regulation of Airway Tight Junctions by Proinflammatory Cytokines. Molecular Biology of the Cell. 13 (9), 3218-3234 (2002).">Coyne, C. B., et al. Regulation of Airway Tight Junctions by Proinflammatory Cytokines. Molecular Biology of the Cell. 13 (9), 3218-3234 (2002).
  45. Biodistribution of single and aggregated gold nanoparticles exposed to the human lung epithelial tissue barrier at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 14 (49), (2017).">Durantie, E., et al. Biodistribution of single and aggregated gold nanoparticles exposed to the human lung epithelial tissue barrier at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 14 (49), (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

makrofagi pochodz ce z monocyt wkom rki dendrytycznegranica powietrze cieczuwalnianie cytokinmonocyty krwi obwodowejinserty do hodowli kom rkowychbod ce prozapalne

Powiązane artykuły