Artykuł metodologiczny

Wielokomórkowy model wyrostka zębodołowego człowieka złożony z komórek nabłonka i pierwotnych komórek odpornościowych do oceny zagrożeń

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61090

⸱

6 maja 2020

 ,  ,  , 
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół pierwotnej izolacji monocytów ludzkiej krwi, jak również ich różnicowania na makrofagi i komórki dendrytyczne oraz łączenia z komórkami nabłonkowymi w wielokomórkowy model ludzkiego płuca. Porównano reakcje biologiczne kokultur złożonych z komórek odpornościowych zróżnicowanych ze świeżo wyizolowanych lub rozmrożonych monocytów, po ekspozycji na bodźce prozapalne.

Streszczenie

Model kokultury ludzkich komórek pęcherzykowych jest tutaj opisany do symulacji bariery tkankowej nabłonka pęcherzyków płucnych składającej się z komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu II i dwóch typów komórek odpornościowych (tj. makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów [MDM] i komórek dendrytycznych [MDDC]). Dostępny jest protokół montażu modelu wielokomórkowego. Komórki nabłonka pęcherzyków płucnych (linia komórkowa A549) są hodowane i różnicowane w warunkach zanurzonych na przepuszczalnych wkładkach w studzienkach dwukomorowych, a następnie łączone ze zróżnicowanymi MDM i MDDC. Na koniec komórki są wystawione na działanie granicy faz powietrze-ciecz przez kilka dni. Ponieważ ludzkie pierwotne komórki odpornościowe muszą być izolowane z ludzkiej kożuchy koralowej, komórki odpornościowe zróżnicowane ze świeżych lub rozmrożonych monocytów są porównywane w celu dostosowania metody do potrzeb eksperymentalnych. Trójwymiarowe modele, złożone z komórek pęcherzyków płucnych ze świeżo wyizolowanymi lub rozmrożonymi komórkami odpornościowymi pochodzącymi z monocytów, wykazują statystycznie istotny wzrost uwalniania cytokin (interleukiny 6 i 8) po ekspozycji na bodźce prozapalne (lipopolisacharyd i czynnik martwicy nowotworu α) w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Z drugiej strony nie ma statystycznie istotnej różnicy między uwalnianiem cytokin obserwowanym w kokulturach. Pokazuje to, że prezentowany model reaguje na bodźce prozapalne w obecności MDM i MDDC zróżnicowanych od świeżych lub rozmrożonych monocytów krwi obwodowej (PBM). Jest to zatem potężne narzędzie do badań nad ostrą reakcją biologiczną na różne substancje, w tym leki w aerozolu czy nanomateriały.

Wprowadzenie

Hodowle komórek płuc in vitro oferują opłacalne, solidne i dobrze kontrolowane platformy do oceny zagrożeń związanych z aerozolami1. Jako modelowy system komórkowy dla ludzkich pneumocytów pęcherzykowych często stosuje się nabłonkową linię komórkową A549 wyizolowaną z gruczolakoraka płuc2. Komórki te reprezentują płaskonabłonkowe komórki nabłonkowe typu II z obszaru pęcherzyka płucnego3 i są szeroko stosowaną linią komórkową płuc do oceny zagrożeń i toksyczności1,4,5,6,7,8,9,10. Linia komórkowa A549 posiada istotne cechy komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu II, takie jak obecność charakterystycznych ciał blaszkowatych zawierających gęsto upakowane fosfolipidy3.

Wykazano, że gdy komórki są hodowane na granicy powietrze-ciecz (ALI), środek powierzchniowo czynny jest uwalniany po wierzchołkowej stronie komórek nabłonkowych narażonych na działanie powietrza, zmniejszając napięcie powierzchniowe11,12,13. Cecha ta jest szczególnie ważna w badaniach zagrożeń dla układu oddechowego i toksyczności nanomateriałów. Gdy wdychane nanomateriały/substancje toksyczne zostaną zdeponowane w okolicy pęcherzyków płucnych, najpierw wchodzą w interakcję z płucnym środkiem powierzchniowo czynnym i są przemieszczane przez siły zwilżające do hipofazy wodnistej, gdzie zachodzi interakcja z komórkami płucnymi14,15. Mimo że komórki A549 tworzą monowarstwę (która może rozrastać się do wielowarstw w późniejszych punktach czasowych, gdy są hodowane w ALI) i wytwarzają środek powierzchniowo czynny, wadą jest ich niewystarczające tworzenie ścisłego połączenia, co skutkuje niskimi wartościami transepitelowego oporu elektrycznego, ale nadal stanowi funkcjonalną barierę przed translokacją międzykomórkowych (nano)cząstek16,17,18.

W płucach znajduje się różnorodność populacji komórek odpornościowych, w tym fagocytarne i profesjonalne komórki prezentujące antygen (tj. makrofagi i komórki dendrytyczne), które bezpośrednio komunikują się poprzez kontakt komórka-komórka lub sygnalizację międzykomórkową w celu kontroli i utrzymania homeostazy. Makrofagi i komórki dendrytyczne są krytycznymi wrodzonymi efektorami immunologicznymi i inicjatorami adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej19. Komórki dendrytyczne znajdujące się wewnątrz lub pod nabłonkiem mogą tworzyć wypukłości w poprzek nabłonka do światła, aby wyłapać antygeny. Makrofagi pęcherzykowe znajdują się na wierzchołkowej powierzchni nabłonka i działają jako komórki wartownicze, stanowiąc pierwszą obronę komórkową przed ciałami obcymi, a także infekcjami bakteryjnymi, wirusowymi i grzybiczymi. Ich plastyczność fenotypowa pozwala na szybką indukcję reakcji prozapalnych w odpowiedzi na takie bodźce, a także przejście do wyzwalania reakcji przeciwzapalnych (tj. hamujących)20.

Aby zasymulować ludzką barierę tkankową nabłonka pęcherzyków płucnych, stworzyliśmy model potrójnej kokultury z komórkami A549 uzupełnionymi makrofagami pochodzącymi z monocytów ludzkiej krwi (MDM) i komórkami dendrytycznymi (MDDC) odpowiednio po stronie wierzchołkowej i podstawnej17. Uprawa tego modelu w ALI była już wcześniej zgłaszana16, nawet do 72 godzin po ekspozycji21. Ostra odpowiedź immunologiczna na ekspozycję na nanorurki węglowe była znacznie wzmocniona w hodowli komórkowej wystawionej na działanie ALI w porównaniu z warunkami zanurzenia22. Model kokultury, hodowany i wystawiony na działanie różnych materiałów w ALI, był wcześniej używany do badania cytotoksyczności, stresu oksydacyjnego i reakcji zapalnych po ekspozycji na tlenek,23 materiały związane z grafenem24, nanocząstki złota25,26, nanorurki węglowe21, oraz pył wulkaniczny i cząstki spalin z silników wysokoprężnych27.

Ponadto, potwierdzono ważną rolę makrofagów i komórek dendrytycznych jako komórek efektorowych układu odpornościowego w modelu ludzkich płuc in vitro. W szczególności zwiększoną odpowiedź prozapalną w modelu zaobserwowano tylko w obecności komórek odpornościowych w porównaniu z systemami monokulturowymi7. Potencjalnymi wadami stosowania pierwotnych komórek odpornościowych pochodzących z monocytów są ograniczona dostępność PBM, a także zmienność między dawcami. Jako rozwiązanie tych potencjalnych wad, przedstawiono tutaj protokół wprowadzający kriokonserwację świeżo wyizolowanych PBM28 do montażu modelu hodowli komórkowej. Celem tego badania jest zademonstrowanie trójwymiarowego modelu tkanki nabłonka wyrostka zębodołowego człowieka, w tym izolacji PBM z ludzkich kożuchów. Reakcję na bodźce prozapalne porównano z modelem złożonym z MDM i MDDC różniących się od świeżych PBM lub zróżnicowanych od zamrożonych/rozmrożonych PBM.

Praca z nieprzetestowanymi próbkami ludzkiej krwi wymaga szczególnej ostrożności, aby zapobiec potencjalnemu przenoszeniu chorób zakaźnych, takich jak HIV (ludzki wirus niedoboru odporności), wirusowe zapalenie wątroby typu B i zapalenie wątroby typu C. Dlatego stosowanie środków ochrony osobistej, takich jak rękawice, fartuchy, maski i ochrona oczu, ma kluczowe znaczenie i musi być zgodne z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej. Zabezpieczenia te zmniejszają ryzyko narażenia skóry lub błon śluzowych na potencjalnie zakaźne płyny. Dodatkowo, dla osób zajmujących się obchodzeniem się z kożuchami i PBM, szczepienie przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu B jest obowiązkowe, a poziom miana przeciwciał przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B we krwi musi przekraczać 100 IU/L (należy spełnić wymagania prawne specyficzne dla danego kraju). Ponadto wszystkie prace muszą być wykonywane w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (należy spełnić wymagania prawne specyficzne dla danego kraju). Podczas realizacji całego protokołu należy przyjąć standardowe środki ostrożności w zakresie zdrowia i bezpieczeństwa związane z pracą w środowisku laboratoryjnym i obsługą hodowli komórek ssaków, w tym obchodzeniem się z odpadami.

Protokół

Praca z wykorzystaniem pierwotnych monocytów wyizolowanych z ludzkiej krwi została zatwierdzona przez komitet Federalnego Urzędu Zdrowia Publicznego Szwajcarii (numer referencyjny: 611-1, Meldung A110635/2) dla Instytutu Adolphe Merkle.

1. Izolacja monocytów krwi obwodowej (PBMs) z ludzkich warstw leukocytarnych

UWAGA: Następująca sekcja opisuje izolację komórek odpornościowych z jednej workowej jednostki 50 mL warstwy leukocytowej (buffy coat), zakupionej w Swiss Transfusion Centre w Bernie w Szwajcarii.

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotować 100 mL buforu do separacji magnetycznej na jedną porcję warstwy leukocytowej (buffy coat): 0,5% [w/v] albuminy surowicy bydlęcej (BSA; w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo [PBS]) z 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i dostosować pH do 7,2 (filtrowanie sterylne przez membranę o rozmiarze oczek 0,22 µm). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez cały czas trwania procedury.
    2. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej (CCM): RPMI 1640 z 10% [v/v] płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% [v/v] L-glutaminy (tutaj 2 mM L-glutaminy) oraz 1% [v/v] penicyliny i streptomycyny (tutaj 100 jednostek/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny).
      UWAGA: Wymagana ilość każdego odczynnika zależy od liczby komórek, które zostaną wysiane w kolejnych krokach.
  2. Izolacja PBM
    UWAGA: Wszelkie szkło i elementy plastikowe muszą zostać wysterylizowane przed użyciem. Ze względów bezpieczeństwa przy pracy z ludzkimi próbkami krwi zaleca się stosowanie elementów plastikowych, aby zmniejszyć ryzyko zranienia szkłem.
    1. Za pomocą nożyczek przeciąć końcówkę węża worka zawierającego warstwę leukocytową.
    2. Rozdzielić warstwę leukocytową, wylewając zawartość worka przez kanał wprost do dwóch stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 mL (~25 mL do każdej).
    3. Delikatnie dolać lub napipetować PBS do probówek, aby osiągnąć objętość 50 mL. Wymieszać zawartość, delikatnie odwracając probówkę 3 razy.
    4. Podzielić mieszaninę warstwy leukocytowej i PBS na cztery nowe stożkowe probówki wirówkowe 50 mL, napipetowując 25 mL mieszaniny do każdej nowej probówki.
    5. Powoli nalać 13 mL medium do gradientu gęstości pod mieszaninę warstwy leukocytowej i PBS, używając pipety serologicznej 10 mL. Odpiąć pełną pipetę z uchwytu i natychmiast zatkać kciukiem górny otwór pipety, aby zapobiec dalszemu wyciekaniu medium do gradientu gęstości do mieszaniny warstwy leukocytowej i PBS.
      UWAGA: Trzymając górny otwór kciukiem, umieścić pełną pipetę na dnie stożkowej probówki wirówkowej tak, aby medium do gradientu gęstości powoli spływało pod mieszaninę warstwy leukocytowej i PBS, pozostawiając około 1 mL medium wewnątrz pipety.
    6. Powtórzyć krok 1.2.5 dla pozostałych trzech probówek zawierających mieszaninę warstwy leukocytowej i PBS.
    7. Wirować wszystkie cztery probówki z mieszaninami przez 20 min przy 1 000 x g i 25 °C w trybie powolnego hamowania. Do wirowania używać uchwytów z pokrywami ochronnymi.
    8. Otworzyć pokrywkę każdej probówki, usunąć górną warstwę zawierającą plazmę i płytki krwi za pomocą pipety serologicznej i zutylizować w pojemniku na ciekłe odpady biologiczne.
    9. Użyć pipety serologicznej do zebrania warstwy mononuklearnych komórek krwi obwodowej, która przejawia się jako biała, mętna, cienka frakcja (~2–3 mm grubości) pomiędzy warstwą plazmy a medium do gradientu gęstości. Osad na dnie zawiera erytrocyty. Należy unikać przenoszenia erytrocytów tworzących najniższą warstwę. Powtórzyć czynność dla wszystkich czterech probówek.
      UWAGA: Mononuklearne komórki krwi obwodowej składają się z PBM i limfocytów. PBM zostaną oddzielone od limfocytów później podczas magnetycznej separacji CD14+.
    10. Zlać mononuklearne komórki krwi obwodowej z czterech probówek do dwóch probówek 50 mL.
    11. Dopełnić obie probówki PBS do 50 mL i przykryć pokrywką.
    12. Pozostałe erytrocyty i plazmę z pierwotnych czterech probówek zutylizować w pojemniku na ciekłe odpady biologiczne.
    13. Wirować obie probówki przez 8 min przy 500 x g i 18–20 °C ze standardową prędkością wirówki.
    14. Po wirowaniu usunąć supernatant pipetą serologiczną i zutylizować w pojemniku na ciekłe odpady biologiczne.
    15. Resuspender komórki w 5 mL PBS za pomocą pipety serologicznej.
    16. Zlać zawiesiny komórkowe do jednej stożkowej probówki wirówkowej 50 mL i dopełnić do 50 mL za pomocą PBS.
    17. Użyć 5 µL zawiesiny komórkowej do policzenia komórek za pomocą licznika komórek metodą wykluczania trypan błękitu (45 µL).
    18. Napipetować 10 µL roztworu trypan błękitu z PBM do komory licznika komórek i policzyć liczbę komórek zgodnie ze standardowym protokołem liczenia. Użyć równania 1 do obliczenia całkowitej liczby komórek, CT.
      Wzór na liczenie komórek, \(c_T = \text{policzone komórki/mL} \times 50\), równanie do obliczenia stężenia.
    19. Po policzeniu komórek zwirnować probówkę 50 mL zgodnie z opisem w kroku 1.2.13.
  3. Selekcja pozytywna CD14
    1. Delikatnie otworzyć pokrywkę każdej probówki, a następnie usunąć i zutylizować supernatant za pomocą pipety serologicznej, nie naruszając osadu.
    2. Dodać obliczoną ilość (Równanie 2) buforu do separacji magnetycznej (tutaj 80 µL buforu na 1 x 107 wszystkich komórek) i resuspender osad komórkowy, pipetując roztwór w górę i w dół.
      Wzór na obliczenie objętości buforu: \( c_T \times 80 / 10^7 = \mu L \), równanie.
    3. Obliczyć za pomocą równania 3 (tutaj 10 µL na 1 x 107 wszystkich komórek) odpowiadającą objętość magnetycznych kulek CD14+ i napipetować odpowiednią ilość.
      Wzór na objętość kulek, cT*10/10^7=µL, równanie do obliczenia objętości w doświadczeniach
    4. Wymieszać dokładnie przez pipetowanie w górę i w dół, zamknąć pokrywkę i inkubować roztwór w temperaturze 4 °C przez 15 min.
    5. Po inkubacji dopełnić probówkę do 50 mL buforem do separacji magnetycznej.
    6. Wirować zgodnie z opisem w kroku 1.2.13.
    7. Odssać i zutylizować supernatant za pomocą pipety serologicznej, nie naruszając osadu komórkowego.
    8. Napipetować odpowiednią ilość buforu do separacji magnetycznej (Równanie 4; tutaj 500 µL buforu na 1 x 108 komórek) i delikatnie wymieszać przez 3-krotne pipetowanie w górę i w dół.
      Równanie objętości buforu, wzór do obliczania objętości buforu w mikrolitrach, analiza naukowa.
    9. Zdezynfekować stację separacji magnetycznej, spryskując ją i wycierając środkiem sterylizującym. Umieścić ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza wraz z kolumną do separacji magnetycznej.
    10. Umieścić kolumnę separacji magnetycznej w polu magnetycznym i postawić pustą stożkową probówkę wirówkową 50 mL bezpośrednio pod kolumną w celu zbierania pozostałości płukania i nieoznakowanych komórek (tj. odpadów).
    11. Przepłukać kolumnę separacji magnetycznej, napipetowując do niej 3 mL buforu do separacji magnetycznej. Nie dopuścić do wyschnięcia kolumny podczas całej procedury.
    12. Przygotować stożkową probówkę wirówkową 15 mL i napipetować 1 mL buforu do separacji magnetycznej.
    13. Nanieść zawiesinę komórkową (przygotowaną w kroku 1.3.8) na kolumnę separacji magnetycznej. W stożkowej probówce wirówkowej 50 mL pod filtrem zebrać nieoznakowane komórki, które przeszły przez kolumnę.
      UWAGA: Nie przekraczać 2 x 109 komórek na kolumnę, aby uniknąć jej zapchania.
    14. Gdy tylko zbiornik kolumny zostanie opróżniony (tj. gdy komórki przejdą przez kolumnę), nanieść 3 mL buforu do separacji magnetycznej za pomocą pipety serologicznej i pozwolić mu przepłynąć przez kolumnę. Powtórzyć tę czynność 3 razy.
    15. Zdjąć kolumnę separacji magnetycznej z separatora magnetycznego, delikatnie pociągając ją rękami, a następnie umieścić ją w probówce 15 mL zawierającej wcześniej napipetowany 1 mL buforu do separacji magnetycznej (przygotowany w kroku 1.3.12).
    16. Dodać 5 mL buforu do separacji magnetycznej do kolumny i wypłukać magnetycznie oznakowane komórki, mocno wpychając tłok do kolumny.
  4. Przygotowanie odczynników do różnicowania MDM i MDDC
    1. Policzyć komórki za pomocą licznika komórek metodą wykluczania trypan błękitu, zgodnie z krokiem 1.2.17.
    2. Obliczyć wymagane objętości CCM lub FBS dla kolejnych kroków w następujący sposób: albo objętość CCM odpowiadającą gęstości komórek 1 x 106 komórek/mL (krok 1.5.1), albo objętość FBS odpowiadającą gęstości komórek 6 x 106 komórek na 0,9 mL FBS (krok 1.6.3).
      Wzory na liczenie komórek, równania do obliczenia objętości CCM i FBS, instrukcja przygotowania laboratoryjnego.
    3. Zamknąć pokrywkę, umieścić probówkę w wirówce i wirować zgodnie z krokiem 1.2.13. Usunąć i zutylizować supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Przejść do kroku 1.5 w celu wysiania komórek lub do kroku 1.6 w celu mrożenia komórek.
  5. Wysiewanie PBM i różnicowanie do MDM i MDDC
    1. Resuspender osad komórkowy w obliczonej objętości CCM (obliczonej w kroku 1.4.2; tutaj końcowe stężenie 1 x 106 komórek/mL) przez 3-krotne pipetowanie w górę i w dół.
    2. Napipetować liczbę komórek przeznaczonych do różnicowania w MDM i MDDC do oddzielnych stożkowych probówek wirówkowych za pomocą pipety serologicznej.
    3. Dodać czynniki różnicujące do CCM z PBM i dobrze wymieszać przez pipetowanie w górę i w dół. Czynniki różnicujące są dodawane w następujący sposób:
      1. Dla MDDC: końcowe stężenie 10 ng/mL interleukiny-4 (IL-4) i 10 ng/mL granulocytowo-makrofagalnego czynnika stymulującego kolonie (GM-CSF).
      2. Dla MDM: końcowe stężenie 10 ng/mL makrofagalnego czynnika stymulującego kolonie (M-CSF).
    4. Napipetować zawiesiny komórkowe w CCM z dodanymi czynnikami różnicującymi do płytek 6-dołkowych, rozdzielając 3 mL zawiesiny na dołek (co odpowiada 3 x 106 komórkom/dołek, tj. 1 x 106 komórkom/mL).
    5. Umieścić płytki 6-dołkowe w inkubatorze do hodowli komórkowej (37 °C, 5% CO2) i pozostawić do różnicowania przez 6 dni bez odświeżania CCM.
      UWAGA: Czas różnicowania wynosi od 5 do 8 dni w zależności od lokalnej dostępności warstw leukocytowych i ustawień eksperymentalnych, pod warunkiem, że wydajność różnicowania zostanie określona za pomocą odpowiednich technik (patrz sekcja dyskusji).
  6. Mrożenie PBM
    1. Resuspender osad komórkowy w medium krioprotekcyjnym (tutaj FBS i siarczek dimetylu [DMSO; cytotoksyczny]) w stosunku 9:1 (v/v), pipetując objętość uprzednio ogrzanego FBS. Odpowiada to końcowemu stężeniu komórek 6 x 106 komórek/mL, biorąc pod uwagę dalszy dodatek 10% DMSO (v/v).
    2. Opisać żądaną liczbę krioprobówek w komorze z laminarnym przepływem powietrza (tj. zapisać datę, kod izolacji i liczbę komórek).
    3. Napipetować 0,9 mL zawiesiny komórkowej w czystym FBS (tutaj 6 x 106 komórek w 0,9 mL FBS) do każdej krioprobówki. Następnie powoli napipetować 0,1 mL DMSO i dobrze wymieszać zawiesinę, 3-krotnie odwracając krioprobówki w górę i w dół.
    4. Przenieść krioprobówki do pojemnika do mrożenia komórek i natychmiast ustawić temperaturę na -80 °C na 24 h.
    5. Po 24 h wyjąć krioprobówki z zamrażarki -80 °C i pojemnika, a następnie umieścić je w zbiorniku z ciekłym azotem odpowiednim do przechowywania komórek.
  7. Rozmrażanie PBM i różnicowanie do MDM i MDDC
    1. Ogrzać wszystkie wymagane odczynniki do 37 °C w kąpieli wodnej (~20–30 min).
    2. Przygotować odpowiednią liczbę płytek 6-dołkowych odpowiadającą liczbie rozmrażanych komórek (tutaj jedna płytka na 1,8 x 107 komórek, tj. 3 krioprobówki). Napipetować 2 mL CCM do każdego dołka w warunkach aseptycznych. Umieścić płytki w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) na 15 min, aby pH się ustabilizowało.
    3. Wyjąć wymaganą liczbę krioprobówek z zamrożonymi komórkami ze zbiornika z ciekłym azotem i delikatnie nimi potrząsnąć w kąpieli wodnej 37 °C (1–2 min), aby zapewnić równomierne rozmrożenie zawiesiny komórkowej.
    4. Wyjąć krioprobówkę z kąpieli wodnej i odkazić środkiem sterylizującym, upewniając się, że środek ten nie wchodzi w kontakt z pokrywką i uszczelką O-ring.

      UWAGA: Od tego momentu wszystkie kroki muszą być wykonywane w warunkach aseptycznych.
    5. Przygotować odpowiednią liczbę stożkowych probówek wirówkowych 15 mL odpowiadającą liczbie rozmrażanych krioprobówek (tutaj 6 x 106 komórek/probówka). Napipetować 9 mL uprzednio ogrzanego CCM do każdej probówki.
    6. Powoli (kropla po kropli) napipetować zawartość krioprobówki do probówki zawierającej CCM. Zamknąć pokrywkę, powtórzyć dla każdej probówki i wirować przy 200 x g przez 5 min ze standardową prędkością wirówki.
    7. Usunąć supernatant, nie naruszając osadu.
    8. Resuspender osad z każdej probówki (zawierającej komórki z jednej krioprobówki) w 2 mL uprzednio ogrzanego CCM, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej (gęstość komórek odpowiadająca 3 x 106 komórkom/mL).
    9. Z każdej probówki napipetować resuspenderane komórki do dwóch dołków (1 mL na dołek) płytki 6-dołkowej zawierającej 2 mL wcześniej przygotowanego CCM, aby osiągnąć gęstość komórek 3 x 106 komórek/dołek (co odpowiada końcowemu stężeniu 1 x 106 komórek/mL). Powtórzyć czynność dla wszystkich pozostałych probówek.
    10. Przystąpić do różnicowania zgodnie z opisem w sekcji 1.5.3.
    11. Umieścić płytki 6-dołkowe w inkubatorze do hodowli komórkowej (37 °C, 5% CO2) i pozostawić do różnicowania przez 6 dni bez odświeżania CCM.

2. Model potrójnej kokultury komórkowej ludzkiej tkanki nabłonka pęcherzyków płucnych

UWAGA: Niniejsza sekcja zawiera instrukcje dotyczące objętości i liczby komórek odpowiadające wkładkom do płytek 12-dołkowych. Rysunek 1 przedstawia proponowany harmonogram montażu modelu.

  1. Wysiewanie komórek nabłonkowych (linia komórkowa A549)
    1. Hodować komórki nabłonkowe zgodnie z zaleceniami dostawcy (ATTC). W skrócie: podkulturujemy komórki w podłożu CCM przy 80% konfluencji (około 2–3 razy w tygodniu).
      UWAGA: Podkulturujemy komórki A549 przez co najmniej cztery pasaże przed stworzeniem modelu kokultury, używając komórek A549 z zakresu pasaży od 5 do 25.
    2. Pipetować 1,5 mL podgrzanego wcześniej podłoża CCM do płytek 12-dołkowych (liczba dołków odpowiada pożądanej liczbie modeli).
    3. Za pomocą sterylizowanych pęset umieścić poszczególne wkładki do hodowli komórkowej w dołkach płytki 12-dołkowej.
    4. Odczepić komórki z kolby zgodnie z protokołem subkultury (tj. używając czynnika odczepiającego, a następnie usuwając go przez wirowanie, jak opisano w kroku 1.2.13). Resuspendować w odpowiedniej objętości CCM, odpowiadającej końcowemu stężeniu komórek A549 (tutaj 50 x 104 komórek/mL; 0,5 mL zawiesiny komórkowej na wkładkę, czyli 25 x 104 komórek/wkładkę, co odpowiada gęstości wysiewu 27,8 x 104 komórek/cm2).
    5. Za pomocą pipety 1 mL nanieść 0,5 mL zawiesiny komórkowej (tj. 25 x 104 komórek/wkładkę) na stronę apikalną wkładki.
    6. Przykryć płytki pokrywkami i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowej (37 °C, 5 % CO2) na 4 dni.
      UWAGA: Regularnie sprawdzać konfluencję komórek A549 pod mikroskopem fazokontrastowym.
  2. Wysiewanie MDDC
    1. Odssać CCM z nieprzylegnymi komórkami z płytek 6-dołkowych zawierających MDDC.
    2. Dodać 1 mL świeżego, podgrzanego wcześniej CCM do każdego dołka.
    3. Używając skrobaka do komórek, odczepić (zeskrobać) przylegające MDDC z każdego dołka, delikatnie przemyć dołki istniejącym 1 mL CCM (3x) i połączyć zawartość w jednej stożkowej probówce do wirowania.
    4. Policzyć komórki za pomocą licznika komórek metodą wykluczania trypan blue, używając 10 μL zawiesiny komórkowej i 10 μL roztworu trypan blue.
    5. Odwirować zawiesinę komórkową zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.2.13.
    6. Obliczyć objętość CCM wymaganą do resuspensji (Równanie 5):
      Wymagana gęstość MDDC = 42 x 104 komórek/mL; każda wkładka wymaga 6,3 x 104 komórek, co odpowiada gęstości wysiewu 7 x 104 komórek/cm2 (tutaj 150 µL dodane do 0,9 cm2 w kroku 2.2.10.).
      Objętość CCM do resuspensji komórek (Vm; Równanie 5):
      Równanie objętości CCM, cT/(42x10^4) mL, wzór obliczeniowy dla procesu chemicznego.
    7. Delikatnie odessać i usunąć CCM z komory górnej płytek 12-dołkowych z rosnącymi wkładkami A549.
    8. Za pomocą sterylizowanych pęset umieścić wkładki z komórkami A549 w pozycji odwróconej w sterylnym naczyniu Petriego. Przygotować stożkową probówkę do wirowania (50 mL) z PBS i zwilżyć skrobak do komórek.
    9. Zeskrobać komórki A549 z powierzchni bazalnej wkładki (czyli z górnej części w pozycji odwróconej), które powinny przerosnąć przez pory wkładki.
      UWAGA: Płukać skrobak w PBS (przygotowanym w probówce) pomiędzy zeskrobywaniem poszczególnych próbek i utrzymywać go w stanie zwilżonym przez cały czas trwania procedury.
    10. Po wirowaniu (krok 2.2.5) odessać i usunąć nadsącz, a następnie resuspendować osad MDDC w obliczonej ilości CCM (krok 2.2.6) i pipetować w górę i w dół 3x.
    11. Pipetować 150 µL zawiesiny komórkowej na górę każdej wkładki w taki sposób, aby cała powierzchnia bazalna wkładki była równomiernie pokryta cieczą i bez pęcherzyków powietrza.
    12. Przykryć naczynie pokrywką i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowej na 70 min. Odessać CCM z płytek do hodowli komórkowej (w których początkowo znajdowały się wkładki), zutylizować go jako ciekły odpad biologiczny i pipetować 1,5 mL świeżego CCM do każdego dołka. Przykryć płytkę pokrywką i umieścić w inkubatorze (37 °C, 5% CO2).
      UWAGA: Nie przekraczać wspomnianego czasu, aby uniknąć wysuszenia komórek.
    13. Po inkubacji ostrożnie chwycić każdą wkładkę sterylizowaną pęsetą i przenieść je do płytek zawierających CCM w pozycji zwykłej. Przykryć płytkę pokrywką i zwrócić do inkubatora (37°C, 5% CO2).
  3. Wysiewanie makrofagów (MDM)
    1. Wziąć płytki 6-dołkowe zawierające przedróżnicowane MDM. Przenieść je z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza.
    2. Odessać i usunąć CCM z nieprzylegnymi MDM hodowanymi w płytkach 6-dołkowych i pipetować 1 mL świeżego, podgrzanego wcześniej CCM do każdego dołka.
    3. Używając skrobaka do komórek, delikatnie usunąć przylegające MDM z poszczególnych dołków (analogicznie do kroku 2.2.3 dla MDDC).
    4. Pipetować 10 µL trypan blue do dołka lub probówki i dodać 10 µL zawiesiny MDM, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:1 (v/v). Policzyć liczbę MDM zgodnie z odpowiednim protokołem liczenia.
    5. Odwirować zawiesinę komórkową zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.2.13.
    6. Obliczyć wymaganą objętość (Równanie 6):
      Wymagana gęstość MDM = 2,5 x 104 komórek/mL w CCM (tutaj każda wkładka wymaga 1,25 x 104 komórek w 0,5 mL CCM, co odpowiada gęstości wysiewu 1,4 x 104 komórek/cm2).
      Wzór wyznaczania objętości CCM, \(c_T/(2.5 \times 10^{-4})\) mL, równanie do ilościowego oznaczenia roztworu. (6)
    7. Po wirowaniu odessać i usunąć nadsącz, resuspendować osad MDM w obliczonej ilości CCM (krok 2.3.6) i pipetować w górę i w dół 3x.
    8. Ostrożnie pipetować 0,5 mL zawiesiny MDM (przygotowanej w kroku 2.3.7) na ściankę wkładek do hodowli komórkowej z A549 i MDDC (nie bezpośrednio na komórki nabłonkowe) za pomocą pipety 1 mL. Przykryć płytki pokrywkami i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowej (37 °C, 5 % CO2) na 24 h.
  4. Przeniesienie modelu kokultury do interfejsu powietrze-ciecz (ALI)
    1. Po zakończeniu 24-godzinnego (±2 h) okresu inkubacji złożonego modelu w inkubatorze do hodowli komórkowej, odessać i usunąć CCM z części apikalnej i bazalnej wkładek do hodowli komórkowej oraz z dołków.
    2. Używając sterylizowanych pęset, podnieść poszczególne wkładki z dołków i pipetować 0,6 mL świeżego, podgrzanego wcześniej CCM do każdego dołka za pomocą pipety 1 mL. Nie dodawać CCM na stronę apikalną wkładki.
    3. Przykryć płytki pokrywkami i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowej (37 °C, 5 % CO2) na 24 h przed dalszym zastosowaniem.

3. Ekspozycja na wybrane kontrole pozytywne (znane bodźce indukujące odpowiedź prozapalną)

UWAGA: Narażenie modeli kokultury na znany bodziec prozapalny — endotoksynę lipopolisacharyd (LPS)7 oraz cytokinę prozapalną czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α)7 służy do zilustrowania responsywności modelu. Ponadto narażenie na detergent (Triton X-100) jest wykorzystywane do potwierdzenia czułości testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH).

  1. Przygotować roztwory kontroli dodatniej: roztwór zapasu LPS (1 mg/mL w wodzie destylowanej), roztwór zapasu TNF-α (100 μg/mL w wodzie destylowanej) oraz Triton-X 100 (2% [v/v] w PBS).
  2. Po 24 h inkubacji modelu kokultury w warunkach ALI, odessać i usunąć nadsącz z komory dolnej. Za pomocą wysterylizowanej pęsety wyjąć poszczególne inserty z dołków i pipetować 0,6 mL świeżego, uprzednio ogrzanego CCM do każdego dołka.
  3. Przygotować poszczególne roztwory robocze kontroli dodatniej poprzez rozcieńczenie roztworów zapasowych w CCM w stożkowych probówkach wirówkowych w następujący sposób: 1 μg/mL LPS, 1 μg/mL TNF-α oraz 0,2% Triton-X 100. Objętości powinny odpowiadać liczbie badanych insertów (w tym przypadku 100 μL/insert). Dobrze wymieszać roztwory, pipetując je w górę i w dół 3 razy.
  4. Nanieść 100 μL każdego roztworu kontroli dodatniej, powoli pipetując go na ściankę insertu do hodowli komórek. Przykryć płytkę do hodowli pokrywką i umieścić w inkubatorze do hodowli komórek (37 °C, 5% CO2) na 24 h. Po inkubacji, trzymając poszczególne inserty pęsetą, odessać i usunąć ciecz ze strony apikalnej insertu.
  5. Zebrać CCM z komór dolnych i przechowywać w temperaturze 1) 4 °C do dalszej analizy LDH, określającej cytotoksyczność opartą na przerwaniu błony komórkowej, i/lub 2) w temperaturze -80 °C do dalszej analizy uwalniania białek za pomocą testu ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Przeprowadzić analizy zgodnie z zaleceniami dostawcy zestawu.
  6. Po usunięciu CCM, przemyć inserty 3 razy PBS i utrwalić komórki na insertach do hodowli komórek w 4% [w/v] paraformaldehydzie (w PBS, 15 min w temperaturze pokojowej), upewniając się, że obie strony insertu są dobrze pokryte roztworem PFA. Następnie przemyć 3 razy PBS w celu usunięcia PFA. Próbki przechowywać zanurzone w PBS w temperaturze 4 °C do dalszego barwienia immunocytochemicznego (przykład tej metody opisano wcześniej17).

Wyniki

Modele kokultury płuc ludzkich, składające się z pęcherzykowych komórek nabłonkowych oraz komórek odpornościowych, zostały utworzone z wyizolowanych świeżych lub rozmrożonych prekursorów MDDCs i MDMs (w tym przypadku monocytów pochodzących z krwi obwodowej człowieka). Jak przedstawiono na Rysunku 1, komórki A549 zasiano 3 dni po pierwszym etapie obejmującym izolację/rozmrażanie monocytów. Po 6 dniach różnicowania zróżnicowane MDMs miały kształt okrągły, natomiast MDDCs przybrały bardziej wydłużony kształt z widocznymi wypustkami. Występowały one również w formie aglomeratów, szczególnie w przypadku różnicowania ze świeżych monocytów (Rysunek 2, Rysunek 3). Komórki nabłonkowe utworzyły gęstą warstwę komórkową po 3 dniach wzrostu na wkładkach membranowych (Rysunek 4), w momencie tworzenia kokultur. Po 24 h od utworzenia kokultur i dodatkowych 24 h ekspozycji na warunki ALI, kokultury zostały przygotowane do dalszych ekspozycji.

Reaktywność trójwymiarowych modeli kultur komórkowych badano po ekspozycji na znane bodźce prozapalne z wykorzystaniem podejścia pseudo-ALI, zgodnie z wcześniejszym opisem29. Bodźce prozapalne, LPS oraz TNF-α, dodawano w małych objętościach (100 μL) na powierzchnię apikalną modelu komórkowego eksponowanego na powietrze. Równolegle, w celu oceny cytotoksyczności, badano brak przerwania błony za pomocą testu LDH. Zaobserwowano istotny wzrost uwalniania LDH w pożywce CCM w komorze bazalnej po ekspozycji na detergent Triton-X 100, służący jako kontrola pozytywna przerwania błony (Rycina 5). Wyniki te potwierdziły reaktywność modelu na substancję cytotoksyczną, podczas gdy po stymulacji apikalnej TNF-α lub LPS nie odnotowano wzrostu uwalniania LDH.

Możliwą przyczyną różnic w zmierzonych wartościach LDH w próbkach przygotowanych z użyciem świeżych lub wcześniej zamrożonych PBM może być sposób przechowywania próbek. Próbki ze świeżych PBM były przechowywane przez dłuższy czas w temperaturze -80 °C, co mogło doprowadzić do spadku aktywności enzymu LDH. Należy zauważyć, że LDH jest stabilne w CCM jedynie przez maksymalnie 4 dni; dlatego zaleca się przeprowadzenie analizy najpóźniej 2 dni po zebraniu supernatantów. Alternatywnie, supernatenty można zamrozić bezpośrednio po zebraniu. Ważne jest jednak, aby wziąć pod uwagę, że zamrażanie może obniżyć aktywność enzymatyczną LDH.

Sekrecję mediatorów prozapalnych (w tym przypadku TNF-α oraz interleukiny 6 [IL-6] i 8 [IL-8]) do podłoża CCM oznaczono za pomocą testu ELISA. Zaobserwowano statystycznie istotne (p < 0,05, jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA) zwiększenie wydzielania IL-6 i IL-8 w próbkach traktowanych LPS oraz TNF-α w porównaniu z odpowiednimi niepoddanymi działaniu tym czynników komórkami, a także w modelach hodowli komórkowych stworzonych z obu źródeł PBM (Rycina 6). Chociaż stężenia (pg/mL) wszystkich badanych cytokin w podłożu CCM były wyższe w kokulturach składających się ze świeżych PBM, różnice między dwiema kokulturami a monokulturami nie były statystycznie istotne (p > 0,05) (Rycina 6). Aby potwierdzić wartość dodaną modeli kokultur w stosunku do 2D hodowli komórek nabłonkowych, monokultury A549 poddano również działaniu LPS lub TNF-α. Zgodnie z przewidywaniami, wydzielanie wszystkich badanych mediatorów z monokultur A549 było niższe w porównaniu z oboma modelami kokultur; różnica ta nie była jednak statystycznie istotna (p > 0,05, jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA).

Morfologię komórkową trójwymiarowej (3D) bariery tkanki nabłonka pęcherzyków płucnych człowieka oceniono za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej (LSM). Aby zwizualizować skład każdego modelu, makrofagi w modelach kokultury (MDMs) barwiono markerem dojrzałych makrofagów 25F9. Komórki MDDCs barwiono CD83, który jest istotnym markerem aktywowanych komórek dendrytycznych30. W zakresie morfologii komórkowej nie zaobserwowano różnic między modelami kokultury z wykorzystaniem MDMs i MDDCs pochodzących ze świeżych PBM a tymi z wykorzystaniem rozmrożonych PBM. W kokulturach poddanych działaniu LPS i TNF-α, składających się zarówno ze świeżych, jak i zamrożonych komórek odpornościowych, w obrazach LSM zaobserwowano przerwaną warstwę nabłonka, co nie wystąpiło w przypadku komórek niepoddanych badaniu (Rysunek 7, Rysunek 8).

Schemat osi czasu różnicowania dla kokultury MDMs/MDDCs i A549 w modelu ALI do badań narażenia.
Rycina 1: Schematyczna oś czasu protokołu. Przedstawienie przygotowania, montażu i zastosowania (narażenia na badaną substancję) modelu kokultury 3D. ALI = interface powietrze-ciecz, MDDCs = dendrytyczne komórki pochodzenia monocytarnego, MDMs = makrofagi pochodzenia monocytarnego, PBMs = monocyty krwi obwodowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie wzrostu komórek; obrazy mikroskopowe a) niska gęstość, b) wysoka gęstość; pasek skali 100µm.
Rycina 2: MDMs i MDDCs zróżnicowane ze świeżych PBMs. Obraz mikroskopiiz fazokontrastowej zróżnicowanych (A) MDMs i (B) MDDCs ze świeżych PBMs (6 dni po izolacji komórek). MDMs mają kształt okrągły, podczas gdy MDDCs często występują w postaci aglomeratów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie wzrostu komórek pod mikroskopem; analiza proliferacji komórek, obrazy pokazują skalę 100 µm.
Rysunek 3: MDM i MDDC zróżnicowane z zamrożonych PBM. Obraz mikroskopii kontrastowej zróżnicowanych (A) MDM oraz (B) MDDC z rozmrożonych PBM (6 dni po rozmrożeniu). MDM mają kształt okrągły, choć można zaobserwować niektóre komórki wydłużone. MDDC również wydają się mieć kształt okrągły z wypustkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Przekrój histologiczny tkanki pod mikroskopem; struktura komórkowa; analiza mikroskopowa; pasek skali 100 µm.
Rysunek 4: Wzrost komórek nabłonkowych na wkładkach membranowych. Obraz z mikroskopiiz fazowo-kontrastowej konfluencyjnych komórek A549 rosnących na wkładce membranowej 4 dni po wysianiu, tworzących gęstą warstwę komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres uwalniania LDH w modelu kokultury z wykorzystaniem MDMs i MDDCs z PBMs; porównanie LPS, TNF-α oraz Triton-X.
Rysunek 5: Wyniki cytotoksyczności zbadanej za pomocą testu opartego na pękaniu błony (LDH). Dane przedstawiono jako krotność wzrostu w stosunku do komórek niepoddanych działaniu czynników (średnia ± SD, n = 3, gwiazdka oznacza statystycznie istotny wzrost w porównaniu z komórkami niepoddanymi działaniu czynników, **p < 0,01, ****p < 0,0001). Kolorem zielonym oznaczono modele MDMs i MDDCs ze świeżych PBMs, a kolorem fioletowym modele zbudowane z rozmrożonych PBMs. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy modelu kokultury: uwalnianie TNF-α, IL-6, IL-8 z MDMs, MDDCs; stymulacja LPS, TNF-α.
Rycina 6: Reakcje prozapalne w kokulturach i monokulturach. Uwalnianie mediatorów prozapalnych (TNF-α, IL-6 oraz IL-8) w kokulturach po 24 h stymulacji LPS lub TNF-α. Dane przedstawiono w stosunku do komórek niepoddanych działaniu czynników (średnia ± SD, n = 3, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001). Kolorem zielonym oznaczono modele MDMs i MDDCs z新鮮 PBMs, a kolorem fioletowym modele złożone z rozmrożonych PBMs. Kolor szary reprezentuje monokultury A549. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna komórek nieleczonych oraz leczonych LPS i TNF-α; porównanie strony apikalnej i bazalnej.
Rysunek 7: Morfologia kokultur składających się ze świeżych komórek odpornościowych.Obrazy LSM stron apikalnej i bazalnej modelu kokultury z projekcjami xz stron apikalnych modelu z wykorzystaniem MDMs i MDDCs ze świeżych PBMs. Kolor cyjan reprezentuje jądra komórkowe (DAPI), magenta reprezentuje cytoszkielet (rodamina-faloidyna), biały reprezentuje MDMs (25F9), a zielony reprezentuje MDDCs (CD 83). Biała strzałka wskazuje MDM, natomiast zielona strzałka wskazuje MDDC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia konfokalna nieleczonych i leczonych komórek nabłonkowych, porównanie stron apikalnej i bazalnej.
Rycina 8: Morfologia kokultur składających się z zamrożonych komórek odpornościowych. Obrazy LSM strony apikalnej modelu kokultury z odpowiadającymi im projekcjami xz oraz strony bazalnej modelu z wykorzystaniem MDMs i MDDCs z rozmrożonych PBMs. Kolor cyjan oznacza jądra (DAPI), magenta oznacza cytoszkielet (rodamina-falloidyna), biały oznacza MDMs (25F9), a zielony oznacza MDDCs (CD 83). Biała strzałka wskazuje MDM, natomiast zielona strzałka wskazuje MDDC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Pojawiająca się produkcja nowych materiałów, w tym chemikaliów i leków, stopniowo zwiększa zapotrzebowanie na predykcyjne modele in vitro. Aby zachować zgodność z trzema zasadami zastępowania, redukcji i udoskonalania testów na zwierzętach32, modele komórkowe in vitro stały się potężnymi narzędziami w aspekcie zastępowania i redukcji w celu wyjaśnienia mechanizmów działania leku lub materiału 8,9,10,11. Przedstawiono tutaj szczegółowy protokół składania modelu wielokomórkowego przy użyciu komórek odpornościowych, które są świeżo wyizolowane lub rozmrożone z wcześniej zamrożonych monocytów. Opisana jest również uprawa modelu w ALI. Wreszcie, protokół ilustruje przykład ekspozycji na bodźce prozapalne i porównuje odpowiedź dwóch modeli zawierających świeże lub mrożone monocyty.

Przeprowadzono różne badania w celu potwierdzenia i uzasadnienia wartości dodanej wynikającej ze zwiększonej złożoności modeli uprawianych i narażonych w warunkach ALI w porównaniu z konwencjonalnym narażeniemw zanurzeniu 7,22,31. Obserwacja wyższej odpowiedzi prozapalnej w kokulturach w porównaniu z monokulturami komórek nabłonkowych potwierdza wcześniejsze badanie. W badaniu wykorzystano przedstawiony model kokultury (stymulowany LPS) i wykazano wyższą odpowiedź na poziomie ekspresji genów TNF i IL1B w porównaniu z równoważnym modelem monokultury A5497. Z drugiej strony, oba modele wykazały większe różnice w zmierzonych wartościach uwalniania mediatorów prozapalnych w porównaniu z monokulturami A549. Można to wytłumaczyć wykorzystaniem komórek odpornościowych od różnych dawców (buffy coats) w ramach powtórzeń biologicznych (tj. jedno powtórzenie, jeden dawca), jak pokazano wcześniej7. W razie potrzeby różnice między powtórzeniami można przezwyciężyć poprzez 1) użycie rozmrożonych PBM od tego samego dawcy lub 2) zebranie PBM od różnych dawców przed zamrożeniem komórek, a następnie użycie tej samej puli w każdym powtórzeniu. Zalecane jest również włączenie większej liczby powtórzeń biologicznych.

Technikę zamrażania komórek można uznać za krytyczny krok; Jest to jednak powszechna procedura laboratoryjna służąca do konserwacji komórek do analizy fenotypowej i funkcjonalnej. Różne badania wykazały, że jakość zamrożonych PBM ma kluczowe znaczenie dla ich przeżycia, a odpowiednia technika zamrażania jest kluczem do sukcesu kolejnych testów na tych samych komórkach 28,32. Modyfikacja protokołu może być przeprowadzona poprzez zamrożenie PBM, co zapewnia elastyczność w konfiguracji eksperymentalnej, ponieważ dostępność buffy coats jest zwykle ograniczona. Kolejną zaletą stosowania mrożonych PBM (w kilku fiolkach) w porównaniu ze świeżo wyizolowanymi jest to, że można je stosować w kolejnych eksperymentach nawet po 1 roku. Zmniejsza to potencjalny problem zmienności między dawcami, jeśli jest to pożądany lub wymagany parametr w eksperymencie.

Wyniki porównania międzylaboratoryjnego przeprowadzonego po upływie do 13 miesięcy pokazują, że PBM, jeśli są prawidłowo przechowywane w zbiorniku z ciekłym azotem, mogą być używane przez długi czas bez żadnego wpływu na żywotność komórek lub ich regenerację33. Dłuższy czas przechowywania (ponad 1 rok) może być możliwy po dokładnej walidacji żywotności komórek i reakcji komórek przed przeprowadzeniem eksperymentu. Ponadto temperatura w zbiorniku ciekłego azotu musi być przez cały czas stabilna. Stwierdzono, że głównym czynnikiem wpływającym na żywotność kriokonserwowanych PBM jest stężenie DMSO, przy optymalnym stężeniu 10%–20% (v/v)28. Aby zminimalizować potencjalnie szkodliwe skutki zamrażania, do podłoża zamrażającego często dodaje się różne źródła białek, FBS lub BSA (o szerokim zakresie stężeń od 40% do 100%34) jako naturalne składniki ochronne, które mogą zwiększyć przeżywalność komórek.

Ze względu na wysoki potencjał cytotoksyczny DMSO, zaleca się najpierw dyspersję PBM w FBS, a następnie dodanie DMSO do PBM już zdyspergowanych w FBS. Warto zauważyć, że chociaż wyższe stężenia FBS (>40%) nie wykazały żadnej poprawy żywotności komórek, jednocześnie nie spowodowały uszkodzenia komórek28. Niemniej jednak zamrażanie monocytów jest możliwym podejściem do przezwyciężenia problemów związanych z ograniczoną dostępnością kożuchówki. Jeśli jednak pożądane jest użycie MDDC i MDM ze świeżych PBM, komórki odpornościowe mogą być różnicowane i wykorzystywane 5-8 dni po izolacji 7,16,17,35,36,37. Jeśli pozwala na to planowanie eksperymentalne, zaleca się co najmniej 6 dni różnicowania zarówno w MDDC, jak i MDM. Jednak spójność między różnymi powtórzeniami w tym samym eksperymencie, wraz z rutynowymi kontrolami ich specyficznych wyrażeń znaczników powierzchniowych, ma kluczowe znaczenie. Należy również regularnie sprawdzać reakcję na bodziec prozapalny, taki jak LPS, po czasie różnicowania.

Wiele badań z wykorzystaniem linii komórkowej A549 przeprowadzono w ALI, zarówno jako monokulturę, jak i w połączeniu z innymi typami komórek (makrofagami, komórkami dendrytycznymi lub fibroblastami) w modelu kokultury 3D 22,24,29,38. Korzystając z tego modelu kokultury 3D, badano cytotoksyczność, stres oksydacyjny lub działanie prozapalne (nano)materiałów przez okres do 72 godzin 1,17,21,24,29. Podobieństwo modelu do tkanki in vivo było wcześniej badane na podstawie konfokalnego obrazowania skaningowego za pomocą skaningu laserowego modelu16. Podczas składania modelu ważne jest, aby wziąć pod uwagę zarówno proliferację komórek (która może wpływać na A549 w przedstawionym tutaj modelu), jak i wydajność pierwotnych (nie proliferujących) komórek odpornościowych (w tym przypadku MDDC i MDM). Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że nie wszystkie monocyty CD14-dodatnie różnicują się w MDDC i MDM oraz że komórki mogą być obecne zarówno w formie przyłączonej, jak i zawieszonej. Ze względu na charakter zespołu kokultury (w tym przypadku oba typy komórek muszą przyłączyć się do istniejącej warstwy nabłonka), zaleca się stosowanie tylko przylegających subpopulacji obu typów komórek odpornościowych. Ponadto rutynowe analizy monocytów, reakcji monokultur MDDC i MDM na LPS oraz ekspresji specyficznych markerów powierzchniowych (CD14, CD163, CD86, CD93 lub CD206, dane nie pokazane) sugerują, że 6 i 7 dni różnicowania są optymalnymi punktami czasowymi.

Chociaż realistyczna liczba komórek nabłonka pęcherzyków płucnych w ludzkich płucach odpowiada ~160 000 komórek/cm2, liczba komórek A549 zliczonych w modelu wynosi ~1 000 000 komórek/cm2 po 9 dniach hodowanych na wkładce16,18. W związku z tym należy wziąć pod uwagę ograniczenia tego modelu in vitro. Po pierwsze, gęstość komórek nabłonkowych ustalono na podstawie ich zdolności do tworzenia warstwy zlewającej się na rosnącej błonie. Należy również wspomnieć, że A549 reprezentuje nabłonkową komórkę typu II o prostopadłościennej formie, w przeciwieństwie do komórek nabłonkowych typu I, które są płaskie i rozproszone. Z drugiej strony, wymagana liczba komórek odpornościowych została ustalona na podstawie literatury i przedstawiona w niniejszym protokole jako liczba komórek/powierzchnia 39,40,41. Gęstość komórek MDDC w zakresie 400 komórek/mm2 (4 komórki/cm2)16 jest porównywalna z gęstością komórek w stanie ustalonym wynoszącą 500–750 komórek/mm2 (5-7 komórek/cm2) opisaną w badaniach in vivo39. Gęstość MDM w tym modelu mieści się w tym samym zakresie, co w sytuacji in vivo w ludzkim obszarze pęcherzykowym40.

Barwienie markerami dojrzałych makrofagów (25F9) obserwowano zarówno po stronie wierzchołkowej (gdzie obecne są MDM), jak i po stronie podstawowej (tj. w miejscu komórek dendrytycznych). Translokacja komórek odpornościowych przez pory wstawiania błony jest możliwa i została również zaobserwowana przy użyciu tego modelu16, co może wyjaśniać obserwowane różnice w intensywności barwienia. Jednak innym możliwym wyjaśnieniem jest to, że dojrzały marker makrofagowy może również ulegać ekspresji na komórkach dendrytycznych, ale ekspresja jest wysoce specyficzna dla dawcy42. Ponadto intensywność ekspresji 25F9 jest znacznie wyższa w MDM (Rysunek 7, Rysunek 8). Oba bodźce prozapalne (LPS i TNF-α) wpłynęły na integralność bariery nabłonkowej płuc w obu kokulturach (ryc. 7, ryc. 8). Oczekiwano tego na podstawie wcześniejszych publikacji43,44 pokazujących, że cytokiny prozapalne i produkty bakteryjne zaburzają integralność barier nabłonkowych.

Wielokomórkowy model 3D ludzkiego nabłonka wyrostka zębodołowego, ustalony i scharakteryzowany wcześniej17, posłużył jako potężne i użyteczne narzędzie do oceny odpowiedzi biologicznych (tj. ostrych reakcji prozapalnych, odpowiedzi na stres oksydacyjny, rozmieszczenia cząstek i komunikacji komórkowej) in vitro 21,24,25,45. Wyniki potwierdzają responsywność modeli kokultury na bodźce prozapalne (w tym przypadku LPS i TNF-α). Odpowiedź była nieznacznie zwiększona w przypadku stosowania komórek odpornościowych ze świeżych PBM; jednak nie było statystycznie istotnej różnicy między kokulturami używającymi świeżych i rozmrożonych PBM. Co więcej, reakcje prozapalne w obu modelach kokultury były wyższe niż w monokulturach komórek nabłonka hodowanych w tych samych warunkach (ALI). Podsumowując, protokół opisuje montaż 3D modelu kokultury tkanki nabłonka ludzkich pęcherzyków płucnych przy użyciu świeżych lub rozmrożonych PBM do różnicowania na MDM i MDDC. Wykazano, że oba modele są wysoce wrażliwe na bodźce prozapalne; W związku z tym mogą służyć jako potężne narzędzia do oceny potencjalnych zagrożeń i toksyczności.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Miguelowi Spuch-Calvarowi za schemat kokultury na rysunku 3 oraz dr Bedii Begum Karakocak za krytyczną lekturę. Badanie było wspierane przez projekt PATROLS, program Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 760813, oraz przez Fundację Adolphe'a Merkle'a. B.D. dziękuje fundacji Peter und Traudl Engelhorn za wsparcie finansowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wzorcowy czytnik mikropłyteknie musi być specyficzny, na przykład BioRad, Cressier, Szwajcaria
Inkubator do hodowli komórkowychnie musi być specyficzny
Pojemnik do zamrażania komórek (na przykład Mr. Frosty)nie musi być specyficzny
Wirówkanie musi być specyficzna
Konfokalny skan laserowy mikroskopnie musi być specyficzny, na przykładZeiss LSM 710 meta
Heamatocytometr lub automatyczny licznik komóreknie musi być specyficzny
Laminarny kaptur bezpieczeństwa biologicznego klasy IInie musi być specyficzny
MultiStand Macs (Macs Cell Separator)Miltenyi, Niemcy130-042-303
pH-metrmusi być specyficzny
Mikroskop światła odwróconego z kontrastem fazowymnie musi być specyficzny
Pipeta chłopcze, pipety (różne objętości)nie muszą być specyficzne
Nożyczkinie muszą być specyficzne
Pompa próżniowanie musi być specyficzna
Kąpiel wodnanie musi być specyficzna
Jednorazowy drobny sprzęt/szkłoNumer katalogowy
Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml i 50 mlmuszą być specyficzne
6- i 12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, płaskie dno, pokrywka o niskiej parowaniu, sterylnyFalcon, Szwajcaria353046 i 353043
Wkładki do hodowli komórkowych, przezroczysta membrana PET, 12-dołkowa, 3 μ m wielkość porówFalcon, Szwajcaria353181
Skrobak do komóreknie musi być specyficzny, na przykład VWR, Szwajcaria353085
Kriofialenie muszą być specyficzne
Szklane autoklawizowane szalki Petriegonie muszą być określone
LS KolumnyMiltenyi, Niemcy130-042-401
Sterylny kubek filtracyjny do filtracji próżniowej, 0,2 i mu; m wielkość porównie musi być określona, na przykład VWR, Szwajcaria10040-446
Sterylna butelka laboratoryjna kompatybilna z kubkiem filtracyjnym (min. 100 ml)nie musi być specyficzna
Sterylne pipetynie muszą być specyficzne
Chemicals
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich, SzwajcariaA7030-100g
CD14+ Mikrokulki ludzkie - kulki magnetyczneMiltenyi, Niemcy130-097-052
Środek deattachnig Trypsin-EDTA, 0,05%, czerwień fenolowaGibco, Szwajcaria25300054
Gradient gęstości średni LymphoprepAlere Technologies AS, Norwegia1114547
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma Aldrich, SzwajcariaD2438
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-Aldrich, SzwajcariaE6758-100g
Surowica bydlęca płodu (inaktywowana termicznie)Gibco, Szwajcaria10270-106
Ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), premium klasaMiltenyi, Niemcy130-093-864
Interleukina ludzka 4 (IL-4), klasa premiumMiltenyi, Niemcy130-095-373
Ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), klasa premiumMiltenyi, Niemcy130-096-485
L-glutaminaGibco, Szwajcaria25030-024
Lipopolisacharyd (LPS) z Escherichia coliSigma-Aldrich, Szwajcaria4524-5mg
Paraformaldehydu (PFA)Sigma-Aldrich, Szwajcaria158127
Penicilin-StreptomycinGibco, Szwajcaria15140-122
Bufor fosforanowy Solanka (PBS)Gibco, Szwajcaria10010-015
Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)Gibco, Szwajcaria42401-018
Triton X-100Sigma-Aldrich, SzwajcariaT8787
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)Sigma Aldrich, Szwajcaria
Czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α)Immunotools11343015
Testy stosowane do cytotoksyczności, odpowiedzi (pro)zapalnej
Zestaw do wykrywania cytotoksyczności (LDH)Roche, Szwajcaria11644793001
Ludzki IL-6 DuoSet ELISAR& D, Biotechne, SzwajcariaDY206
Człowiek IL-8/CXCL8 DuoSet ELISAR& D, Biotechne, SzwajcariaDY208
Immunostaining
4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), stężenie 2 μ g/mLSigma-Aldrich, Szwajcaria10236276001
Kozioł anty-mysi IgG (H+L) Alexa Fluor 647 sprzężony, stężenie 20 μ g / mlAbcam, Wielka Brytaniaab150115
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Dylight 488 sprzężone, stężenie 10 μ g/mlAgrisera, SzwecjaAS09 633
Dojrzałe przeciwciało monoklonalne markera makrofagów, stężenie 50 μ g/mleBioScience, Thermo Fischer, Szwajcaria14-0115-82
Rodamina falloidyna, stężenie 0,264 i mikro; MMolecular Probes, Life Technologies, SzwajcariaR415
, rozcieńczenie 1:50Abcam, Wielka Brytaniaab244204
nie nie Rekombinowane przeciwciało anty-CD83

Bibliografia

  1. Rothen-Rutishauser, B., Blank, F., Mühlfeld, C., Gehr, P. In vitro models of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of particulate matter. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (8), 1075-1089 (2008).
  2. Giard, D., et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of National Cancer Institute. 51 (5), 1417-1423 (1973).
  3. Ochs, M., Weibel, E. R., et al. Ch. 2: Functional Design of the Human Lung for Gas Exchange . Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders, 5e. Grippi, M. A., et al. , McGraw-Hill Education. (2008).
  4. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism. Experimental Cell Research. 243 (2), 359-366 (1998).
  5. Guo, X. Y., Lu, M., Chen, X. Q., He, F. D., Li, A. Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 9 (6), 582-586 (2016).
  6. Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS ONE. 11 (10), 0164438(2016).
  7. Bisig, C., Voss, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. The crux of positive controls - Proinflammatory responses in lung cell models. Toxicology In Vitro. 54, 189-193 (2019).
  8. Rothen-Rutishauser, B., et al. A newly developed in vitro model of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of nanoparticles. ALTEX. 25, (2008).
  9. Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  10. Thai, P., Chen, Y., Dolganov, G., Wu, R. Differential regulation of MUC5AC/Muc5ac and hCLCA-1/mGob-5 expression in airway epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (6), 523-530 (2005).
  11. Wu, J., et al. Characterization of air-liquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 51 (2), 6950(2017).
  12. Shapiro, D. I., Nardone, L. L., Rooney, S. A., Motoyama, E. K., Munoz, J. L. Phospholipid biosynthesis and secretion by a cell line (A549) which resembles type II aleveolar epithelial cells. Biochimica and Biophysica Acta. 530 (2), 197-207 (1978).
  13. Balis, J., Bumgarner, S. D., Paciga, J. E., Paterson, J. F., Shelley, S. A. Synthesis of lung surfactant-associated glycoproteins by A549 cells: description of an in vitro model for human type II cell dysfunction. Experimental Lung Research. 6 (3-4), 197-213 (1984).
  14. Schurch, S., Gehr, P., Im Hof, V., Geiser, M., Green, F. Surfactant displaces particles toward the epithelium in airways and alveoli. Respiration Physiology. 80 (1), 17-32 (1990).
  15. Gehr, P., Schurch, S., Berthiaume, Y., Hof, V. I., Geiser, M. Particle Retention in Airways by Surfactant. Journal of Aerosol Medicine. 3 (1), 27-43 (2009).
  16. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B., Gehr, P. Dendritic Cells and Macrophages Form a Transepithelial Network against Foreign Particulate Antigens. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (6), (2007).
  17. Rothen-Rutishauser, B. M., Kiama, S. G., Gehr, P. A three-dimensional cellular model of the human respiratory tract to study the interaction with particles. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 32, (2005).
  18. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An optimized in vitro model of the respiratory tract wall to study particle cell interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (2006).
  19. Jardine, L., et al. Lipopolysaccharide inhalation recruits monocytes and dendritic cell subsets to the alveolar airspace. Nature Communications. 10 (1), 1999(2019).
  20. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  21. Chortarea, S., et al. Repeated exposure to carbon nanotube-based aerosols does not affect the functional properties of a 3D human epithelial airway model. Nanotoxicology. 9 (8), 983-993 (2015).
  22. Hilton, G., Barosova, H., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B., Bereman, M. Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model. Toxicology In Vitro. 54, 58-66 (2019).
  23. Brandenberger, C., et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicology and Applied Pharmacology. 242, (2010).
  24. Drasler, B., et al. Single exposure to aerosolized graphene oxide and graphene nanoplatelets did not initiate an acute biological response in a 3D human lung model. Carbon. 137, 125-135 (2018).
  25. Durantie, E., et al. Carbon nanodots: Opportunities and limitations to study their biodistribution at the human lung epithelial tissue barrier. Biointerphases. 13, (2018).
  26. Brandenberger, C., et al. Quantitative evaluation of cellular uptake and trafficking of plain and polyethylene glycol-coated gold nanoparticles. Small. 6 (15), 1669-1678 (2010).
  27. Tomašek, I., et al. Combined exposure of diesel exhaust particles and respirable Soufrière Hills volcanic ash causes a (pro-)inflammatory response in an in vitro multicellular epithelial tissue barrier model. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 67(2016).
  28. Nazarpour, R., et al. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 1 (2), 88-93 (2012).
  29. Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), (2014).
  30. Ju, X., et al. The Analysis of CD83 Expression on Human Immune Cells Identifies a Unique CD83+-Activated T Cell Population. Journal of Immunology. 197 (12), 4613-4625 (2016).
  31. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface: A Comparison with Conventional, Submerged Cell-Culture Conditions. BioMed Research International. , 12(2013).
  32. Germann, A., Schulz, J. C., Kemp-Kamke, B., Zimmermann, H., von Briesen, H. Standardized serum-free cryomedia maintain peripheral blood mononuclear cell viability, recovery, and antigen-specific T-cell response compared to fetal calf serum-based medium. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 229-236 (2011).
  33. Weinberg, A., et al. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (8), 1176(2009).
  34. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. Freshney, R. I. , Wiley-Liss Inc. 321-334 (2005).
  35. Lehmann, A. B. C., Blank, F., Gehr, P., Rothen-Rutishauser, B. Alternatives to animal testing. Yarmush, M. L., Langer, R. S. , Artech House. 239-260 (2010).
  36. Steiner, S., et al. Reduction in (pro-)inflammatory responses of lung cells exposed in to diesel exhaust treated with a non-catalyzed diesel particle filter. Atmospheric Environment. 81, 117-124 (2013).
  37. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional Profiling of the Human Monocyte-to-Macrophage Differentiation and Polarization: New Molecules and Patterns of Gene Expression. The Journal of Immunology. 177 (10), 7303(2006).
  38. Chortarea, S., et al. Profibrotic activity of multi-walled carbon nanotubes upon prolonged exposures in different human lung cell types. Applied In Vitro Toxicology. 5 (1), (2019).
  39. Holt, P. G. Pulmonary Dendritic Cells in Local Immunity to Inert and Pathogenic Antigens in the Respiratory Tract. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (2), 116-120 (2005).
  40. Pinkerton, K. E., Gehr, P., Castañeda, A., Crapo, J. D. Comparative Biology of the Normal Lung (Second Edition). Parent, R. A. , Academic Press. 105-117 (2015).
  41. Crapo, J., Barry, B., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  42. Maniecki, M. B., Møller, H. J., Moestrup, S. K., Møller, B. K. CD163 positive subsets of blood dendritic cells: The scavenging macrophage receptors CD163 and CD91 are coexpressed on human dendritic cells and monocytes. Immunobiology. 211 (6), 407-417 (2006).
  43. Chignard, M., Balloy, V. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (6), 1083-1090 (2000).
  44. Coyne, C. B., et al. Regulation of Airway Tight Junctions by Proinflammatory Cytokines. Molecular Biology of the Cell. 13 (9), 3218-3234 (2002).
  45. Durantie, E., et al. Biodistribution of single and aggregated gold nanoparticles exposed to the human lung epithelial tissue barrier at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 14 (49), (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

makrofagi pochodz ce z monocyt wkom rki dendrytycznegranica powietrze cieczuwalnianie cytokinmonocyty krwi obwodowejinserty do hodowli kom rkowychbod ce prozapalne
Wielokomórkowy model wyrostka zębodołowego człowieka złożony z komórek nabłonka i pierwotnych komórek odpornościowych do oceny zagrożeń
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.