Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/61100

⸱

7 września 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do utrzymania prawidłowego funkcjonowania i fałdowania proteomu (homeostazy białek) spada podczas normalnego starzenia, co ułatwia pojawienie się coraz większej liczby chorób związanych z wiekiem. Na przykład, białka z ekspansją poliglutaminy są podatne na agregację, czego przykładem jest białko huntingtyny i jednoczesny początek choroby Huntingtona. Związane z wiekiem pogorszenie proteomu zostało szeroko zbadane dzięki zastosowaniu transgenicznych Caenorhabditis elegans wykazujących ekspresję powtórzeń polyQ połączonych z żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP). Ten transgeniczny model zwierzęcy polyQ::YFP ułatwia bezpośrednią kwantyfikację związanego z wiekiem spadku proteomu poprzez obrazowanie postępującego tworzenia ognisk fluorescencyjnych (tj. agregatów białkowych) i późniejszego wystąpienia wad lokomocyjnych, które rozwijają się w wyniku zapadnięcia się proteomu. Co więcej, ekspresja transgenu polyQ::YFP może być sterowana przez promotory specyficzne dla tkanki, co pozwala na ocenę proteostazy w tkankach w kontekście nienaruszonego organizmu wielokomórkowego. Model ten jest wysoce podatny na analizę genetyczną, zapewniając w ten sposób podejście do ilościowego określania starzenia się, które jest komplementarne do testów długości życia. Opisujemy, jak dokładnie zmierzyć powstawanie ognisk polyQ::YFP w neuronach lub mięśniach ściany ciała podczas starzenia się, a następnie wystąpienia defektów behawioralnych. Następnie podkreślamy, w jaki sposób podejścia te można dostosować do wyższej przepustowości i potencjalnych przyszłych zastosowań przy użyciu innych pojawiających się strategii analizy genetycznej C. elegans.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Homeostaza białek (proteostaza) jest definiowana jako komórkowa zdolność do utrzymania prawidłowego funkcjonowania i fałdowania proteomu. Nieodłącznym wyzwaniem dla proteostazy jest zapewnienie, że wszystkie białka są prawidłowo sfałdowane i utrzymywane w natywnej konformacji, która jest dodatkowo wzmacniana przez zróżnicowaną naturę wielkości białka, składu aminokwasowego, konformacji strukturalnej, stabilności, obrotu, ekspresji, kompartmentalizacji subkomórkowej i modyfikacji1. Proteostaza jest utrzymywana dzięki skoordynowanemu działaniu dużej sieci proteostatycznej, składającej się z około 2000 unikalnych białek, które regulują prawidłową syntezę, fałdowanie, transport i degradację w proteomie2,3. Składnikami sieci proteostatycznej jest dziewięć głównych rodzin molekularnych białek opiekuńczych4. Każda tkanka i typ komórki preferencyjnie wykorzystuje określone podzbiory molekularnych białek opiekuńczych, przypuszczalnie zgodnie z różnymi wymaganiami różnych proteomów5.

Jedną z cech charakterystycznych normalnego starzenia się organizmu jest postępujący spadek i załamanie proteostazy komórkowej, która jest uważana za podstawową podstawę początku i progresji rosnącej liczby chorób związanych z wiekiem. Na przykład choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona i stwardnienie zanikowe boczne (ALS) mają wspólną cechę: w każdym przypadku przejawy neurodegeneracji są napędzane przez zmiany genetyczne, które predysponują zmutowane białko do agregacji (amyloid-β/Tau, α-synukleina, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, odpowiednio)6,7,8,9,10. Podczas starzenia się zmniejsza się integralność i indukowalność sieci proteostatycznej, co powoduje akumulację agregatów proteotoksycznych, które skutkują dysfunkcją komórkową i neurodegeneracją. Warto zauważyć, że choroby konformacyjne białek nie są unikalne dla neuronów i występują w wielu tkankach, jak podkreślono w przypadku cukrzycy typu II, szpiczaka mnogiego i mukowiscydozy11,12,13,14. W związku z tym wyjaśnienie mechanizmów zdolnych do zachowania proteostazy ułatwi opracowanie ukierunkowanych interwencji w leczeniu chorób i będzie sprzyjać zdrowemu starzeniu się.

Mały nicień glebowy Caenorhabditis elegans (C. elegans) odegrał kluczową rolę w odkryciu genów i wyjaśnieniu szlaków, które zmieniają proteostazę. Wiele elementów sieci proteostatycznej i szlaków transdukcji sygnału, które regulują proteostazę, jest ewolucyjnie zachowanych. Co więcej, C. elegans ma zmniejszoną złożoność i redundancję w porównaniu z systemami kręgowców, dzięki czemu jest bardziej podatny na analizę genetyczną i odkrywanie genów. Dodatkowe zalety C. elegans, które doprowadziły do jego szerokiego zastosowania jako systemu modelowego do badania proteostazy, obejmują: potężną genomikę genetyczną i funkcjonalną, krótki cykl życia (3 dni) i długość życia (3 tygodnie), zwarty i dobrze opisany genom, dostępność szerokiego asortymentu mutantów genetycznych oraz łatwość wizualizacji specyficznych dla tkanek zmian w biologii komórki za pomocą reporterów fluorescencyjnych.

Postępujący zanik proteostazy podczas starzenia się można łatwo określić ilościowo u C. elegans. Laboratorium Morimoto po raz pierwszy wykazało, że ekspandacja poliglutaminy połączona z żółtym białkiem fluorescencyjnym (polyQ::YFP) może być wykorzystana do ilościowego określenia spadku proteostazy u C. elegans podczas starzenia15,16,17,18. Fuzje YFP z 35 powtórzeniami glutaminy lub więcej powodują związane z wiekiem tworzenie ognisk fluorescencyjnych wraz z objawami patologii komórkowej. Warto zauważyć, że ten zakres ekspansji glutaminy odzwierciedla długość przewodu poliglutaminowego białka huntingtyny, przy którym patologia choroby Huntingtona zaczyna być obserwowana u ludzi (zazwyczaj >35 powtórzeń CAG)19. Szczepy z ekspresją polyQ::YFP w komórkach mięśniowych, jelitowych lub neuronalnych zostały wykorzystane do potwierdzenia, że związany z wiekiem spadek proteostazy występuje w różnych typach komórek i tkanek. Specyficzna dla mięśni ekspresja polyQ::YFP (tj. unc-54p::Q35::YFP) była najczęściej stosowanym reporterem specyficznym dla tkanki, ponieważ akumulujące ogniska fluorescencyjne są łatwe do ilościowego określenia w ciągu pierwszych kilku dni dorosłości za pomocą prostego fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego (Rysunek 1A-1B). Dodatkowo, zwierzęta stają się sparaliżowane w wieku średnim, ponieważ proteom w mięśniu załamuje się z powodu proteotoksycznego działania reportera (Rysunek 1C). Podobnie, związany z wiekiem spadek proteostazy neuronalnej może być śledzony (rgef-1p::Q40::YFP) poprzez bezpośrednie ilościowe określanie powstawania ognisk/agregatów i związanych z wiekiem spadków skoordynowanych zgięć ciała po umieszczeniu zwierząt w płynie (Ryc. 2).

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół, jak mierzyć zależny od wieku postęp akumulacji agregatów białkowych i związaną z tym proteotoksyczność wywołaną ekspresją powtórzeń poliglutaminy w tkance neuronalnej i mięśniowej u C. elegans. Podajemy przykłady typowych wyników uzyskanych przy użyciu tych szczepów i metod. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy te metody do badania regulacji transkrypcji sieci proteostatycznej. Omawiamy dodatkowe sposoby, w jakie te reportery można łatwo zintegrować z innymi istniejącymi odczynnikami lub dostosować do większych ekranów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników

  1. Wybierz interesujące geny, które mają być inaktywowane za pomocą RNAi opartego na żywieniu. Zakup zapasów HT115 E. coli zawierających klon RNAi będący przedmiotem zainteresowania20. Alternatywnie, należy sklonować cDNA interesującego genu do miejsca multiklonowania plazmidu L4440.
    UWAGA: Aby zapobiec degradacji dsRNA w bakteriach, należy użyć szczepu HT115. Jest to szczep E. coli z niedoborem RNazy III z indukowaną przez IPTG aktywnością polimerazy T7. Do badań proteostazy, w których nie wykorzystuje się RNAi opartego na karmieniu, można użyć HT115 lub OP50 E. coli na standardowych płytkach NGM.
  2. Przygotuj płytki o wymiarach 5 x 6 cm na każdy warunek testowy. W przypadku eksperymentów z użyciem RNAi indukuj produkcję dsRNA w przekształconym HT115 E. coli. Do badań bez RNAi można użyć OP50 E. coli na standardowych płytkach NGM (patrz plik uzupełniający 1 dla standardowych receptur płytek NGM i RNAi).
    UWAGA: Płytki RNAi można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy przed wysiewem z bakteriami.
  3. Hodować kultury E. coli przez noc (16-20 godzin) w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 220 obr./min. Hoduj HT115 E. coli w bulionie Luria (LB) z ampicyliną (50 μg/mL).
    UWAGA: Standardowa OP50 E. coli nie jest oporna na antybiotyki, ale dostępne są również warianty oporne na streptomycynę.
    1. Zagęścić bakterie przez odwirowanie przy 2,400 x g przez 15-20 minut w wirówce stołowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1/10 objętości początkowej (tj.10-krotnym stężeniu) LB z ampicyliną dla HT115 lub LB bez ampicyliny dla wzorca OP50.
    2. Podamy 200 μl skoncentrowanych 10 razy bakterii na każdą płytkę (3-4 powtórzenia na warunki testowe, z 2 dodatkowymi płytkami zapasowymi, do użycia w przypadku zanieczyszczenia).
    3. Pozostaw otwarte płytki do wyschnięcia w czystym środowisku, takim jak stół z przepływem laminarnym, aż cała ciecz zostanie wchłonięta, lub pozwól przykrytym płytkom wyschnąć na stole laboratoryjnym przez noc.
  4. W przypadku wysianych płytek RNAi wysuszonych w kapturze, wysuszone płytki należy przechowywać w pojemniku na robaki przez noc (do 24 godzin) w temperaturze pokojowej. Po 1 dniu w temperaturze pokojowej płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni w szczelnie zamkniętej torbie (aby zapobiec wysychaniu płytek). Przed użyciem należy odczekać, aż płytki przechowywane w temperaturze 4 °C powrócą do temperatury pokojowej w woreczku z zamkiem błyskawicznym, aby zapobiec kondensacji przedostającej się zanieczyszczeń grzybowych unoszących się w powietrzu.
    1. W przypadku stosowania RNAi na bazie karmienia, pozostaw wysiane bakterie HT115 na płytkach RNAi w temperaturze pokojowej na co najmniej 12 godzin przed dodaniem C. elegans. Płytki RNAi zawierają IPTG, który indukuje produkcję dsRNA. Alternatywnie, IPTG można dodać do płynnych kultur pod koniec kroku 1.3.1, 2 godziny przed siewem.
    2. Unikaj długotrwałego przechowywania płytek HT115 z nasionami w temperaturze pokojowej (dłużej niż kilka dni), aby uniknąć pękania agaru, które spowoduje zagrzebanie się C. elegans w agarze.

2. Synchronizacja C. elegans

UWAGA: Wybierz, czy synchronizować C. elegans przez alkaliczne traktowanie podchlorynem ciężarnych dorosłych osobników lub składanie jaj.

  1. Synchronizuj zwierzęta poprzez leczenie podchlorynem dorosłych zwierząt, aby przyspieszyć uwalnianie zarodków22.
    1. W celu leczenia podchlorynem należy przemyć grawitacyjne hermafrodyty 2 razy buforem M9, a następnie ponownie zawiesić w 5 ml roztworu podchlorynu (3,25 ml roztworu podchlorynu, 1 ml buforu M9 i 0,75 ml 5 M NaOH) przez 5 minut, wstrząsając zawieszonymi zwierzętami co minutę. Po 5 minutach odwiruj zwierzęta i umyj 3 razy buforem M9.
      UWAGA: Zakłada się, że leczenie podchlorynem wpływa na proteostazę21.
    2. Po poddaniu działaniu podchlorynu pozostawić zarodki do wylęgu się przez noc w 3 ml roztworu M9 z rotacją w temperaturze 20 °C.
    3. Obliczyć gęstość zwierząt L1 (lub alternatywnie zarodków) na μl, wrzucając 10 μl roztworu L1 3x na płytkę o średnicy 6 cm i licząc liczbę zwierząt L1, aby obliczyć średnią liczbę zwierząt L1 na μl. Zwierzęta L1 ustabilizują się z czasem. Dlatego należy okresowo mieszać roztwory L1, aby uniknąć osiadania.
    4. Wysiać 50 zwierząt L1 na płytkę, policzyć i zapisać liczbę wysianych, a następnie przenieść szalki do inkubatora o temperaturze 20 °C. Ważne jest, aby znać rzeczywistą liczbę zwierząt na każdej płytce na początku testu.
      UWAGA: Synchronizacja zwierząt L1 przez nocne wylęg w M9 jest rutynowo stosowana, ponieważ minimalizuje heterogeniczność rozwojową po umieszczeniu zwierząt na żywności. Jednak synchronizacja następuje poprzez zatrzymanie rozwoju w odpowiedzi na sygnały głodu, których w przypadku niektórych badań należy unikać (zobacz23 dla dodatkowej dyskusji). Alternatywnie, z grubsza zsynchronizowane zwierzęta można uzyskać poprzez składanie jaj, patrz 2.2.
    5. Resztki L1 należy zamrozić i przechowywać w ciekłym azocie lub w zamrażarce o temperaturze -80 °C. W ten sposób zachowana jest próbka każdego szczepu w momencie konfiguracji eksperymentalnej, co stanowi cenne źródło informacji dla przyszłych badań i poprawia odtwarzalność.
      UWAGA: Patrz plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z przepisami na podchloryn i roztwór M9.
  2. Aby zsynchronizować zwierzęta poprzez składanie jaj, umieść 20 młodych dorosłych zwierząt (1. dzień dorosłości) na każdej szalce na 4-6 godzin i pozwól im złożyć jaja, aż na jednej płytce będzie około 50 jaj. Usuń wszystkie ciężarne dorosłe osobniki i przenieś płytki z jajami do inkubatora o temperaturze 20 °C.
    UWAGA: Dorosłe zwierzęta w ciąży powinny być zsynchronizowane w pierwszym dniu dorosłości. Starsze zwierzęta mogą składać jaja, które zostały zatrzymane w macicy, powodując uwalnianie jaj, które są w bardziej zaawansowanym stadium rozwojowym.

3. Produkcja potomstwa

UWAGA: Należy podjąć kroki w celu zapobieżenia produkcji potomstwa lub oddzielenia zsynchronizowanej populacji wyjściowej od ich potomstwa. Zapobieganie produkcji potomstwa można osiągnąć chemicznie poprzez dodanie 5-Fluoro-2'-deoksyurydyny (FUdR) do płytek, co opisano tutaj. Niektóre badania wykazały, że FUdR może zmieniać proteostazę24,25. Poniżej omówiono alternatywne podejścia do zapobiegania produkcji potomstwa.

  1. Przygotować 1000-krotny roztwór podstawowy FUdR, rozpuszczając 1 g FUdR w 10 ml ultraczystegoH2O. Filtruj wylew FUdR za pomocą filtra 0,2 μm i strzykawki o pojemności 10 ml. Porcję 1 ml bulionu przelać do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Zamrażać i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Hodować zwierzęta w temperaturze 20 °C aż do etapu L4. Zwierzęta N2 wyhodowane ze zsynchronizowanych L1 z leczenia podchlorynem wymagają około 40 godzin wzrostu w temperaturze 20 °C, aby osiągnąć L4. Tempo wzrostu innych szczepów powinno być empirycznie przetestowane przed rozpoczęciem eksperymentów. Szczegółowe informacje na temat dokładnej oceny C. elegans można znaleźć na stronie 26.
    1. Do każdej 6 cm płytki ze zwierzętami L4 dodaj 100 μL 80x FUdR. Bardzo ważne jest, aby dodać FUdR na etapie L4.
  3. Włóż płytki do pojemnika na robaki i włóż pudełko do torby z zamkiem błyskawicznym. Wróć do odpowiedniego inkubatora.

4. Pomiar spadku proteostazy w tkance mięśniowej za pomocą zwierząt wykazujących ekspresję poliglutaminy

UWAGA: Do identyfikacji spadku proteostazy w komórkach mięśniowych można użyć dwóch metod: obrazowania powstawania agregatów białkowych podczas starzenia się (4.1) i pomiaru proteotoksyczności, jaką te agregaty powodują wraz z wiekiem aż do wystąpienia paraliżu (4.2).

  1. Obrazowanie tworzenia się agregatów poliglutaminy w mięśniach podczas starzenia
    UWAGA: Zależna od wieku progresja agregacji białek w komórkach mięśniowych jest obrazowana za pomocą powtórzeń poliglutaminy (polyQ) połączonych z żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP). Protokół ten określa użycie szczepu AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], ale można również użyć innych szczepów wariantu poliglutaminy. Transgen polyQ::YFP ulega ekspresji w mięśniach za pomocą promotora specyficznego dla mięśni unc-54. Zsynchronizowane unc-54p::p olyQ::YFP zwierzęta eksprymujące są wizualizowane w 1, 2, 3 i 4 dniu dorosłości. Aby zobrazować agregaty unc-54p::p olyQ::YFP, użyj mikroskopu złożonego wyposażonego w fluorescencyjny mikroskop lub fluorescencyjny mikroskop preparacyjny. AM140 jest dostępny w Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC) pod adresem: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
    1. W dniach obrazowania (1., 2., 3. i 4. dzień dorosłości) wybierz 20 zwierząt i umieść je na szkiełku mikroskopowym z 3% podkładką agarozową i kroplą 5 μl 10 mM azydku sodu (rozcieńczonego w buforze M9).
    2. Po tym, jak wszystkie zwierzęta zostaną unieruchomione przez azydek sodu (~ 5 minut), zobrazuj całe ciała zwierząt za pomocą soczewki o 10-krotnym powiększeniu (Rysunek 1A). Do obrazowania należy użyć filtra FITC i takiej samej ekspozycji dla każdego zwierzęcia. Odrzuć slajdy po obrazowaniu.
      UWAGA: Alternatywnie, ogniska YFP można również określić ilościowo bezpośrednio na płytkach, ale ruch musi być zahamowany poprzez nałożenie strumienia dwutlenku węgla na płytkę podczas nacinania. Ta alternatywna metoda jest najbardziej odpowiednia w przypadku badań przesiewowych dużej liczby schorzeń (więcej szczegółów można znaleźć w dyskusji).
    3. Po uzyskaniu obrazów policz liczbę ognisk w mięśniach ściany ciała całego zwierzęcia. Ogniska to jaśniejsze sygnały punktowe, które można odróżnić od ciemniejszego sygnału rozpuszczalnego w tle.
    4. Wykreśl progresję akumulacji ognisk YFP od dni 1, 2, 3 i 4. Wykreśl wykres XY, gdzie X oznacza dni dorosłości, a Y oznacza liczbę ognisk unc-54p::p olyQ::YFP (Rysunek 1B). Liczba ognisk w warunkach doświadczalnych (np. obniżenie lub nadekspresja genów) jest porównywana ze zwierzętami kontrolnymi. Przeprowadź analizę statystyczną między grupami w każdym punkcie czasowym obserwowanym dla każdego badania.
      1. Porównując liczbę ognisk tylko dla dwóch warunków, należy wykonać niezależny test t próbki w każdym punkcie czasowym.
      2. Porównując liczbę ognisk dla więcej niż dwóch warunków, należy przeprowadzić zbiorczą jednokierunkową analizę ANOVA dla każdego punktu czasowego, w tym dane dla wszystkich warunków w tym punkcie czasowym. Jeśli ANOVA omnibus daje znaczącą wartość p (tj. p < 0,005), należy przeprowadzić analizę post-hoc z parami niezależnych testów t próby w celu określenia konkretnych warunków, między którymi wykryto znaczącą różnicę w ogniskach (np. dla grup A, B i C porównaj A i B, A i C oraz B i C).
  2. Pomiar wskaźników paraliżu zwierząt jako substytut toksyczności poliglutaminy w komórkach mięśniowych
    UWAGA: Zależny od wieku wzrost agregatów polyQ w mięśniach powoduje spadek funkcji mięśni, które napędzają lokomocję. Ten defekt w poruszaniu się można określić, mierząc postępujące tempo paraliżu u zwierząt z ekspresją polyQ. W teście paraliżu zsynchronizowane zwierzęta z ekspresją unc-54p::p olyQ::YFP są oceniane w 3., 5., 7. i 9. dniu dorosłości. W razie potrzeby dodaj dodatkowe punkty czasowe, aby rozszerzyć zakres punktacji, tak aby można było ocenić efekt perturbacji genetycznej.
    1. W dniach, w których zdobywano punkty (3, 5, 7 i 9 dzień dorosłości) spójrz na 6-centymetrowe tabliczki z 50 zwierzętami i zapisz liczbę sparaliżowanych zwierząt. Usuń sparaliżowane zwierzęta z talerza. Jeśli zwierzęta wypełzły z talerza lub zdechły, powinny zostać ocenzurowane; Zapisz zdarzenie, aby można je było uwzględnić w analizie.
      UWAGA: Zwierzę uważa się za sparaliżowane, gdy po wystawieniu go na działanie lekkich lub delikatnych bodźców dotykowych nie obserwuje się żadnego ruchu. Aktywność pompowania gardła służy do określenia, czy zwierzęta nieporuszające się są żywe, czy martwe.
    2. Po zakończeniu eksperymentu oblicz współczynnik paraliżu dla każdego stanu. Zrób to w każdym punkcie czasowym, dzieląc frakcję sparaliżowanych zwierząt przez całkowitą liczbę zwierząt obserwowanych w tym stanie w tym czasie. W przypadku obserwacji wielu płytek na warunek w danym punkcie czasowym (tj. płytek replikowanych) należy obliczyć stosunek oddzielnie dla każdej kontrpróby.
    3. Wykreśl progresję szybkości paraliżu na wykresie XY (wykres rozrzutu). X oznacza dni dorosłości, a Y oznacza wskaźniki paraliżu. Współczynnik paraliżu zwierząt unc-54p::p olyQ::YFP porównano ze zwierzętami kontrolnymi (Rysunek 1C). Przeprowadzanie analiz statystycznych między grupami; W przypadku wielu badań należy traktować je niezależnie. Użyj regresji proporcjonalnego hazardu Coxa i testu Walda. Większość narzędzi do analizy danych, które obsługują analizę przeżycia, obsługuje również modelowanie Coxa.
      1. Przekształć dane: każdy warunek powinien mieć dwie kolumny, jedną dla czasu, a drugą dla "zdarzenia". W każdym obserwowanym punkcie czasowym dodaj wiersz z "0" dla każdego sparaliżowanego zwierzęcia i "1" dla każdego ocenzurowanego zwierzęcia. Łączna liczba rzędów powinna być równa liczbie zwierząt wyjściowych na tablicy dla tego warunku.
      2. Wykonaj modelowanie proporcjonalnych hazardów Coxa, a następnie test Walda, zgodnie z instrukcjami oprogramowania statystycznego. Model jednowymiarowy będzie odpowiedni dla typowych projektów eksperymentalnych. W przypadku więcej niż dwóch warunków, jeśli test z uwzględnieniem wszystkich warunków wskazuje na istotny wynik (tj. p < 0,005), można przeprowadzić testy parami między warunkami w celu określenia określonej znaczącej pary (par) warunków.
        UWAGA: Model Coxa opiera się na założeniu, że warunki testowe modulują prawdopodobieństwo zdarzenia proporcjonalnie w czasie. Oznacza to na przykład, że model Coxa nie byłby odpowiedni do porównywania stanu, w którym większość zwierząt jest sparaliżowana w dniu 1, ze stanem, w którym większość zwierząt jest sparaliżowana w dniu 9. Rozszerzenia modelu Coxa i inne podejścia do porównywania proporcji sparaliżowanych w każdym punkcie czasowym są dostępne dla przypadków, w których założenie proporcjonalnego hazardu nie jest prawdziwe, patrz27,28,29,30.

5. Pomiar spadku proteostazy w tkance neuronalnej za pomocą zwierząt z ekspresją poliglutaminy.

UWAGA: Dwie uzupełniające się metody są używane do badania spadku proteostazy w neuronach (1) poprzez ilościowe określenie powstawania agregatów białkowych (ognisk fluorescencyjnych) podczas starzenia się i (2) poprzez pomiar związanego z wiekiem spadku proteomu neuronalnego za pomocą testu opartego na ruchu.

  1. Obrazowanie tworzenia się agregatów poliglutaminy w neuronach podczas starzenia się
    UWAGA: Podobnie jak w przypadku testu już omówionego w tkance mięśniowej, zależna od wieku progresja agregacji białek w neuronach jest obrazowana przez ekspresję białka fuzyjnego polyQ::YFP napędzanego przez panneuronalny, specyficzny dla tkanki promotor rgef-1. W szczególności używamy AM101: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP], fuzji czterdziestu glutaminy do YFP16. Aby zobrazować rgef-1p::p olyQ::YFP, użyj mikroskopu złożonego wyposażonego w fluorescencję z soczewką o 40-krotnym powiększeniu. AM101 jest dostępny w CGC pod adresem: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
    1. W dniach obrazowania (4., 6., 8. i 10. dzień dorosłości) wybierz 20 zwierząt i zamontuj je na szkiełku mikroskopowym zawierającym 3% wacik agarozy z kroplą 5 μl 10 mM azydku sodu (rozcieńczonego w buforze M9).
    2. Po unieruchomieniu wszystkich zwierząt przez azydek sodu (~ 5 minut), wykonaj zdjęcia głowy zwierząt w kształcie litery Z za pomocą soczewki o 40-krotnym powiększeniu (Rysunek 2A). Odrzuć slajdy po obrazowaniu.
    3. Po uzyskaniu obrazów przetwórz z-stosy, aby uzyskać maksymalną projekcję i użyj do ilościowego określenia liczby ognisk w neuronach zlokalizowanych w obszarze pierścienia nerwowego. Ogniska to jaśniejsze, przerywane sygnały, które można odróżnić od ciemniejszego sygnału rozpuszczalnego w tle.
      UWAGA: Specjalnie wybraliśmy obszar pierścienia nerwowego do ilościowego określenia agregatów rgef-1p::p olyQ::YFP, ponieważ jest to region, w którym większość neuronów zbiega się, tworząc połączenia synaptyczne. Jednak w celu zmierzenia poziomów tworzenia agregatów w neuronach ruchowych można określić ilościowo agregaty rgef-1p::p olyQ::YFP zlokalizowane na grzbietowym lub brzusznym rdzeniu nerwowym.
    4. Wykreśl progresję akumulacji ognisk YFP od D4, D6, D8 i D10. Zrób to na wykresie XY, gdzie X oznacza dni dorosłości, a Y oznacza liczbę ognisk rgef-1p::p olyQ::YFP (Rysunek 2B). Liczba ognisk w warunkach doświadczalnych (np. obniżenie lub nadekspresja genów) jest porównywana ze zwierzętami kontrolnymi. Analiza statystyczna liczby ognisk dla neuronów jest przeprowadzana w taki sam sposób, jak dla ognisk poliQ mięśniowych; Zobacz Kroki 4.1.4 i związane z nimi uwagi.
  2. Pomiar zgięć ciała jako zastępcza miara proteotoksyczności poliglutaminy w neuronach.
    UWAGA: Stres proteotoksyczny wywołany postępującą akumulacją agregatu neuronalnego polyQ określa się poprzez przyjrzenie się defektom neuronów ruchowych za pomocą testu młócenia. Określ ilościowo liczbę zgięć ciała w okresie 30 sekund w stanie zawieszenia w buforze fizjologicznym M9 (plik uzupełniający 1).
    1. W 2 dniu dorosłości wybierz 10 zsynchronizowanych zwierząt z płytki i umieść je na 10 μl kropli buforu M9 na szkiełku mikroskopowym. Powtórz ten krok co najmniej cztery razy, aby uzyskać próbkę 40 lub więcej zwierząt.
    2. Rejestruj na wideo ruch 10 zwierząt umieszczonych na szkiełku mikroskopowym z 10 μl buforu M9 przez okres 30 s na mikroskopie stereoskopowym z kamerą obsługującą wideo. Powtórz ten krok 4 razy, aby uzyskać łączną liczbę próbek 40. Powiększenie i pozycja powinny być dostosowane tak, aby wszystkie zwierzęta były widoczne w kadrze przez pełne 30 sekund.
    3. Po nagraniu wszystkich filmów ze zwierzętami do analizy odtwórz wideo i oceń zgięcia ciała każdego zwierzęcia. Jedno zgięcie ciała definiuje się jako sytuację, w której srom zwierzęcia przechodzi z jednej strony na drugą i z powrotem do pozycji wyjściowej.
      UWAGA: Okazuje się, że zwierzęta typu dzikiego mają zazwyczaj 49 ± 0,79 zgięć ciała w ciągu 30 sekund.
    4. Wykreśl liczbę zgięć ciała dla każdego zwierzęcia na wykresie kolumnowym, gdzie każda kropka reprezentuje liczbę zgięć ciała w ciągu 30 s (oś Y) z różnymi warunkami testowanymi na osi X. Liczba zgięć ciała zwierząt unc-54p::p olyQ::YFP jest porównywana ze zwierzętami kontrolnymi (Rysunek 2C). Przeprowadzanie analizy statystycznej między grupami niezależnie dla każdego badania; Jeśli test jest powtarzany w wielu punktach czasowych, analizuj dane niezależnie dla każdego punktu czasowego.
      1. Biorąc pod uwagę tylko dwa warunki, należy wykonać test t dla próby niezależnej.
      2. W przypadku rozważania więcej niż dwóch warunków jednocześnie, najpierw należy przeprowadzić zbiorczą jednoczynnikową analizę ANOVA, w tym dane dla wszystkich warunków w danym momencie próby/punktu czasowego. Jeśli ANOVA omnibus daje znaczącą wartość p (tj. p < 0,005), należy przeprowadzić analizę post-hoc z parami niezależnych prób t w celu określenia konkretnych warunków, między którymi wykryto istotną różnicę w liczbie zgięć ciała.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U C. elegans, model powtórzeń poliglutaminy odegrał kluczową rolę w identyfikacji genów regulujących sieć proteostatyczną. Na przykład wcześniej wykazaliśmy, że homeodomenyczna kinaza białkowa oddziałująca (hpk-1), kofaktor transkrypcyjny, wpływa na proteostazę podczas starzenia się poprzez regulację ekspresji autofagii i molekularnych białek opiekuńczych31. Odkryliśmy, że utrata hpk-1, zarówno przez wyciszenie RNAi, jak i u zmutowanych zwierząt hpk-1 (pk1393), ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Starzenie się charakteryzuje się stopniowym spadkiem proteostazy. Proteostaza jest utrzymywana przez złożony system, sieć proteostatyczną, która zapewnia skoordynowaną, dynamiczną, reagującą na stres kontrolę fałdowania, degradacji i translacji białek. Dlaczego proteostaza zawodzi w trakcie starzenia się, jest słabo poznana, ale rozpadający się epigenom, malejąca indukowalność reakcji na stres i utrata kompensacyjnego przesłuchu zbiegają się z tym załamaniem. U C. elegans indukowalność transkrypcji wielu form re...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować byłym i obecnym członkom laboratorium Samuelsona za pomoc w udoskonaleniu tej metody i/lub dyskusję, która pomogła w rozwoju tego manuskryptu. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez National Institute on Aging of the National Institutes of Health w ramach numerów nagród RF1AG062593 i R21AG064519. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki do hodowli 24-dołkowychGreiner Bio-One#662102
2 ml Płytki 96-dołkoweGreiner Bio-One#780286
600 µ L 96-dołkowe płytkiGreiner Bio-One#786261
96-pinowy replikator płytekNunc250520
Przepuszczająca powietrze uszczelka płytkowaVWR60941-086
agar bakteriologicznyAffymetrix/USB10906
baktopeptonVWR90000-368
Biblioteka klonów C. elegans RNAi w bakteriach HT115 - AhringerŹródło: BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)Patrz także Kamath et al, Nature 2003.
Biblioteka klonów RNAi C. elegans w bakteriach HT115 - VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)Zobacz także Rual i in., Badania nad genomem 2004. Ta biblioteka jest również dostępna w Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoksyurydyna)Alfa AesarL16497
Szkiełka nakrywkowe do mikroskopuszklanego VWR48404-455
Szkiełka podstawoweVWR160004-422
IPTG (beta-digalaktopionozyd izopropylu)Gold Bio12481C100
Płytka jednodołkowa nieobrobiona, kątowa, niepoddana obróbce, 128x86mmThermo-Fisher
Azek sodu, CAS #26628-22-8Mikroskop Sigma-AldrichS2002
Zeiss Axio Imager M2m z oprogramowaniem AxioVision v4.8.2.0Zeissnieznany
Mikroskop Zeiss StemiSV11 M2 Bio QuadZeissnieznany
242811

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
  2. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  3. Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
  4. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  5. Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
  6. Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
  7. Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
  8. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659(2014).
  9. Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
  10. Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155(2016).
  11. Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
  12. Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
  13. Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
  14. Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
  15. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  16. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  17. Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
  18. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
  19. Walker, F. O. Huntington's disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
  20. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002(2001).
  21. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840(2013).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  23. Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819(2018).
  24. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964(2014).
  26. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  27. Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
  28. Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
  29. Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
  30. Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell's recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
  31. Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038(2017).
  32. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
  33. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  35. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  36. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  37. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  38. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  39. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438(2011).
  40. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
  41. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
  42. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  43. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  44. Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278(2014).
  45. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  46. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Proteostasis DeclineC elegans AgingPolyQ YFP ReporterTissue Specific ExpressionFluorescent Foci QuantificationLocomotion DefectsNeuronal ProteostasisMuscle ProteostasisGenetic AnalysisHPK 1 Regulation

Powiązane artykuły