Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Homeostaza białek (proteostaza) jest definiowana jako komórkowa zdolność do utrzymania prawidłowego funkcjonowania i fałdowania proteomu. Nieodłącznym wyzwaniem dla proteostazy jest zapewnienie, że wszystkie białka są prawidłowo sfałdowane i utrzymywane w natywnej konformacji, która jest dodatkowo wzmacniana przez zróżnicowaną naturę wielkości białka, składu aminokwasowego, konformacji strukturalnej, stabilności, obrotu, ekspresji, kompartmentalizacji subkomórkowej i modyfikacji¹. Proteostaza jest utrzymywana dzięki skoordynowanemu działaniu dużej sieci proteostatycznej, składającej się z około 2000 unikalnych białek, które regulują prawidłową syntezę, fałdowanie, transport i degradację w proteomie^2,3. Składnikami sieci proteostatycznej jest dziewięć głównych rodzin molekularnych białek opiekuńczych⁴. Każda tkanka i typ komórki preferencyjnie wykorzystuje określone podzbiory molekularnych białek opiekuńczych, przypuszczalnie zgodnie z różnymi wymaganiami różnych proteomów⁵.

Jedną z cech charakterystycznych normalnego starzenia się organizmu jest postępujący spadek i załamanie proteostazy komórkowej, która jest uważana za podstawową podstawę początku i progresji rosnącej liczby chorób związanych z wiekiem. Na przykład choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona i stwardnienie zanikowe boczne (ALS) mają wspólną cechę: w każdym przypadku przejawy neurodegeneracji są napędzane przez zmiany genetyczne, które predysponują zmutowane białko do agregacji (amyloid-β/Tau, α-synukleina, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, odpowiednio)^6,7,8,9,10. Podczas starzenia się zmniejsza się integralność i indukowalność sieci proteostatycznej, co powoduje akumulację agregatów proteotoksycznych, które skutkują dysfunkcją komórkową i neurodegeneracją. Warto zauważyć, że choroby konformacyjne białek nie są unikalne dla neuronów i występują w wielu tkankach, jak podkreślono w przypadku cukrzycy typu II, szpiczaka mnogiego i mukowiscydozy^11,12,13,14. W związku z tym wyjaśnienie mechanizmów zdolnych do zachowania proteostazy ułatwi opracowanie ukierunkowanych interwencji w leczeniu chorób i będzie sprzyjać zdrowemu starzeniu się.

Mały nicień glebowy Caenorhabditis elegans (C. elegans) odegrał kluczową rolę w odkryciu genów i wyjaśnieniu szlaków, które zmieniają proteostazę. Wiele elementów sieci proteostatycznej i szlaków transdukcji sygnału, które regulują proteostazę, jest ewolucyjnie zachowanych. Co więcej, C. elegans ma zmniejszoną złożoność i redundancję w porównaniu z systemami kręgowców, dzięki czemu jest bardziej podatny na analizę genetyczną i odkrywanie genów. Dodatkowe zalety C. elegans, które doprowadziły do jego szerokiego zastosowania jako systemu modelowego do badania proteostazy, obejmują: potężną genomikę genetyczną i funkcjonalną, krótki cykl życia (3 dni) i długość życia (3 tygodnie), zwarty i dobrze opisany genom, dostępność szerokiego asortymentu mutantów genetycznych oraz łatwość wizualizacji specyficznych dla tkanek zmian w biologii komórki za pomocą reporterów fluorescencyjnych.

Postępujący zanik proteostazy podczas starzenia się można łatwo określić ilościowo u C. elegans. Laboratorium Morimoto po raz pierwszy wykazało, że ekspandacja poliglutaminy połączona z żółtym białkiem fluorescencyjnym (polyQ::YFP) może być wykorzystana do ilościowego określenia spadku proteostazy u C. elegans podczas starzenia^15,16,17,18. Fuzje YFP z 35 powtórzeniami glutaminy lub więcej powodują związane z wiekiem tworzenie ognisk fluorescencyjnych wraz z objawami patologii komórkowej. Warto zauważyć, że ten zakres ekspansji glutaminy odzwierciedla długość przewodu poliglutaminowego białka huntingtyny, przy którym patologia choroby Huntingtona zaczyna być obserwowana u ludzi (zazwyczaj >35 powtórzeń CAG)¹⁹. Szczepy z ekspresją polyQ::YFP w komórkach mięśniowych, jelitowych lub neuronalnych zostały wykorzystane do potwierdzenia, że związany z wiekiem spadek proteostazy występuje w różnych typach komórek i tkanek. Specyficzna dla mięśni ekspresja polyQ::YFP (tj. unc-54p::Q35::YFP) była najczęściej stosowanym reporterem specyficznym dla tkanki, ponieważ akumulujące ogniska fluorescencyjne są łatwe do ilościowego określenia w ciągu pierwszych kilku dni dorosłości za pomocą prostego fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego (Rysunek 1A-1B). Dodatkowo, zwierzęta stają się sparaliżowane w wieku średnim, ponieważ proteom w mięśniu załamuje się z powodu proteotoksycznego działania reportera (Rysunek 1C). Podobnie, związany z wiekiem spadek proteostazy neuronalnej może być śledzony (rgef-1p::Q40::YFP) poprzez bezpośrednie ilościowe określanie powstawania ognisk/agregatów i związanych z wiekiem spadków skoordynowanych zgięć ciała po umieszczeniu zwierząt w płynie (Ryc. 2).

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół, jak mierzyć zależny od wieku postęp akumulacji agregatów białkowych i związaną z tym proteotoksyczność wywołaną ekspresją powtórzeń poliglutaminy w tkance neuronalnej i mięśniowej u C. elegans. Podajemy przykłady typowych wyników uzyskanych przy użyciu tych szczepów i metod. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy te metody do badania regulacji transkrypcji sieci proteostatycznej. Omawiamy dodatkowe sposoby, w jakie te reportery można łatwo zintegrować z innymi istniejącymi odczynnikami lub dostosować do większych ekranów.

1. Przygotowanie odczynników

1. Wybierz interesujące geny, które mają być inaktywowane za pomocą RNAi opartego na żywieniu. Zakup zapasów HT115 E. coli zawierających klon RNAi będący przedmiotem zainteresowania²⁰. Alternatywnie, należy sklonować cDNA interesującego genu do miejsca multiklonowania plazmidu L4440.
   UWAGA: Aby zapobiec degradacji dsRNA w bakteriach, należy użyć szczepu HT115. Jest to szczep E. coli z niedoborem RNazy III z indukowaną przez IPTG aktywnością polimerazy T7. Do badań proteostazy, w których nie wykorzystuje się RNAi opartego na karmieniu, można użyć HT115 lub OP50 E. coli na standardowych płytkach NGM.
2. Przygotuj płytki o wymiarach 5 x 6 cm na każdy warunek testowy. W przypadku eksperymentów z użyciem RNAi indukuj produkcję dsRNA w przekształconym HT115 E. coli. Do badań bez RNAi można użyć OP50 E. coli na standardowych płytkach NGM (patrz plik uzupełniający 1 dla standardowych receptur płytek NGM i RNAi).
   UWAGA: Płytki RNAi można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy przed wysiewem z bakteriami.
3. Hodować kultury E. coli przez noc (16-20 godzin) w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 220 obr./min. Hoduj HT115 E. coli w bulionie Luria (LB) z ampicyliną (50 μg/mL).
   UWAGA: Standardowa OP50 E. coli nie jest oporna na antybiotyki, ale dostępne są również warianty oporne na streptomycynę.
   1. Zagęścić bakterie przez odwirowanie przy 2,400 x g przez 15-20 minut w wirówce stołowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1/10 objętości początkowej (tj.^10-krotnym stężeniu) LB z ampicyliną dla HT115 lub LB bez ampicyliny dla wzorca OP50.
   2. Podamy 200 μl skoncentrowanych 10 razy bakterii na każdą płytkę (3-4 powtórzenia na warunki testowe, z 2 dodatkowymi płytkami zapasowymi, do użycia w przypadku zanieczyszczenia).
   3. Pozostaw otwarte płytki do wyschnięcia w czystym środowisku, takim jak stół z przepływem laminarnym, aż cała ciecz zostanie wchłonięta, lub pozwól przykrytym płytkom wyschnąć na stole laboratoryjnym przez noc.
4. W przypadku wysianych płytek RNAi wysuszonych w kapturze, wysuszone płytki należy przechowywać w pojemniku na robaki przez noc (do 24 godzin) w temperaturze pokojowej. Po 1 dniu w temperaturze pokojowej płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni w szczelnie zamkniętej torbie (aby zapobiec wysychaniu płytek). Przed użyciem należy odczekać, aż płytki przechowywane w temperaturze 4 °C powrócą do temperatury pokojowej w woreczku z zamkiem błyskawicznym, aby zapobiec kondensacji przedostającej się zanieczyszczeń grzybowych unoszących się w powietrzu.
   1. W przypadku stosowania RNAi na bazie karmienia, pozostaw wysiane bakterie HT115 na płytkach RNAi w temperaturze pokojowej na co najmniej 12 godzin przed dodaniem C. elegans. Płytki RNAi zawierają IPTG, który indukuje produkcję dsRNA. Alternatywnie, IPTG można dodać do płynnych kultur pod koniec kroku 1.3.1, 2 godziny przed siewem.
   2. Unikaj długotrwałego przechowywania płytek HT115 z nasionami w temperaturze pokojowej (dłużej niż kilka dni), aby uniknąć pękania agaru, które spowoduje zagrzebanie się C. elegans w agarze.

2. Synchronizacja C. elegans

UWAGA: Wybierz, czy synchronizować C. elegans przez alkaliczne traktowanie podchlorynem ciężarnych dorosłych osobników lub składanie jaj.

1. Synchronizuj zwierzęta poprzez leczenie podchlorynem dorosłych zwierząt, aby przyspieszyć uwalnianie zarodków²².
   1. W celu leczenia podchlorynem należy przemyć grawitacyjne hermafrodyty 2 razy buforem M9, a następnie ponownie zawiesić w 5 ml roztworu podchlorynu (3,25 ml roztworu podchlorynu, 1 ml buforu M9 i 0,75 ml 5 M NaOH) przez 5 minut, wstrząsając zawieszonymi zwierzętami co minutę. Po 5 minutach odwiruj zwierzęta i umyj 3 razy buforem M9.
      UWAGA: Zakłada się, że leczenie podchlorynem wpływa na proteostazę²¹.
   2. Po poddaniu działaniu podchlorynu pozostawić zarodki do wylęgu się przez noc w 3 ml roztworu M9 z rotacją w temperaturze 20 °C.
   3. Obliczyć gęstość zwierząt L1 (lub alternatywnie zarodków) na μl, wrzucając 10 μl roztworu L1 3x na płytkę o średnicy 6 cm i licząc liczbę zwierząt L1, aby obliczyć średnią liczbę zwierząt L1 na μl. Zwierzęta L1 ustabilizują się z czasem. Dlatego należy okresowo mieszać roztwory L1, aby uniknąć osiadania.
   4. Wysiać 50 zwierząt L1 na płytkę, policzyć i zapisać liczbę wysianych, a następnie przenieść szalki do inkubatora o temperaturze 20 °C. Ważne jest, aby znać rzeczywistą liczbę zwierząt na każdej płytce na początku testu.
      UWAGA: Synchronizacja zwierząt L1 przez nocne wylęg w M9 jest rutynowo stosowana, ponieważ minimalizuje heterogeniczność rozwojową po umieszczeniu zwierząt na żywności. Jednak synchronizacja następuje poprzez zatrzymanie rozwoju w odpowiedzi na sygnały głodu, których w przypadku niektórych badań należy unikać (zobacz²³ dla dodatkowej dyskusji). Alternatywnie, z grubsza zsynchronizowane zwierzęta można uzyskać poprzez składanie jaj, patrz 2.2.
   5. Resztki L1 należy zamrozić i przechowywać w ciekłym azocie lub w zamrażarce o temperaturze -80 °C. W ten sposób zachowana jest próbka każdego szczepu w momencie konfiguracji eksperymentalnej, co stanowi cenne źródło informacji dla przyszłych badań i poprawia odtwarzalność.
      UWAGA: Patrz plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z przepisami na podchloryn i roztwór M9.
2. Aby zsynchronizować zwierzęta poprzez składanie jaj, umieść 20 młodych dorosłych zwierząt (1. dzień dorosłości) na każdej szalce na 4-6 godzin i pozwól im złożyć jaja, aż na jednej płytce będzie około 50 jaj. Usuń wszystkie ciężarne dorosłe osobniki i przenieś płytki z jajami do inkubatora o temperaturze 20 °C.
   UWAGA: Dorosłe zwierzęta w ciąży powinny być zsynchronizowane w pierwszym dniu dorosłości. Starsze zwierzęta mogą składać jaja, które zostały zatrzymane w macicy, powodując uwalnianie jaj, które są w bardziej zaawansowanym stadium rozwojowym.

3. Produkcja potomstwa

UWAGA: Należy podjąć kroki w celu zapobieżenia produkcji potomstwa lub oddzielenia zsynchronizowanej populacji wyjściowej od ich potomstwa. Zapobieganie produkcji potomstwa można osiągnąć chemicznie poprzez dodanie 5-Fluoro-2'-deoksyurydyny (FUdR) do płytek, co opisano tutaj. Niektóre badania wykazały, że FUdR może zmieniać proteostazę^24,25. Poniżej omówiono alternatywne podejścia do zapobiegania produkcji potomstwa.

1. Przygotować 1000-krotny roztwór podstawowy FUdR, rozpuszczając 1 g FUdR w 10 ml ultraczystego_H2O. Filtruj wylew FUdR za pomocą filtra 0,2 μm i strzykawki o pojemności 10 ml. Porcję 1 ml bulionu przelać do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Zamrażać i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Hodować zwierzęta w temperaturze 20 °C aż do etapu L4. Zwierzęta N2 wyhodowane ze zsynchronizowanych L1 z leczenia podchlorynem wymagają około 40 godzin wzrostu w temperaturze 20 °C, aby osiągnąć L4. Tempo wzrostu innych szczepów powinno być empirycznie przetestowane przed rozpoczęciem eksperymentów. Szczegółowe informacje na temat dokładnej oceny C. elegans można znaleźć na stronie ²⁶.
   1. Do każdej 6 cm płytki ze zwierzętami L4 dodaj 100 μL 80x FUdR. Bardzo ważne jest, aby dodać FUdR na etapie L4.
3. Włóż płytki do pojemnika na robaki i włóż pudełko do torby z zamkiem błyskawicznym. Wróć do odpowiedniego inkubatora.

4. Pomiar spadku proteostazy w tkance mięśniowej za pomocą zwierząt wykazujących ekspresję poliglutaminy

UWAGA: Do identyfikacji spadku proteostazy w komórkach mięśniowych można użyć dwóch metod: obrazowania powstawania agregatów białkowych podczas starzenia się (4.1) i pomiaru proteotoksyczności, jaką te agregaty powodują wraz z wiekiem aż do wystąpienia paraliżu (4.2).

1. Obrazowanie tworzenia się agregatów poliglutaminy w mięśniach podczas starzenia
   UWAGA: Zależna od wieku progresja agregacji białek w komórkach mięśniowych jest obrazowana za pomocą powtórzeń poliglutaminy (polyQ) połączonych z żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP). Protokół ten określa użycie szczepu AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], ale można również użyć innych szczepów wariantu poliglutaminy. Transgen polyQ::YFP ulega ekspresji w mięśniach za pomocą promotora specyficznego dla mięśni unc-54. Zsynchronizowane unc-54p::p olyQ::YFP zwierzęta eksprymujące są wizualizowane w 1, 2, 3 i 4 dniu dorosłości. Aby zobrazować agregaty unc-54p::p olyQ::YFP, użyj mikroskopu złożonego wyposażonego w fluorescencyjny mikroskop lub fluorescencyjny mikroskop preparacyjny. AM140 jest dostępny w Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC) pod adresem: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
   1. W dniach obrazowania (1., 2., 3. i 4. dzień dorosłości) wybierz 20 zwierząt i umieść je na szkiełku mikroskopowym z 3% podkładką agarozową i kroplą 5 μl 10 mM azydku sodu (rozcieńczonego w buforze M9).
   2. Po tym, jak wszystkie zwierzęta zostaną unieruchomione przez azydek sodu (~ 5 minut), zobrazuj całe ciała zwierząt za pomocą soczewki o 10-krotnym powiększeniu (Rysunek 1A). Do obrazowania należy użyć filtra FITC i takiej samej ekspozycji dla każdego zwierzęcia. Odrzuć slajdy po obrazowaniu.
      UWAGA: Alternatywnie, ogniska YFP można również określić ilościowo bezpośrednio na płytkach, ale ruch musi być zahamowany poprzez nałożenie strumienia dwutlenku węgla na płytkę podczas nacinania. Ta alternatywna metoda jest najbardziej odpowiednia w przypadku badań przesiewowych dużej liczby schorzeń (więcej szczegółów można znaleźć w dyskusji).
   3. Po uzyskaniu obrazów policz liczbę ognisk w mięśniach ściany ciała całego zwierzęcia. Ogniska to jaśniejsze sygnały punktowe, które można odróżnić od ciemniejszego sygnału rozpuszczalnego w tle.
   4. Wykreśl progresję akumulacji ognisk YFP od dni 1, 2, 3 i 4. Wykreśl wykres XY, gdzie X oznacza dni dorosłości, a Y oznacza liczbę ognisk unc-54p::p olyQ::YFP (Rysunek 1B). Liczba ognisk w warunkach doświadczalnych (np. obniżenie lub nadekspresja genów) jest porównywana ze zwierzętami kontrolnymi. Przeprowadź analizę statystyczną między grupami w każdym punkcie czasowym obserwowanym dla każdego badania.
      1. Porównując liczbę ognisk tylko dla dwóch warunków, należy wykonać niezależny test t próbki w każdym punkcie czasowym.
      2. Porównując liczbę ognisk dla więcej niż dwóch warunków, należy przeprowadzić zbiorczą jednokierunkową analizę ANOVA dla każdego punktu czasowego, w tym dane dla wszystkich warunków w tym punkcie czasowym. Jeśli ANOVA omnibus daje znaczącą wartość p (tj. p < 0,005), należy przeprowadzić analizę post-hoc z parami niezależnych testów t próby w celu określenia konkretnych warunków, między którymi wykryto znaczącą różnicę w ogniskach (np. dla grup A, B i C porównaj A i B, A i C oraz B i C).
2. Pomiar wskaźników paraliżu zwierząt jako substytut toksyczności poliglutaminy w komórkach mięśniowych
   UWAGA: Zależny od wieku wzrost agregatów polyQ w mięśniach powoduje spadek funkcji mięśni, które napędzają lokomocję. Ten defekt w poruszaniu się można określić, mierząc postępujące tempo paraliżu u zwierząt z ekspresją polyQ. W teście paraliżu zsynchronizowane zwierzęta z ekspresją unc-54p::p olyQ::YFP są oceniane w 3., 5., 7. i 9. dniu dorosłości. W razie potrzeby dodaj dodatkowe punkty czasowe, aby rozszerzyć zakres punktacji, tak aby można było ocenić efekt perturbacji genetycznej.
   1. W dniach, w których zdobywano punkty (3, 5, 7 i 9 dzień dorosłości) spójrz na 6-centymetrowe tabliczki z 50 zwierzętami i zapisz liczbę sparaliżowanych zwierząt. Usuń sparaliżowane zwierzęta z talerza. Jeśli zwierzęta wypełzły z talerza lub zdechły, powinny zostać ocenzurowane; Zapisz zdarzenie, aby można je było uwzględnić w analizie.
      UWAGA: Zwierzę uważa się za sparaliżowane, gdy po wystawieniu go na działanie lekkich lub delikatnych bodźców dotykowych nie obserwuje się żadnego ruchu. Aktywność pompowania gardła służy do określenia, czy zwierzęta nieporuszające się są żywe, czy martwe.
   2. Po zakończeniu eksperymentu oblicz współczynnik paraliżu dla każdego stanu. Zrób to w każdym punkcie czasowym, dzieląc frakcję sparaliżowanych zwierząt przez całkowitą liczbę zwierząt obserwowanych w tym stanie w tym czasie. W przypadku obserwacji wielu płytek na warunek w danym punkcie czasowym (tj. płytek replikowanych) należy obliczyć stosunek oddzielnie dla każdej kontrpróby.
   3. Wykreśl progresję szybkości paraliżu na wykresie XY (wykres rozrzutu). X oznacza dni dorosłości, a Y oznacza wskaźniki paraliżu. Współczynnik paraliżu zwierząt unc-54p::p olyQ::YFP porównano ze zwierzętami kontrolnymi (Rysunek 1C). Przeprowadzanie analiz statystycznych między grupami; W przypadku wielu badań należy traktować je niezależnie. Użyj regresji proporcjonalnego hazardu Coxa i testu Walda. Większość narzędzi do analizy danych, które obsługują analizę przeżycia, obsługuje również modelowanie Coxa.
      1. Przekształć dane: każdy warunek powinien mieć dwie kolumny, jedną dla czasu, a drugą dla "zdarzenia". W każdym obserwowanym punkcie czasowym dodaj wiersz z "0" dla każdego sparaliżowanego zwierzęcia i "1" dla każdego ocenzurowanego zwierzęcia. Łączna liczba rzędów powinna być równa liczbie zwierząt wyjściowych na tablicy dla tego warunku.
      2. Wykonaj modelowanie proporcjonalnych hazardów Coxa, a następnie test Walda, zgodnie z instrukcjami oprogramowania statystycznego. Model jednowymiarowy będzie odpowiedni dla typowych projektów eksperymentalnych. W przypadku więcej niż dwóch warunków, jeśli test z uwzględnieniem wszystkich warunków wskazuje na istotny wynik (tj. p < 0,005), można przeprowadzić testy parami między warunkami w celu określenia określonej znaczącej pary (par) warunków.
         UWAGA: Model Coxa opiera się na założeniu, że warunki testowe modulują prawdopodobieństwo zdarzenia proporcjonalnie w czasie. Oznacza to na przykład, że model Coxa nie byłby odpowiedni do porównywania stanu, w którym większość zwierząt jest sparaliżowana w dniu 1, ze stanem, w którym większość zwierząt jest sparaliżowana w dniu 9. Rozszerzenia modelu Coxa i inne podejścia do porównywania proporcji sparaliżowanych w każdym punkcie czasowym są dostępne dla przypadków, w których założenie proporcjonalnego hazardu nie jest prawdziwe, patrz^27,28,29,30.

5. Pomiar spadku proteostazy w tkance neuronalnej za pomocą zwierząt z ekspresją poliglutaminy.

UWAGA: Dwie uzupełniające się metody są używane do badania spadku proteostazy w neuronach (1) poprzez ilościowe określenie powstawania agregatów białkowych (ognisk fluorescencyjnych) podczas starzenia się i (2) poprzez pomiar związanego z wiekiem spadku proteomu neuronalnego za pomocą testu opartego na ruchu.

1. Obrazowanie tworzenia się agregatów poliglutaminy w neuronach podczas starzenia się
   UWAGA: Podobnie jak w przypadku testu już omówionego w tkance mięśniowej, zależna od wieku progresja agregacji białek w neuronach jest obrazowana przez ekspresję białka fuzyjnego polyQ::YFP napędzanego przez panneuronalny, specyficzny dla tkanki promotor rgef-1. W szczególności używamy AM101: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP], fuzji czterdziestu glutaminy do YFP¹⁶. Aby zobrazować rgef-1p::p olyQ::YFP, użyj mikroskopu złożonego wyposażonego w fluorescencję z soczewką o 40-krotnym powiększeniu. AM101 jest dostępny w CGC pod adresem: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
   1. W dniach obrazowania (4., 6., 8. i 10. dzień dorosłości) wybierz 20 zwierząt i zamontuj je na szkiełku mikroskopowym zawierającym 3% wacik agarozy z kroplą 5 μl 10 mM azydku sodu (rozcieńczonego w buforze M9).
   2. Po unieruchomieniu wszystkich zwierząt przez azydek sodu (~ 5 minut), wykonaj zdjęcia głowy zwierząt w kształcie litery Z za pomocą soczewki o 40-krotnym powiększeniu (Rysunek 2A). Odrzuć slajdy po obrazowaniu.
   3. Po uzyskaniu obrazów przetwórz z-stosy, aby uzyskać maksymalną projekcję i użyj do ilościowego określenia liczby ognisk w neuronach zlokalizowanych w obszarze pierścienia nerwowego. Ogniska to jaśniejsze, przerywane sygnały, które można odróżnić od ciemniejszego sygnału rozpuszczalnego w tle.
      UWAGA: Specjalnie wybraliśmy obszar pierścienia nerwowego do ilościowego określenia agregatów rgef-1p::p olyQ::YFP, ponieważ jest to region, w którym większość neuronów zbiega się, tworząc połączenia synaptyczne. Jednak w celu zmierzenia poziomów tworzenia agregatów w neuronach ruchowych można określić ilościowo agregaty rgef-1p::p olyQ::YFP zlokalizowane na grzbietowym lub brzusznym rdzeniu nerwowym.
   4. Wykreśl progresję akumulacji ognisk YFP od D4, D6, D8 i D10. Zrób to na wykresie XY, gdzie X oznacza dni dorosłości, a Y oznacza liczbę ognisk rgef-1p::p olyQ::YFP (Rysunek 2B). Liczba ognisk w warunkach doświadczalnych (np. obniżenie lub nadekspresja genów) jest porównywana ze zwierzętami kontrolnymi. Analiza statystyczna liczby ognisk dla neuronów jest przeprowadzana w taki sam sposób, jak dla ognisk poliQ mięśniowych; Zobacz Kroki 4.1.4 i związane z nimi uwagi.
2. Pomiar zgięć ciała jako zastępcza miara proteotoksyczności poliglutaminy w neuronach.
   UWAGA: Stres proteotoksyczny wywołany postępującą akumulacją agregatu neuronalnego polyQ określa się poprzez przyjrzenie się defektom neuronów ruchowych za pomocą testu młócenia. Określ ilościowo liczbę zgięć ciała w okresie 30 sekund w stanie zawieszenia w buforze fizjologicznym M9 (plik uzupełniający 1).
   1. W 2 dniu dorosłości wybierz 10 zsynchronizowanych zwierząt z płytki i umieść je na 10 μl kropli buforu M9 na szkiełku mikroskopowym. Powtórz ten krok co najmniej cztery razy, aby uzyskać próbkę 40 lub więcej zwierząt.
   2. Rejestruj na wideo ruch 10 zwierząt umieszczonych na szkiełku mikroskopowym z 10 μl buforu M9 przez okres 30 s na mikroskopie stereoskopowym z kamerą obsługującą wideo. Powtórz ten krok 4 razy, aby uzyskać łączną liczbę próbek 40. Powiększenie i pozycja powinny być dostosowane tak, aby wszystkie zwierzęta były widoczne w kadrze przez pełne 30 sekund.
   3. Po nagraniu wszystkich filmów ze zwierzętami do analizy odtwórz wideo i oceń zgięcia ciała każdego zwierzęcia. Jedno zgięcie ciała definiuje się jako sytuację, w której srom zwierzęcia przechodzi z jednej strony na drugą i z powrotem do pozycji wyjściowej.
      UWAGA: Okazuje się, że zwierzęta typu dzikiego mają zazwyczaj 49 ± 0,79 zgięć ciała w ciągu 30 sekund.
   4. Wykreśl liczbę zgięć ciała dla każdego zwierzęcia na wykresie kolumnowym, gdzie każda kropka reprezentuje liczbę zgięć ciała w ciągu 30 s (oś Y) z różnymi warunkami testowanymi na osi X. Liczba zgięć ciała zwierząt unc-54p::p olyQ::YFP jest porównywana ze zwierzętami kontrolnymi (Rysunek 2C). Przeprowadzanie analizy statystycznej między grupami niezależnie dla każdego badania; Jeśli test jest powtarzany w wielu punktach czasowych, analizuj dane niezależnie dla każdego punktu czasowego.
      1. Biorąc pod uwagę tylko dwa warunki, należy wykonać test t dla próby niezależnej.
      2. W przypadku rozważania więcej niż dwóch warunków jednocześnie, najpierw należy przeprowadzić zbiorczą jednoczynnikową analizę ANOVA, w tym dane dla wszystkich warunków w danym momencie próby/punktu czasowego. Jeśli ANOVA omnibus daje znaczącą wartość p (tj. p < 0,005), należy przeprowadzić analizę post-hoc z parami niezależnych prób t w celu określenia konkretnych warunków, między którymi wykryto istotną różnicę w liczbie zgięć ciała.

U C. elegans, model powtórzeń poliglutaminy odegrał kluczową rolę w identyfikacji genów regulujących sieć proteostatyczną. Na przykład wcześniej wykazaliśmy, że homeodomenyczna kinaza białkowa oddziałująca (hpk-1), kofaktor transkrypcyjny, wpływa na proteostazę podczas starzenia się poprzez regulację ekspresji autofagii i molekularnych białek opiekuńczych31. Odkryliśmy, że utrata hpk-1, zarówno przez wyciszenie RNAi, jak i u zmutowanych zwierząt hpk-1 (pk1393), zwiększa liczbę agregatów Q35::YFP, które gromadzą się podczas starzenia. Dorosłe zwierzęta kontrolne dnia 2 wykazują 18,0 ± 2,7 agregatów, podczas gdy zwierzęta z zerowym mutantem hpk-1 (pk1393) i potraktowane HPK-1 RNAi Q35::YFP miały średnio odpowiednio 28 ± 5,3 i 26,0 ± 5,1 agregatów (Rysunek 3A-D). Podobnie, do 8 dnia dorosłości, 77-78% zwierząt hpk-1(RNAi) i hpk-1(pk1393) było sparaliżowanych, podczas gdy 50% zwierząt kontrolnych Q35::YFP było sparaliżowanych (Rysunek 3E). Ponadto HPK-1 jest wystarczający do regulacji tworzenia agregatów białkowych, ponieważ wszechobecna nadekspresja hpk-1 zmniejsza liczbę ognisk Q35::YFP w tkance mięśniowej i chroni starzejące się zwierzęta przed paraliżem związanym z Q35::YFP podczas starzenia się (Rysunek 3E). Podsumowując, wyniki te pokazują, że HPK-1 reguluje proteostazę i podkreśla, w jaki sposób model polyQ::YFP może być wykorzystany do odwrotnej analizy genetycznej zmian w proteostazie podczas starzenia.

Rycina 1: Ekspresja polyQ::YFP w mięśniach C. elegans powoduje postępującą akumulację ognisk i paraliż podczas starzenia. (A) Ekspresja C. elegans unc-54p::Q35::YFP w 1 i 4 dniu dorosłości (odpowiednio górny i dolny panel). Strzałki wskazują reprezentatywne ogniska. (B) Kwantyfikacja ognisk fluorescencyjnych w ciągu pierwszych 4 dni dorosłości. Ogniska są odporne na FRAP15,32,33, zgodne z nierozpuszczalnym agregatem białkowym. Słupki błędu reprezentują błąd standardowy średniej (SEM) (C) unc-54p::Q35::YFP zwierzęta stają się sparaliżowane podczas starzenia. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd proporcji. Surowe dane dla (B-C) znajdują się w tabeli uzupełniającej 1. Podziałka liniowa reprezentuje 100 μm we wszystkich panelach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Ekspresja polyQ::YFP w neuronach C. elegans powoduje postępującą akumulację ognisk i zakłócenie normalnych zgięć ciała. (A, góra) Obraz DIC C. elegans przedniego. Gardło to dwupłatkowa struktura w głowie zwierzęcia, która jest otoczona pierścieniem nerwowym, połączonym skupiskiem 180 neuronów. Czerwone nawiasy wskazują region, w którym należy ocenić ogniska w neuronach głowy. (A, środek) rgefp-1::Q40::Fluorescencja YFP w 2 dniu dorosłości. Należy zauważyć, że wyrażenie YFP jest w dużej mierze rozproszone, z wyjątkiem sporadycznej agregacji (strzałki). (A, na dole) rgefp-1::Q40::Fluorescencja YFP w 10 dniu dorosłości. Ogniska/agregaty są oznaczone (czerwona strzałka). (B) Kwantyfikacja ognisk fluorescencyjnych w ciągu pierwszych 10 dni dorosłości. Ogniska są odporne na FRAP15,32,33, zgodne z nierozpuszczalnym agregatem białkowym. Słupki błędu reprezentują błąd standardowy średniej (C) Typowa częstość zgięć ciała typu dzikiego i rgef-1p::Q40::YFP zwierząt utrzymywanych w temperaturze 20°C żywiących się pustym wektorem RNAi (L4440) w 2 dniu dorosłości. Zwiększona ekspansja glutaminy koreluje z wadami ruchowymi15. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej. Surowe dane dla (B-C) znajdują się w tabeli uzupełniającej 1. Podziałka liniowa reprezentuje 20 μm we wszystkich panelach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: HPK-1 wspomaga proteostazę. (A-C) aktywność hpk-1 wpływa na akumulację ognisk Q35::YFP w komórkach mięśniowych. Pokazano reprezentatywne obrazy zwierząt Punc-54::p olyQ::YFP leczonych (A) kontrolnym RNAi lub (B) hpk-1 RNAi, oraz (C) zwierząt transgenicznych z nadekspresją hpk-1 (Psur-5::HPK-1::CFP). (D) Przebieg czasowy akumulacji ognisk polyQ::YFP w połączeniu z: traktowaniem kontrolnym RNAi (czarne kółka), hpk-1 RNAi (białe kółka), hpk-1 (pk1393) (białe kwadraty) lub nadekspresją hpk-1 (otwarte trójkąty). Punkty danych przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe (S.D.) co najmniej 15 zwierząt na kontrpróbę biologiczną; Przeprowadzono co najmniej 5 niezależnych eksperymentów. (E) Przebieg czasowy paraliżu zwierząt Punc-54::p olyQ::YFP w połączeniu z: leczeniem kontrolnym RNAi (czarne kółka), hpk-1 RNAi (białe kółka), hpk-1(pk1393) (białe kwadraty), lub nadekspresją hpk-1 (otwarte trójkąty). Wykreślone dane przedstawiają wyniki dla pojedynczego reprezentatywnego badania. Ten rysunek został przedrukowany z reference31 za zgodą na licencji Creative Commons Uznanie autorstwa (CC BY). Podziałka liniowa reprezentuje 100 μm we wszystkich panelach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Surowe dane wyników. Tabela zawiera dane dotyczące ognisk, paraliżu i zgięcia ciała z Rysunek 2 i Rysunek 3. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Popularne odczynniki do rutynowej pracy C. elegans. Do typowych odczynników należą receptury przygotowania różnego rodzaju płytek i. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.