Artykuł metodologiczny

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61112

⸱

31 maja 2020

 , 
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Streszczenie

Przedstawione procedury opisują uogólnioną metodologię zakażania komarów Aedes aegypti wirusem Zika w warunkach laboratoryjnych w celu określenia szybkości infekcji, rozprzestrzeniania się infekcji i potencjalnej transmisji wirusa w danej populacji komarów. Procedury te są szeroko stosowane z różnymi modyfikacjami w ocenach kompetencji wektorowych na całym świecie. Są one istotne w określeniu potencjalnej roli, jaką dany komar (tj. gatunek, populacja, osobnik) może odgrywać w przenoszeniu danego czynnika.

Wprowadzenie

Kompetencja wektorowa jest definiowana jako zdolność na poziomie gatunku, populacji, a nawet osobnika danego stawonoga, takiego jak komar, kleszcz lub mucha piaskowa flebotominowa, do nabycia i przekazania czynnika biologicznie z replikacją lub rozwojem w stawonogach1,2. W odniesieniu do komarów i wirusów przenoszonych przez stawonogi (tj. arbowirusów), czynnik jest wchłaniany od żywiciela wirusowego przez samicę komara. Po spożyciu wirus musi produktywnie zainfekować jedną z niewielkiej populacji komórek nabłonka jelita środkowego3, pokonując różne przeszkody fizjologiczne, takie jak degradacja proteolityczna przez enzymy trawienne, obecność mikrobioty (bariery infekcji jelita środkowego lub MIB) oraz wydzielana macierz perytroficzna. Po zakażeniu nabłonka jelita środkowego musi nastąpić replikacja wirusa i ostateczna ucieczka z jelita środkowego do otwartego układu krążenia komara lub hemolimfy, co oznacza początek rozsianej infekcji pokonującej barierę ucieczki jelita środkowego (MEB). W tym momencie wirus może wywołać infekcje tkanek wtórnych (np. nerwów, mięśni i ciał tłuszczowych) i kontynuować replikację, chociaż taka wtórna replikacja może nie być absolutnie konieczna, aby wirus mógł zainfekować komórki groniaste gruczołów ślinowych (pokonując barierę infekcji gruczołów ślinowych). Wyjście z komórek groniastych gruczołów ślinowych do ich jamy wierzchołkowych, a następnie przemieszczenie się do przewodu ślinowego umożliwia inokulację wirusa do kolejnych gospodarzy podczas gryzienia i kończy cykl transmisji1,2,4,5,6,7.

Biorąc pod uwagę ten dobrze scharakteryzowany i ogólnie zachowany mechanizm rozprzestrzeniania się w obrębie wektora komara, oceny kompetencji wektorów laboratoryjnych są często metodologicznie podobne, chociaż istnieją różnice w protokołach1,2. Ogólnie rzecz biorąc, po doustnym narażeniu na wirusa, komary są preparowane, aby można było zbadać poszczególne tkanki, takie jak jelito środkowe, nogi, jajniki lub gruczoły ślinowe, odpowiednio pod kątem infekcji wirusowej, infekcji rozsianej, infekcji rozsianej/potencjalnej transmisji przezjajnikowej i rozsianej infekcji/potencjalnej zdolności transmisji8. Sama obecność wirusa w gruczołach ślinowych nie jest jednak ostatecznym dowodem zdolności przenoszenia, biorąc pod uwagę dowody na istnienie bariery ucieczki/wyjścia gruczołu ślinowego (SGEB) w niektórych kombinacjach wektora/wirusa1,2,4,5,7,9. Standardową metodą udowodnienia kompetencji do przenoszenia wirusa pozostaje przenoszenie komarów na zwierzę podatne10,11,12. Biorąc jednak pod uwagę, że w przypadku wielu arbowirusów wymaga to użycia modeli mysich z obniżoną odpornością13,14,15,16, ta metoda jest często zbyt kosztowna. Powszechnie stosowaną alternatywą jest pobieranie śliny komara, którą można analizować za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) lub testu zakaźnego w celu wykazania odpowiednio obecności genomu wirusa lub cząstek zakaźnych. Warto zauważyć, że takie metody pobierania śliny in vitro mogą zawyżać12 lub zaniżać17 ilość wirusa zdeponowanego podczas karmienia in vivo, co wskazuje, że takie dane należy interpretować z ostrożnością. Niemniej jednak metoda in vitro jest bardzo cenna, gdy analizuje się ją z perspektywy samej obecności wirusa w ślinie, co wskazuje na potencjał transmisyjny.

Istnieją dwa główne podejścia do określania roli wektorów komarów w wybuchach chorób arbowirusowych. Pierwsza metoda polega na nadzorze terenowym, w którym komary są zbierane w kontekście aktywnej transmisji18,19,20,21,22,23,24. Biorąc jednak pod uwagę, że wskaźniki infekcji są zazwyczaj dość niskie (np. szacowany wskaźnik infekcji komarami na obszarach występowania aktywnego wirusa Zika (ZIKV) na obszarach występowania aktywnego wirusa Zika (ZIKV) w Stanach Zjednoczonych21), inkryminacja potencjalnych gatunków wektorów może być mocno obciążona przez metodologię pułapek25,26 i losowy przypadek (np. próbka jednej zakażonej osoby z 1 600 niezainfekowanych)21. Biorąc to pod uwagę, dane badanie może nie pozyskać wystarczającej liczby komarów zarówno w surowej liczbie, jak i różnorodności gatunkowej, aby dokładnie pobrać próbki komarów biorących udział w przenoszeniu. Natomiast analizy kompetencji wektorowych są przeprowadzane w warunkach laboratoryjnych, co pozwala na ścisłą kontrolę parametrów, takich jak dawka doustna. Chociaż nie są one w pełni w stanie odzwierciedlić prawdziwej złożoności infekcji komarów i zdolności przenoszenia się w terenie, te oceny laboratoryjne pozostają potężnymi narzędziami w dziedzinie arbowirusologii.

Na podstawie różnych analiz kompetencji wektorowych z ZIKV w kilku gatunkach, populacjach i metodach komarów27,28,29,30,31,32, a także niedawny przegląd ocen kompetencji wektorowych1, opisujemy tutaj kilka protokołów związanych z typowym przepływem pracy z kompetencjami wektorowymi. W tych eksperymentach trzy populacje Ae. aegypti z obu Ameryk (miasto Salvador w Brazylii, Dominikana i dolna dolina Rio Grande w Teksasie w USA) zostały wystawione na działanie pojedynczego szczepu ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) w dawkach 4, 5 lub 6 log10 jednostek tworzących ognisko (FFU)/ml za pomocą sztucznych posiłków z krwi. Następnie przeanalizowano je pod kątem dowodów infekcji, rozsianej infekcji i zdolności transmisyjnej po różnych okresach inkubacji zewnętrznej (2, 4, 7, 10 i 14 dni) za pomocą sekcji i testu zakaźnego opartego na kulturze komórkowej. Chociaż obecny przepływ pracy/protokoły są zoptymalizowane pod kątem ZIKV, wiele elementów można bezpośrednio przetłumaczyć na inne arbowirusy przenoszone przez komary w zakresie powstrzymywania stawonogów i poziomów bezpieczeństwa biologicznego 2 i 3 (ACL/BSL2 lub ACL/BSL3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury wykonane w tych protokołach zostały wykonane w pełnej zgodności z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego oraz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksańskiego w Galveston.

1. Wzmocnienie ZIKV w komórkach Vero

  1. Hoduj komórki Vero (CCL-81 lub VeroE6) w modyfikacji Dulbecco minimalnej pożywki egzogennej (DMEM) firmy Eagle, uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) v/v i 1% (v/v) penicyliną-streptomycyną (odpowiednio 100 U/ml i 100 μg/ml) w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 do zbiegu od 80 do 90-90% w kolbie do hodowli tkankowej o długości 150 cm2.
  2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) usunąć pożywkę i wyrzucić do 10% wybielacza lub roboczego rozcieńczenia podwójnego czwartorzędowego amoniaku (tabela materiałów). Natychmiast zaszczepić monowarstwę 1 ml zapasu wirusa, dążąc do uzyskania 0,1-1 zakaźnej cząsteczki wirusa na komórkę. Natychmiast wymieszać kolbę w taki sposób, aby inokulum zetknęło się z monowarstwą w całości.
  3. Uzupełnij pożywkę do objętości 5 ml za pomocą DMEM uzupełnionego 2% v/v inaktywowanym termicznie FBS i 1% (v/v) penicyliną-streptomycyną. Następnie umieścić kolbę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 60 minut.
  4. Wyjąć kolbę z inkubatora i umieścić ją w BSC. Dodaj dodatkową pożywkę do całkowitej objętości 15 ml za pomocą DMEM uzupełnionego 2% v/v inaktywowanym termicznie FBS i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny. Przenieść kolbę do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  5. Codziennie badać kolbę pod mikroskopią z kontrastem fazowym pod kątem dowodów na działanie cytopatyczne (CPE). Przejdź do zbioru wirusa (krok 1.7), gdy tylko około 40-50% komórek pozostaje w monowarstwie, zwykle 3-5 dni po zakażeniu, w zależności od stosowanego szczepu ZIKOV.
  6. Odessać supernatant i umieścić w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml. Sklarować supernatant resztek komórkowych przez odwirowanie (3 500 x g przez 20 min).
    UWAGA: Jeśli wiele kolb zostało zakażonych identycznie, supernatanty z wielu kolb można połączyć w stożkowe probówki o pojemności 50 ml.
  7. Usunąć supernatant ze stożkowej probówki o pojemności 50 ml do świeżej, uważając, aby nie naruszyć osadu. Uzupełnić supernatant inaktywowanym termicznie FBS do końcowego stężenia 30% (v/v). Mieszaninę tę rozlać do pojedynczych zakręcanych probówek i zamrozić w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. Przygotowanie sztucznych posiłków z krwi

  1. W dniu, w którym komary mają być narażone na zakaźne posiłki z krwi, włącz źródło zasilania (Tabela materiałów) w pomieszczeniu przechowawczym dla stawonogów tak, aby jednostki żywieniowe (Tabela materiałów) zostały wstępnie podgrzane do czasu, gdy komary są przygotowane do ekspozycji.
  2. Przygotuj sztuczne posiłki z krwi, korzystając z jednej z metod opisanych poniżej.
    1. Metoda 1: Połączyć świeżo zebraną (w ciągu tygodnia) cytrynowaną lub heparynizowaną krew ludzką zakupioną w handlu w stosunku 1:1 v/v z wyrobem wirusowym (przygotowanym zgodnie z opisem w sekcji 1).
      UWAGA: Metoda ta jest uwarunkowana brakiem przeciwciał przeciwko wirusowi/rodzinie wirusów obecnych we krwi.
    2. Jeśli nie można potwierdzić braku przeciwciał lub wiadomo, że źródło krwi miało wcześniejszą ekspozycję na flawiwirusa, umyj i ręcznie zapakuj erytrocyty.
      1. W BSC dodać 30 ml pełnej krwi ludzkiej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i uzupełnić do 50 ml solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
      2. Wirować przy 3.500 x g przez 20 min.
      3. Odessać supernatant przez delikatne wlanie do tacki zawierającej 10% wybielacza lub robocze rozcieńczenie podwójnego czwartorzędowego amoniaku, uważając, aby nie wyrzucić osadu erytrocytów.
      4. Dodać 10 ml PBS i delikatnie postukać dnem stożkowej rurki o dno BSC, tak aby osad erytrocytów został odtworzony. Doprowadzić objętość zawiesiny do 50 ml za pomocą PBS. Wymieszaj przez delikatne odwrócenie.
      5. Powtórz kroki 2.2.2.1−2.2.2.4 w sumie 4−6x. Upewnij się, że supernatant jest przezroczysty lub tylko lekko różowy i nie jest już nieprzezroczysty. Usunąć cały sklarowany osad za pomocą pipety serologicznej. Zawiesić osad erytrocytów w 1-2 ml PBS.
      6. Zbierz mączkę z krwi: 350 μl upakowanych erytrocytów, 100 μl 10% sacharozy, 200 μl inaktywowanego termicznie FBS, 900 μM rekombinowanego ATP i 2 ml odpowiednio rozcieńczonego zapasu wirusa za pomocą DMEM uzupełnionego 2% v/v inaktywowanego termicznie FBS i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny.
  3. Nałóż standardowy zbiornik o pojemności 3 ml (tabela materiałów) na skórę niezakażonej myszy (inne opcje to folia parafinowa, błony kolagenowe lub osłonka kiełbasy).
  4. Umieść przykryty zbiornik na białych ręcznikach papierowych. Dodaj ~ 2 ml zakaźnej mączki z krwi do zbiornika po 1 ml na raz. Sprawdź ręcznik pod podajnikiem pod kątem oznak wycieku. Jeśli występują nieszczelności, odzyskaj mączkę z krwi z karmników i wyrzuć osłony. Uszczelnij podajniki zatyczkami. Jeszcze raz potwierdź, że nie ma wycieków.

3. Odwrotne miareczkowanie mączek krwioodpornych/płytki nazębnej

  1. Wykorzystując pozostałą objętość przygotowanej mączki z krwi, wykonaj serię 10-krotnego seryjnego rozcieńczania (tj. 6 rozcieńczeń, w zakresie od rozcieńczonego 10x do 1 000 000x) przy użyciu DMEM uzupełnionego 2% v/v inaktywowanym termicznie FBS i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny.
  2. Podzielić 100 μl rozcieńczeń do studzienek na płytkach 24 lub 12-dołkowych, od najbardziej rozcieńczonych do najbardziej skoncentrowanych.
  3. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% emisjiCO2
    4. .
  4. Pod koniec 1-godzinnego okresu inkubacji wprowadzić płytki z powrotem do BSC i dodać odpowiednio 1 ml lub 2 ml nakładki metylocelulozy do 24 dołków lub 12 dołków.
  5. Umieść nałożone płytki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubuj przez 3-7 dni (w zależności od szczepu wirusa).
  6. Po inkubacji wyjąć płytki z inkubatora i wprowadzić do BSC. Wyrzuć nakładkę metylocelulozy do tacki zawierającej 10% wybielacza lub dwutorzędowego środka dezynfekującego amon.
  7. Umyj każdą studzienkę 2x PBS, wyrzucając popłuczynę do tacki zawierającej 10% wybielacza lub podwójny czwartorzędowy amon.
  8. Dodaj ~1 ml metanolu:acetonu (1:1 v:v) i pozwól komórkom utrwalić się na płytce przez co najmniej 30 minut w BSC w temperaturze pokojowej (RT). Wyrzuć metanol: aceton zgodnie z polityką instytucjonalną dotyczącą odpadów organicznych.
  9. Wizualizację ZIKV przy użyciu jednej z dwóch metod opisanych poniżej.
    1. Po usunięciu metanolu: acetonu, natychmiast zabarwić roztworem fioletu krystalicznego (0,25% w/v w 30% metanolu) przez 5 minut. Spłukać 2x w wodzie z kranu i pozostawić do wyschnięcia, a następnie bezpośrednio uwidocznić wzrokowo w poszukiwaniu śladów blaszek nazębnych lub zniszczenia monowarstwy.
    2. Alternatywnie wykonaj test tworzenia ostrości.
      1. Pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu, aż nie pozostanie żaden organiczny utrwalacz.
        UWAGA: Powinno to zająć ~2-3 godziny poza BSC, ale można je przyspieszyć przez suszenie powietrzem w BSC lub dygestoriach chemicznych.
      2. Umyj każdą studzienkę 3x przez 15 minut w niesterylnym PBS (bez Mg2+ i Ca2+) na kołysku orbitalnym. Usunąć PBS i dodać 1 ml roztworu blokującego (PBS + 3% FBS) do każdej studzienki i wstrząsać przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Dodać 100 μl do studzienki przeciwciała pierwszorzędowego α-ZIKV lub α-flawiwirusa (np. hybrydoma grupy flawiwirusowej D1-4G2-4-15 [4G2]) w rozcieńczeniu 1:2 000 w roztworze blokującym. Inkubować z kołysaniem przez co najmniej 4 godziny (najlepiej przez noc, nie dłużej niż 18 godzin) w temperaturze pokojowej.
      4. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj 3x przez 15 minut każdy PBS (Mg2+ i Ca2+ free) na kołysku orbitalnym.
      5. Dodać 100 μl na studzienkę przeciwciała drugorzędowego (znakowanego HRP kozą α myszą) rozcieńczonego w stosunku 1:2,000 w buforze blokującym. Inkubować z bujaniem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      6. Umyć 3x po 15 minut za pomocą PBS (wolne od Mg2+ i Ca2+) na kołysku orbitalnym.
      7. Podwielokrotność 100 μl odczynnika do rozwoju substratu (tabela materiałów) na studzienkę. Płyty skalne w RT przez 15 min.
      8. Zatrzymaj reakcję po powstaniu ognisk/blaszek miażdżycowych, usuwając podłoże i spłukując płytki 2x wodą z kranu. Odlej wodę z kranu i pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu przed określeniem ilościowym.
      9. Policz ogniska wirusowe, aby określić liczbę FFU obecnych w danej próbce.

4. Podawanie posiłków z krwi

  1. Użyj komarów Ae. aegypti 2−4 dni po ekleksji. Sortuj samice komarów do kartonowych kartonów o pojemności 0,5 l z osłoniętymi pokrywkami i pozbawiaj je cukru (zwykle 36-48 godzin przed zakaźną mączką krwi). Dostarczaj wodę ad libitum za pomocą wacików nasączonych wodą.
  2. Usuń waciki nasączone wodą rano, kiedy komary będą narażone na zakaźną mączkę z krwi.
  3. Przymocuj zbiorniki zawierające sztuczne posiłki z krwi do przewodów jednostki karmiącej w przezroczystym plastikowym schowku na rękawiczki.
  4. W schowku podręcznym umieść kartonowy karton o pojemności 0,5 l z osłoniętą pokrywą, zawierający 50−100 wygłodzonych komarów Ae. aegypti, pod jednostką karmiącą przymocowaną do zbiornika.
    UWAGA: Odpowiednio wygłodzone komary zazwyczaj żerują w ciągu 20 minut. Karmienie można przedłużyć w razie potrzeby, aby zwiększyć wielkość próbki w wolniejszych populacjach, chociaż nie powinno to trwać dłużej niż 60 minut, ponieważ miano wirusa (ZIKV) może zmniejszyć się w karmniku po ~60 minutach.
  5. Po zakończeniu karmienia wyjmij zbiornik i zanurz w świeżo przygotowanym 10% wybielaczu.
  6. Znieczulenie komarów na zimno przez inkubację przez 30 s w temperaturze -20 °C lub przez 5 minut w lodówce.
  7. W schowku podręcznym wlej komary na szalkę Petriego na lodzie. Policz i posortuj nabrzmiałe samice od nienabrzmiałych komarów. Pozbądź się nienabrzmiałych komarów przez zanurzenie w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 70% etanolem. Gdy komary są jeszcze znieczulone, wlej je z powrotem do kartonu o pojemności 0,5 l i szybko przykryj sitkiem i pokrywką. Odetnij nadmiar siatki sitowej z kartonu i zabezpiecz siatkę taśmą.
  8. Dodaj wacik nasączony sterylnym, przefiltrowanym 10% wodnym roztworem sacharozy do sita każdego kartonu. Umieść wszystkie kartony na komary w dużym plastikowym pojemniku wtórnym z wilgotną gąbką, aby utrzymać wilgotność.
  9. Umieścić pojemnik wtórny zawierający kartony komarów w inkubatorze o temperaturze 27 ± 1 °C (lub, w stosownych przypadkach, w celu symulacji warunków w regionie zainteresowania) o wilgotności względnej 80% ± 10% i cyklu światło:ciemność 16:8). Utrzymuj komary z dostępem ad libitum do 10% sacharozy do czasu zakończenia eksperymentów.

5. Pobieranie i przetwarzanie próbek

  1. W określone dni po karmieniu należy odessać z góry określoną liczbę komarów z odpowiednich kartonów za pomocą mechanicznego aspiratora umieszczonego w komorze rękawicowej. Zakryj probówkę bawełnianą nawałnicą po zebraniu wymaganej liczby komarów.
  2. Znieczulanie komarów na zimno przez inkubację przez 30 sekund w temperaturze -20 °C lub przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. W schowku podręcznym wlej komary na szalkę Petriego na lodzie. Za pomocą dwóch par kleszczy usuń wszystkie sześć nóg każdego komara i umieść we wstępnie oznakowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z okrągłym dnem zawierającej sterylizowane łożysko kulkowe ze stali nierdzewnej (7/32") i 500 μl pożywki do zbierania komarów (MCM) składającej się z DMEM, 2% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny i 2,5 μg/ml amfoterycyny.
  4. Delikatnie umieść komara na kropli oleju mineralnego, aby go powstrzymać, uważając, aby nie dopuścić do kontaktu olejku z głową komara i trąbką.
  5. Włóż trąbkę przeciw komarom do końcówki pipety o pojemności 10 μl wypełnionej 10 μl inaktywowanego termicznie FBS.
    UWAGA: Alternatywnie pipetę można napełnić sacharozą, krwią lub olejem mineralnym. Olejek pozwala na bezpośrednią wizualizację pęcherzyków śliny za pomocą mikroskopii świetlnej.
  6. Pozwól komarowi ślinić się przez 30 minut. Wyrzuć końcówkę mikropipety zawierającą FBS + ślinę do probówki mikrowirówkowej zawierającej 100 μl MCM, a następnie umieść tuszę w oddzielnej probówce do mikrowirówki z okrągłym dnem o pojemności 2 ml zawierającej wysterylizowane stalowe łożysko kulkowe i 500 μl MCM. Upewnij się, że probówki używane do ciała, nóg i śliny są oznaczone tak, aby było jasne, że wszystkie trzy próbki pochodzą od tego samego komara.
  7. Podczas gdy komary się ślinią, wykonaj kroki 5.3−5.5 na pozostałych komarach.
  8. Przetransportować probówki zawierające ciała i nogi do urządzenia do homogenizacji tkanek do mielenia kulek znajdującego się w BSC. Wszystkie próbki ciała i nóg należy rozcierać przy 26 Hz przez 5 minut, aby uwolnić cząsteczki wirusa do supernatantu. Sklarować wszystkie próbki przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w celu osadzenia resztek komórkowych.
    UWAGA: W tym momencie próbki można zamrozić w temperaturze -80 °C lub natychmiast poddać oznaczeniu.

6. Wykrywanie ZIKV za pomocą testu zakaźnego

  1. W BSC należy przygotować 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowej z komórkami Vero (10-5 komórek na dołek) 24 godziny przed rozpoczęciem testu zakaźnego. Oznacz każdą studzienkę tożsamością pojedynczego komara/próbki.
  2. Jeżeli próbki zostały zamrożone w temperaturze -80 °C, pozostawić do rozmrożenia.
  3. Usunąć pożywkę z płytek komórek Vero przed zaszczepieniem próbkami po jednej płytce na raz.
  4. W przypadku próbek zawierających ciała lub nogi, ostrożnie poddzielić 100 μl sklarowanego supernatantu do każdej studzienki, uważając, aby nie naruszyć resztek komórek komara z osadu.
    UWAGA: Próbki śliny można rozcieńczyć w stosunku 1:1 (v/v) MCM przed inokulacją na komórki, aby zachować próbki do późniejszego miareczkowania, jeśli to konieczne.
  5. Przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubować przez 1 godzinę.
  6. Zwróć płytki do BSC i dodaj ~1 ml nakładki metylocelulozowej do każdej studzienki. Umieść nałożone płytki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubuj przez 3-7 dni (w zależności od wirusa/szczepu).
  7. Wykonaj fiksację i wizualizację zgodnie z opisem w krokach 3.6−3.9.
  8. Jeśli chodzi o punktację za pomocą testu tworzenia ogniska, określ ilościowo dołki dodatnie, badając je pod mikroskopem świetlnym. Wykrycie wewnątrzcytoplazmatycznego barwienia komórek w studzience wskazuje na obecność wirusa. Próbki są oceniane wyłącznie jako dodatnie lub ujemne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Trzy populacje Ae. aegypti z obu Ameryk (Salwador, Brazylia; Dominikana; oraz Rio Grande Valley, TX, USA) poddano ekspozycji na szczep ZIKV z Ameryk wywołujący epidemię (ZIKV Mex 1-7, stan Chiapas, Meksyk, 2015) w zakresie mian w posiłku krwi (4, 5 i 6 log10 FFU/mL), podanych w sztucznym posiłku krwi na bazie przemytych ludzkich erytrocytów. W dniach 2, 4, 7, 10 i 14 po infekcji analizowano podgrupy komarów w celu określenia stopnia zakażenia, dysseminacji oraz potencjalnych wskaźników transmisji.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj metody zapewniają uogólniony przepływ pracy do przeprowadzania analiz kompetencji wektorowych. Jako ogólne ramy, wiele z tych metodologii jest zachowanych w całej literaturze. Jest jednak spore pole do modyfikacji (recenzowane w Azar i Weaver1). Wiadomo, że wirus (np. linia wirusa, przechowywanie wirusa prowokacyjnego, historia pasażu wirusa), entomologia (np. kolonizacja laboratoryjna populacji komarów, odporność wrodzona, mikrobiom/wirom komarów) i zmienne eksperymentalne (np. skła...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy personelowi Światowego Centrum Referencyjnego ds. Pojawiających się Wirusów i Arbowirusów (WRCEVA): Dr. Robertowi Tesh, Hildzie Guzman, Dr. Kennethowi Plante, Dr. Jessice Plante, Dionnie Scharton i Divyi Mirchandani, za ich niestrudzoną pracę w kuratorowaniu i dostarczaniu wielu szczepów wirusowych wykorzystywanych w naszych i innych grupach eksperymentach z kompetencjami wektorowymi. Prezentowana praca została sfinansowana przez McLaughlin Fellowship Fund () oraz granty NIH AI120942 i AI121452.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3 ml Standardowy zbiornikR37P30Hemotek LtdSprzęt owadobójczy
7/32 "Kulki ze stali nierdzewnej 440 klasy C4RJH9GraingerŚrodek szlifierski
Aceton, klasa histologiczna, Fisher Chemicals, butelka polietylenowa, 4L, 4 / CaseA16-P4FisherScientificFixative
Adenozyna 5'-trifosforan sól disodowa hydrat, mikrobiologiczna, BioReagent, odpowiednia do komórek kulturaA6419-1GMiliporeSigmaOdczynnik
Przeciwciało anty-flawiwirusowe grupy antygenowej, klon D1-4G2-4-15MAB10216MiliporePrzeciwciało pierwotne Sigmado testu tworzenia ogniska
Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L), surowica ludzka adsorbowana i znakowana peroksydazą, 1,0 ml / butelka5450-0011KPL/SeracarePrzeciwciało wtórne do testu tworzenia ogniska
WybielaczNC0427256FisherScientificDekontaminacja
Corning, Kolby poddane działaniu kultur komórkowych, 150cm2, nasadka wentylowana, opakowanie 50 sztuk10-126-34FisherScientificPłytki
do hodowli komórkowych Costar, 24-dołkowe, 5/worek, 100/opakowanie, Corning07-200-740FisherScientificMateriały eksploatacyjne do hodowli komórkowych
Płytki do hodowli komórkowych Costar, 96-dołkowe, 5/worek, 100/opakowanie, Corning07-200-91FisherScientificMateriał eksploatacyjny do hodowli komórkowych
Crystal VioletC0775-100GMilliporeSigmaStain
Eppendorf Snap Cap Mikrowirówki Safe-Lock 2mL, 500/skrzynka05-402-7FisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
Falcon 15mL stożkowe probówki centryczne14-959-70CFisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
Falcon 50mL stożkowe probówki centryczne14-959-49AFisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
Falcon Jednorazowe pipety serologiczne polistyrenowe 10 ml, 200 / opakowanie13-675-20FisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
Falcon Jednorazowe pipety serologiczne polistyrenowe 1 ml, 1000 / opakowanie13-675-15BFisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
Falcon Jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu 25 ml, 200 / opakowanie13-675-30FisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
Falcon Jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu 5 ml, 200 / opakowanie13-675-22FisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
Falcon Standardowe naczynia do hodowli tkankowych08-772BFisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
Płodowa surowica bydlęca-Premium, 500 mlS11150Atlanta BiologicalsOdczynnik
do hodowli komórkowychFisherbrand Economy Szkiełka mikroskopowe ze zwykłego szkła12-550-A3FisherScientificImmobilizacja komarów
FU1 KarmnikFU1-0Hemotek LtdSprzęt owadobójczy; jednostki karmiące
Gibco DPBS z wapniem i magnezem, 10 x 500 ml Butelki140-040-182FisherScientificOdczynnik do hodowli komórkowych
Gibco Fungizone, Amfoterycyna B, 250μ g / mL, 50 ml / butelka15-290-026Fisher ScientificOdczynnik do hodowli komórkowych
Gibco Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml), 100 ml / butelka, 20 butelek / opakowanie15-140-163FisherScientificOdczynnik do hodowli komórkowych
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), czerwień fenolowa, 20 x 100 ml Butelki25-200-114FisherScientificOdczynnik do hodowli komórkowych
Gibcom DMEM, Wysoka zawartość glukozy, 10 x 500 ml Butelki11-965-118FisherScientificOdczynnik do hodowli komórkowych
Ludzka krew, nieokreślona płeć, cytrynian na, 1 jednostka7203706Lampire Przygotowanie mączki z krwi
Aspirator InsectaVac2809BBioquipSprzęt owadobójczy
Metanol, certyfikowany ACS, Fisher Chemicals, butelka ze szkła bursztynowego, 4L, 4/PrzypadekA412-4Utrwalacz
FisherScientificMetyloceluloza, lepkość: 3,500-5,600 cP, 2 % w wodzie (20 ° C), 250g / butelkęM0512-250GMilliporeSigmaOdczynnik do hodowli komórkowych
Detergent dezynfekujący Micro-chem PlusC849T34Thomas ScientificDekontaminacja; robocze rozcieńczenie podwójnego czwartorzędowego amoniaku
Olej mineralny, Bioodczynnik, do biologii molekularnejM5904-5X5MLMiliporeSigmaImmobilizacja komarów
O-ringiOR37-25Hemotek Sp. z o.o.Sprzęt owadobójczy
Plastikowe zatyczkiPP5-250Hemotek LtdSprzęt owadobójczy
PS6 Jednostka napędowa (110-120 V)PS6120Hemotek LtdSprzęt owadobójczy; źródło zasilania
Kleszcze Rubisa, ostrza offsetowe, bardzo drobne punkty4525BioquipSprzęt owadobójczy
Sarstedt Inc, 2mL Mikroprobówka z nakrętką, stożkowe dno, nasadka O-ring, sterylna, 1000/skrzynka50-809-242FisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
Sacharoza, BioUltra, do biologii molekularnej84097-250GMiliporeOdczynnik Sigma
ThermoScientific, ART Bariera Niska retencja 1000μ L Końcówki do pipet, 100 końcówek/stojak, 8 stojaków/opakowanie, 4 opakowania/opakowanie21-402-487FisherScientificMateriał eksploatacyjny z tworzywa sztucznego
ThermoScientific, bariera ART Niska retencja 200μ L Końcówki do pipet, 96 końcówek/stojak, 10 stojaków/opakowanie, 5 sztuk/opakowanie21-402-486FisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
ThermoScientific, ART Bariera Niska retencja 20μ L Końcówki do pipet, 96 końcówek/stojak, 10 stojaków/opakowanie, 5 opakowań/opakowanie21-402-484FisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
ThermoScientific, bariera ART Niska retencja, zwiększony zasięg 10 μ; L Końcówki do pipet, 96 końcówek/stojak, 10 stojaków/opakowanie, 5 sztuk/opakowanie21-402-482FisherScientificPlastikowy materiał eksploatacyjny
TissueLyser II85300QIAGEN
Zestaw substratów do homogenizacji peroksydazy TrueBlue, 200 ml5510-0030SeracareOpracowywanie rozwiązania do oznaczania formowania ostrości
VeroCCL-81Kolekcjakultur typu amerykańskiegoLinia komórkowa ssaków do amplifikacji wirusa i przeprowadzania testów zakaźnych
Vero C1008 [Vero 76, klon E6, Vero E6]CRL-1586American Type Culture CollectionLinia komórkowa ssaków do amplifikacji wirusa i przeprowadzania testów zakaźnych

Bibliografia

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867(2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980(2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102(2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346(2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702(2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462(2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661(2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072(2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434(2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804(2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055(2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zaka enie komar wzaka enie uog lnionetransmisja wirusaekspozycja na posi ek krwitest z u yciem kom rek Verojednostki tworz ce ogniskaprotok z u yciem komory r kawicowej

Powiązane artykuły