Artykuł metodologiczny

Model inokulacji opuszki stopy myszy do badania reakcji neurozapalnych wywołanych wirusem

DOI:

10.3791/61121

⸱

14 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Princeton University, 2Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model inokulacji opuszki stopy jest cennym narzędziem do charakteryzowania indukowanych przez wirusy reakcji neurozapalnych in vivo. W szczególności zapewnia jasną ocenę kinetyki wirusa i związanych z nią procesów immunopatologicznych inicjowanych w obwodowym układzie nerwowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje model inokulacji opuszki stopy używany do badania inicjacji i rozwoju reakcji neurozapalnych podczas infekcji wirusem alfaherpeswirusa u myszy. Ponieważ alfaherpeswirusy są głównymi najeźdźcami obwodowego układu nerwowego (PNS), model ten jest odpowiedni do scharakteryzowania kinetyki replikacji wirusa, jego rozprzestrzeniania się z PNS do OUN i związanych z tym reakcji neurozapalnych. Model inokulacji opuszki stopy umożliwia rozprzestrzenianie się cząsteczek wirusa z pierwotnego miejsca infekcji w naskórku opuszki stopy do czuciowych i współczulnych włókien nerwowych, które unerwiają naskórek, gruczoły potowe i skórę właściwą. Infekcja rozprzestrzenia się przez nerw kulszowy do zwojów korzenia grzbietowego (DRG) i ostatecznie przez rdzeń kręgowy do mózgu. W tym przypadku opuszka myszy jest zaszczepiana wirusem rzekomej wścieklizny (PRV), alfaherpeswirusem blisko spokrewnionym z wirusem opryszczki pospolitej (HSV) i wirusem ospy wietrznej i półpaśca (VZV). Model ten pokazuje, że zakażenie PRV wywołuje ciężki stan zapalny, charakteryzujący się naciekiem neutrofili w opuszkach stopy i DRG. Wysokie stężenia cytokin zapalnych są następnie wykrywane w homogenizowanych tkankach za pomocą testu ELISA. Ponadto obserwuje się silną korelację między ekspresją genu PRV i białka (poprzez barwienie qPCR i IF) w DRG a wytwarzaniem cytokin prozapalnych. W związku z tym model inokulacji opuszki stopy pozwala lepiej zrozumieć procesy leżące u podstaw neuropatii wywołanych przez alfaherpeswirusa i może prowadzić do opracowania innowacyjnych strategii terapeutycznych. Ponadto model może stanowić podstawę badań nad neuropatiami obwodowymi, takimi jak stwardnienie rozsiane i związane z nim uszkodzenia PNS wywołane przez wirusy. W ostatecznym rozrachunku może służyć jako opłacalne narzędzie in vivo do opracowywania leków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie opisuje model inokulacji opuszki stopy w celu zbadania replikacji i rozprzestrzeniania się wirusów z PNS do OUN oraz związanych z tym reakcji neurozapalnych. Model inokulacji opuszki stopy był intensywnie wykorzystywany do badania infekcji wirusem alfaherpeswirusa w neuronach1,2,3. Głównym celem tego modelu jest umożliwienie wirusom neurotropowym pokonania maksymalnej odległości przez PNS przed dotarciem do OUN. W tym przypadku model ten służy do uzyskania nowych informacji na temat rozwoju określonej neuropatii (świądu neuropatycznego) u myszy zakażonych wirusem wścieklizny rzekomej (PRV).

PRV to alfaherpeswirus związany z kilkoma dobrze znanymi patogenami (np. wirusem opryszczki pospolitej typu 1 i 2 [HSV1 i HSV2] oraz wirusem ospy wietrznej i półpaśca [VZV]), które powodują odpowiednio opryszczkę, zmiany w narządach płciowych i ospę wietrzną4. Wszystkie te wirusy są pantropiczne i mogą infekować wiele różnych typów komórek, nie wykazując powinowactwa do określonego typu tkanki. Jednak wszystkie wykazują charakterystyczny neurotropizm poprzez inwazję na PNS (a czasami na OUN) gatunków gospodarzy. Naturalnym żywicielem jest świnia, ale PRV może zarazić większość ssaków. U tych nienaturalnych gospodarzy PRV infekuje PNS i wywołuje silny świąd zwany "szalonym swędzeniem", po którym następuje śmierć okołoostrą5,6. Rola odpowiedzi neuroimmunologicznej w wynikach klinicznych i patogenezie zakażenia PRV jest słabo poznana.

Model inokulacji opuszki stopy pozwala PRV zainicjować infekcję w komórkach naskórka opuszki. Następnie infekcja rozprzestrzenia się na czuciowe i współczulne włókna nerwowe, które unerwiają naskórek, gruczoły potowe i skórę właściwą. Infekcja rozprzestrzenia się przez cząsteczki wirusa przemieszczające się przez nerw kulszowy do DRG w ciągu około 60 godzin. Infekcja rozprzestrzenia się przez rdzeń kręgowy, ostatecznie docierając do tyłomózgowia, gdy zwierzęta stają się w stanie agonalnym (82 godziny po zakażeniu). W tym oknie czasowym próbki tkanek mogą być pobierane, przetwarzane i analizowane pod kątem replikacji wirusa i markerów odpowiedzi immunologicznej. Na przykład badanie histologiczne i kwantyfikacja wiremii mogą być przeprowadzone w różnych tkankach w celu ustalenia korelacji między inicjacją a rozwojem procesów klinicznych, wirusologicznych i neurozapalnych w patogenezie PRV.

Korzystając z modelu inokulacji opuszki stopy, można badać komórkowe i molekularne mechanizmy świądu wywołanego PRV u myszy. Co więcej, model ten może dostarczyć nowych informacji na temat inicjacji i rozwoju zapalenia nerwów wywołanego przez wirusa podczas infekcji wirusem opryszczki. Lepsze zrozumienie procesów leżących u podstaw neuropatii wywołanych przez alfaherpeswirus może doprowadzić do opracowania innowacyjnych strategii terapeutycznych. Na przykład model ten jest przydatny do badania mechanizmów swędzenia neuropatycznego u pacjentów ze zmianami popółpaścowymi (np. półpaścem, półpaścem) i testowaniem nowych celów terapeutycznych u myszy w przypadku odpowiednich chorób ludzkich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem (numery 2083-16 i 2083-19) sprawdzonym i zatwierdzonym przez Instytucję Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Princeton. Praca ta została wykonana przy ścisłym przestrzeganiu wymagań poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), do których mamy w pełni wyposażone laboratorium zatwierdzone przez komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego Uniwersytetu Princeton. Procedury, w tym ścieranie opuszki myszy opuszki podeszwy, inokulacja wirusa, sekcja myszy i pobieranie tkanek, zostały przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) w pomieszczeniu dla zwierząt na Uniwersytecie Princeton. Osoby wykonujące zabieg miały na sobie jednorazowe fartuchy, nakrycie głowy, ochronę oczu, sterylne rękawiczki, maski chirurgiczne i ochraniacze na buty.

1. Ścieranie podkładki pod nóżki myszy

  1. Znieczulij mysz C57BL/6 (w wieku 5–7 tygodni) znieczuleniem gazowym izofluranem, podawanym w dawce 3% przez mały system (komorę) znieczulający.
    1. Umieść mysz w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia na plecach, przed zaszczepieniem, w tylnej opuszki stopy. Przymocuj stożek nosowy z membraną (szczelina wystarczająco duża, aby pasowała do pyska zwierzęcia) do myszy i podawaj znieczulenie izofluranem w stałej dawce 1,5%-2,0%.
    2. Uważnie monitoruj mysz pod kątem reakcji na bolesny bodziec wywołany silnym szczypnięciem palca u nogi kleszczami.
  2. Lekko chwyć jedną tylną poduszkę stopy płaskimi kleszczami.
    1. Delikatnie zetrzyj nagą skórę tylnej poduszki stopy około 20 razy, między piętą a poduszkami do chodzenia, za pomocą szmergla (ziarnistość 100–180). Nie wywoływać krwawienia poprzez zbyt częste ścieranie lub wywieranie zbyt dużego nacisku.
    2. Za pomocą cienkich kleszczyków powoli oderwij warstwę rogową naskórka oderwaną przez ścieranie, aby odsłonić warstwę podstawną.

2. Szczepienie opuszki PRV

  1. Przygotować inokulum wirusa rozcieńczone do pożądanego miana w pożywce DMEM zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (tabela materiałów).
    1. Określ ilościowo liczbę jednostek tworzących blaszki (PFU) w zapasie wirusa na komórkach PK15, aby obliczyć i ustandaryzować dawkę wirusa i odpowiednio rozcieńczyć inokulum wirusa.
      UWAGA: W tym badaniu zastosowano zjadliwy szczep PRV (PRV-Becker) w dawce 8 x 106 PFU. Dawka ta została zoptymalizowana w poprzednim wstępnym eksperymencie, aby upewnić się, że wszystkie zaszczepione zwierzęta wykazywały objawy kliniczne po 82 godzinach od inokulacji (hpi).
    2. Utrzymuj inokulum wirusa na lodzie i delikatnie wymieszaj przed użyciem.
  2. Dodać 20 μl kropli inokulum wirusa (8 x 106 PFU) na startą opuszkę stopy (podanie miejscowe). Przeprowadzać szczepienia próbne (tylko pożywka) równolegle.
  3. Delikatnie przetrzyj 10x trzonkiem igły, aby ułatwić adsorpcję wirusa. Unikać drapania czubkiem igły. Powtarzaj ten krok co 10 minut.
  4. Trzymaj mysz w znieczuleniu przez 30 minut, aż starta podkładka wyschnie.
  5. Po przerwaniu znieczulenia monitoruj mysz, aż będzie w stanie utrzymać leżącą mostek i umieść ją w indywidualnej klatce w celu obserwacji klinicznej i pobrania próbek.

3. Sekcja myszy i pobieranie tkanek

  1. W odpowiednim czasie po zakażeniu należy poddać mysz eutanazji metodą uduszenia (CO2 ).
    UWAGA: W tym badaniu humanitarny punkt końcowy (kiedy zwierzęta zaczynają wykazywać objawy terminalne) dla myszy zakażonych PRV-Becker wynosi 82 hpi. Eutanazja zwierząt kontrolnych równolegle.
  2. Połóż mysz brzuszną stroną skierowaną do góry na macie chirurgicznej za pomocą igieł/szpilek. Przymocuj kończyny myszy za pomocą szpilek do chirurgicznej płyty piankowej. Zwilż brzuszną stronę myszy 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierści.
  3. Uszczypnij zewnętrzną warstwę futra i skóry za pomocą kleszczy i wykonaj małe początkowe nacięcie cienkimi nożyczkami w pobliżu ujścia cewki moczowej.
    1. Od tego otworu kontynuuj nacięcie po środkowej stronie brzusznej aż do podbródka.
    2. Przedłuż dwa boczne nacięcia w kierunku kończyn przednich i tylnych.
    3. Oddziel skórę od leżącej pod spodem warstwy mięśniowej i przypnij z boku.
    4. Otwórz jamę brzuszną i naciąć do podstawy klatki piersiowej. Zakończ otwarcie jamy brzusznej, wykonując dwa nacięcia poprzeczne.
    5. Otwórz klatkę piersiową, przecinając przeponę i żebra po obu bocznych stronach.
      UWAGA: Przecięcie boków klatki piersiowej zapobiega ryzyku skaleczenia serca.
    6. Zbierz odsłonięte narządy, w tym serce, płuca, śledzionę, trzustkę, wątrobę, nerki i pęcherz moczowy w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml. Trzymaj probówki na lodzie.
    7. Przeciąć startą podkładkę pod stopę między piętą a podkładkami do chodzenia i umieścić kawałek tkanki w tubie, jak opisano w kroku 3.3.6.
  4. Umieść mysz grzbietem do góry i zwilż futro 70% etanolem. Wytnij warstwę skóry, aby odsłonić kręgosłup.
    1. Wykonaj małe nacięcie w okolicy miednicy. Zdejmij skórę z tylnych kończyn w kierunku głowy.
    2. Usuń nogi i ramiona, tnąc nożyczkami równolegle do kręgosłupa i blisko niego po obu stronach.
    3. Odetnij głowę u podstawy czaszki (poziom C1–C2).
    4. Rozetnij czaszkę nożyczkami od otworu wielkiego do kości czołowej.
    5. Otwórz czaszkę w kierunkach bocznych za pomocą kleszczy.
    6. Delikatnie zgarnij mózg za pomocą kleszczy i postępuj zgodnie z opisem w kroku 3.3.6.
  5. Oczyść kręgosłup, przecinając mięśnie, tłuszcz i tkanki miękkie za pomocą zakrzywionych nożyczek. Odetnij ogon. Umieść nienaruszony kręgosłup w probówce o pojemności 15 ml zawierającej sterylny, lodowaty roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS). Trzymaj rurki na lodzie do czasu dalszej sekcji rdzenia kręgowego i DRG.

4. Ekstrakcja rdzenia kręgowego i DRG

UWAGA: Wyodrębnij rdzeń kręgowy i DRG z kolumny kręgów bezpośrednio po sekcji myszy. Protokół ekstrakcji rdzenia kręgowego i DRG został zaadaptowany z poprzedniej publikacji7.

  1. Wyjmij kręgosłup z lodowatej rurki PBS i usuń pozostałe tkanki miękkie, co staje się łatwiejsze po schłodzeniu.
  2. Wykonaj trzy poprzeczne nacięcia w kolumnie przez kręgi (poziomy T1, L1 i S2) za pomocą żyletki. Umieść trzy części na szalce Petriego o średnicy 15 mm zawierającej sterylny, lodowaty PBS. Śledź i oznaczaj początek segmentów do późniejszej analizy.
  3. Weź jeden segment i zabezpiecz go między kleszczami, grzbietową stroną skierowaną do góry. Wykonaj pojedyncze, podłużne cięcie przez linię środkową za pomocą żyletki, dzieląc kolumnę na dwie równe połowy.
  4. Umieść obie połówki na nowej szalce Petriego zawierającej nowy, sterylny, lodowaty PBS. Upewnij się, że segment jest prawidłowo zorientowany, aby móc odróżnić lewą i prawą stronę.
  5. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie oderwij rdzeń kręgowy z kolumny kręgów z każdej połowy w kierunku rostralnym do ogonowego za pomocą cienkich kleszczy.
  6. Zbierz obie połówki rdzenia kręgowego do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml zawierających 500 μl sterylnego, lodowatego PBS. Trzymaj probówki na lodzie.
  7. Delikatnie usuń opony mózgowe z jednej strony kręgosłupa na drugą, aby odsłonić DRG.
  8. Usuń każdy DRG indywidualnie, chwytając odsłonięty nerw rdzeniowy i delikatnie wyciągnij go z kręgosłupa. Umieść zebrany DRG na szalce Petriego o średnicy 15 mm zawierającej lodowaty PBS. Pobrać wszystkie ipsilateralne i przeciwległe DRG oddzielnie od segmentu kręgosłupa i postępować zgodnie z opisem w kroku 4.5.
    UWAGA: DRG jest widoczny jako okrągła przezroczysta struktura wzdłuż białego nerwu rdzeniowego.
  9. Powtórz kroki 4.3–4.7, używając dwóch pozostałych segmentów kręgosłupa w ciągu 30–45 minut.
  10. Odwirować wszystkie probówki z dużą prędkością (17 900 x g) przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  11. Probówki do zasysania supernatantu i błyskawicznego zamrażania w ciekłym azocie. Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C w celu dalszej homogenizacji tkanek.
  12. Alternatywnie, utrwalić i podzielić oczyszczone DRG i inne tkanki myszy do analiz histopatologicznych i/lub barwienia immunofluorescencyjnego po kroku 4.9.

5. Homogenizacja tkanek

  1. Rozmrozić probówki zawierające zamrożone próbki tkanek na lodzie.
  2. Zważyć 100 mg tkanki i umieścić ją w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml zawierającej sterylny stalowy koralik i 500 μl buforu RIPA zawierającego 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS i tabletki inhibitora koktajlu proteazy.
  3. Rozbić tkanki w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą homogenizatora przy 20 cyklach/s przez 2 minuty, następnie 1 minutę oczekiwania, a następnie 20 cykli/s przez 2 minuty.
  4. Odwirować probówkę z dużą prędkością (17 900 x g) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Zebrać supernatant (500 μl) w nowej probówce i przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu wykonania testów ELISA i qPCR w celu ilościowego określenia odpowiednio markerów stanu zapalnego i miana wirusa.
    UWAGA: W przypadku qPCR należy zebrać wszystkie próbki z materiałem wolnym od RNaz (tj. kulkami, probówkami itp.) i rozbić tkanki za pomocą buforu do lizy RNA zawierającego 1% betamerkaptoetanolu (tabela materiałów).

6. Przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne zamrożonych skrawków DRG

  1. Przetwarzanie tkanek
    1. Utrwalić wypreparowany i oczyszczony DRG w 1% paraformaldehydzie (PFA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Przenieś tkankę do probówki o pojemności 15 ml z 10% sacharozą w PBS. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Przenieś tkankę do probówki o pojemności 15 ml z 20% sacharozą w PBS. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Przenieś tkankę do probówki o pojemności 15 ml z 30% sacharozą w PBS. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Osadź tkanki w OCT za pomocą kriomoldu i umieść bloki w suchym lodzie w celu szybkiego zamrożenia.
    6. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  2. Przygotowanie do kriosekcji
    1. Wyjąć zamrożony blok z temperatury -80 °C i pozostawić do wyrównania temperatury w komorze kriostatu przez 30 minut.
    2. Przeprowadzić kriosekcję DRG o grubości 15 μm i zamontować sekcje na szkiełkach.
    3. Za pomocą pisaka narysuj hydrofobowy okrąg wokół chusteczki zamontowanej na szkiełku.
    4. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C aż do zabarwienia.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Umyj sekcje DRG 3x w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    2. Inkubować skrawki ze 100 μl pożądanego przeciwciała pierwszorzędowego (np. mysiego przeciwciała przeciwko glikoproteinie B PRV) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w PBS zawierającym 10% ujemnej surowicy koziej.
    3. Powtórz krok 6.3.1.
    4. Inkubować skrawki ze 100 μl pożądanego przeciwciała drugorzędowego (koziego przeciwciała anty-mysiego Alexa Fluor 488) przez 50 minut w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe tylko w PBS.
    5. Dodać 100 μl barwnika DAPI (4′,6-diamidyn-2-fenyloindolowego) rozcieńczonego w PBS na sekcję. Dalsze próbki inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    6. Powtórz krok 6.3.1.
    7. Umieścić próbki za pomocą fluorescencyjnego podłoża mocującego na szkiełkach podstawowych, zabezpieczyć i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.

7. Przygotowanie i barwienie H&E skrawków tkanek zatopionych w parafinie

  1. Utrwalić tkankę w 10% formalinie przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  2. Wykonaj standardowy harmonogram przetwarzania dla zatapiania parafiny i cięcia utrwalonych tkanek. Przenieś utrwalone tkanki do 70% etanolu i przeprowadź przez ulepszone alkohole na ksylen, a następnie parafinę, jak opisano wcześniej8.
    UWAGA: Użyj gąbek poliestrowych do przechowywania małych próbek tkanek, takich jak DRG, w kasetach.
  3. Wykonaj standardową deparafinowanie, a następnie barwienie H&E skrawków tkanek, jak opisano wcześniej9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model inokulacji opuszki myszy pozwala na scharakteryzowanie immunopatogenezy infekcji wirusem alfaherpeswirusa in vivo, w tym replikacji i rozprzestrzeniania się infekcji z zaszczepionej opuszki stopy do układu nerwowego oraz indukcji specyficznych reakcji neurozapalnych.

W tym badaniu, najpierw przetarliśmy tylną poduszkę stopy myszy i albo próbowaliśmy lub zaszczepiliśmy starty obszar zjadliwym szczepem PRV (PRV-Becker). Miejsce otarcia było widoczne w stopce sterowej. W miejscu ścierania p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj model inokulacji opuszki stopy jest przydatny do badania inicjacji i rozwoju odpowiedzi neurozapalnych podczas infekcji wirusem alfaherpeswirusa. Co więcej, ten model in vivo jest wykorzystywany do ustalenia kinetyki replikacji i rozprzestrzeniania się alfaherpeswirusa z PNS do OUN. Jest to alternatywa dla innych modeli inokulacji, takich jak model inokulacji skóry na boku, który opiera się na głębokim drapaniu skóry13, lub droga wewnątrzczaszkowa, która bezpośrednio wprowadza wirusa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują laboratoriom Charles River za doskonałe wsparcie techniczne przy przeprowadzaniu analiz histopatologicznych. Praca ta została sfinansowana przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 i RO1 NS060699). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-PRV gBWykonane przez laboratorium/500 rozcieńczenie
Aqua-hold2 pap pen czerwonyFisher scientific2886909
Kompaktowe tablice ścierne - 24 sztuki (pilniki do paznokci o ziarnistości 100/180)Revlon
Complete Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTASigma-Aldrich11836170001
C57BL/6 myszy (5-7 tygodni)The Jackson Laboratoria
Roztwór DAPI (1 mg / ml)Fisher scientific62248Rozcieńczenie 1/1000
Jednorazowa sterylna polistyrenowa szalka Petriego 100 x 15 mmSigma-AldrichP5731500
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Hyclone, GE Healthcare Life SciencesSH30022
Dulbecco's Phophate Buffer Sol (PBS)Hyklon, GE Healthcare Life SciencesSH30028
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Hyklon, GE Healthcare Life SciencesSH30088
Drobno zakrzywione nożyczki ze stali nierdzewnejFST14095-11
Fluoromount-G Media montażoweFisher scientific0100-01
Roztwór formaliny, neutralny buforowany 10%Sigma-AldrichHT501128
Isothesia IsofluranHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Probówka do mikrowirówek 2mlDenville Scientific 1000945
Microtube 1,5 mlSARSTEDT72692005
Ujemna surowica koziaWektorS-1000
Penicylina/StreptomycynaGibco154022
Igła Precision Glide 18GBD305196
Żyletki stalowy tyłPersonna9412071
Bufor do lizy RNA (RLT)Qiagen79216
Koraliki ze stali nierdzewnej, 5 mmQiagen69989
Superfrost/plus Fisherscientific12-550-15
Lizer tkanek LTQiagen69980
Tissue-Tek OCTSakura4583
488 (koza anty-mysz)Life TechnologiesA110291/2000 rozcieńczenie
1 Szkiełka mikroskopowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
  2. Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
  3. Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
  4. Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
  5. Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).
  6. Diseases of swine, 6th ed. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).
  7. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82(2016).
  8. Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
  9. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  10. Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608(2017).
  11. Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
  12. Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087(2019).
  13. Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
  14. Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
  15. Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
  16. Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
  17. Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).
  18. Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
  19. MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188(2018).
  20. Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
  21. Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49(2017).
  22. Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wirusowa odpowied neurozapalnazaka enie alphaherpeswirusemmodel wirusa pseudow ciekliznyanaliza zwoj w korzeni grzbietowychsekcja rdzenia kr gowegohomogenizacja tkanekdetekcja cytokin metod ELISAekspresja gen w qPCRbarwienie immunofluorescencyjne

Powiązane artykuły