Artykuł metodologiczny

Flypub do badania odhamowania behawioralnego i uwrażliwienia wywołanego etanolem

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61123

⸱

18 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Texas at El Paso

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Test Flypub mierzy zachowanie, jakie muszka owocowa Drosophila melanogaster przejawia pod wpływem etanolu. Test może być łatwo opanowany przez eksperymentatorów na wszystkich poziomach i stosowany do różnych odparowanych bodźców, ułatwiając badania nad nadużywaniem substancji i uzależnieniami.

Streszczenie

Zaburzenia związane z używaniem alkoholu (AUD) pozostają poważnym problemem w naszym społeczeństwie. Aby opracować skuteczne interwencje w przypadku uzależnienia, ważne jest zrozumienie podstawowych mechanizmów neurobiologicznych, dla których potrzebne są różnorodne podejścia eksperymentalne i systemy modelowe. Głównym składnikiem napojów alkoholowych jest etanol, który powoduje zmiany adaptacyjne w ośrodkowym układzie nerwowym i zachowaniu przy przewlekłym spożyciu. W szczególności uwrażliwienie behawioralne (tj. eskalacja reakcji) stanowi kluczową zmianę adaptacyjną leżącą u podstaw uzależnienia. Większość badań uczulenia behawioralnego wywołanego etanolem na modelach zwierzęcych przeprowadzono na aktywującym ruch efekt etanolu. Wyraźnym efektem działania etanolu jest odhamowanie behawioralne. Uwrażliwienie behawioralne na efekt odhamowania etanolu jest jednak niedostatecznie reprezentowane. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy test Flypub, który umożliwia pomiar eskalacji wzrostu odhamowanych działań związanych z zalotami po powtarzającym się narażeniu na etanol u Drosophila melanogaster. Tutaj przedstawiamy krok po kroku test Flypub, w tym montaż komór do ekspozycji na etanol, konfigurację stacji testowej, kryteria opieki nad muchami i zbierania, dostarczanie etanolu, kwantyfikacja odhamowanych działań związanych z zalotami, przetwarzanie danych i analiza statystyczna. Podano również, jak rozwiązywać problemy z krytycznymi krokami, pokonywać ograniczenia i rozszerzać jego użyteczność w celu oceny dodatkowych zachowań wywołanych etanolem. Test Flypub w połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi w Drosophila melanogaster ułatwi zadanie odkrycia mechanizmu leżącego u podstaw uczulenia behawioralnego wywołanego etanolem.

Wprowadzenie

Alkohol jest jednym z najłatwiej dostępnych i najczęściej spożywanych narkotyków na świecie. Ma wysoki potencjał do nadużywania i uzależnienia; Jednak mechanizm leżący u podstaw tego procesu pozostaje nie do końca poznany. Etanol wywołuje odhamowanie, euforię, upośledzenie funkcji poznawczych, nadpobudliwość, utratę kontroli motorycznej i uspokojenie u robaków1, muszki owocowe1,2,3, mice4, rats5 i ludzie6, wskazując na wspólne składniki neurobiologiczne pośredniczące w działaniu etanolu od bezkręgowców po ssaki, w tym ludzi. Przewlekłe przyjmowanie etanolu powoduje adaptacje neuronalne i modyfikacje behawioralne, które leżą u podstaw AUD. Jedną z adaptacji jest uczulenie behawioralne definiowane jako zwiększona reakcja z powtarzającymi się doświadczeniami z etanolem7,8,9 lub inne substancje uzależniające10,11,12.

Przez dziesięciolecia, badania nad uczulaniem behawioralnym wywołanym etanolem (EIBS) koncentrowały się na efekcie stymulującym motorykę, który jest używany jako wskaźnik reakcji euforycznej7,8,9,13. Na przykład szczury lub myszy po wielokrotnym (co 24, 48 lub 72 godzinach) podawaniu etanolu wykazują zwiększoną aktywność lokomotoryczną mierzoną prędkością chodu8,14,15,16,17,18,19,20,21. Podobnie, muszki owocowe poddane drugiej ekspozycji na opary etanolu 4 godziny po pierwszej ekspozycji wykazują zwiększoną reakcję lokomotoryczną, mierzoną również prędkością chodzenia22. Chociaż nie ma dostępnych informacji na temat mechanizmu leżącego u podstaw EIBS do efektu stymulującego ruch u muszek owocowych, badania na szczurach i myszach ujawniły składniki molekularne i sygnalizacyjne (na przykład układy dopaminy, glutaminianu i GABA), a także substraty i obwody nerwowe (na przykład brzuszny obszar nakrywki, jądro półleżące, ciało migdałowate i kora przedczołowa), które odgrywają główną rolę w EIBS6, 9,23.

Odhamowanie jest głównym efektem działania etanolu i prowadzi do przejawów zachowań, które zazwyczaj są ograniczone. Efekt odhamowujący wywierany jest na funkcje motoryczne, emocjonalne, społeczne, seksualne i poznawcze, co może prowadzić do niewłaściwych zachowań seksualnych, agresji werbalnej lub fizycznej oraz impulsywnych aktów u ludzi i modeli zwierzęcych24,25,26,27,28,29. Odhamowanie wywołane etanolem zostało zbadane w modelach zwierzęcych do badań mechanistycznych i obejmują one impulsywność ruchową i agresję u gryzoni i małp, a także odhamowanie żerowania u robaków6,9,24,28,29,30. Wykazaliśmy, że muszki owocowe wykazują odhamowane zachowania seksualne pod wpływem etanolu31. W szczególności, samce typu dzikiego rzadko zalecają się do innych samców bez etanolu31, a kiedy to robią, uprzejmości aktywnie odrzucają zaloty samców. Jednak pod wpływem etanolu samce much wykazują więcej zalotów do innych samców, a kurtuzany wykazują mniej odrzucenia, co skutkuje ogólnie zwiększonymi zalotami między samcami. Warto zauważyć, że muchy rozwijają behawioralne uczulenie na efekt odhamowania przy powtarzającej się ekspozycji na etanol, co służy jako unikalny system do badania EIBS31,32.

W tym raporcie opisujemy, jak skonfigurować, wykonać, rozwiązać problemy i przeanalizować test Flypub oraz dane do badania indukowanej etanolem dezynsekcji i uwrażliwienia u muszki owocowej Drosophila melanogaster. Aby zapewnić jego użyteczność i skuteczność, przetestowaliśmy Canton-S typu dzikiego (CS; szczep muchy kontrolnej) wraz z muchami z niedoborem tyraminy β hydroksylazy (tβh), która syntetyzuje oktopaminę (OA). Choroba zwyrodnieniowa stawów jest głównym neuromodulatorem u bezkręgowców33,34 i odgrywa kluczową rolę w rozwoju tolerancji etanolu u much22. Po raz pierwszy informujemy, że otwarty dostęp jest ważny dla EBI.

Protokół

UWAGA: Sekcja protokołu szczegółowo opisuje etapy przygotowawcze, testy i analizy Flypub, które obejmują (1) montaż komory, (2) opiekę nad muchami i zbieranie, (3) ustawienie stacji testowej, (4) ekspozycję na etanol, (5) ocenę zalotów i analizę danych oraz (6) analizę statystyczną. Kluczowe kroki przeprowadzania testu i analizy Flypub są przedstawione w przepływie pracy (Rysunek 1).

1. Montaż komory (Rysunek 2)

  1. Odetnij dolną część okrągłej butelki Drosophila w miejscu oznaczonym 25 ml za pomocą żyletki.
  2. Wykonaj otwór o średnicy 5 mm w miejscu oznaczenia 50 ml butelki za pomocą gorącej lutownicy.
    UWAGA: Jest to punkt dostępu, w którym muchy zostaną przeniesione do komory.
  3. Wytnij arkusz siatki w okrąg o średnicy 54 mm, aby zmieścił się w butelce Drosophila na znaku 75 ml.
  4. Zabezpiecz siatkę w miejscu oznaczenia 75 ml butelki za pomocą gorącego kleju.
  5. Pokrój arkusz poliwęglanu w okrąg o średnicy 70 mm.
  6. Przymocuj plastikowy arkusz poliwęglanu do butelki w miejscu oznaczenia 25 ml (dolna otwarta przestrzeń wykonana w kroku 1.1) za pomocą gorącego kleju.
  7. Dociśnij w dół za pomocą obciążników, aby upewnić się, że okrągły poliwęglan jest mocno przymocowany do dna.
  8. Umyj puby etanolem, aby usunąć wszelkie zapachy i obficie spłucz je wiele razy pod bieżącą wodą destylowaną. Energicznie wstrząśnij pubami, aby usunąć nadmiar wody.
  9. Osusz puby, kładąc je poziomo na ręcznikach papierowych w temperaturze pokojowej.

2. Pielęgnacja i zbieranie much

  1. Utrzymuj muchy na standardowym podłożu spożywczym z mąki kukurydzianej/agaru/cukru/drożdży (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).
  2. Zbierz jedno- lub dwudniowe samce much w grupie 33, które reprezentują jeden punkt danych, w znieczuleniu dwutlenkiem węgla (CO2). Upewnij się, że wybrałeś muchy z nienaruszoną morfologią i umieść je w fiolce z jedzeniem, aby wyzdrowieć.
    UWAGA: Dopuszczalne są dwie lub trzy muchy mniej na grupę. Zachowania mogą być wrażliwe na ustawienia eksperymentalne, dlatego całkowita liczba much na pub może wymagać dostosowania za pomocą linii kontrolnej.
    UWAGA: Upewnij się, że fiolka z jedzeniem jest położona z boku, aby znieczulone muchy nie przykleiły się do jedzenia.
  3. Muchy należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 25 °C o wilgotności względnej co najmniej 50% i 12-godzinnym cyklu światła / 12 godzin ciemności przez 2 dni przed ekspozycją na etanol.
    UWAGA: Usuwanie CO2 ma kluczowe znaczenie dla wyeliminowania wszelkich skutków fizjologicznych lub behawioralnych wywołanych przez CO2, które mogą zmienić reakcje wywołane etanolem.
  4. Użyj kodów, aby zaślepić genotypy much lub warunki leczenia dla eksperymentatorów przeprowadzających ekspozycję na etanol i oceniających zachowania godowe.
    UWAGA: Ślepe testy pomagają wyeliminować błąd systematyczny eksperymentu.

3. Ustawienie stacji probierczej (Rysunek 3A)

  1. Ustaw stojak na kopie kopie z dołączonym środkowym ramieniem na blacie w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
    UWAGA: Stojak na kopie nie jest obowiązkowy. Wystarczające jest dowolne urządzenie do przemieszczania, które zapewnia platformę poziomą.
  2. Clamp dwa boczne ramiona do stojaka, tak aby każde ramię znajdowało się około 18 cm od środka stojaka.
  3. Umieść lampę fluorescencyjną na każdym ramieniu stojaka i jedną pośrodku.
  4. Przymocuj magnetowid do środkowego ramienia, około 38 cm powyżej środka podstawy. Spowoduje to nagranie pubów z widoku z góry.
  5. Przykryj podstawę stojaka białym papierem, który pomaga wizualizować ciemne muchy, aby stworzyć kontrast.
  6. W dniu ekspozycji włącz lampy fluorescencyjne i komputer podłączony do kamery wideo, która jest podłączona do podstawki pod kserokopiarkę (Rysunek 3A).
    UWAGA: Natężenie światła 2100-2200 luksów zapewnia dobrą jakość rejestrowanych zachowań do punktacji. Jednak warunki oświetlenia otoczenia w laboratorium są wystarczające, aby zaobserwować zaloty wywołane etanolem.
  7. Przygotuj przedmioty, które mają być użyte do ekspozycji na etanol przedstawione w Rysunek 3B.
  8. Zbierz sześć czystych, zmontowanych pubów do zestawu eksperymentów i oznacz je kodami od 1 do 6.
    UWAGA: Upewnij się, że umieściłeś losowe kody na genotypach much lub warunkach leczenia.

4. Ekspozycja na etanol (Rysunek 3)

  1. Delikatnie przenieś grupę 33 samców do komory Flypub przez otwór w znaku 50 ml za pomocą małego lejka.
    UWAGA: Aby zminimalizować naprężenia mechaniczne much, podczas przenoszenia umieść podkładkę pod mysz lub dowolny materiał amortyzujący pod pubem.
  2. Zakryj otwór taśmą.
    UWAGA: Taśma służy do zamykania otworu, zapobiegając wydostawaniu się much z pubu.
  3. Wyrównaj puby na scenie od 1 do 6.
  4. Przyzwyczajaj muchy do komory przez 10 minut (Rysunek 3D).
  5. Dostosuj ustawienia aparatu, w tym ostrość, zoom i jasność, a następnie nagraj ostatnie 5 minut aklimatyzacji, aby zmierzyć podstawowy poziom zalotów.
    UWAGA: Aby wyeliminować odblaski generowane przez odbicie światła od pubu, umieść chusteczki laboratoryjne (zwykle 4 warstwy lub mniej niż 1 mm grubości) na dnie pubu, aby wyregulować kąt.
  6. Przygotuj waciki do dostarczania etanolu, przecinając podkładkę na cztery równe ćwiartki czystymi nożyczkami, a następnie przytnij rogi, aby zmieściła się na szalce Petriego podczas aklimatyzacji (Rysunek 3C).
    UWAGA: Nie używaj gołymi rękami do obsługi wacików. Używaj kleszczy do obchodzenia się z wacikami, aby uniknąć potencjalnego przenoszenia zapachów.
  7. Dodaj wacik do każdej szalki Petriego.
  8. Dodaj 1 ml 95% etanolu do każdego wacika, upewnij się, że roztwór etanolu jest równomiernie rozprowadzony na całej powierzchni płatka.
  9. Przykryj dwuwarstwowymi chusteczkami laboratoryjnymi, aby uniknąć szybkiego parowania etanolu.
  10. Po aklimatyzacji umieść małą szalkę Petriego zawierającą wacik nasączony etanolem i dwuwarstwowe chusteczki laboratoryjne przez dolny otwór pubu.
  11. Wyrównaj puby na scenie, rozpocznij nagrywanie i jednocześnie uruchom stoper.
  12. Nagrywaj puby, w których znajdują się muchy podczas ekspozycji na etanol, dopóki muchy nie przestaną się zalecać lub poruszać z powodu uspokojenia.
  13. Usuń szalkę Petriego zawierającą etanol z każdego pubu za pomocą szpatułki, gdy ponad 90% much jest uspokojonych.
  14. Delikatnie przenieś muchy z powrotem do przypisanych im fiolek przez otwór w znaku 50 ml w pubie.
    UWAGA: Umieść lejek na fiolkach z jedzeniem, aby ułatwić przenoszenie. Upewnij się, że umieściłeś uspokojone muchy z boku fiolek z jedzeniem, aby zapobiec ich utknięciu w jedzeniu.
  15. Oczyść puby etanolem, aby usunąć wszelkie zapachy i obficie spłucz je wiele razy pod bieżącą wodą destylowaną. Energicznie wstrząśnij pubami, aby usunąć nadmiar wody.
  16. Osusz puby, kładąc je poziomo na ręcznikach papierowych w temperaturze pokojowej.
  17. Muchy należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 25 °C o wilgotności względnej co najmniej 50% i cyklu 12 godzin światła / 12 godzin ciemności.
  18. Powtarzaj kroki 4.1-4.17 co 24 godziny przez sześć kolejnych dni i upewnij się, że przeprowadzasz ekspozycję na etanol o tej samej porze dnia, aby uniknąć jakichkolwiek skutków okołodobowych.
    UWAGA: Zmieniaj fiolki z jedzeniem co 2-3 dni, aby utrzymać zdrowe muchy.

5. Punktacja zalotów i analiza danych (Rysunek 4-6)

  1. Otwórz nagrane filmy za pomocą odtwarzacza multimedialnego (np. VLC) i powiększ wideo, aby wyraźnie obserwować muchy do zdobycia (Rysunek 4A).
  2. Dołącz kod czasowy do filmu (Rysunek 4B).
  3. Policz liczbę samców zaangażowanych w czynności związane z zalotami, w tym podążanie, jednostronne wysuwanie skrzydeł, łańcuch zalotów, krąg zalotów, zginanie brzucha i dosiadanie na każde 10 s bloku czasowego31 (Rysunek 5).
  4. Wprowadź do arkusza liczbę samców wykazujących zaloty na każde 10 sekund bloku czasu (Rysunek 6A).
  5. Użyj maksymalnej liczby zalecających się samców w trzech kolejnych 10-sekundowych blokach czasowych jako reprezentatywnego punktu danych (Rysunek 6B).
  6. Oblicz średnią z 10 kolejnych punktów danych o najwyższej wartości (Rysunek 6C), a to reprezentuje procent zalotów między mężczyznami na pub (Rysunek 6A).

6. Analiza statystyczna (Rysunek uzupełniający 1)

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy statystycznej (np. Minitab 17) i dodaj dane dotyczące zalotów w arkuszu.
    UWAGA: Można użyć dowolnego oprogramowania do analizy statystycznej.
  2. Aby określić rozkład danych (rozkład normalny lub nienormalny), przejdź do zakładki Statystyki, wybierz Podstawowe statystyki i kliknij opcję Test normalności (Rysunek uzupełniający 1Ai).
  3. W polu Zmienna wybierz poszczególne kolumny (każda kolumna reprezentuje zestaw danych badanego genotypu lub leczenia), wybierz test Andersona-Darlinga i kliknij przycisk OK (Rysunek uzupełniający 1Aii).
    UWAGA: Wykres prawdopodobieństwa normalności pokaże obliczoną wartość P: jeśli wartość P jest większa niż 0,05, oznacza to, że dane mają rozkład normalny. Jeśli wartość P jest mniejsza niż 0,05, dane mają rozkład inny niż normalny (rysunek uzupełniający 1Aiii).
  4. Aby porównać wiele grup, ułóż kolumny do porównania, klikając kartę Dane, wybierz pozycję Stos, a następnie pozycję Kolumny (rysunek uzupełniający 1Bi).
  5. W oknie Stos kolumn wybierz kolumny danych, które mają zostać ułożone w stos, wybierz stos wykonany w obszarze Nowy arkusz lub Kolumna bieżącego arkusza z następną kolumną przeznaczoną do oznaczania indeksu dolnego (np. tożsamość grupy danych; Rysunek uzupełniający 1Bii-1Biii).
  6. Kliknij kartę Statystyki, wybierz test ANOVA, wybierz Ogólny model liniowy, a następnie kliknij Dopasuj ogólny model liniowy (Rysunek uzupełniający 1Ci).
  7. W oknie Ogólny model liniowy wybierz kolumny do porównania w polu Odpowiedzi, wybierz kolumnę z indeksem dolnym w polu Czynniki i kliknij przycisk OK, co prowadzi do wyników analizy statystycznej (Rysunek uzupełniający 1Cii-1Ciii).
  8. Aby porównać dwie grupy z danymi o rozkładzie normalnym, kliknij kartę Statystyki, wybierz Podstawowe statystyki i wybierz test t dla 2 prób (Rysunek uzupełniający 1Di).
  9. W oknie 2-Sample t for the Average (Średnia) wybierz opcję Each sample is in its own column (Każda próbka znajduje się w osobnej kolumnie) z listy rozwijanej wybierz dwie grupy do porównania w polach Sample 1 (Próbka 1) i Sample 2 (Próbka 2), a następnie kliknij przycisk OK, co spowoduje wyświetlenie wyników analizy statystycznej (Rysunek uzupełniający 1Dii-1Diii).
  10. Aby porównać dwie grupy z danymi o rozkładzie nienormalnym, przejdź do zakładki Stat, wybierz Nieparametryczne i kliknij Mann-Whitney (Rysunek uzupełniający 1Ei)
  11. W oknie Manna-Whitneya wybierz dwie grupy do porównania w polach Pierwsza próbka i Druga próbka, a następnie kliknij przycisk OK, co prowadzi do wyników analizy statystycznej (Rysunek uzupełniający 1Eii-1Eiii).
  12. W celu porównania trzech lub więcej grup danych o rozkładzie nienormalnym należy przejść do zakładki Statystyki, wybrać opcję Nieparametryczne, a następnie kliknąć test Kruskala-Wallisa (rysunek uzupełniający 1Fi).
  13. W oknie Kruskala-Wallisa wybierz kolumny do porównania w polu Odpowiedź, wybierz kolumnę z indeksem dolnym w polu Współczynnik i kliknij przycisk OK, co prowadzi do wyników analizy statystycznej (Rysunek uzupełniający 1Fii-1Fiii).

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono wyniki reprezentatywnego eksperymentu Flypub. Samce Drosophila rzadko zabiegają o inne samce35,36. Podczas pierwszej ekspozycji na etanol samce typu dzikiego Canton-S (CS) wykazały niewielki, lecz nieistotny wzrost odhamowanych zalotów między samcami31 (Rysunek 7A). Jednakże u samców CS zaobserwowano zwiększone nasilenie aktywności odhamowanych zalotów w kolejnych ekspozycjach na etanol (ANOVA GLM, CS: R2=0.83, F(5,66) =65.21, p < 0.0001; n = 12; Rysunek 7A), co wskazuje na behawioralną sensytyzację na efekt odhamowania wywołany przez etanol. Wykazaliśmy wcześniej, że ten typ EIBS wymaga dopaminy oraz receptora dopaminowego DopEcR w neuronach grzyba31,32.

Aby ustalić, czy w EIBS biorą udział dodatkowe neuromodulatory, zbadaliśmy rolę OA, testując muchy (tβh; allel null nM18)37,38 pozbawiony tyraminy β hydroksylaza, enzym ograniczający szybkość biosyntezy OA, a zatem wykazujący niedobór w OA. tβh samce w CS tło genetyczne (uprzejmie przekazane przez dr. Andreasa Thuma z Uniwersytetu w Lipsku w Niemczech) wykazywało uwrażliwioną, odhamowaną reakcję kojarzenia po codziennej ekspozycji na etanol (ANOVA GLM, tβh: R2=0.67, F(5,66) =27.60, p < 0.0001; n = 12; Rysunek 7B) ale na poziomie obniżonym w porównaniu do CS (GLM ANOVA, efekt interakcji: F =2.50, p <0,034). W analizie post hoc tβh samce wykazywały niższy poziom zalotów między samcami przy każdej ekspozycji, co było najbardziej widoczne podczas czwartej do szóstej ekspozycji na etanol, w porównaniu do CS (Test t dla dwóch prób: p < 0,002 w EXP4, p < 0,004 w EXP5, p < 0,021 w EXP6; n = 12; Rycina 7C). Wspólnie wyniki te wskazują, że OA może odgrywać rolę w EIBS w odniesieniu do efektu odhamowania wywołanego przez etanol. Co ważniejsze, zbiory danych te wyraźnie demonstrują użyteczność i skuteczność testu Flypub w badaniu indukowanego etanolem odhamowania i uczulenia.

figure-results-1
Rycina 1: Schemat przepływu analizy Flypub. Schemat przepływu przedstawiający kluczowe etapy przeprowadzania analizy Flypub. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Materiały i montaż komory Flypub. (A) Materiały niezbędne do budowy komory Flypub obejmują (i) wkład do pistoletu z klejem na gorąco, (ii) pistolet z klejem na gorąco, (iii) żyletkę, (iv) lutownicę, (v) linijkę, (vi) siatkę, (vii) arkusz poliwęglanu oraz (viii) okrągłą butelkę dla Drosophila. (B) Schematyczny rysunek montażu komory Flypub. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Ekspozycja na etanol. (A) Całkowicie zmontowana stacja Flypub. (B) Materiały wymagane do ekspozycji na etanol obejmują (i) mikropipetę P1000, (ii) taśmę, (iii) wacik bawełniany, (iv) szalkę Petriego, (v) chusteczki laboratoryjne, (vi) mały lejek, (vii) timer, (viii) średni lejek, (ix) podkładkę pod mysz, (x) nożyczki, (xi) 95% etanol, (xii) pęsetę oraz (xiii) szpatułkę. (C) Kroki obrazujące sposób cięcia wacików bawełnianych. (D) Widok z góry na ustawione na platformie puby. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Konfiguracja wideo do oceny behawioralnej. Przedstawiono instrukcję krok po kroku dotyczącą (A) powiększania obrazu w wideo oraz (B) wstawiania pliku z kodem czasowym do odtwarzacza VLC w celu przeprowadzenia oceny behawioralnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Zachowania godowe samców. Reprezentatywne obrazy ilustrują zachowania godowe samców Drosophila, w tym podążanie i jednostronne wyciąganie skrzydła dla (A) pieśni godowej, (B) łańcucha godowego, (C) kręgu godowego, (D) zginania odwłoka oraz (E) kopulacji, które są wykorzystywane do oceny behawioralnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rysunek 6: Wprowadzanie i analiza danych. (A) Liczba samców biorących udział w zalotach w każdym 10 s przedziale czasowym jest wpisywana do arkusza. Najwyższa liczba samców wykonujących zaloty z trzech kolejnych 10 s przedziałów czasowych (zielona strzałka) służy jako reprezentatywny punkt danych. Średnia z 10 kolejnych punktów danych (niebieski lub pomarańczowy nawias) o wartości maksymalnej reprezentuje procent zalotów między samcami na pub [pomarańczowy nawias; MAX (średnia), czarna strzałka]. (B,C) Formuły w arkuszu użyte do obliczenia maksymalnego reprezentatywnego punktu danych oraz maksymalnej średniej z 10 kolejnych reprezentatywnych punktów danych na pub. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Indukowana etanolem odhamowanie behawioralne i sensytyzacja w CS i tβh. (A,B) Ten CS i tβh samce wykazywały uwraźnione odhamowanie zachowań godowych przy powtarzalnych ekspozycjach na etanol (ANOVA GLM, CS: R2=0.83, F(5,66)=65.21, p < 0.0001; tβh: R2=0.67, F(5,66)=27.60, p < 0.0001; n = 12). (C) The tβh samce wykazywały mniejszą odhamowaną aktywność zalotną w porównaniu do CS (n=12). p Wartości analiz post hoc przedstawiono powyżej linii. Aktywność zalotową między samcami analizowano na podstawie nagrań wideo wykonanych dla każdej ekspozycji na etanol. Wszystkie dane przedstawiono jako średnie. ± błąd standardowy średniej Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Analiza statystyczna.Kroki w oprogramowaniu Minitab 17 dotyczące przeprowadzania (A) testu normalności, (B) piętrowania danych, (C) testu ANOVA w ogólnym modelu liniowym, (D) testu t dla dwóch prób, (E) testu Mann-Whitneya oraz (F) testu Kruskala-Wallisa. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym raporcie opisaliśmy konfigurację i szczegółowy protokół testu Flypub; Nowatorska metoda mierzenia, w jaki sposób powtarzające się narażenie na etanol wyzwala odhamowane zaloty i uwrażliwienie behawioralne. Chociaż test Flypub jest stosunkowo prosty, kilka kroków wymaga ostrożności i uwagi, aby zapewnić wiarygodne wyniki. Po pierwsze, muszki do testów muszą być w pełni pigmentowane (tj. w pełni rozwinięte dorosłe muchy), zdrowe i nienaruszone. Deformacje lub uszkodzenia, zwłaszcza skrzydeł lub nóg, mogą wpływać na zdolność samca do zalecania się. Po drugie, wiek muchy jest ważny i musi być dopasowany między grupą kontrolną i eksperymentalną (optymalny wiek: 3-5 dni przy ekspozycji na etanol 1). Dwutygodniowe i starsze samce much typu dzikiego mają tendencję do wykazywania podwyższonego poziomu odinstalowanych zalotów31. W związku z tym właściwe dopasowanie wieku badanych much jest niezbędne, aby uniknąć zmiennych wyników. Po trzecie, istotna jest liczba much na pub (optymalnie: 33 na pub). Niższa lub wyższa liczba much w pubie może znacznie zniekształcić wyniki zalotów (dane nie pokazane). Po czwarte, komory Flypub muszą mieć identyczne objętości, jak pokazano na rysunku 2B. Gwarantuje to, że muchy odbierają parę etanolu synchronicznie, a wywołane zachowania są spójne. Po piąte, niezbędne jest wyraźne nagrywanie wideo i precyzyjna ocena zalotów. Protokół ten w dużym stopniu zależy od obserwacji behawioralnych, więc skrupulatne przestrzeganie standardowego protokołu oceny zalotów ma fundamentalne znaczenie dla zminimalizowania niespójnych wyników. Wreszcie, zdecydowanie zaleca się, aby zarówno ekspozycja na etanol, jak i etapy oceny zalotów były wykonywane na ślepo, gdy eksperymentator nie jest świadomy genotypów much lub eksperymentalnych zabiegów, zapobiegając w ten sposób błędowi eksperymentu.

Test Flypub ma wiele zalet. Po pierwsze, wiele grup much może być testowanych i porównywanych jednocześnie. Po drugie, jest niedrogi, prosty w konfiguracji i łatwy do nauczenia, dzięki czemu jest bardzo przystępny dla eksperymentatorów na wszystkich poziomach, w tym szkół podstawowych i średnich, studentów studiów licencjackich i magisterskich, doktorantów i wykładowców, a także laboratoriów dydaktycznych o ograniczonej przestrzeni i budżecie. Po trzecie, można go wykorzystać do pomiaru dodatkowych zachowań, takich jak odhamowane zaloty samic much i uspokajające działanie etanolu lub innych środków uspokajających, aby ocenić początkową wrażliwość i tolerancję, rozwój i utrzymanie31,32. Razem Flypub jest wszechstronną metodą badania różnych cech AUD.

Głównym ograniczeniem testu Flypub jest rygorystyczny i pracochłonny reżim punktacji zalotów. Zachowanie godowe pod wpływem etanolu jest bardzo dynamiczne w taki sposób, że czas trwania zalotów waha się od mniej niż jednej sekundy do wielu minut, a muchy zaangażowane w zaloty dość często się zmieniają. Przedstawiony tutaj system punktacji został opracowany w celu uwzględnienia tej dynamicznej natury i zapewnienia spójnych wyników dla indywidualnych ekspozycji na etanol dla danego genotypu 31,32. Jak zaznaczono w protokole, aktywność zalotów jest oceniana ręcznie, co jest czasochłonne. Opracowano kilka zautomatyzowanych programów punktacji, aby ułatwić bezstronne, wysokoprzepustowe badania behawioralne, z których wszystkie opierają się na ruchach i lokalizacjach poszczególnych much 39,40,41,42,43,44,45. Próbowaliśmy również opracować oprogramowanie komputerowe, które automatycznie liczyłoby aktywność zalotów, ale nie byliśmy w stanie uzyskać spójnych i wiarygodnych wyników. Może to wynikać z faktu, że ocena behawioralna obejmuje wiele etapów zalotów (tj. podążanie, jednostronne rozciąganie skrzydeł, zginanie brzucha i dosiadanie)35,36,46 wielu much jednocześnie. Nawet przy tym ograniczeniu, eksperymentator z odpowiednim przeszkoleniem powinien być w stanie określić ilościowo zachowania zalotów wywołane etanolem z konsekwencją i dokładnością. Niemniej jednak bardzo pomocne i ważne byłoby przyjęcie uczenia maszynowego lub innych zaawansowanych algorytmów jako kontynuacji.

Podobnie jak w przypadku modeli gryzoni, badania nad etanolem w modelu muchowym w dużej mierze koncentrowały się na stymulującym działanie lokomotoryczne i uspokajające etanolu. Test Flypub mierzy jednak odhamowane zaloty, rodzaj odhamowania poznawczego, który jest nowy31,32. Dlatego Flypub może pomóc w wyjaśnieniu graczy molekularnych, szlaków komórkowych i obwodów neuronalnych, a także czynników ryzyka (np. wieku, snu, diety lub środowiska społecznego) krytycznych dla odhamowania behawioralnego i uwrażliwienia. Wcześniej wykazaliśmy, że sygnalizacja dopaminy jest wymagana dla EIBS, co jest zgodne z wynikami w modelach gryzoni i ludziach 6,9,31. Również jako dowód słuszności koncepcji zbadaliśmy mutanta tβh pozbawionego choroby zwyrodnieniowej stawów (bezkręgowego odpowiednika noradrenaliny) i stwierdziliśmy, że choroba zwyrodnieniowa stawów jest również ważna dla behawioralnego uwrażliwienia na efekt odhamowywania etanolu, chociaż jego udział jest stosunkowo niewielki w porównaniu z dopaminą31. Odkrycie to kontrastuje z obserwacją Scholza47, że zmutowane muchy tβh nie wykazują oczywistych upośledzeń w uwrażliwieniu na lokomotoryczne działanie aktywujące etanol47. Sugeruje to odrębne szlaki molekularne, komórkowe i neuronalne pośredniczące w uwrażliwieniu behawioralnym na odhamowanie w porównaniu z aktywacją lokomotoryczną. Dalsze badania powinny dalej współpracować z tym kuszącym pojęciem.

Podsumowując, Flypub jest tanią, wieloaspektową i skuteczną metodą badania reakcji behawioralnych na etanol, w szczególności odhamowania i uwrażliwienia behawioralnego, która może pomóc w lepszym zrozumieniu AUD i zapewnić wgląd w skuteczne interwencje w przypadku tego przewlekłego zaburzenia.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain & Behavior Research Foundation NARSAD oraz NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster. Jesteśmy również wdzięczni finansowanemu przez NIH programowi RISE (NIGMS 5R25GM069621) za wspieranie NMD i CMS, programowi UTEP COURI-SURPASS wspierającemu NMD, finansowanemu przez NIH programowi MARC (NIGMS 2T34GM008048-31) za wspieranie AA oraz Dr. Keelung Hong Graduate Fellowship za wspieranie EBS. Jesteśmy bardzo wdzięczni działowi komunikacji UTEP: Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, Jose Loya Fernandez oraz działowi muzycznemu: Stephenowi A. Haddadowi za pomoc w produkcji wideo i lektora. Na koniec jesteśmy bardzo wdzięczni dr Andreasowi Thumowi za podzielenie się mutantem tβh w tle Canton-S wraz z kontrolnymi muchami Canton-S; oraz Jessica Burciaga za jej cenny wkład we wstępne badania nad oktopaminą oraz członkom laboratorium Han za dyskusję i wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
95 % etanoluVWR ChemicalsBDH1158-4LP
i>Canton-S--Wild type szczep używany jako kontrola
Stojak na kopie z ramionamiKaiser205411model RS 2-XA, z jednym ramieniem centralnym i dwoma ramionami bocznymi; aby ustawić stację flypub
Bawełniane krążkiSwisspersCOT-027do dostarczania etanolu
PrzewyższaćMicrosoft-do analizowania danych; można użyć dowolnego arkusza roboczego lub arkusza kalkulacyjnego
Żarówka fluorescencyjnaLights of America7108N(maks. 120 V-70 W); do oświetlenia stacji flypub
Oprogramowanie Microsoft LifeCamMicrosoftwwersji 3.60; do nagrywania flypubów
Microsoft LifeCam StudioMicrosoftQ2F-00013Czujnik HD 1080P; do nagrywania flypubów
Minitab 17Minitab-wersja17; do przeprowadzania analiz statystycznych; można użyć dowolnego oprogramowania do analizy statystycznej
Arkusz siatki nylonowejSefar Nitex-modelB0043D1TVY, nieprzezroczysty biały, siatka 200 mikronów; do zrobienia flypub
Szalki PetriegoSokół08-757-100A35 x 10 mm; do dostarczania etanolu
Lejek plastikowy - średniej wielkościFisher scientific10-348Aśrednica 65 mm i wysokość 67 mm; do przenoszenia uspokojonych much z flypubu do fiolki z jedzeniem
Lejek plastikowy - małyFisher scientific07-202-121średnica 4 mm i wysokość 46 mm; do przenoszenia much z fiolki do flypub
Arkusz poliwęglanumm grubość, przezroczysty, 610 x 1220 mm nominalny; zrobić flypub
Butelka okrągłodennaFisher scientificAS115polipropylen o wysokości 103 mm, średnicy 60 mm i pojemności 177 ml; zrobić
lutownicęWellerWES51zrobić dziurę w flypub
Kod czasowy-plik .smi, kod czasowy tykający napisy utworzony w laboratorium Han; monitorowanie czasu podczas punktacji zalotów; za każdym razem, gdy można użyć napisów
Tyramina β hydroksylaza (tβ h)--zmutowany szczep muchy (nM18 allel zerowy) z niedoborem tβ h w tle typu dzikiego Canton-S ; uzyskane od dr Andreasa Thuma (Uniwersytet w Lipsku, Leipzeig, Niemcy)
Odtwarzacz multimedialny VLCVideoLAN-wersja3.0.8; do zdobywania zalotów można użyć dowolnego odtwarzacza multimedialnego
< Maksymalnie Lexan-0,762 flypub

Bibliografia

  1. Scholz, H. Unraveling the Mechanisms of Behaviors Associated With AUDs Using Flies and Worms. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (11), 2274-2284 (2010).
  2. Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual Review of Neuroscience. 36, 121-138 (2013).
  3. Park, A., Ghezzi, A., Wijesekera, T. P., Atkinson, N. S. Genetics and genomics of alcohol responses in Drosophila. Neuropharmacology. 122, 22-35 (2017).
  4. Kippin, T. E. Adaptations underlying the development of excessive alcohol intake in selectively bred mice. Alcoholism: Clinical Experimental Research. 38 (1), 36-39 (2014).
  5. Bell, R. L., et al. Rat animal models for screening medications to treat alcohol use disorders. Neuropharmacology. 122, 201-243 (2017).
  6. Nona, C. N., Hendershot, C. S., Le, A. D. Behavioural sensitization to alcohol: Bridging the gap between preclinical research and human models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 173, 15-26 (2018).
  7. Robinson, T. E., Berridge, K. C. The neural basis of drug craving: an incentive-sensitization theory of addiction. Brain Research Reviews. 18 (3), 247-291 (1993).
  8. Masur, J., Boerngen, R. The excitatory component of ethanol in mice: a chronic study. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 13 (6), 777-780 (1980).
  9. Camarini, R., Pautassi, R. M. Behavioral sensitization to ethanol: Neural basis and factors that influence its acquisition and expression. Brain Research Bulletin. 125, 53-78 (2016).
  10. Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology (Berl). 52 (2), 185-191 (1977).
  11. Short, P. H., Shuster, L. Changes in brain norepinephrine associated with sensitization to d-amphetamine. Psychopharmacology (Berl). 48 (1), 59-67 (1976).
  12. Vanderschuren, L. J., Pierce, R. C. Sensitization processes in drug addiction. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 3, 179-195 (2010).
  13. Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5 (4), 9954(2010).
  14. Broadbent, J., Harless, W. E. Differential effects of GABA(A) and GABA(B) agonists on sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in DBA/2 J mice. Psychopharmacology (Berl). 141 (2), 197-205 (1999).
  15. Camarini, R., Andreatini, R., Monteiro, M. G. Prolonged treatment with carbamazepine increases the stimulatory effects of ethanol in mice. Alcohol. 12 (4), 305-308 (1995).
  16. Camarini, R., Hodge, C. W. Ethanol preexposure increases ethanol self-administration in C57BL/6J and DBA/2J mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 79 (4), 623-632 (2004).
  17. Hoshaw, B. A., Lewis, M. J. Behavioral sensitization to ethanol in rats: evidence from the Sprague-Dawley strain. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 68 (4), 685-690 (2001).
  18. Kawakami, S. E., Quadros, I. M., Takahashi, S., Suchecki, D. Long maternal separation accelerates behavioural sensitization to ethanol in female, but not in male mice. Behavioural Brain Research. 184 (2), 109-116 (2007).
  19. Lessov, C. N., Phillips, T. J. Duration of sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in mice. Psychopharmacology (Berl). 135 (4), 374-382 (1998).
  20. Melon, L. C., Boehm, S. L. Role of genotype in the development of locomotor sensitization to alcohol in adult and adolescent mice: comparison of the DBA/2J and C57BL/6J inbred mouse strains. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (7), 1351-1360 (2011).
  21. Pastor, R., Aragon, C. M. The role of opioid receptor subtypes in the development of behavioral sensitization to ethanol. Neuropsychopharmacology. 31 (7), 1489-1499 (2006).
  22. Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
  23. Cofresi, R. U., Bartholow, B. D., Piasecki, T. M. Evidence for incentive salience sensitization as a pathway to alcohol use disorder. Neuroscience & Biobehavrioal Reviews. 107, 897-926 (2019).
  24. Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. Plos One. (93), 92965(2014).
  25. Stoner, S. A., George, W. H., Peters, L. M., Norris, J. Liquid courage: alcohol fosters risky sexual decision-making in individuals with sexual fears. AIDS and Behavior. 11 (2), 227-237 (2007).
  26. Marinkovic, K., Halgren, E., Klopp, J., Maltzman, I. Alcohol effects on movement-related potentials: a measure of impulsivity. Journal of Studies on Alcohol and Drugs. 61 (1), 24-31 (2000).
  27. Prause, N., Staley, C., Finn, P. The effects of acute ethanol consumption on sexual response and sexual risk-taking intent. Archives of Sexual Behavior. 40 (2), 373-384 (2011).
  28. Miczek, K. A., DeBold, J. F., Hwa, L. S., Newman, E. L., de Almeida, R. M. Alcohol and violence: neuropeptidergic modulation of monoamine systems. Annals of the New York Academy of Sciences. 1349, 96-118 (2015).
  29. Heinz, A. J., Beck, A., Meyer-Lindenberg, A., Sterzer, P., Heinz, A. Cognitive and neurobiological mechanisms of alcohol-related aggression. Nature Reviews Neuroscience. 12 (7), 400-413 (2011).
  30. Schwandt, M. L., Higley, J. D., Suomi, S. J., Heilig, M., Barr, C. S. Rapid tolerance and locomotor sensitization in ethanol-naive adolescent rhesus macaques. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (7), 1217-1228 (2008).
  31. Lee, H. G., Kim, Y. C., Dunning, J. S., Han, K. A. Recurring ethanol exposure induces disinhibited courtship in Drosophila. Plos One. 3 (1), 1391(2008).
  32. Aranda, G. P., Hinojos, S. J., Sabandal, P. R., Evans, P. D., Han, K. A. Behavioral Sensitization to the Disinhibition Effect of Ethanol Requires the Dopamine/Ecdysone Receptor in Drosophila. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, 56(2017).
  33. Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Progress in Neurobiology. 59 (5), 533-561 (1999).
  34. Gallo, V. P., Accordi, F., Chimenti, C., Civinini, A., Crivellato, E. Catecholaminergic System of Invertebrates: Comparative and Evolutionary Aspects in Comparison With the Octopaminergic System. International Review of Cell Molecular Biology. 322, 363-394 (2016).
  35. Curcillo, P. G., Tompkins, L. The ontogeny of sex appeal in Drosophila melanogaster males. Behavior Genetics. 17 (1), 81-86 (1987).
  36. Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annual Review of Entomology. 19, 385-405 (1974).
  37. Monastirioti, M., Linn, C. E., White, K. Characterization of Drosophila tyramine beta-hydroxylase gene and isolation of mutant flies lacking octopamine. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3900-3911 (1996).
  38. Certel, S. J., Savella, M. G., Schlegel, D. C., Kravitz, E. A. Modulation of Drosophila male behavioral choice. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 104 (11), 4706-4711 (2007).
  39. Kido, A., Ito, K. Mushroom bodies are not required for courtship behavior by normal and sexually mosaic Drosophila. Journal of Neurobiology. 52 (4), 302-311 (2002).
  40. Winbush, A., et al. Identification of gene expression changes associated with long-term memory of courtship rejection in Drosophila males. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 2 (11), 1437-1445 (2012).
  41. Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neuroscience. 10 (12), 1587-1593 (2007).
  42. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nature Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  43. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  44. Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (2), 105-111 (2013).
  45. Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 10 (10), 20140749(2014).
  46. Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. Courtship in Drosophila. Annual Reviews of Genetics. 34, 205-232 (2000).
  47. Scholz, H. Influence of the biogenic amine tyramine on ethanol-induced behaviors in Drosophila. Journal of Neurobiology. 63 (3), 199-214 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test Flypubekspozycja na etanolDrosophila melanogasteraktywno godowapodawanie etanolurejestracja wideoprzetwarzanie danychanaliza statystycznanarz dzia genetyczne

Powiązane artykuły