Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura

DOI:

10.3791/61126

⸱

15 kwietnia 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, Stanford School of Medicine, 2Vera Moulton Wall Center for Pulmonary Vascular Disease, Stanford School of Medicine, 3Stanford Cardiovascular Institute, Stanford School of Medicine, 4Division of Pulmonary Biology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 5Center for Stem Cell and Organoid Medicine, CuSTOM, Division of Developmental Biology, and Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serc szczurów poprzez sekwencyjne trawienie tkanek w buforze trawiennym, pobieranie komórek z powtarzających się cykli wirowania i oczyszczanie komórek za pomocą mikrogranulek anty-szczurzych CD31.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że komórki śródbłonka wsierdzia (EEC) i komórki śródbłonka wieńcowego (CEC) różnią się pochodzeniem, rozwojem, markerami i funkcjami. W związku z tym te dwie populacje komórek odgrywają wyjątkową rolę w chorobach serca. Obecne badania z udziałem izolowanych komórek śródbłonka dotyczą populacji komórek składających się zarówno z EWG, jak i CEC. Protokół ten przedstawia metodę niezależnej izolacji tych dwóch populacji komórek w celu scharakteryzowania specyficznego dla komórki. Po zebraniu wolnej ściany lewej i prawej komory, komórki śródbłonka z powierzchni zewnętrznej i wewnętrznej są oddzielnie uwalniane za pomocą roztworu buforowego do wytrawiania. Sekwencyjne trawienie zewnętrznej powierzchni i wewnętrznej warstwy wsierdzia zachowało separację dwóch populacji komórek śródbłonka. Oddzielna izolacja EWG i CEC jest następnie weryfikowana poprzez identyfikację markerów specyficznych dla każdej populacji. Opierając się na wcześniej opublikowanym profilowaniu RNA pojedynczej komórki w sercu myszy, ekspresja genów Npr3, Hapln1 i Cdh11 jest unikalna dla EEC; podczas gdy ekspresja genów Fabp4, Mgll i Cd36 jest unikalna dla CEC. Dane qPCR ujawniły wzbogaconą ekspresję tych charakterystycznych markerów w odpowiednich próbkach, co wskazuje na pomyślną izolację EEC i CEC, a także utrzymanie fenotypu komórki, umożliwiając dalszą analizę funkcjonalną specyficzną dla komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół (zmodyfikowany z Gladka et al.1) do preparowania i późniejszej izolacji komórek śródbłonka wsierdzia (EEC) i komórek śródbłonka wieńcowego (CEC) z serc szczurów. Możliwość niezależnego badania tych populacji komórek umożliwiłaby zbadanie specyficznych dla typu komórek mechanizmów leżących u podstaw różnych chorób serca, które mogłyby służyć jako potencjalne cele terapeutyczne. Skuteczna metoda niezależnego zbierania tych populacji komórek nie została jednak jeszcze opublikowana.

CEC różnią się od EEC pod względem pochodzenia, markerów i funkcji podczas rozwoju i choroby serca1,2,3,4,5,6,7. EEC wywodzą się z brzusznej powierzchni mezodermy serca3. Powstają z komórek progenitorowych Flk1+ w odpowiedzi na sygnalizację VEGF i HIF i tworzą najbardziej wewnętrzną warstwę trzech dyskretnych regionów rozwijającego się serca: przedsionka, komory i zatoki żylnej3,6. Śledzenie linii genetycznej sugeruje, że pluripotencjalne komórki wsierdzia zatoki żylnej pochodzą z komórek żylnych, które migrują, tworząc warstwę podnasierdziową3. Następnie warstwa podnasierdziowa różnicuje się w tętnice wieńcowe i żyły, w tym CEC, które pozostają w poprzek wolnej ściany komory obwodowej3,4. Ten szlak wsierdzia do śródbłonka jest regulowany przez sygnalizację VEGFC, ELA/APJ i SOX173,4,6,8,9. Wsierdzie komorowe wyprowadza mniej CEC przegrody międzykomorowej w wyniku nieznanego mechanizmu3. Następnie, miejscowe różnicowanie między EEC i CEC jest sugerowane przez markery specyficzne dla tych dwóch populacji komórek, w tym ekspresję Mgll, Fabp4 i Cd36 w CEC lub ekspresję Npr3, Cdh11 i Hapln1 w EECs3,5,10.

EEC i CEC odgrywają różne role w funkcjonowaniu serca. Przejście wsierdziowe do mezenchymalnej, tworzenie zastawek, dojrzewanie komory, regulacja drogi odpływu i rozwój kanału przedsionkowo-komorowego są zależne od EECs6. Alternatywnie, CEC przyczyniają się do napięcia naczynioruchowego i zapalenia tętnic wieńcowych11. Te różnice w funkcji skutkują zindywidualizowanymi rolami w rozwoju choroby4,12. Na przykład, dowody sugerują, że nieprawidłowo działające EEC mogą prowadzić do wrodzonej choroby zastawek6, myocardium6, efekt przegrody przedsionkowo-komorowej6, fibroelastoza wsierdzia13, zespół niedorozwoju lewego serca13, hipoplazja komorowa13, oraz przerost mięśnia sercowego12. Podobnie, badania wykazały, że nieprawidłowe CEC przyczyniają się do choroby wieńcowej14 i zakrzepicy11.

Skuteczna izolacja EEC i CEC jest niezbędna do uzyskania wszechstronnej wiedzy o tych dwóch populacjach komórek, która może być wykorzystana zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych. Określenie czynników wzrostu i różnicowania tych populacji komórek dostarczyłoby odniesienia do różnicowania podtypów śródbłonka od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Co więcej, pełna identyfikacja różnic w rozwoju, regulacji i funkcjonowaniu EEC i CEC jest niezbędna do zrozumienia czynników genomicznych i epigenomicznych odpowiedzialnych za liczne choroby serca w sposób specyficzny dla typu komórki. W tym artykule przedstawiono kroki prowadzące do pomyślnego niezależnego pobierania EEC i CEC oraz przedstawiono dowody na separację poprzez ocenę poziomów ekspresji genów markerów specyficznych dla typu komórki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Panel Administracyjny ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (APLAC31608) na Uniwersytecie Stanforda.

1. Przygotowanie

  1. Przygotować bufor do wytrawiania, używając odczynników wymienionych w tabeli 1.
    1. Przygotować roztwór podstawowy DNazy I: Rozpuścić DNazę I w wodzie wolnej od RNaz do roztworu podstawowego o stężeniu 2000 jednostek/ml (1 mg/ml). Podwielokrotność roztworu podstawowego należy rozdzielić i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować roztwór liberazy: Rozpuścić liberazę w wodzie wolnej od RNaz do uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 5 mg/ml. Obracać go na runie rolkowej w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Podwielokrotność roztworu podstawowego należy rozdzielić i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować bufor sortujący, rozcieńczając 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 10% roztworu podstawowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 2 mM EDTA i 0,5% BSA.

2. Kolekcja serc

UWAGA: W tym protokole użyto sześciu szczurów Sprague Dawley o wadze 50–100 g. Nie zaobserwowano różnicy między płciami.

  1. Poddaj szczura eutanazji CO2 i umieść go w pozycji leżącej na platformie sekcyjnej. Przypnij kończyny i wysterylizuj zarówno brzuch, jak i klatkę piersiową 70% etanolem.
  2. Otwórz jamę brzuszną nożyczkami i wbij igłę 21 G w część żyły głównej tylnej znajdującą się za jelitami. Odciągnąć tłok strzykawki do tyłu, pobierając krew z żyły, aż wątroba stanie się jaśniejsza i nie będzie można pobrać więcej krwi, co wskazuje na wystarczające usunięcie krwi.
  3. Za pomocą nożyczek ostrożnie otwórz klatkę piersiową, aby uniknąć uszkodzenia płuc i serca. Podnieś łuk aorty/przedsionek za pomocą kleszczy i przetnij aortę, tętnicę płucną, żyły płucne i żyłę główną, aby uwolnić i usunąć serce.
  4. Umyj serce 50 ml zimnego 1x buforu Hanks' balanced salt solution (HBSS) 3x, aby usunąć nadmiar krwi.
  5. Pod mikroskopem mikrodyparacyjnym usuń prawą wolną ścianę komory do probówki o pojemności 5 ml zawierającej zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco (Rysunek 1A,B).
    1. Połóż serce na jego bardziej płaskiej, tylnej powierzchni, aby zidentyfikować lewą i prawą stronę.
    2. Zlokalizuj tętnicę płucną, najbardziej przednią z żył i tętnic rozgałęziających się od szczytu serca i przetnij tętnicę płucną w dół do prawej komory komory. Na przedniej powierzchni serca przeciąć wzdłuż przegrody, aż dojdziesz do wierzchołka. Kontynuuj cięcie od wierzchołka w górę tylnej strony serca wzdłuż przegrody, aż do punktu połączenia tętnicy płucnej i prawej komory komory (Rysunek 1A).
    3. Zaczynając od tętnicy płucnej i punktu połączenia prawej komory, przeciąć zarówno przednią, jak i tylną stronę serca prostopadle do poprzedniego rozwarstwienia i z dala od przegrody, aż wolna ściana prawej komory zostanie uwolniona od reszty serca (Ryc. 1B).
  6. Pod mikroskopem mikrodyparacyjnym usuń wolną ścianę lewej komory do probówki o pojemności 5 ml zawierającej DMEM (Rysunek 1C, D).
    1. Zlokalizuj aortę, rozgałęziającą się od szczytu serca za tętnicą płucną i powtórz metodę opisaną w kroku 2.5, aby odciąć wolną ścianę lewej komory.

3. Trawienie EWG

  1. Umieść zarówno prawą, jak i lewą wolną ścianę komory w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 cm, z wewnętrzną powierzchnią leżącą płasko, skierowaną w dół (Rysunek 2).
    UWAGA: Wewnętrzna powierzchnia to wewnętrzna powierzchnia lekko wklęsłej komory, jak pokazano na Rysunek 2A,C.
  2. Dodaj 0,5–1 ml buforu wytrawiającego do naczynia, umieszczając końcówkę pipety bezpośrednio pod tkanką. Kontynuuj, aż zanurzona zostanie tylko wewnętrzna powierzchnia.
  3. Inkubować naczynie w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  4. Dodaj pożywkę EC do naczynia hodowlanego, aby zatrzymać trawienie.
    UWAGA: Ilość buforu wytrawiającego do pożywki EC należy utrzymywać w stosunku 1:5.
  5. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przepłukać wewnętrzną powierzchnię komór pożywką EC i przenieść spływ do probówki zbiorczej o pojemności 50 ml przez sitko o średnicy 40 mm (Rysunek 2E). Przechowuj kolekcje na lodzie w celu dalszego oczyszczenia.

4. Trawienie CEC

  1. Przeciąć wzdłuż zewnętrznej powierzchni lewej komory bez zanieczyszczenia warstwą wewnętrzną (Rysunek 2B, D) i umieścić każdą z nich w oddzielnej probówce o pojemności 5 ml zawierającej 1 ml buforu wytrawiającego.
    UWAGA: Lewą komorę można zidentyfikować jako grubszą komorę, a zewnętrzną powierzchnię można określić jako zewnętrzną powierzchnię lekko wklęsłej komory.
  2. Za pomocą nożyczek preparacyjnych zmiel ścianę komory na małe, 1 mm3 kawałki.
  3. Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez około 15–20 minut. Wirować co 2–3 minuty.
  4. Odpipetować 4 ml pożywki EC do probówki o pojemności 5 ml, aby zakończyć trawienie.
  5. Przenieść roztwór za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml do probówki o pojemności 50 ml przez sitko o średnicy 40 mm (Rysunek 2E). Przechowuj kolekcje na lodzie w celu dalszego oczyszczenia.

5. Kolekcja komórek

  1. Odwirować probówki o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie odessać supernatant.
  2. Jeśli osad wydaje się czerwony, ponownie zawieś go w 1-2 ml 1x buforu lizującego czerwone krwinki (RBC) (Rysunek 2F).
    UWAGA: Jeśli nie ma RBC, przejdź do kroku 6.
  3. Inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  4. Odpipetować 10 ml PBS do probówek o pojemności 50 ml, aby zatrzymać lizę.
  5. Odwirować probówki o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać supernatant.

6. Sortowanie EC

  1. Dodać 90 μl buforu sortującego i 10 μl przeciwciała anty-CD31 PE do probówek o pojemności 50 ml.
  2. Zwirować probówki, a następnie inkubować je przez 10 minut w lodówce o temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 10 ml buforu sortującego do probówek, dokładnie wymieszać, a następnie odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 80 μl buforu sortującego i 20 μl mikrogranulek anty-PE.
  5. Wirować probówki i inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  6. Przemyć komórki, dodając 10 ml buforu sortującego do probówek, dokładnie wymieszać, a następnie odwirować je przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu sortującego.
  8. Umieścić kolumnę zawierającą kulki superparamagnetyczne w separatorze magnetycznym i przepłukać kolumnę 3 ml buforu sortującego.
  9. Po "zatrzymaniu przepływu" należy odpipetować 500 μl zawiesiny komórek do kolumn, a następnie przemyć kolumny buforem sortującym. Powtórz mycie 3 razy, każde z 3 ml buforu sortującego ( Rysunek 2G).
  10. Wyjmij kolumny z separatora i umieść je na nowej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.
  11. Za pomocą pipety dodać 5 ml pożywki EC do kolumn i przecisnąć roztwór za pomocą tłoka kolumny.
  12. Odwirować probówki zbiorcze o stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać supernatant.
  13. Ekstrahować RNA z osadu komórkowego próbek EWG i CEC za pomocą zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Można uzyskać minimum 500 ng RNA.
    UWAGA: Po ekstrakcji RNA próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C.
  14. Odwrotna transkrypcja 500 ng RNA, aby uzyskać cDNA za pomocą losowego startera i zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  15. Wykonaj ilościowy PCR w celu walidacji populacji wsierdzia i śródbłonka (Rysunek 2H). Sekwencje starterów są wymienione w Tabeli 2.
    1. Dodać 5 μl cDNA EWG lub CEC (1 ng/μl) do studzienek płytki 384 qPCR. Dodaj cDNA EWG lub CEC do wystarczającej liczby studzienek, tak aby na liczbę starterów przypadały trzy dołki.
    2. Wymieszaj 6 μl zielonego buforu 2x qPCR SYBR z 0,5 μl każdego startera 10 μM, w tym starterów do przodu i do tyłu, i dodaj je do jednego dołka odpowiadającego każdemu genowi kandydującemu.
    3. Uszczelnić płytkę folią z tworzywa sztucznego i wirować przez 1 minutę przy 300 x g przy temperaturze pokojowej.
    4. Umieścić płytkę w maszynie qPCR, a następnie uruchomić program w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, następnie w temperaturze 95 °C przez 15 s, a następnie w temperaturze 55 °C przez 60 s. Powtórz kolejne dwa kroki przez 45 cykli.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces izolacji EEC i CEC jest opisany w Rysunek 2. Pomyślna izolacja EEC i CEC została określona poprzez ocenę obecności markerów komórek śródbłonka, a także tych odrębnych dla obu populacji podtypów. Zgodnie z przewidywaniami, qPCR ujawnił, że w porównaniu z β-aktyną, EEC wyrażały wyższe poziomy markerów wsierdzia Npr3, Hapln1 i Cdh11 w porównaniu z CEC (Figura 3A). Podobnie, CEC wyrażały wyższe poziomy markerów wieńcowych Fabp4, Mgll i Cd36 w porównaniu z EEC (Figura 3B). Dodatkowo, zarówno EWG, jak i CEC wyrażały gen markerowy pan-EC Cdh5, z nieco wyższymi poziomami w CEC (Figura 3C).


Diagram anatomii serca; oznaczone aorty, komory, tętnice; badanie szlaku przepływu krwi.
Rycina 1: Schemat rozwarstwienia serca. (A) Pierwsze cięcie wykonane w celu oddzielenia ściany wolnej od prawej komory od przegrody. (B) Drugie cięcie wykonane w celu całkowitego uwolnienia prawej komory. (C) Pierwsze cięcie wykonane w celu oddzielenia ściany wolnej od lewej komory od przegrody. (D) Drugie cięcie wykonane w celu całkowitego uwolnienia lewej komory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.


Schemat izolacji komórek serca z trawieniem, lizą RBC, sortowaniem MACS i analizą qPCR.
Rysunek 2: Schemat rozmieszczenia trawienia CEC i EWG oraz następujący układ sortowania komórek. (A) najbardziej wewnętrzna wolna ściana komorowa i (B) najbardziej zewnętrzna wolna ściana komory były (C) zanurzone odpowiednio w buforze wytrawiającym lub (D) strawione w buforze wytrawiającym. (E) Zbieranie i filtracja roztworów komórkowych, a następnie (F) liza czerwonych krwinek (RBC) i (G) sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS) przy użyciu przeciwciała CD31. (h) Oczyszczone EC poddano procesowi weryfikacji ekspresji genów za pomocą qPCR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.


Wykres porównawczy ekspresji genów przedstawiający EEC vs. CEC dla Npr3, Cdh11, Hapln1, Mgll, Fabp4, Cd36.
Rycina 3: Dane qPCR weryfikujące izolację CEC i EWG. (A) Poziomy ekspresji genów markerów EWG Npr3, Cdh11 i Hapln1 w EWG i CEC określono ilościowo za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. (B) Poziomy ekspresji genów markerów CEC Mgll, Fabp4 i Cd36 w EWG i CEC określono ilościowo za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. (C) Marker pan-EC Cdh5 został określony ilościowo w EWG i CEC metodą PCR w czasie rzeczywistym. (n = 3 w każdej grupie). Słupki reprezentują średnią ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 w porównaniu z EEC, niesparowany test t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Bufor trawienny (1,5 ml)
 Stan magazynowyKońcowa kondysja.głośność
Liberaza TM5 mg/ml0,5 mg/ml150 ul
Dnaza I1 mg/ml20 μg/ml30 ul
HEPESY1 mln10 mM15 ul
DMEM (DMEM)--1305 ul

Tabela 1: Przepis na bufor trawienny.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
Tabela 2. Sekwencje podkładowe
Nazwa genunaprzódrewers
Protokół NPR3TCCTTGCAAATCATGTGGCCTAGGAATCTTCCCGCAGCTCTC
CDH11GTGAATGGGACTGGGACTGGGTAATTTCTGGGGCCCTTGC powiedział:
Hapln1CCAGCTAAGTGGGACTCGAAGGGGCCATTTTCAGCTTGGATG powiedział:
Mgll powiedział:CCCGGGGCCCAAAGAC powiedział:GAAGATGAGGGCCTTGGGTG powiedział:
Fabp4AGAAGTGGGAGTTGGCTTCGACTCTCTGACCGGATGACGA
Zobacz materiał CD36GCAAAACGACTGCAGGTCAA powiedział:CCCGGTCACTTGGTTTCTGA
CDH5CCATTGAGACAGACCCCGAC powiedział:TGTGGAACGTGTACTGCTGG
B-aktynaTCTGTGTGGATTGGTGGCTC powiedział:CGGACTCGTACTCCTGC powiedział:

Tabela 2: Sekwencje podkładowe

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CEC i EEC różnią się pochodzeniem, markerami i funkcjami, a zatem mogą odgrywać wyjątkową rolę w rozwoju i chorobie. Istniejące protokoły izolacji komórek śródbłonka są ograniczone do tkanek makronaczyniowych, zaniedbując pobieranie EWG, ograniczając w ten sposób badanie funkcji specyficznych dla CEC i EWG. Niezbędne jest wyizolowanie i zbadanie tych dwóch populacji niezależnie, ponieważ wiedza ta może stanowić punkt odniesienia dla różnicowania iPSC na CEC i EEC dla przyszłych badań i ułatwić badanie tych populacji komórek pod kątem potencjalnych celów terapeutycznych dla różnych chorób serca. Ten nowatorski protokół przedstawia metodę izolacji EWG od wewnętrznej powierzchni i CEC od zewnętrznej powierzchni wolnej ściany komorowej dorosłych szczurów.

Bardzo ważne jest, aby w tym protokole bardzo precyzyjnie kontrolować czas dla każdego kroku. Ponieważ liczba EEC w tkance serca szczura jest bardzo ograniczona, zminimalizowaliśmy czas trawienia wewnętrznej warstwy serca, aby zapobiec uszkodzeniu komórek, a co ważniejsze, zanieczyszczeniu CEC. Natychmiastowe dodanie roztworu pożywki EC w celu zakończenia reakcji enzymatycznej jest również bardzo ważne dla utrzymania wysokiej żywotności komórek. Czerwona osadka po pobraniu komórek sugeruje obecność dużej liczby krwinek czerwonych. W zależności od ilości zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi, można dodać 1–2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych w celu degradacji krwinek czerwonych. Inkubacja musi być starannie zaplanowana, aby uniknąć znacznego uszkodzenia komórek, a PBS jest natychmiast dodawany w celu zakończenia reakcji. Korzystając z obecnego protokołu, byliśmy w stanie wyizolować 105 EEC z sześciu serc szczurów. Komórki te można umieścić na naczyniu do hodowli komórkowej w celu dalszej ekspansji i charakterystyki.

Podczas przygotowywania tkanki do pobrania wolnej ścianki, serce przemyto HBSS w celu usunięcia większości pozostałych krwinek czerwonych. HBSS jest zalecaną pożywką ze względu na jej przejrzysty wygląd, który umożliwia wizualizację komórek krwi, w przeciwieństwie do DMED zawierającego czerwień fenolową. Skład buforu trawiennego zapewnia wystarczające uwolnienie komórek śródbłonka, w którym enzym trawienia liberazy zdziera tkankę z odsłoniętych komórek, DNaza I eliminuje DNA z martwych komórek, aby promować odwarstwienie komórek, które może być hamowane przez jakość adhezyjną DNA, bufor HEPES równoważy pH, a DMEM jest zmodyfikowaną pożywką podstawową o wyższym stężeniu aminokwasów i witamin dla lepszego utrzymania komórek i zawiera niezbędny wapń , aby aktywować liberase.

Zgodnie z sekwencjonowaniem RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) uzyskanym zarówno z serca człowieka15, jak i myszy10, zgłoszono kilka markerów przypisywanych do określonych populacji EC. Wybraliśmy niektóre z najbardziej wzbogaconych genów, aby zbadać czystość wyizolowanych EEC (tj. Npr3, Cdh11 i Hapln1) i EEC (tj. Mgll, Fabp4 i Cd36). W stosunku do β-aktyny, markery Npr3, Cdh11 i Hapln1 wykazały zwiększoną ekspresję w EWG w porównaniu z CEC. Podobnie, ekspresja markerów Mgll, Fabp4 i Cd36 była większa w CEC w porównaniu z EWG. Jednoznacznie wyrażone markery dla każdej próbki są zgodne z markerami charakterystycznymi odpowiednio dla EWG i CEC, co wskazuje na udaną izolację.

Obecny protokół nie może jednak wykluczyć zanieczyszczenia krzyżowego między dwiema populacjami EC podczas izolacji, nawet przy starannie kontrolowanym sekwencyjnym trawieniu. Dlatego niektóre markery powierzchni komórek można zastosować w celu dalszego oczyszczenia. Na przykład NPR3 ogólnie oznacza wsierdzie10, podczas gdy APJ może śledzić większość CEC16. Ponieważ te dwa markery ulegają ekspresji na powierzchni komórki, można je wykorzystać do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), a przeciwciała do dalszego oczyszczania odrębnych populacji EC. Ponadto, sekwencja scRNA-seq serca człowieka15 imyszy 10 może potwierdzić wzbogacenie Npr3 w EEC, a Cd36 może być potencjalnie wykorzystany do oczyszczania CEC.

Podsumowując, przedstawiony protokół nakreśla niezależną izolację EEC i CEC od serca szczura. Kompleksowa identyfikacja właściwości komórkowych, możliwa dzięki izolacji komórek, może być wykorzystana do istotnych dalszych zastosowań.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy bardzo dziękują dr Lingli Wang za pomoc w protokole dla zwierząt, a Departamentowi Pediatrii w Stanford za wsparcie infrastruktury. Prace te były wspierane przez NIH/NHLBI K99 HL135258 (do MG).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)Gibco156300801M
15ml ProbówkiEppendorf0030122151
50ml ProbówkiNunc339652
5mlEppendorf30119401
ACK Bufor lizującyGibcoA1049201
Anti-CD31 PEMiltenyi Biotec130-115-505
Mikrogranulki anty-PEMiltenyi Biotec130-048-801
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Miltenyi Biotec130-091-37610%
CFX384 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-rad1855485do qPCR
DNAse IWorthingtonLK 0031721 mg / ml w wodzie
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco10313021
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)LonzaCC-3162EC Medium
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Invitrogen155750200,5 m
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) X1Gibco14025092
Płytki do PCR Hard-Shell 384-Well, cienkościenne, listwowe, przezroczyste/białeBio-radHSP3805Do qPCR
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościApplied Biosystems4368813
Liberase TMSigma Aldrich54011190015 mg / mL
MACS LSKolumna Miltenyi Biotec130-042-401Do izolacji EC
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-302Do izolacji EC
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Folia, klej, optycznaBio-radMSB1001qPCR
wąskim wzorzeFST11002-12Do zbioru serca
Nylonowe sterylne sitkoFalcon35234040 mm
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) X1Gibco1001023
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25780Do zestawu mikroprzygotowawczego qPCR
Quick-RNA ZymoResearchR1050Do ekstrakcji RNA
S& Kleszcze T - Końcówki SuperGripFST00632-11Do zbioru serca
Nożyczki do zeza - Węglik wolframuFST14574-11Do zbioru serca
Nożyczki sprężynowe Vannas - mikroząbkowaneFST15007-08Do zbioru serca
Do kleszczyków o

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gladka, M. M., et al. Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
  2. Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua). Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).
  3. Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
  4. Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
  5. Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
  6. Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration. Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).
  7. Yu, S. Y., et al. Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions. Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).
  8. Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
  9. Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner. Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).
  10. Zhang, H., et al. Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls. Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).
  11. Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. Endothelial function and coronary artery disease. Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).
  12. Jacques, D., Bkaily, G. Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy. Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).
  13. Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).
  14. Li, Y., et al. Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease. Cardiovascular Research. , (2019).
  15. Miao, Y., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome. bioRxiv. , (2019).
  16. Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

r db one kom rki r dwsierzneprotok izolacji kom rektrawienie sekwencyjnekom rki CD31 dodatnieseparacja magnetycznaanaliza qPCRspecyficzne dla typu kom rkibadania nad chorobami serca

Powiązane artykuły