Indukcja całkowitego uszkodzenia rdzenia kręgowego typu transsection u myszy

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak stworzyć precyzyjną laminektomię do indukcji stabilnego uszkodzenia rdzenia kręgowego typu transsection w modelu mysim, z minimalnymi szkodami ubocznymi dla badań nad uszkodzeniem rdzenia kręgowego.

Streszczenie

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) w dużej mierze prowadzi do nieodwracalnej i trwałej utraty funkcji, najczęściej w wyniku urazu. Badanych jest kilka opcji leczenia, takich jak metody przeszczepu komórek, w celu przezwyciężenia wyniszczającej niepełnosprawności wynikającej z SCI. Większość badań przedklinicznych na zwierzętach przeprowadza się na modelach SCI u gryzoni. Podczas gdy modele szczurze SCI były szeroko stosowane, modelom mysim poświęcono mniej uwagi, mimo że modele myszy mogą mieć znaczną przewagę nad modelami szczurzymi. Niewielki rozmiar myszy równa się niższym kosztom utrzymania zwierząt niż w przypadku szczurów, a dostępność wielu transgenicznych modeli myszy jest korzystna dla wielu rodzajów badań. Wywołanie powtarzalnych i precyzyjnych urazów u zwierząt jest głównym wyzwaniem dla badań nad SCI, które u małych gryzoni wymagają bardzo precyzyjnej operacji. Model urazu typu transekcyjnego był powszechnie stosowanym modelem urazu w ciągu ostatniej dekady w badaniach terapeutycznych opartych na transplantacji, jednak nie istnieje ustandaryzowana metoda wywoływania całkowitego urazu typu transekcyjnego u myszy. Opracowaliśmy protokół chirurgiczny do wywoływania całkowitego urazu typu przecięcia u myszy C57BL / 6 na poziomie kręgów piersiowych 10 (T10). W zabiegu wykorzystuje się wiertło z małą końcówką zamiast rongeurs do precyzyjnego usunięcia blaszki, po czym do wywołania przecięcia rdzenia kręgowego używa się cienkiego ostrza z zaokrągloną krawędzią tnącą. Metoda ta prowadzi do powtarzalnego urazu typu przecięcia u małych gryzoni z minimalnym pobocznym uszkodzeniem mięśni i kości, a tym samym minimalizuje czynniki zakłócające, szczególnie tam, gdzie analizowane są behawioralne wyniki funkcjonalne.

Wprowadzenie

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) to złożony problem medyczny, który powoduje drastyczne zmiany w zdrowiu i stylu życia. Nie ma lekarstwa na SCI, a patofizjologia SCI nie jest dokładnie poznana. Zwierzęce modele SCI, w szczególności modele gryzoni, stanowią nieocenione narzędzie do testowania nowych metod leczenia i są wykorzystywane do badania SCI od dziesięcioleci. Do tej pory w ponad 72% przedklinicznych badań SCI wykorzystano modele szczurze, w porównaniu z zaledwie 16%, w których użyto myszy¹. Chociaż szczury, ze względu na ich większe rozmiary i tendencję do tworzenia jam podobnych do ludzkiego SCI, tradycyjnie były preferowanymi zwierzętami modelowymi do badania nowych podejść terapeutycznych, myszy (w tym wiele transgenicznych modeli myszy) są obecnie częściej wykorzystywane do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych SCI². Model myszy oferuje dodatkowe korzyści w postaci łatwiejszej obsługi, szybszego tempa reprodukcji i niższych kosztów niż u szczurów; Myszy wykazują również wysoki stopień podobieństwa genomowego do ludzi^1,2,3. Główną wadą modelu mysiego został zidentyfikowany znacznie mniejszy rozmiar, który stwarza wyzwania dla interwencji chirurgicznych w celu tworzenia i leczenia urazów rdzenia kręgowego^4,5.

Istnieje luka w istniejącej literaturze, która podkreśla potrzebę solidnego i powtarzalnego protokołu chirurgicznego w celu wywołania stabilnego SCI w modelu mysim. Dlatego w tym protokole zapewniamy nowatorskie i precyzyjne podejście chirurgiczne, aby przezwyciężyć te ograniczenia. Protokół ten zawiera szczegółowe wytyczne dotyczące wywoływania urazu typu przecięcia u myszy, ponieważ ten typ urazu został uznany za najbardziej odpowiedni do badania zmian regeneracyjnych i zwyrodnieniowych po urazie⁶, a także podejść neuroplastycznych, obwodów neuronowych i inżynierii tkankowej⁷. Zdecydowaliśmy się na wywołanie urazu w dolnej części klatki piersiowej, ponieważ SCI na poziomie klatki piersiowej jest najczęściej używany w literaturze¹.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu Etyki Zwierząt Uniwersytetu Griffith (ESK/04/16 AEC i MSC/04/18 AEC) zgodnie z wytycznymi Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii.

1. Procedura przygotowania zwierzęcia do operacji

1. Znieczulić i ustabilizować zwierzę.
   1. Użyj 8–10-tygodniowych samic myszy C57BL/6. Użyj 5% izofluranu w 1 l/min tlenu do indukcji znieczulenia. Do podtrzymania znieczulenia należy stosować 1,5–2% izofluranu w 1 l/min tlenu. Potwierdź odpowiednie znieczulenie, ustalając brak odruchu bólowego w ogonie i tylnych łapach.
2. Podawać buprenorfinę (0,03 mg/kg masy ciała) w celu znieczulenia i enrofloksacynę (10 mg/kg masy ciała) w celu pokrycia antybiotykowego, podskórnie w zależności od masy ciała. Meloksykam (2 mg/kg masy ciała) może być podawany w celu długotrwałego znieczulenia, jeśli jest to wymagane.
3. Utrzymuj stałą temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C za pomocą poduszki grzewczej
   1. Ogol futro na grzbiecie, aby odsłonić obszar chirurgiczny nad grzbietem kręgosłupa. Usuń ogolone futro z obszaru operacyjnego przed sterylizacją miejsca nacięcia. Wysterylizuj ogolony obszar sterylnymi wacikami nasączonymi powidonem, jodem, płynem antyseptycznym i spirytusem chirurgicznym.
4. Przyklej łapy myszy do obszaru operacyjnego, aby ustabilizować zwierzę (Rysunek 1A). Umieść owalne okno nad myszą (Rysunek 1B).

2. Laminektomia

1. Wykonaj pionowe nacięcie linii środkowej na poziomie kręgu T10 za pomocą skalpela chirurgicznego.
   1. Zlokalizuj wyrostek kolczysty kręgu T10, aby określić miejsce laminektomii. Trzon kręgu leży lekko czaszkowo do końca wyrostka kolczystego⁸ (patrz Rysunek 2). Końcówka spoczywa w przybliżeniu w punkcie środkowym kręgu T11 classebra⁸.
   2. Wykonaj nacięcie o długości ~2,5 cm, tak aby kręgosłup kręgu T10 znajdował się mniej więcej w połowie długości nacięcia.
2. Odbijaj skórę i chowaj się za pomocą retraktorów.
   1. Użyj prostych kleszczy, aby podnieść skórę z leżącej poniżej powięzi. Stworzy to miejsce na umieszczenie zwijaczy; Dzięki temu pole operacyjne pozostanie otwarte.
3. Wykonaj wycięcie tkanki podskórnej i powięzi, aby odsłonić wyrostki kolczyste.
   1. Użyj krawędzi skalpela, aby wykonać małe nacięcie w linii środkowej w tkance podskórnej i powięzi poniżej, aby odsłonić kolce kręgów T9–T11. Użyj kleszczyków z cienką końcówką (nieostrych), aby wykonać rozwarstwienie i odbić powięź.
4. Podziel i oddziel mięśnie przykolcowe, aby odsłonić blaszki.
   1. Użyj końcówki skalpela, aby rozciąć mięśnie grzbietowe tułowia i mięśnie przykolczaste wzdłuż kolców kręgów T9–T11. Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby wykonać rozwarstwienie mięśni warstwami i odsłonić blaszki kręgów. Powinno to zminimalizować krwawienie.
      UWAGA: Jeśli wystąpi krwawienie, użyj podgrzanej soli fizjologicznej (37 °C) i bawełnianych wacików, aby je opanować i usunąć krew z pola operacyjnego.
   2. Użyj tych samych kleszczy, aby zrobić małe kieszenie wokół wyrostków poprzecznych kręgu T10. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby ustabilizować trzon kręgu T10, zaczepiając jego zęby pod wyrostkami poprzecznymi, w utworzonych kieszeniach (Rysunek 1C).
   3. Dokładnie spłucz blaszki T10 ciepłą solą fizjologiczną i delikatnie wytrzyj do czysta bawełnianymi wacikami, aby wyraźnie uwidocznić kostną powierzchnię. Upewnij się, że żadne przyczepy mięśni/więzadeł nie pozostają obustronnie wzdłuż powierzchni.
5. Użyj wiertła z cienką końcówką (średnica 0,55 mm, długość 7 mm), aby obustronnie rozbić blaszki.
   1. Użyj końcówki wiertła, aby prześledzić pionową ścieżkę od przestrzeni międzykręgowej T9–T10 do przestrzeni międzykręgowej T10–T11 wzdłuż obu blaszek T10, bez włączania wiertła. Ma to na celu upewnienie się, że wiertło nie zahaczy o żadną tkankę (Rysunek 1D).
   2. Teraz włączając wiertło, powoli i ostrożnie wykop pionowy rów na prawej blaszce kręgu T10. Ta część laminektomii powinna stworzyć precyzyjny ubytek chirurgiczny na całej grubości kości w prostej linii pionowej. Utrzymuj chwyt za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby kręg był stabilny.
6. Upewnij się, że końcówka wiertła nie przebija przez kość i nie uszkadza rdzenia kręgowego. Powtórz ten sam proces po lewej stronie blaszki, utrzymując kręg stabilnie za pomocą zakrzywionych kleszczy. Nawadniaj ciepłą solą fizjologiczną, aby zmyć pozostałe fragmenty kości.
7. Podnieś i usuń tylną część łuku nerwowego (Rysunek 1F).
   1. Użyj kątowych kleszczyków z cienką końcówką, aby chwycić wyrostek kolczysty i usunąć cały grzbietowy segment blaszek oddzielonych dwustronnym wierceniem. Przepłukać i ponownie pobrać wymaz, jeśli wystąpi krwawienie, aby wyraźnie uwidocznić rdzeń kręgowy odsłonięty pod oknem laminektomii (Rysunek 1E).

3. Przecięcie

1. Wywołaj uraz rdzenia kręgowego poprzez przecięcie odsłoniętego rdzenia za pomocą jednego plastra ostrza.
   1. Użyj wąskiego, okrągłego ostrza z krawędzią tnącą, aby przeciąć pępowinę na środku okienka laminektomii. Upewnij się, że zamiatałeś boczne wgłębienia kręgosłupa, aby wywołać całkowite uszkodzenie przecięcia (Rysunek 1G).
2. Potwierdź kompletność urazu po przecięciu za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i usuń wszelkie pozostałe połączenia w miejscu przecięcia.
3. Kontroluj krwawienie, jeśli występuje, przed zamknięciem warstw chirurgicznych.
4. Użyj ciepłej soli fizjologicznej do przepłukania i usunięcia krwawienia, które występuje z przeciętych pni pępowiny. Użyj bawełnianego wacika, aby delikatnie docisnąć, aby w razie potrzeby uzyskać hemostazę. Uważaj, aby nie uciskać rdzenia kręgowego.

4. Zamknięcie i natychmiastowa opieka pooperacyjna

1. Zbliż mięśnie do siebie i zszyj warstwą.
   1. Po osiągnięciu hemostazy w miejscu przecięcia, zwolnij zakrzywiony uchwyt kleszczy na kręgach T10. Zbliż krawędzie wyciętych mięśni do siebie wzdłuż linii środkowej, aby uzyskać dobre ułożenie.
   2. Zszyj mięśnie warstwowo za pomocą wchłanialnych szwów 5-0 polyglactin 910. Upewnij się, że naturalna krzywizna kręgosłupa nie powoduje żadnego napięcia na linii szwów ani nie otwiera szwów, odsłaniając miejsce laminektomii.
2. Zamknij tkankę podskórną i skórę.
   1. Użyj niewchłanialnych jedwabnych szwów 5-0, aby zamknąć nacięcie skóry. Przed zamknięciem upewnij się, że pod skórą nie pozostało krwawienie, skrzepy ani zanieczyszczenia. Na tym etapie może być konieczne końcowe nawadnianie ciepłą solą fizjologiczną.
3. Przerwij znieczulenie. Obserwuj zwierzę przez 10–30 minut, aż do wyzdrowienia. Przez ten czas zwierzę powinno pozostać na poduszce grzewczej. Zapewnij wodę, żel i uwodnioną karmę w klatce.
4. W leczeniu pooperacyjnym należy profilaktycznie przyjmować buprenorfinę (dwa razy dziennie), enrofloksacynę (raz dziennie) przez pierwsze dwa dni. Dodatkowo należy ręcznie opróżniać pęcherz co najmniej dwa razy dziennie, postępując zgodnie z wytycznymi komisji etycznej ds. zwierząt.
   UWAGA: Zwierzęta w tym eksperymencie były oceniane dwa razy dziennie pod kątem ich ogólnego stanu zdrowia i samopoczucia, co obejmowało sprawdzenie utrzymującego się bólu (w celu podania dodatkowych dawek buprenorfiny) lub infekcji (dodatkowa enrofloksacyna), ich stanu odżywienia i nawodnienia (podać płyny do wstrzykiwań, jeśli są odwodnione) oraz wszelkich oznak autotomii (zapewnić pielęgnację ran w przypadku niewielkiej autotomii). Zdecydowanie zaleca się, aby te aspekty opieki pooperacyjnej, w tym decyzje dotyczące eutanazji, były ustalane pod kierunkiem instytucjonalnej komisji etycznej ds. zwierząt.

5. Ocena modelu szkody

1. Ustalenie utraty funkcji motorycznych.
   1. Oceń zachowanie motoryczne rannych myszy 2, 7, 14, 21 i 28 dni po urazie na otwartym polu za pomocą skali Basso Mouse Scale (BMS), aby określić utratę funkcji⁹ (Rysunek 3C–E).
2. Histologiczne potwierdzenie urazu
   1. Zbierz uszkodzone rdzenie kręgowe wraz z kręgosłupami po eutanazji (wykonanej za pomocą dwutlenku węgla w tym eksperymencie, zatwierdzonym przez komisję etyki zwierząt).
   2. Utrwal tkankę przez zanurzenie na noc w 4% paraformaldehydzie i odwapnij kości poprzez leczenie 20% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 3 tygodnie, zastępując świeży EDTA co 48 godzin.
   3. Przygotuj odwapnione kolce do kriosekcji i pokrój je na odcinki o grubości 30 μm.
   4. Zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną w celu barwienia immunologicznego przeciwciałami anty-GFAP i Hoechst 33342.
   5. Zobrazuj preparaty na mikroskopie fluorescencyjnym (Rysunek 3A) i wykonaj pomiary wielkości obrażeń za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (np. oprogramowania do analizy Nikon - NIS Elements [Rysunek 3B]).

Wyniki

Opracowana metoda, przedstawiona na Rysunku 1, obejmuje odpowiednią stabilizację myszy (Rysunek 1A) oraz dobrą wizualizację kręgosłupa i tkanek okołokręgosłupowych (Rysunek 1B). Wyrostki kolczyste i łuki kręgów można wyraźnie uwidocznić przy minimalnej dyssekcji mięśni i niewielkiej utracie krwi (Rysunek 1C, zaznaczona strefa). Wiercenie precyzyjnym wiertłem wykonuje się zgodnie z R...

Dyskusja

Metoda ta indukuje u myszy całkowite uszkodzenie typu transsekcji na poziomie kręgów T10, co skutkuje całkowitą paraplegią zwierzęcia, poniżej poziomu urazu. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta skutkuje minimalnym krwawieniem, znikomymi uszkodzeniami ubocznymi i stabilnym, powtarzalnym urazem. W porównaniu z wcześniej opublikowanymi metodami przecięcia bez laminektomii¹⁰, metoda ta oferuje korzyści w postaci bezpośredniej wizualizacji bez manipulowania krzywizną kręgosłupa, lepszej kontroli nad komple...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Baytril do wstrzykiwań 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Lek do pielęgnacji pooperacyjnej
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Materiałowy
uchwyt na igły Castroviejo, blokujący	ProSciTech	T149C
Ceramiczne ostrze z tlenku cyrkonu, okrągłe z ostrymi bokami, z pojedynczą krawędzią, kątowe	bawełniane wielokrotnego użytku	ProSciTech	TXD101A-X
( 5szt)	Multigate	21-893	Materiały eksploatacyjne
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Akumulatorowe narzędzie
obrotowe Kleszcze do opatrunków drobne	Multigate	06-306	Jednorazowe
wiertła	Kemmer Prä zision	SM 32 M 0550 070
Kleszcze do #7b	Dumont Fine Science Tools	11270-20
Pęseta Dumont	ProSciTech	T05-822
Trymer do futra	WAHL	WA9884-312	Trymer do włosów Zero Overlap
Nożyczki do irysów, Ti, ostre końcówki, proste, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Wielokrotnego użytku
Izoteza izofluranowa NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Środek znieczulający
Colibri Retraktor - 4cm	Fine Science Tools	17000-04
Rękojeść skalpela	ProSciTech	T133
Lateksowe rękawiczki chirurgiczne wielokrotnego użytku rozmiar 7,5	Medline	MSG5475	Materiał eksploatacyjny
Chlorek sodu 0,9%	STS	PHA19042005	Materiały eksploatacyjne
Sterylny zestaw opatrunkowy	Multigate	08-709	Jednorazowa
sterylna serweta nieprzepuszczalna dla płynów 60x60 cm	Multigate	29-220	Jednorazowa
spirytus chirurgiczny 100 ml	Provet	# SURG SP	Materiał do zszywania materiałów eksploatacyjnych
- JEDWAB BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Materiał	szwów jedwabnych	682G
- Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0,3 mg w 1 ml, x 5 ampułek (lek klasy S8)	Provet	TEMG I	Lek do opieki pooperacyjnej

Waciki wielokrotnego użytku wielokrotnego użytku, styl 5 wielokrotnego użytku wielokrotnego użytku jednorazowa do Johnson Medical