Worm-align i Worm_CP, dwa potoki typu open source do prostowania i kwantyfikacji danych obrazu fluorescencji uzyskanych z Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Worm-align/Worm_CP to prosty proces pracy FIJI/CellProfiler, który może być używany do prostowania i wyrównywania próbek Caenorhabditis elegans oraz do oceny testów opartych na obrazach całych robaków bez konieczności wcześniejszego szkolenia. Zastosowaliśmy Worm-align/Worm_CP do ilościowego oznaczania ekspresji wywołanej szokiem cieplnym u żywych zwierząt lub kropelek lipidów w ustalonych próbkach.

Streszczenie

Często napotykanym problemem podczas pozyskiwania danych obrazowych od stałych lub znieczulonych C. elegans jest to, że robaki krzyżują się i grupują ze swoimi sąsiadami. Problem ten nasila się wraz ze wzrostem zagęszczenia robaków i stwarza wyzwania dla obrazowania i kwantyfikacji. Opracowaliśmy oparty na FIDŻI przepływ pracy, Worm-align, który może być używany do generowania jedno- lub wielokanałowych montaży wybranych przez użytkownika, wyprostowanych i wyrównanych robaków na podstawie surowych danych obrazowych C. elegans. Worm-align to prosty i przyjazny dla użytkownika przepływ pracy, który nie wymaga wcześniejszego szkolenia ani użytkownika, ani algorytmu analizy. Montaże generowane za pomocą Worm-align mogą pomóc w wizualnej kontroli robaków, ich klasyfikacji i reprezentacji. Ponadto dane wyjściowe Worm-align mogą być wykorzystane do późniejszej kwantyfikacji intensywności fluorescencji u pojedynczych robaków, bezpośrednio na FIDŻI lub na innych platformach oprogramowania do analizy obrazu. Pokazujemy to, importując dane wyjściowe Worm-align do Worm_CP, potoku korzystającego z oprogramowania CellProfiler o otwartym kodzie źródłowym. Elastyczność CellProfiler umożliwia włączenie dodatkowych modułów do badań przesiewowych o wysokiej zawartości. Jako praktyczny przykład wykorzystaliśmy potok na dwóch zestawach danych: pierwszy zestaw danych to obrazy robaków reporterowych szoku cieplnego, które wyrażają białko zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora genu indukowanego szokiem cieplnym HSP-70, a drugi zestaw danych to obrazy uzyskane z utrwalonych robaków, Barwiony dla magazynów tłuszczów barwnikiem fluorescencyjnym.

Wprowadzenie

Stosunkowo prosty organizm, nicień C. elegans, jest niezwykle użytecznym systemem modelowym do badania chorób ludzkich. Około 38% genów w genomie C. elegans ma funkcjonalne odpowiedniki u ludzi^1,2. Jedną z unikalnych cech C. elegans jest to, że jest optycznie przezroczysty, co umożliwia łatwy dostęp do informacji in vivo dotyczących (sub)komórkowej ekspresji reporterów fluorescencyjnych w tkankach. To sprawia, że C. elegans jest głównym organizmem modelowym dla ekranów o wysokiej zawartości przy użyciu platform opartych na obrazach³. Jednak jedną z kwestii, która często komplikuje te badania, jest to, że podczas obrazowania gęstych populacji robaków mają one tendencję do krzyżowania się i grupowania, co sprawia, że porównania między poszczególnymi robakami są trudne, zaciemniając dalszą analizę obrazu i ocenę ilościową.

Istniejące rozwiązania, które rozwiązują ten problem, zazwyczaj polegają na optymalizacji protokołu hodowli i obrazowania, na przykład poprzez użycie konfiguracji mikro-fluidycznych⁴, co pozwala na uchwycenie pojedynczych robaków na oddzielnych obrazach5^,6. Inni zastosowali algorytmy uczenia maszynowego pozwalające na rozpoznawanie pojedynczych robaków, nawet w zbitej populacji. Doskonałym przykładem tego ostatniego jest WormToolbox, który jest modułowym rozszerzeniem platformy analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym, CellProfiler⁷. WormToolbox oferuje rozwiązanie o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości do analizy C. elegans i wyraźnie korzysta z jego włączenia do CellProfiler, ponieważ można łatwo dołączyć dodatkowe moduły analityczne. Chociaż WormToolbox jest dostarczany ze wstępnie wytrenowanym modelem (DefaultWormModel.xml), ponowne trenowanie algorytmu uczenia maszynowego jest zwykle wymagane dla każdej nowej aplikacji. Samouczki online, jak to zrobić, są dostępne na Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Mimo to instalacja i użytkowanie WormToolbox wymaga od początkujących użytkowników znacznej inwestycji czasu.

Tutaj opisujemy prosty, ekonomiczny i efektywny czasowo protokół do hodowli i obrazowania populacji C. elegans. Aby umożliwić ocenę poszczególnych robaków w pozyskanych obrazach, opracowaliśmy prosty przepływ pracy oparty na FIDŻI o otwartym kodzie źródłowym, nazwany Worm-align. Worm-align może być używany do generowania jedno- lub wielokanałowych montaży wyprostowanych i wyrównanych ślimaków. Po pierwsze, użytkownik musi ręcznie wybrać poszczególne robaki do analizy, rysując linię od głowy do ogona. Worm-align użyje tego zaznaczenia, aby przyciąć wybrane robaki z obrazu przeglądowego i wygenerować montaż, w którym wybrane robaki są prostowane i wyrównywane, aby ułatwić wizualne porównanie i prezentację.

Ponadto, wynik Worm-align może być wykorzystany do późniejszej kwantyfikacji intensywności fluorescencji u pojedynczych robaków, bezpośrednio na FIDŻI lub na innych platformach oprogramowania do analizy obrazów. Pokazujemy to, importując dane wyjściowe Worm-align do Worm_CP, potoku korzystającego z oprogramowania CellProfiler o otwartym kodzie źródłowym. Elastyczność CellProfiler umożliwia włączenie dodatkowych modułów do badań przesiewowych o wysokiej zawartości. Wykorzystaliśmy Worm_CP potok do ilościowego określenia reakcji na szok cieplny, dobrze zachowanego mechanizmu ochronnego, który ponownie fałduje białka, które są nieprawidłowo sfałdowane z powodu stresorów, takich jak wysoka temperatura⁸. W szczególności zastosowaliśmy potok do robaków przenoszących zintegrowany transgen wielokopijny, w którym promotor genu indukowanego szokiem cieplnym, hsp-70 (C12C8.1), napędza białko zielonej fluorescencji (GFP) ⁹. Użyliśmy również Worm_CP rurociągu na utrwalonych zwierzętach, które zostały oznaczone barwnikiem fluorescencyjnym, który wizualizuje kropelki lipidów (LD), główne organelle magazynujące tłuszcz w C. elegans¹⁰. Chociaż ten przepływ pracy nie ma przepustowości oferowanej przez WormToolBox, jest przyjazną dla użytkownika i prostą alternatywą dla wizualnej prezentacji i analizy eksperymentów C. elegans opartych na obrazach.

Protokół

1. Utrwalanie robaków do obrazowania zawartości tłuszczu za pomocą barwnika fluorescencyjnego do kropelek lipidów (BODIPY)¹⁰

1. Przygotuj zsynchronizowaną populację C. elegans poprzez wybielanie zgodnie ze standardowymi procedurami². Umieść około 1,000 robaków w stadium L1 na 9-centymetrowej pożywce dla nicieni (NGM) na warunek.
   UWAGA: Na końcu przygotowywanych jest więcej robaków, niż faktycznie określono ilościowo, z powodu utraty robaków podczas obchodzenia się
z nimi.
2. W celu zobrazowania zwierząt w młodym stadium dorosłym (około 50 godzin po posiewie L1 w temperaturze 20 °C), należy umyć każdą 9 cm płytkę z 15 ml M9 w stożkowej probówce, odwirować przy 252 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.
3. Powtórz pranie i pozostaw 1 ml M9 na granulkach robaków.
4. Przenieś 1 ml M9 zawierającego robaki do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml o niskiej zawartości wiązania białek, używając końcówek o niskiej retencji.
5. Wirować w mikrowirówce przez 1 minutę z prędkością 252 x g i usunąć supernatant, uważając, aby nie dotknąć osadu robaka znajdującego się na dnie probówki.
6. W celu monitorowania zawartości tłuszczu za pomocą barwienia 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacenu (BODIPY) barwienie¹⁰ (Tabela materiałów), utrwal robaki, dodając 0,5 ml 60% izopropanolu do osadu robaka przez 3 min¹¹, lub dodając 2 ml lodowatego metanolu przez 10 minut. W przypadku obu procedur należy odwrócić rurkę co 30 s.
   UWAGA: Jeśli metanol jest wybranym odczynnikiem utrwalającym, ten krok należy wykonać w dygestoriach ze względu na jego toksyczność.
7. Usuń jak najwięcej utrwalacza bez dotykania osadu robaka i dodaj 1 ml M9. Pozwól robakom osiąść na dnie rurki przez 3-5 minut.
8. Przemyć ponownie 1 ml M9, pozwolić robakom osiąść i usunąć supernatant, pozostawiając około 50 μl w probówce. Zabezpiecz rurkę za pomocą zacisku.
9. Robaki należy rozmrozić przez zamrożenie, zanurzając bezpiecznie zamkniętą rurkę w ciekłym azocie, a następnie w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze ~40 °C.
10. Powtórz krok 1.9 jeszcze raz.
11. Dodać 0,5 ml BODIPY rozcieńczonego w M9 o końcowym stężeniu 1 μg/μL i umieścić na rotatorze w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
12. Po 1 godzinie pozwól robakom osiąść na dnie rurki przez 3-5 minut.
13. Usunąć supernatant i dodać 1 ml M9.
14. Niech robaki osiądą na dnie i usuń supernatant.
    UWAGA: Alternatywnie możliwe jest wirowanie z prędkością 252 x g przez 1 minutę, ponieważ nie wydaje się, aby miało to wpływ na morfologię.
15. Dodać 0,5 ml M9.
    UWAGA: Jeśli utrwalacz składa się w 60% z izopropanolu, robaki można zutylizować tylko w ciągu 48 godzin. Jeśli utrwalaczem jest metanol, robaki należy zutylizować w ciągu 24 godzin.

2. Przygotowanie podkładek agarozowych do montażu robaków

UWAGA: Kluczowym krokiem podczas przygotowywania podkładki agarozowej jest uzyskanie podkładki o regularnej grubości. W przeciwnym razie robaki na podkładce będą znajdować się w różnych płaszczyznach ogniskowych, co utrudni uzyskanie ostrego obrazu o szerszym polu widzenia.

1. Przygotować 2% płatki agarozowe, dodając 0,2 g agarozy do 10 ml wysterylizowanego_H2Ow zlewce lub kolbie stożkowej. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 30 s, aż agaroza zacznie wrzeć.
   UWAGA: Nie przegrzewaj i nie zatrzymuj się, gdy tylko pojawią się bąbelki; W przeciwnym razie zwiększa lepkość agarozy, co utrudnia osiągnięcie pożądanej grubości podkładki.
2. Po stopieniu agarozy dozuj kroplę stopionej agarozy na środek szkiełka mikroskopowego za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 μl z nacięciem na samym końcu. Natychmiast, ale delikatnie, przytrzymaj kolejne szkiełko bardzo blisko kropli agarozy i uwolnij je na agarozę, aby utworzyć podkładkę o regularnej grubości, aby uzyskać najlepsze wyniki mikroskopii.
   UWAGA: Zwolnienie górnego suwaka z wysokości nie tylko utworzy bąbelki, ale spowoduje powstanie nierównej podkładki. Alternatywnie możliwe jest również użycie dwóch szkiełek podstawowych otaczających zjeżdżalnię z podkładką, z cienką warstwą taśmy na każdym szkiełku.
3. Po upływie co najmniej 2−3 minut delikatnie zdejmij górne szkiełko. Korzystając z boku górnego suwaka, przytnij podkładkę, aby nadać jej kwadratowy kształt. Zamontuj robaki w ciągu 5 minut, aby zapobiec wyschnięciu podkładki przed użyciem.

3. Montowanie stałych robaków do obrazowania

1. Stwórz mikropipetę do ust, rozciągając cienką szklaną kapilarnę w płomieniu palnika Bunsena (Rysunek 1A). Po rozciągnięciu w płomieniu rozbij kapilarnę na dwie części (Rysunek 1B). Wybierz najbardziej odpowiednią, zwykle najdłuższą, i sprawdź, czy koniec kapilary jest otwarty, próbując zassać wodę.
   UWAGA: Jeśli płyn nie dostanie się do kapilary, jest zbyt rzadki lub zablokowany. Delikatnie odetnij koniec kapilary nożyczkami, unikając zbyt dużego cięcia, ponieważ robaki zostaną zassane, jeśli otwór jest zbyt duży.
2. Podłącz szklaną kapilarnę z kroku 3.1 do adaptera kapilarnego (Rysunek 1C), połączonego z silikonową rurką 6 mm, a drugi koniec silikonowej rurki 6 mm podłącz do filtra 0,2 μm, przymocowanego do silikonowej rurki 3 mm na drugim końcu (Rysunek 1C). Podłącz końcówkę filtra o pojemności 1 ml (Rysunek 1C) do wolnego końca silikonowej rurki o średnicy 3 mm, aby zassać płyn.
   UWAGA: Filtr 0,2 μm dodaje się między usta eksperymentatora a kapila, aby zapewnić maksymalne bezpieczeństwo eksperymentatora. Podobne rozwiązanie stosuje się w przypadku mikropipet doustnych używanych do pracy z zarodkami myszy¹². Wymieniaj filtr (zwykle co kilka miesięcy), jeśli mikropipeta doustna nie zasysa już płynu.
3. Używając mikropipety do jam ustnych pod mikroskopem preparacyjnym, usuń jak najwięcej płynu wokół osadu robaków (Rysunek 2).
   UWAGA: Odpipetowanie supernatantu za pomocą ręcznej mikropipety może być stosowane jako alternatywa dla pipet doustnych w krokach od 3.1 do 3.3 w celu usunięcia jak największej ilości supernatantu. Dodać 6 μl podłoża montażowego. Okazuje się jednak, że ta metoda nie działa tak wydajnie, ponieważ nadmiar płynu w elektrodach powoduje rzadkie zagęszczenie robaków, co sprawia, że obrazowanie jest bardziej czasochłonne. Wznów krok 3.6. Spójrz na spód probówki i upewnij się, że pipeta nie zasysa robaków.
4. Szybko dodaj 10 μl medium montażowego (tabela materiałów) na dno probówki.
5. Przepłucz końcówkę o pojemności 10 μl w PBS śladowymi ilościami detergentu (0,01% Triton), aby zapobiec przywieraniu robaków do boków plastikowej końcówki pipety. Odetnij sam koniec końcówki nożyczkami.
6. Przenieść 8 μl podłoża montażowego zawierającego robaki na podkładkę agarozową przygotowaną w kroku 2.3. Pod mikroskopem delikatnie potrząśnij szkiełkiem, aby uniknąć nakładania się robaków.
7. Przykryj kroplę podłoża montażowego na podkładce agarozowej szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 mm x 18 mm (Rysunek 3).
   UWAGA: Preferowane są mniejsze szkiełka nakrywkowe, ponieważ wywierają mniejszy nacisk na robaki. Przytrzymaj szkiełko nakrywkowe pęsetą i przyłóż jedną krawędź szkiełka nakrywkowego do wacika agarozowego, a następnie delikatnie nałoż szkiełko nakrywkowe pęsetą.

4. Montowanie żywych robaków do obrazowania

UWAGA: Aby zobaczyć żywe robaki, muszą być one unieruchomione na podkładce. Jednym ze sposobów osiągnięcia tego celu jest sparaliżowanie ich za pomocą agonisty receptora nikotynowego: lewamizolu (tabela materiałów).

1. Odpipetować 3−4 μl 3 mM lewamizolu rozpuszczonego w M9 na podkładkę agarozową utworzoną w kroku 2.3.
   UWAGA: Powinna być wystarczająca objętość płynu, aby robaki nie znajdowały się jeden na drugim, ale nie za dużo płynu, aby robaki były zbyt rzadkie na podkładce. Doświadczeni zbieracze robaków mogą użyć 3 μl lewamizolu. Mniej doświadczeni zbieracze mogą potrzebować dodać większą objętość lewamizolu, aby lewamizol nie wyparował całkowicie.
2. Wybierz 30-50 robaków na warunek do kropli lewamizolu.
3. Przykryj kroplę lewamizolu na wkładce agarozowej szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 mm x 18 mm. Robaki obrazowe w ciągu 1 godziny, ponieważ środek paraliżujący ostatecznie doprowadzi do śmierci robaków.

5. Preparaty obrazowe z mikroskopem epifluorescencyjnym

1. Za pomocą podkładki agarozowej o jednolitej grubości można jednocześnie zobrazować wszystkie robaki na szkiełku za pomocą dużego obrazu o wymiarach 6 x 6 lub 7 x 7, na przykład za pomocą obiektywu 20x mikroskopu fluorescencyjnego. Jeśli grubość pola lutowniczego nie jest równa, uzyskaj kilka mniejszych obrazów 3 x 3 lub 4 x 4 tego samego slajdu.
2. Użyj tych samych ustawień intensywności fluorescencji i czasu ekspozycji dla wszystkich warunków. Dostosuj każde ustawienie, aby dopasować je do slajdu o najjaśniejszej intensywności, upewniając się, że nie ma nasycenia pikseli. Aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące pozyskiwania obrazu, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta mikroskopu.

6. Tworzenie obrazów montażowych wyrównanych pojedynczych robaków za pomocą potoku Worm-align FIJI

1. Zainstaluj pakiet oprogramowania do analizy obrazów typu open source FIJI¹³/ImageJ¹⁴ z https://imagej.net/Fiji. Jeśli dostępna jest wcześniejsza instalacja FIJI, upewnij się, że została zaktualizowana do wersji 1.52a lub nowszej, ponieważ wymagają tego niektóre funkcje używane w makrze (np. funkcje tabeli). Pobierz makro Worm-align z Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
2. Otwórz FIJI i uruchom makro Worm-align. Uruchom Worm-align, klikając Wtyczki | Makra | Uruchom na głównym pasku menu FIDŻI (Rysunek S1). Teraz zlokalizuj skrypt Worm-align.ijm na komputerze.
3. Makro inicjuje się, pytając o lokalizację obrazów. Potok będzie działał zarówno na jednokanałowych, jak i wielokanałowych obrazach fluorescencyjnych (rysunek S2). Wybierz folder wejściowy, a makro automatycznie wygeneruje folder wyjściowy, w którym zostaną zapisane wszystkie wyniki (Rysunek S3).
   UWAGA: Ważne jest, aby wybrany folder zawierał tylko pliki obrazów, ponieważ obecność innych formatów plików spowoduje awarię makra. Najlepiej grupować tylko te obrazy, które zostały zarejestrowane przy użyciu tych samych ustawień mikroskopu. Worm-align akceptuje wiele różnych formatów plików, w tym nd2, czi, tif, rgb, jpg i png. Nazwa folderu wyjściowego będzie taka sama jak folderu wejściowego, z "_output" dodanym jako przyrostkiem, tj. jeśli folder wejściowy to "images", Dane wyjściowe zostaną znalezione w 'images_output'. Folder wyjściowy będzie zawierał cztery podfoldery, w których zostaną zapisane dane.
4. Poczekaj, aż makro przejdzie dalej, aby otworzyć pierwszy obraz w folderze wejściowym i użyj go jako reprezentatywnego obrazu, aby wyodrębnić ustawienie do wygenerowania montage.
   UWAGA: Worm-align automatycznie wybierze pierwszy obraz w folderze wejściowym, aby wygenerować ustawienia, które zostaną zastosowane do wszystkich innych obrazów w folderze. Jeśli inny obraz zostanie uznany za bardziej reprezentatywny dla zestawu danych, upewnij się, że ten obraz został wybrany, zapisując kopię obrazu w folderze wejściowym, zmieniając nazwę tak, aby była teraz wymieniona na górze listy (np. "0_RepresentativeImage").
5. Za pomocą narzędzia do rysowania linii prostej narysuj linię na całej szerokości robaka (Rysunek S4) i użyj długości tej linii, aby określić wysokość przyciętych obszarów dla pojedynczych robaków. Dla każdego kanału określ nazwę, tabelę przeglądową (LUT), ustawienia intensywności (B&C) oraz to, czy powinien być uwzględniony w montażu (Rysunek S4).
   UWAGA: Parametry te są rejestrowane i zapisywane w pliku ustawień Settings.csv, który znajduje się w podfolderze CellProfiler folderu wyjściowego.
6. Po przechwyceniu wszystkich ustawień użytkownikowi wyświetla się, jak będą wyglądać obrazy po zastosowaniu zastosowanych ustawień (Rysunek S5). Zaznacz górne pole, jeśli ustawienia są wystarczające. Wybierz opcje generowania montażu (usuń znaczniki, jeśli nie jest to wymagane): 1. Wygeneruj montaż wybranych robaków dla każdego pojedynczego obrazu, lub 2. Wygeneruj połączony montaż, w którym wszystkie robaki wybrane na wszystkich obrazach w folderze wejściowym zostaną połączone w jeden montaż. Kliknij przycisk OK, aby uruchomić pozostałą część makra.
   UWAGA: Jeśli górne pole nie zostanie zaznaczone przed kliknięciem przycisku "OK", makro ponownie uruchomi konfigurację, dzięki czemu można zoptymalizować ustawienia obrazu.
7. Potok Worm-align przechodzi teraz do otwierania wszystkich obrazów w folderze wejściowym. Dla każdego obrazu narysuj linie na osi podłużnej wszystkich robaków, które mają zostać uwzględnione w montażu i/lub określ ilościowo (Rysunek 4 i Rysunek S6) za pomocą narzędzia "linia segmentowa" (na pasku menu głównego FIDŻI). Aby zapewnić prawidłowe wyrównanie robaka, narysuj linie konsekwentnie od głowy do końca ogona (lub odwrotnie) oraz wzdłuż całej długości robaka (zobacz przykłady rysowania "dobrych" i "złych" linii w Rysunek 4B).
8. Dodaj każdą linię do menedżera ROI, klikając Ctrl+T. Worm-align wykorzystuje linie dodane do menedżera ROI w połączeniu z parametrem szerokości robaka (ustawionym w kroku 6.4) do generowania przyciętych obrazów pojedynczych wybranych robaków. Zbiór ROI linii jest zapisywany w podfolderze "data". Ten folder zawiera również kopię oryginalnego obrazu przedstawiającego linie, a także numer robaka. Linie są oznaczone kolorami za pomocą tabeli przeglądowej Glasbey_on_dark. Obrazy wyprostowanych robaków są zapisywane w podfolderze single_worms folderu wyjściowego. Ponadto, jeśli zostanie to wybrane w kroku 6.6 tego protokołu, Worm-align tworzy montaże wszystkich robaków wybranych dla każdego obrazu przeglądowego i/lub dla wszystkich obrazów przeglądowych w folderze wejściowym (patrz Rysunek 4C i Rysunek S7). Te montaże można znaleźć w "wyrównanym" podfolderze folderu wyjściowego.

7. Analiza intensywności fluorescencji pojedynczego robaka przy użyciu danych wyjściowych z Worm-align w zautomatyzowanym potoku CellProfiler

1. W celu dalszego przetwarzania danych i analizy danych wyjściowych Worm-align należy pobrać i zainstalować pakiet oprogramowania do analizy obrazów typu open source 'CellProfiler^15,16 z https://cellprofiler.org/. Pobierz potok Worm_CP.cpproj z usługi GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align
   UWAGA: Opisany tutaj przykładowy potok został skonstruowany przy użyciu programu CellProfiler2.2.0 i może nie działać w nowszych wersjach programu CellProfiler.
2. Przed uruchomieniem potoku Worms_CP.cpproj upewnij się, że w podfolderze CellProfiler folderu wyjściowego Worm-align znajdują się wszystkie oczekiwane obrazy wyjściowe: przetworzona kopia oryginalnego obrazu (o nazwie: Original_), binarna maska obrazu populacji robaka (o nazwie: Mask_), maska linii linii narysowanych na wybranych robakach (o nazwie: Lines_) oraz jeden obraz reprezentujący każdy z kanałów obecnych na oryginalnym obrazie (nazwany przez numer kanału).
3. Aby określić ilościowo intensywność fluorescencji u pojedynczych robaków, kliknij moduł wejściowy Obrazy i po prostu przeciągnij folder wyjściowy CellProfiler do okna z napisem Upuść pliki i foldery tutaj. Jeśli istnieje lista obrazów z poprzedniej analizy, najpierw usuń je, klikając prawym przyciskiem myszy w oknie i wybierając Wyczyść listę plików. Aby wykluczyć plik "Settings.csv" z listy obrazów, wybierz opcję "Tylko obrazy" lub "Niestandardowy" z opcją "Rozszerzenie to tif, tiff, ome.tif lub ome.tiff" dla ustawień filtra (Rysunek S8).
4. Kliknij moduł wprowadzania metadanych. W drugiej metodzie ekstrakcji kliknij żółty folder i zlokalizuj podfolder CellProfiler w folderze wyjściowym WormAlign (Rysunek S9). Wybierz plik Settings.csv i połącz ustawienia w pliku z danymi wyjściowymi programu CellProfiler, dopasowując metadane w plikach CSV do metadanych na obrazach (metadane kanału).
5. Kliknij moduł wejściowy NamesAndTypes i wstaw nowy obraz dla każdego kanału oryginalnego obrazu, który ma zostać określony ilościowo.
   UWAGA: W przykładowym potoku znajduje się już maska robaka, dwa kolorowe obrazy, maska linii i oryginalny obraz oraz trzy obrazy w skali szarości (kanał zielony i czerwony). Lista w tym module musi zostać dostosowana, jeśli oryginalne obrazy mają więcej lub mniej kanałów niż przykładowe obrazy.
6. Sprawdź, czy nazwy obrazów w każdej kolumnie label/mask/worms są poprawne.
   UWAGA: Nazwy obrazów w jednym wierszu powinny odpowiadać temu samemu początkowemu obrazowi do analizy. Jeśli podczas procesu analizy obrazu zostanie popełniony błąd, niektóre obrazy wyjściowe będą brakować, a nazwy pod trzema kolumnami etykieta/maska/robaki nie będą już odpowiadać temu samemu początkowemu obrazowi dla każdej linii. W takim przypadku sprawdź, gdzie jest błąd.
7. Naciśnij Wyświetl ustawienia wyjściowe, aby wybrać folder, w którym chcesz zapisać dane wyjściowe z Cellprofiler.
8. Kliknij przycisk Rozpocznij tryb testowy. W trybie testowym sprawdź dwukrotnie ustawienia potoku, stosując je do pierwszego obrazu w zestawie danych, klikając pozycję Uruchom (co spowoduje uruchomienie przez wszystkie aktywne moduły w potoku) lub Krok (który będzie uruchamiany przez potok po jednym module naraz).
   UWAGA: W trybie testowym wyodrębnione pomiary nie zostaną wyeksportowane, nawet jeśli moduł ExportToSpreadsheet jest obecny (i aktywny) w potoku.
9. Gdy potok będzie działał tak, jak powinien, kliknij pozycję Wyjdź z trybu testowego, a następnie naciśnij przycisk Analizuj obrazy. Zgodnie z obecnymi ustawieniami, Worms_CP (1) użyje obrazu Mask_ do segmentacji szorstkiej maski robaka i obrazu Lines_ (Rysunek S10A) do wyodrębnienia wybranych robaków i wytworzenia masek pojedynczego robaka (Rysunek S10C), (2) zmierzy intensywność fluorescencji wszystkich kanałów obecnych na obrazach wejściowych w tych zidentyfikowanych i zamaskowanych robakach. Potok może również mierzyć intensywność tła (rysunek S10B) i odpowiednio korygować wszystkie obrazy (oznaczone słowem próg w nazwie mierzonego parametru. np.: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) mierzyć rozmiar wybranych robaków oraz (4) eksportować wszystkie zmierzone parametry (rysunek S10D).
10. Otwórz dane wyjściowe Worm_CP składające się z dwóch plików worms.csv i lines.csv , które są zapisane w wybranym folderze wyjściowym (patrz Rysunek S11). Pliki te można otwierać w programie Excel lub R (Studio) w celu przetwarzania końcowego i raportowania. Jeśli wymagane jest dodatkowe wyjście, np. dla danych obrazu, można je wybrać w module ExportToSpreadsheet w potoku.

Wyniki

Hodowla i obrazowanie C. elegans zgodnie z metodą opisaną w tym protokole tworzy duże obrazy przeglądowe populacji robaków. Aby ułatwić kontrolę wzrokową i klasyfikację robaków na podstawie tych obrazów, opracowaliśmy Worm-align. Worm-align to prosty i przyjazny dla użytkownika skrypt FIJI, którego można używać do tworzenia montaży wyprostowanych i wyrównanych robaków. Robaki są wybierane z obrazów poglądowych poprzez narysowanie linii wzdłuż osi podłużnej robaków. Każdemu wybranemu robakowi przypisywany jest numer, przycinany i prostowany, a następnie dodawany do montażu. Montaże mogą być generowane dla każdego obrazu lub łączące wszystkie obrazy z oryginalnego folderu wejściowego.

Zgodnie z oczekiwaniami, wynik potoku w dużej mierze zależy od jakości linii narysowanych na obrazach. Aby zilustrować ten punkt, Rysunek 4 pokazuje kilka przykładów linii i ich dane wyjściowe z Worm-align. Pełna linia od głowy do czubka ogona tworzy prawidłowo ustawionego robaka (oznaczonego jako "dobry"). Rysunek 4 pokazuje również, jak niedokładności śledzenia podczas wykonywania wyrównania robaka wpływają na wynik wyrównania. Z adnotowanego montażu zawartego w Rysunek 4C, należy zwrócić uwagę na to, aby uniknąć następujących błędów, ponieważ utrudniają one prawidłowe ustawienie robaków:

• Niekonsekwentne śledzenie robaka od głowy do ogona (oznaczone jako "ogon do głowy"). Powoduje to, że robaki są zorientowane w różnych kierunkach (tj. ogon do głowy lub głowa w ogon) w wyrównaniu.
• Niekompletne śledzenie (oznaczone jako "niekompletne"). Powoduje to, że tylko ta część robaka, która została prześledzona, zostanie przycięta do montażu.
• Włączenie wielu robaków do jednego śladu (oznaczonego jako "robak z dwiema głowami"). Powoduje to, że robaki oraz (znaczne sekcje) ich sąsiadów są wstawiane do tego samego panelu montażu.
• Dodawanie losowych linii do obrazu (oznaczonych jako "losowe"). Powoduje to wstawienie losowych paneli w montażu.

Dla stworzenia montażu nie jest problemem, jeśli dwie pojedyncze linie przecinają się (oznaczone jako "przecinające") lub są połączone na obu końcach robaka (oznaczone jako "połączone"), o ile każda linia śledzi całą długość pojedynczego robaka: Skrypt Worm-align indywidualnie i sekwencyjnie wybiera każdą linię ROI, przycina ją i prostuje, tak, aby każdy panel w końcowym montażu reprezentował pojedynczy ślad linii. Jednak w przypadku krzyżujących się robaków, mimo że wyprostowane robaki na całej długości pojawiają się dla robaka "intersecting1" i robaka "intercining2" w montażu (patrz Rysunek 5A-B), wyraźnie widać, że robaki te krzyżują się ze sobą na oryginalnym obrazie przeglądowym. W związku z tym można wnioskować, że identyfikacja wizualna przecinających się linii jest możliwa na podstawie obrazu nakładki znajdującego się w podfolderze 'data' (Rysunek 5A), a także na podstawie paneli poszczególnych robaków w montażu (Rysunek 5B). Ponadto, wszelkie nakładanie się robaków/linii może być zidentyfikowane na podstawie tabeli kontroli jakości (QC) generowanej dla każdego przetworzonego obrazu przez Worm-align i zapisanej w podfolderze danych. Ta tabela rejestruje trzy parametry dla każdego z ROI linii narysowanych na obrazie (patrz Rysunek 5C): Spośród nich długość wskazuje długość ROI linii, co jest dobrym wskaźnikiem rozmiaru robaka; a numer robaka wskazuje kolejność, w jakiej linie zostały narysowane na obrazie przeglądowym. Wreszcie ostatnia kolumna wskazuje, czy robak/linia, o której mowa, nakłada się na siebie którykolwiek z innych robaków/linii zaznaczonych na obrazie. W przypadku nakładania się liczba w tej kolumnie będzie inna niż podana w kolumnie Numer robaka. W połączeniu z obrazem nakładki, tabela kontroli jakości powinna pomóc badaczowi w podejmowaniu wyuczonych decyzji dotyczących tego, które robaki powinny zostać wykluczone z montażu i/lub kwantyfikacji.

Dane wyjściowe z Worm-align mogą być wykorzystane do późniejszej kwantyfikacji intensywności fluorescencji u pojedynczych robaków. Na FIDŻI liniowe ROI mogą być używane do pomiaru intensywności fluorescencji w oryginalnych danych obrazu, na przykład poprzez wykonanie prostego skryptu FIJI "Worm-quant.ijm", który można również znaleźć w repozytorium Worm-align na Github. Alternatywnie, dane wyjściowe Worm-align można zaimportować do oprogramowania do analizy obrazu innej firmy. Pokazujemy to, importując dane wyjściowe Worm-align dwóch zestawów danych do potoku Worm_CP, który wygenerowaliśmy w CellProfiler. Worm_CP wykorzystuje pliki znajdujące się w podfolderze "CellProfiler" w folderze wyjściowym Worm-align w celu precyzyjnego dostrojenia masek segmentacji poszczególnych robaków wybranych podczas wykonywania makra Worm-align. W szczególności wykorzystuje maskę liniową (o nazwie: Lines_) do izolowania wybranych robaków z populacji robaków widocznych w masce binarnej (o nazwie: Mask_). Należy zauważyć, że linie, które przecinają się na obrazie przeglądowym (Rysunek 5A), choć nie stanowią problemu dla generowania montaży, są problematyczne dla potoku Worm_CP. Dlaczego tak jest, zilustrowano na stronie Rysunek 5 D-E. Worm_CP używa maski liniowej (Rysunek 5D), a nie indywidualnych ROI, aby pomóc w identyfikacji poszczególnych robaków. Przecinająca się linia narysowana jako druga podczas wykonywania wyrównania robaka jest nakładana na pierwszą linię i dlatego intensywność wzdłuż tej linii będzie równa intensywności ROI2, w tym w bitach, w których linie 1 i 2 nakładają się na siebie. W rezultacie CellProfiler podzieli linię2 na segmenty jako jeden obiekt, ale linię1 na dwa obiekty, które są oddzielone w miejscu, w którym przecina się z linią2. Oznacza to, że CellProfiler wytworzy dwie (połowiczne) maski robaka dla robaka 'intersecting1' (Rysunek 5E). Najprostszym sposobem wykluczenia tych zdarzeń z końcowej analizy (jeśli jest to wymagane) jest zidentyfikowanie liczby krzyżujących się robaków z tabeli QC (podfolderu danych) i usunięcie pomiarów dla tych robaków z plików wyjściowych CellProfiler. Należy pamiętać, że robakom niekoniecznie zostanie przydzielony ten sam numer w FIJI i CellProfiler: Aby zidentyfikować numer robaka FIJI w danych wyjściowych CellProfiler, należy zwrócić uwagę na wartości Intensity_Max_Intensity w pliku wyjściowym "Lines.csv". Każda wartość Intensity_Max_Intensity, która pojawia się w tabeli "Lines.csv" więcej niż raz na obraz, wskazuje na zwrot z inwestycji w tę linię, co skutkuje pękniętą maską robaka.

Po podzieleniu masek na segmenty, Worm_CP może zmierzyć intensywność fluorescencji w wybranych robakach dla wszystkich zarejestrowanych kanałów. Wszystkie pomiary są wykonywane na podstawie oryginalnych (surowych) danych obrazu, choć należy zauważyć, że CellProfiler automatycznie przeskalowuje intensywność pikseli w skali 0-1. Osiąga się to poprzez podzielenie wartości intensywności nieprzetworzonych pikseli przez maksymalną możliwą intensywność pikseli dla obrazu. W przypadku obrazów 8-bitowych wartość ta wynosi 255, a w przypadku obrazów 16-bitowych jest to 65535. W związku z tym wartości intensywności CellProfiler należy pomnożyć przez maksymalną możliwą wartość intensywności, aby odzyskać wartości równoważne surowym danym obrazu. Dane wyjściowe Worm_CP składają się z dwóch plików csv "worms.csv" i "Lines.csv", które są zapisywane w wybranym folderze wyjściowym. Podczas sprawdzania tych plików jasne jest, że CellProfiler rejestruje dużą liczbę parametrów związanych z intensywnością fluorescencji. Spośród nich Intensity_IntegratedIntensity odpowiada całkowitej fluorescencji na robaka (tj. sumie intensywności fluorescencji we wszystkich pikselach, które składają się na maskę pojedynczego robaka). Parametr Intensity_MeanIntensity odnosi się do średniej intensywności fluorescencji w obrębie pojedynczego robaka (tj. średniej intensywności fluorescencji na piksel dla wszystkich pikseli zawartych w pojedynczym robaku). Ze względu na sporadyczne występowanie (niewielkich) błędów w segmentacji masek robaków, zaleca się stosowanie pomiarów MeanIntensity przy porównywaniu pomiarów fluorescencji poszczególnych robaków w dwóch warunkach. Jeśli chcesz odjąć fluorescencję tła od pomiarów ilościowych, użyj pomiarów o nazwie MeanIntensity_Threshold.

Użyliśmy Worm_CP potoku do ilościowego określenia intensywności fluorescencji od zwierząt utrwalonych, które zostały oznaczone barwnikiem fluorescencyjnym, który włącza się do kropelek lipidów (LDs) (Rysunek 6). Aby zweryfikować kwantyfikację fluorescencji z potoku Worm-align/Worm_CP, określiliśmy ilościowo intensywność fluorescencji w tym samym zestawie robaków ze zbioru danych BODIPY za pomocą potoku Worm-align/Worm_CP lub ręcznej kwantyfikacji w FIJI/ImageJ. Ręczna kwantyfikacja została przeprowadzona na FIJI/ImageJ, poprzez okrążenie każdego robaka, a także ciemną strefę tła na każdym obrazie. Intensywność fluorescencji została zmierzona w menedżerze ROI, a wartość zmierzona dla tła obrazu została odjęta od pomiaru fluorescencji robaka każdego robaka, zgodnie z opisem¹⁷. Porównaliśmy robaki N2 typu dzikiego (WT) z mutantami dbl-1(nk3), które wykazują zmniejszoną zawartość kropelek lipidów¹⁸. Zgodnie z oczekiwaniami, intensywność zielonej fluorescencji jest znacznie zmniejszona między robakami WT i dbl-1(nk3) przy użyciu obu metod (Rysunek 6A,B). Przykłady wyrównanych robaków można zaobserwować w Rysunek 6C,D. Zawartość lipidów w kropelkach zmniejsza się o 17% (wartość p<0,0001, niesparowany test t) między WT a dbl-1 (nk3) przy użyciu ręcznej kwantyfikacji i o 14% (wartość p = 0,0051 niesparowany test t) przy użyciu Worm_CP rurociągu. Spadek zawartości kropelek lipidów obserwowany tutaj w dbl-1(nk3) przy obu metodach oznaczania ilościowego jest zgodny z literaturą¹⁸. Pokazuje to, że kwantyfikacja uzyskanych obrazów fluorescencyjnych za pomocą Worm_CP potoku CellProfiler jest porównywalna z ręczną kwantyfikacją.

Również użyliśmy Worm_CP do ilościowego określenia reakcji na szok cieplny u żywych robaków wyrażających GFP pod kontrolą genu indukowanego szokiem cieplnym hsp-70(C12C8.1)⁹. Rysunek 7 pokazuje reprezentatywne obrazy żywych C. elegans niosących reagujący na ciepło reporter hsp-70(C12C8.1)p::GFP. Przy braku stresu cieplnego robaki nie wywołują ekspresji GFP (Rysunek 7A,B). Jednakże, kiedy robaki są wystawione na krótki szok cieplny trwający 30 minut w temperaturze 34 °C, indukują one ekspresję GFP (Rysunek 7C,D). Poziomy ekspresji GFP z szokiem cieplnym i bez niego są określane ilościowo w Rysunek 7E.

Na dzień dzisiejszy, jest Worm_CP to bardzo prosty potok. Jednak takie podejście umożliwia dokładniejszą segmentację poszczególnych masek robaków, co pozwala na dokładniejsze określenie ilościowe intensywności fluorescencji u robaków wybranych z obrazu. Z tego powodu preferujemy to podejście zamiast przybliżonej kwantyfikacji na FIDŻI, przy użyciu samych masek liniowych. Ponadto CellProfiler ma tę zaletę, że dodatkowe moduły analityczne można łatwo włączyć do potoku. Na przykład w przypadku zestawu danych, który analizuje zawartość kropelek lipidów, wstawienie dodatkowych modułów do Worm_CP rurociągu może zbadać liczbę kropelek lipidów i intensywność fluorescencji poszczególnych kropelek w tych robakach, które zostały wybrane na obrazach przeglądowych.

Rysunek 1: Generowanie mikropipety do jamy ustnej. Szklana kapilara jest przedłużana w płomieniu palnika Bunsena (A), aż zapewni cienkie, wydłużone kończyny (B). Przedłużona szklana kapilara jest następnie podłączana do adaptera mikropipety do jamy ustnej. (C) Schemat mikropipety do jamy ustnej. Mikropipeta do ust została zmontowana ze szklaną kapilarą podłączoną do adaptera. Silikonowa rurka o średnicy 6 mm łączy adapter z filtrem strzykawkowym 0,2 μm, używanym dla bezpieczeństwa. Drugi koniec filtra jest przymocowany do silikonowej rurki o średnicy 3 mm zakończonej końcówką filtra o pojemności 1 ml. Eksperymentator może zasysać przez końcówkę filtra. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 2: Zasysanie cieczy otaczającej osad robaka za pomocą mikropipety doustnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Dodawanie szkiełka nakrywkowego na robaki leżące na podkładce agarozowej Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Przykłady prostowania robaków przy użyciu Worm-align na obrazach fluorescencyjnych uzyskanych od żywych zwierząt przenoszących transkrypcję reporterową fat-7p::GFP w jelicie i czerwony marker do jednoczesnego wstrzyknięcia w gardle (myo-2p::tdtomato). (A) Zrzut ekranu złożonego obrazu żywego robaka uzyskanego pod mikroskopem fluorescencyjnym w 3 dniu dorosłości. Obraz został otwarty za pomocą Worm_align, a linie zostały narysowane wzdłuż osi podłużnej robaków za pomocą Worm-align. (B) Zrzut ekranu tego samego obrazu co w (A), z przykładami dobrego i złego rysowania linii wzdłuż osi robaków, za pomocą Worm-align. (C) Przykłady linii narysowanych na czubku robaków które mogą wznieść się do nieprawidłowo ustawionych robaków. Wyjście robaków wybranych w B. Obrazy zostały wykonane obiektywem 20x na odwróconym mikroskopie szerokokątnym (patrz tabela materiałów) z intensywnością zielonej fluorescencji = 1, ekspozycją = 60 ms i intensywnością czerwonej fluorescencji = 8, ekspozycją = 60 ms. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykłady prostowania ślimaków za pomocą wyrównania ślimaka na przecinających się ślimakach. (A) Zrzut ekranu złożonego obrazu uzyskanego pod mikroskopem fluorescencyjnym żywych robaków w 3 dniu dorosłego życia zwierząt noszących transkrypcję reporterowego tłuszczu-7p::GFP w jelicie i czerwony marker do jednoczesnego wstrzyknięcia w gardle (myo-2p::tdtomato). Przecinające się robaki są oznaczone jako "intersecting1" i "intersecting2", podczas gdy robaki nienakładające się na siebie są oznaczone jako "good3" i "good4". (B) Montaż stworzony przez Worm-align reprezentujący wyprostowane robaki wybrane w (A). W montażu można zauważyć, że robaki 1 i 2 przecinały się na oryginalnym obrazie (robaki oznaczone jako "intersecting1" i "intersecting2"). (C) Zrzut ekranu tabeli QC z Worm-align, która pozwala dostrzec przypadki gdzie robaki się przecinają. Długość: długość linii zwrotu z inwestycji; numer robaka: kolejność, w jakiej zostały narysowane linie; Ostatnia kolumna wskazuje, czy robak/linia zainteresowania nakłada się na siebie. W tym przykładzie robak w pierwszym surowym pliku (robak numer 1) nakłada się na robaka numer 2, na co wskazuje liczba "2" w ostatniej kolumnie. (D) Zrzut ekranu przedstawiający linie narysowane za pomocą Worm-align na czterech robakach wybranych w A. (E) Zrzut ekranu przedstawiający maski wygenerowane przez Worm-align na czterech robakach wybranych w A, pokazujący, jak renderowane są maski dwóch przecinających się robaków. W tym przypadku dwie maski zamiast jednej odpowiadają teraz robakowi "intersecting1". Zdjęcia zostały wykonane obiektywem 20x na odwróconym mikroskopie szerokokątnym (patrz tabela materiałów) z intensywnością zielonej fluorescencji = 1, ekspozycją = 60 ms i intensywnością czerwonej fluorescencji = 8, ekspozycją = 60 ms. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Worm_CP rurociąg określa ilościowo fluorescencję tak dokładnie, jak w przypadku ręcznej oceny ilościowej. Porównanie ilościowej oceny fluorescencji młodych dorosłych robaków utrwalonych i wybarwionych pod kątem zawartości kropelek lipidów za pomocą zielonego barwnika fluorescencyjnego BODIPY, przy użyciu Worm_CP rurociągu (A) lub ręcznej kwantyfikacji (B). Zawartość lipidów w kropelkach WT i dbl-1 (nk3) monitorowano poprzez wiązanie i barwienie zwierząt za pomocą BODIPY, który ulega interkalacji w kwasy tłuszczowe kropelek lipidów (patrz protokół A). Młode dorosłe zwierzęta utrwalono 60% izopropanolem i barwiono preparatem BODIPY przez 1 godzinę. Ten sam zestaw zwierząt został oceniony ilościowo za pomocą Worm_CP rurociągu (patrz krok 7) lub ręcznie zgodnie ze standardowymi procedurami¹⁷. (A) Kwantyfikacja fluorescencji przy użyciu Worm_CP rurociągu. WT: n=22 zwierzęta, średnia fluorescencja = 1,016 (A.U) ± 0,206 SD; dbl-1(nk3): n=25 zwierząt, średnia fluorescencja = 0,8714 (A.U) ± 0,126 SD. Niesparowany test t. (B) Ręczne oznaczanie ilościowe fluorescencji. WT: n=22 zwierzęta, średnia fluorescencja = 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3): n=25 zwierząt, średnia fluorescencja = 0,8632 ± 0,109 SD. Niesparowany test t. (C, D) Reprezentatywny przykład lub dane wyjściowe Worm-Align dla zwierząt WT (C) i dbl-1(nk3) (D) wyprostowanych za pomocą potoku Worm-align. Zdjęcia zostały wykonane obiektywem 20x na odwróconym mikroskopie szerokokątnym (patrz tabela materiałów) z intensywnością zielonej fluorescencji = 2, ekspozycją = 60 ms. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Przykład kwantyfikacji fluorescencji i wyrównania żywych robaków na podstawie obrazów fluorescencyjnych żywych robaków przenoszących reporter transkrypcyjny hsp-70(C12C8.1)p::GFP po szoku cieplnym. (A) Po krótkim szoku cieplnym (30 minut w temperaturze 34 °C), młode dorosłe robaki zostały odzyskane w temperaturze uprawy (25 °C) i zamontowane, a następnie zobrazowane 3,5 godziny po szoku cieplnym. Około 30 robaków poddano ocenie ilościowej po szoku cieplnym przy użyciu rurociągu Worm-align. Punkty A-B) Przykłady wyrównanych robaków, które nie były narażone na szok cieplny. (C-D) Przykłady robaków poddanych szokowi termicznemu przenoszących hsp-70(C12C8.1)p::GFP przy użyciu Worm-align. (E) przedstawia średnią intensywność (parametr Worm_CP: MeanIntensity_Threshold) wyhodowanych młodych dorosłych robaków WT bez szoku cieplnego lub po wystawieniu na szok cieplny (34 °C przez 30 min). Zdjęcia wykonano obiektywem 20x na odwróconym mikroskopie szerokokątnym (patrz tabela materiałów) z intensywnością zielonej fluorescencji = 1, ekspozycją = 60 ms; brak HS: n=12, HS: n=32. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Lokalizacja na FIDŻI, gdzie można znaleźć makro Worm-align, po zainstalowaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Wybór folderu zawierającego wszystkie zdjęcia wykonane przy tych samych ustawieniach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Generacja 4 podfolderów w folderze wyjściowym na FIDŻI. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Rysowanie linii w poprzek szerokości robaka i ustawień kanału dla montażu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Podgląd obrazu z zastosowanymi ustawieniami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: Rysunek linii wzdłuż osi podłużnej interesujących robaków do włączenia do montażu i/lub kwantyfikacji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 7: Montaż wybranych robaków w folderze wyjściowym, w folderze "wyrównanym". Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 8: Usuwanie poprzednich obrazów z poprzedniej analizy w Cell Profiler. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 9: Importowanie metadanych do CellProfiler z folderu wyjściowego Worm-align poprzez wybranie podfolderu Settings.csv. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 10: Potok CellProfiler Worm_CP.cpproj wykorzystuje obrazy Lines_ do wyodrębniania wybranych robaków (A) i tworzy maski pojedynczych robaków będących przedmiotem zainteresowania (C). Rurociąg mierzy również intensywność tła (B). Perspektywa wszystkich parametrów mierzonych przez potok Worm_CP.ccproj, które są eksportowane w pliku csv (D). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 11: Wybór plików wyjściowych w "ExportToSpreadsheet w potoku Worm_CP.cpproj. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Worm-align to potok przetwarzania obrazu oparty na FIDŻI, który z łatwością generuje montaże wybranych przez użytkownika robaków, w których robaki są prostowane i wyrównywane, aby ułatwić wizualne porównanie, klasyfikację i reprezentację. Chociaż ta funkcja jest również oferowana przez niektóre istniejące narzędzia, w szczególności moduł WormToolbox w CellProfiler⁷, Worm-align wymaga stosunkowo niewielkiego wcześniejszego doświadczenia w analizie obrazu: użytkownicy muszą tylko śledzić te robaki, które chcieliby wybrać do montażu (i analizy). Chociaż śledzenie robaków na surowych danych obrazu jest łatwym procesem - szczególnie gdy dostępny jest komputer lub tablet z ekranem dotykowym - niezwykle ważne jest, aby linie były prawidłowo narysowane wzdłuż osi podłużnej robaków. Niekompletne linie, które podążają tylko za częścią robaka, spowodują częściowe robaki w montażu (tj. robaki pozbawione główek lub końców ogona) i częściowe maski segmentacji podczas analizy CellProfiler. Ponadto, jeśli linie dwóch pojedynczych ślimaków się przecinają, robaki nie zostaną prawidłowo przetworzone w montażu wyrównania robaka, a także w celu ilościowego określenia fluorescencji. W celu kontroli jakości w folderze danych zapisywany jest obraz nakładki z zaznaczonymi liniami na oryginalnym obrazie wraz z tabelą kontroli jakości. Na tej podstawie problematyczne linie, które doprowadzą do nieprawidłowej segmentacji robaków, można łatwo zidentyfikować i wykluczyć z montażu i/lub późniejszej analizy.

Chociaż bezpośredni wkład eksperymentatora w selekcję robaków może wydawać się nieco czasochłonny, przedstawia on wyraźną przewagę przepływu pracy nad innymi w eksperymentach, w których robaki z różnych stadiów rozwojowych są obecne na tym samym obrazie: Robaki można wybrać podczas "etapu śledzenia", poprzez nakreślenie tylko tych robaków, które są we właściwym stadium rozwoju. Alternatywnie, robaki mogą być filtrowane za pomocą danych wyjściowych z Worm_CP w oparciu o długość linii śledzenia lub obszar maski segmentacji, które są wiarygodnymi wskaźnikami długości/rozmiaru robaków. Prawdopodobnie algorytmy uczenia maszynowego mogą mieć trudności z rozpoznawaniem robaków na różnych etapach rozwoju, ponieważ ich rozmiar i wygląd na obrazach DIC jest tak różny.

Dane wyjściowe Worm-align mogą być wykorzystane do późniejszej kwantyfikacji intensywności fluorescencji u pojedynczych robaków, bezpośrednio na FIDŻI lub na innych platformach oprogramowania do analizy obrazu. Pokazaliśmy to, importując dane wyjściowe Worm-align do prostego potoku CellProfiler (Worm_CP), który umożliwia ilościowe określenie intensywności fluorescencji wielokanałowej w tych pojedynczych robakach, które zostały wybrane podczas uruchamiania potoku Worm-align. Wybraliśmy to podejście ze względu na elastyczność oprogramowania CellProfiler: łatwo jest włączyć do procesu dodatkowe moduły do analizy dodatkowych cech poszczególnych robaków (np. pomiar wielkości kropelek lipidów lub granulek stresu, jąder, mitochondriów). Ponadto maski pojedynczych robaków mogą potencjalnie zostać wykorzystane do wytrenowania nowego modelu dla WormToolbox⁷.

Główną zaletą tej metody jest to, że jest szybka i wymaga prostej konfiguracji montażu ślimaka. Ta metoda jest szybsza, ponieważ nie wymaga poświęcania czasu na naukę obsługi oprogramowania ani uruchamiania zestawów treningowych za pomocą algorytmu maszynowego⁷. Co więcej, ta metoda działa zarówno z żywymi, jak i stałymi robakami po prostu zamontowanymi na zwykłych podkładkach agarozowych. Nie ma potrzeby stosowania skomplikowanych komór mikroprzepływowych, opracowanych w innych metodach ^5,6.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza	MeLford Biolaboratories Ltd	MB1200
Probówka aspiratora	Sigma-Aldrich	A5177	do tworzenia mikropipety do ust (patrz krok protokołu)
Zlewka
BODIPY 493/593	Invitrogen	D3922	roztwór podstawowy przygotowany w DMSO w stężeniu 1mg/ml
Wirówka	MSE MISTRAL 1000
Kolba
Szkiełko nakrywkowe	VWR	631-0120
Filtr 0,2 &mikro; m dla strzykawki	Sartrius	16534-K	Filtr, do tworzenia mikropipety do ust (patrz krok protokołu)
Chlorowodorek lewamizolu	izopropanolu
ciekłym azocie			Instalacja ciekłego azotu
Końcówka o niskiej retencji 1000&mikro; L	Starlab	S1182-1830
Metanol	VWR chemikalia	20847.307
Szkiełka mikroskopowe, MENZEL GLASSER	Thermo Scientific	BS7011/2
Mikroskop Kuchenka mikrofalowa
			>
9cm NGM Płytki			w laboratorium w15
PBS			przygotowane w laboratorium
Białkowa tubka LoBind 2ml	Eppendorf	22431102
Triton	SIGMA	T9284-500ML
Nakrętki pierścieniowe	SIGMA-ALDRICH	Z611247-250EA	szklane rurki mikrokapilarne do tworzenia ust mikropipeta (patrz krok protokołu)
Rotator	Stuart Scientific
Silikonowa rurka półprzezroczysta	Dostawcy laboratoriów naukowych	TSR0600200P	ścianka 6,0 mm x 2,0 mm - do tworzenia mikropipety do ust (patrz krok protokołu)
Sterylizowana woda H2O			MilliQ autoklawizowana w laboratorium
10&mikro; L Końcówki	Starlab	S1120-3810
200 i mikro; L Końcówki	Starlab	S1120-8810
1000µ L Końcówki	Starlab	S1122-1830
15mL Probówka wirówkowa	CORNING	430791
Vecta Shield	VECTOR	94010	antifade medium montażowe (H-1000) bez DAPI