Artykuł metodologiczny

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61146

⸱

13 maja 2020

 ,  , 
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Streszczenie

Lipoproteiny z proteobakterii są modyfikowane potranslacyjnie przez kwasy tłuszczowe pochodzące z fosfolipidów błonowych przez działanie trzech integralnych enzymów błonowych, w wyniku czego powstają triacylowane białka. Pierwszy etap szlaku modyfikacji lipoprotein polega na przeniesieniu grupy diacyloglicerylowej z fosfatydyloglicerolu do prolipoproteiny, w wyniku czego powstaje prolipoproteina diacyloglicerolu. W drugim etapie peptyd sygnałowy prolipoproteiny jest rozszczepiany, tworząc apolipoproteinę, która z kolei jest modyfikowana przez trzeci kwas tłuszczowy pochodzący z fosfolipidu. Ten ostatni etap jest katalizowany przez N-acylotransferazę apolipoproteiny (Lnt). Szlak modyfikacji lipoprotein jest niezbędny w większości γ-proteobakterii, co czyni go potencjalnym celem dla rozwoju nowych środków przeciwbakteryjnych. Opisano tutaj czuły test na Lnt, który jest zgodny z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi małych cząsteczek hamujących. Enzym i substraty są cząsteczkami osadzonymi w błonie; W związku z tym opracowanie testu in vitro nie jest proste. Obejmuje to oczyszczanie aktywnego enzymu w obecności detergentu, dostępność alkinofosfolipidów i substratów peptydu diacyloglicerylu oraz warunki reakcji w mieszanych miceli. Ponadto, aby można było wykorzystać test aktywności w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym (HTS), preferowany jest bezpośredni odczyt produktu reakcji w stosunku do sprzężonych reakcji enzymatycznych. W tym fluorometrycznym teście enzymatycznym produkt peptydowy triacylowany alkiny jest przekształcany w fluorescencyjny proces reakcji chemicznej i wykrywany w formacie płytki wielodołkowej. Metoda ta ma zastosowanie do innych acylotransferaz, które wykorzystują substraty zawierające kwasy tłuszczowe, w tym fosfolipidy i acylo-CoA.

Wprowadzenie

Lipoproteiny bakteryjne charakteryzują się kowalencyjnie związanymi kwasami tłuszczowymi na ich końcach aminowych, przez które są zakotwiczone w błonach1,2. Dojrzała część białka jest bardzo zróżnicowana pod względem budowy i funkcji, co wyjaśnia rolę lipoprotein w różnych procesach biologicznych w otoczce komórki bakteryjnej.

Lipoproteiny są modyfikowane przez kwasy tłuszczowe pochodzące z fosfolipidów po wprowadzeniu do błony cytoplazmatycznej. Prolipoproteiny zawierają charakterystyczny motyw, lipobox, który zawiera niezmienną resztę cysteiny, która ulega acylacji i jest pierwszym aminokwasem w dojrzałym białku. Pierwszy etap tego szlaku jest katalizowany przez prolipoproteinę fosfatydyloglicerol::d transferazę iacyloglicerylu (Lgt), która przenosi grupę diacyloglicerynową z fosfatydyloglicerolu na prolipoproteinę za pośrednictwem wiązania tioeterowego między diacyloglicerolem a cysteiną. Peptydaza sygnałowa II (Lsp) rozszczepia peptyd sygnałowy od prolipoproteiny diacyloglicerylu, w wyniku czego powstaje apolipoproteina, która jest zakotwiczona w błonie poprzez ugrupowanie diacyloglicerolu. Trzeci i ostatni etap jest katalizowany przez N-acylotransferazę apolipoproteiny (Lnt), która dodaje kwas tłuszczowy z pozycji sn-1 fosfolipidu do apolipoproteiny, w wyniku czego powstaje triacylozacyjna dojrzała lipoproteina (Rysunek 1) 3. Reakcja Lnt to dwuetapowa reakcja pingpongowa, w której powstaje stabilny półprodukt tioestrowego enzymu acylowego. Produkt uboczny lizofosfolipidów jest uwalniany przed acylacją substratu apolipoproteiny w drugim etapie reakcji.

Specyficzność substratu fosfolipidowego jest określana w teście Lnt na podstawie przesunięcia ruchliwości peptydu N-acyl-diacyloglicerylu na wysokim procencie mocznika tris-tricine SDS-PAGE4. Preferowanymi substratami były fosfolipidy z małymi polarnymi grupami głowy, nasycone [sn-1] i nienasycone [sn-2], 4. Test przesunięcia żelu nie jest odpowiedni do rozległych badań kinetycznych N-acylotransferazy apolipoproteiny ani do HTS do identyfikacji cząsteczek hamujących. Click-chemistry z wykorzystaniem alkinowych kwasów tłuszczowych została z powodzeniem wykorzystana do badania modyfikacji lipoprotein u bakterii5 oraz metabolizmu kwasów tłuszczowych u eukariontów6. Niedawno doniesiono, że test in vitro palmitoilacji Ras ma na celu zidentyfikowanie inhibitorów7.

W opisanej tutaj metodzie, oczyszczony aktywny Lnt w detergentach jest inkubowany z substratami w mieszanych micelach, tworząc peptyd triacylowany alkinem, który jest następnie wykrywany przez spektrometrię fluorescencyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie enzymów i substratów

  1. Oczyszczanie enzymu
    1. Wyprodukuj i oczyść enzym Lnt z membran rozpuszczonych w detergentach, jak opisano wcześniej4,8. Krótko mówiąc, indukuj ekspresję genu lnt-strep, kodując Lnt z C-końcowym znacznikiem paciorkowca, przy OD600 0,6 za pomocą bezwodnej tetracykliny (200 ng / ml) w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
    2. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
    3. Zawiesić osad komórkowy w buforze WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) do 100 OD600 jednostek na ml.
    4. Rozbij komórki dwoma przejściami przez francuską prasę ciśnieniową pod ciśnieniem 10 000 psi.
    5. Usunąć nieuszkodzone komórki i zanieczyszczenia przez odwirowanie przy 13 000 x g przez 20 min. Zachować supernatant i wyrzucić osad.
    6. Odwirować supernatant o stężeniu 120 000 x g przez 60 minut i zebrać pęcherzyki błonowe (półprzezroczyste brązowe osadki). Odrzucić supernatant.
    7. Rozpuścić integralne białka błonowe z osadu błonowego z 1% (w/v) n-dodecylu β-D-maltozydu (DDM) w buforze WA przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odwirować i usunąć nierozpuszczalny materiał w ilości 120 000 x g przez 30 minut. Do oczyszczania należy użyć frakcji supernatantu.
    8. Oczyść Lnt-strep na kolumnie chromatograficznej o powinowactwie (patrz Tabela materiałów) i kolumnie do filtracji żelu S400 (patrz Tabela materiałów) zgodnie z opisem Nozeret et al.8.
    9. Oczyszczony enzym należy przechowywać w buforze WA zawierającym 0,05% DDM i 10% glicerolu w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Enzym jest stabilny przez ponad 5 lat.
  2. Otrzymywanie alkinofosfolipidów i biotynylowanych substratów ligandów stymulujących fibroblasty (FSL-1-biotyna)
    1. Podwielokrotność 100 μl specjalnie syntetyzowanego alkinu-POPE (1-heksadek-15-ynoylo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy, patrz tabela materiałów) rozpuszczonego w chloroformie do probówek o pojemności 1,5 ml.
    2. Przekłuć probówki strzykawką i odparować chloroform w temperaturze obrotowej w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Przechowywać suche próbki fosfolipidów w temperaturze -20 °C.
    3. Przed użyciem rozpuścić alkino-POPE w 0,1% Triton X-100 w temperaturze 500 μM. Dodaj 3-minutowy etap sonikacji w ultradźwiękowej łaźni wodnej w temperaturze pokojowej, aby w razie potrzeby rozpuścić alkino-POPE.
    4. Zawiesić FSL-1-biotynę w wodzie o stężeniu 445 μM.
      UWAGA: Oba roztwory można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 miesiące.

2. Test probówkowy

UWAGA: W dniu 1 ustaw reakcję Lnt w probówkach o pojemności 1,5 ml (krok 2.1) i pokryj 96-dołkowe płytki streptawidyną (krok 2.2).

  1. Przygotowanie mieszaniny odczynników i reakcja enzymatyczna
    1. W przypadku standardowego testu Lnt należy zmieszać alkino-POPE (końcowe 50 μM z 500 μM zapasu) i FSL-1-biotynę (końcowe stężenie 50 μM z 445 μM zapasu) w buforze reakcyjnym Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 zawierający 1% BSA) w końcowej objętości 18 μL w probówkach 1,5 ml. Wykonaj wszystkie warunki w trzech egzemplarzach.
    2. Sonikować mieszaninę substratów (przygotowaną w kroku 2.1.1) przez 3 minuty w ultradźwiękowej łaźni wodnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut przed dodaniem enzymu Lnt (etap 2.1.3).
      UWAGA: MTSES ((2-sulfoniatoetylo)metanetiosiulfonian sodu), odczynnik specyficzny dla tiolu, hamuje Lnt8. Dodać 10 mM MTSES (100 mM roztwór podstawowy w 100% DMSO) do probówek reakcyjnych (krok 2.1.1), które mają być użyte jako ujemne próbki kontrolne. Dostosuj objętość buforu reakcyjnego Lnt tak, aby całkowita objętość wynosiła 18 μl.
    3. Dodać aktywny (1 ng/μl, co odpowiada 17,2 nM) lub nieaktywny Lnt (C387S) (2 μl z 10 ng/μL zapasu w buforze WA zawierającym 0,05% DDM) i wymieszać z substratami (krok 2.1.2), pipetując w górę i w dół.
    4. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 16 godzin w termomikserze z podgrzewaną pokrywą.
  2. Powłoka streptawidyny na 96-dołkowych płytkach
    1. Przygotować roztwór podstawowy streptawidyny w stężeniu 2 mg/ml w H2O.
      UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy.
    2. Z roztworu podstawowego przygotować 10 μg/ml streptawidyny w wodzie jako roztwór roboczy. Dodać 100 μl roztworu do każdego dołka na płytce 96-dołkowej. Związać streptawidynę z płytką przez inkubację w temperaturze 37 °C przez noc bez pokrywki, aby wysuszyć studzienki na powietrzu.

UWAGA: W dniu 2 wykonaj chemię kliknięć (krok 2.3), zwiąż mieszaninę reakcyjną Lnt z płytkami pokrytymi streptawidyną (krok 2.4), a następnie wykryj fluorescencję i przeanalizuj wyniki (krok 2.5).

  1. Reakcja chemiczna kliknięcia
    1. Przygotować roztwory podstawowe Azido-FAM (5 mM w DMSO), TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny; 50 mM przygotowany w wodzie), TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metylo]amina; 2 mM w tert-butanolu:DMSO (4:1)) i CuSO4∙5H2O (50 mM świeżo przygotowany w H2O).
    2. W probówkach o pojemności 1,5 ml zawierających mieszaninę reakcyjną Lnt przygotowaną w kroku 2.1.4 należy przeprowadzić chemię typu click, dodając odczynniki w następującej kolejności: 0,2 μl podstawowego Azido-FAM (stężenie końcowe 50 μM), 0,4 μl podstawowego TCEP (stężenie końcowe 1 mM), 0,2 μl podstawowego TBTA (stężenie końcowe 0,02 mM).
    3. Wiruj roztwór przez 5 sekund. Następnie dodać 0,4 μl bulionu CuSO4 (stężenie końcowe 1 mM). Wiruj ponownie przez 5 s. Próbki należy inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  2. Wiązanie mieszaniny reakcyjnej Lnt z płytkami pokrytymi streptawidyną
    1. Po całonocnej inkubacji z etapu 2.2.2 przemyć studzienki płytek pokrytych streptawidyną 3x 200 μl PBS-T1 (PBS zawierający 0,05% Tween-20).
      UWAGA: Płytki ze streptawidyną można zużyć natychmiast lub przechowywać w suchym miejscu w temperaturze 4 °C.
    2. Przenieść 18 μl z mieszaniny chemicznej z etapu 2.3.3 do studzienki na 96-dołkowej płytce pokrytej streptawidyną i dodać 100 μl PBS-T1 w celu związania produktu N-acyl-FSL-1-biotyny-FAM z płytkami streptawidyny.
    3. Użyj biotyny-fluoresceiny (0,26 μM z 3,1 mM zapasu w DMSO) jako kontroli pozytywnej dla wiązania streptawidyny i odczytu fluorescencji.
    4. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności w termomikserze, wstrząsając z prędkością 300 obr./min.
    5. Wykonać ręczne płukanie 96-dołkowych płytek za pomocą wielokanałowej pipety elektronicznej w następujący sposób: sześć płukań 200 μL PBS-T2 (PBS zawierający 1% Tween-20), trzy płukania pipetą, trzy płukania 200 μL PBS, trzy płukania pipetą.
  3. Detekcja i analiza fluorescencji
    1. Dodać 200 μl PBS i zarejestrować fluorescencję przy długości fali 520 nm w czytniku mikropłytek fluorescencyjnych. Zapisz wyniki w oprogramowaniu do arkuszy kalkulacyjnych.
      UWAGA: Biotyna-fluoresceina jest stosowana jako kontrola pozytywna do wiązania streptawidyny i wykrywania fluorescencji przy 520 nm. Oczekuje się powtarzalnego odczytu 30 000–40 000 j.a. z 0,26 μM biotyny-fluoresceiny. Wszystkie próbki są analizowane w trzech egzemplarzach, łącznie z próbkami kontrolnymi.
    2. Obliczyć odchylenie standardowe dla każdej reakcji i obliczyć wartości P dla kontroli ujemnych i próbek dodatnich przy użyciu niesparowanego testu t przy użyciu oprogramowania statystycznego.

3. Test płytkowy wielodołkowy

UWAGA: W dniu 1 ustaw reakcję Lnt na płytkach 384 dołkowych (krok 3.1) i pokryj płytki 384 dołków streptawidyną (krok 3.2).

  1. Przygotowanie mieszaniny odczynników i reakcja enzymatyczna
    UWAGA: Ilość odczynników i enzymu jest zmniejszona w porównaniu z testem probówkowym, a reakcja Lnt jest przeprowadzana bezpośrednio w płytkach 384-dołkowych. Pozwala to na użycie mniejszej ilości materiału i zmniejszenie liczby kroków, które można jeszcze bardziej zautomatyzować.
    1. Wymieszać substraty w następujący sposób: alkine-POPE (końcowe stężenie 50 μM z 500 μM zapasu) i FSL-1-biotyna (końcowe 50 μM z 500 μM zapasu) w buforze reakcyjnym Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 zawierający 1% BSA) w objętości 13,5 μl na reakcję na dołek w formacie płytki 384-dołkowej. Wykonaj wszystkie warunki w trzech egzemplarzach. Obliczyć całkowitą ilość odczynników wymaganych do przeprowadzenia liczby reakcji (tj. 5,184 μl na jedną płytkę 384-dołkową).
    2. Sonikować mieszaninę substratów przez 3 minuty w ultradźwiękowej łaźni wodnej.
    3. Podwielokrotność 13,5 μl mieszaniny substratów na studzienkę w płytce 384-dołkowej.
      UWAGA: Jako kontrolę ujemną można dodać 10 mM MTSES (625 mM roztworu podstawowego w 100% DMSO) do studzienki. Dostosuj objętość buforu Lnt (krok 3.1.1), aby osiągnąć końcową objętość reakcji 13,5 μl.
    4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut przed dodaniem enzymu Lnt (etap 3.1.5).
    5. Dodać 0,5 ng/μL (co odpowiada 8,6 nM) aktywnego enzymu Lnt lub nieaktywnego wariantu (C387S) (1,5 μl z 5 ng/μL zapasu w buforze WA zawierającym 0,05% DDM) do buforu reakcyjnego Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) do każdej studzienki zawierającej mieszaninę reakcyjną z kroku 3.1.3. Mieszać odczynniki, pipetując w górę i w dół. Całkowita objętość reakcji wynosi 15 μl.
    6. Uszczelnij płytkę folią z tworzywa sztucznego w przypadku płytek wielodołkowych.
    7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin w termomikserze z podgrzewaną pokrywą.
  2. Streptawidyna powlekająca płytki 384-dołkowe
    1. Użyj 75 μl streptawidyny (10 μg/ml w H2O) z kroku 2.2.2 do pokrycia studzienek płytki 384-dołkowej. Pozostawić streptawidynę do związania się z płytką przez inkubację w temperaturze 37 °C przez noc bez pokrywki, aby wysuszyć studzienki na powietrzu.

UWAGA: W dniu 2 wykonaj chemię kliknięć (krok 3.3), zwiąż mieszaninę reakcyjną Lnt z płytkami pokrytymi streptawidyną (krok 3.4), wykryj fluorescencję i przeanalizuj wyniki (krok 3.5).

  1. Reakcja chemiczna kliknięcia
    1. Przygotować roztwory podstawowe Azido-FAM (1,2 mM w DMSO), TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny; 24 mM przygotowany wH2O), TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]amina; 0,48 mM w tert-butanolu:DMSO (4:1)) i CuSO4∙5H2O(24 mM świeżo przygotowany wH2O).
    2. Połącz trzy odczynniki do chemii metodą click: mieszaninę Azido-FAM (stężenie końcowe 50 μM), TCEP (1 mM wersja końcowa) i TBTA (0,02 mM wersja końcowa), każdy w ilości 0,75 μl w końcowej objętości 2,25 μl na studzienkę. Obliczyć wymaganą objętość na płytkę 384-dołkową (tj. użyć 864 μl, gdy używane są wszystkie studzienki płytki 384-dołkowej). Mieszaj energicznie.
    3. Dodać 2,25 μl roztworu odczynnika na basenik bezpośrednio do zakończonej reakcji Lnt na płytce 384-dołkowej z kroku 3.1.7.
    4. Mieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą wielokanałowej pipety elektronicznej.
    5. Dodać CuSO4 (0,75 μl z 24 mM zapasu, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM) i mieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą wielokanałowej pipety elektronicznej.
    6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności.
  2. Wiązanie mieszaniny reakcyjnej Lnt z płytkami 384-dołkowymi pokrytymi streptawidyną
    1. Po całonocnej inkubacji przemyć dołki płytek pokrytych streptawidyną z kroku 3.2.1 1x 85 μl PBS-T1.
    2. Przenieść 11 μl reakcji chemicznej typu click-chemistry z każdego dołka płytki inkubacyjnej z etapu 3.3.6 na płytkę pokrytą streptawidyną z etapu 3.4.1 w celu związania produktu N-acylo-FSL-1-biotyny-FAM z płytkami streptawidyny.
    3. Dodać 64 μl buforu PBS-T1.
    4. Włączyć biotynę-fluoresceinę (0,19 μM z 3,1 mM zapasów w DMSO) jako kontrolę wiązania ze studzienkami pokrytymi streptawidyną.
    5. Inkubować 384 płytki dołkowe w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności w termomikserze, wstrząsając z prędkością 300 obr./min.
    6. Umyj płytki za pomocą automatycznej myjki do płyt w następujący sposób: 10 prań z 85 μl PBS-T2, płytki są wstrząsane między praniami; 5 prań z 85 μl PBS, płytki są wstrząsane między praniami.
  3. Detekcja i analiza fluorescencji
    1. Dodać PBS (85 μl) i zarejestrować fluorescencję w czytniku mikropłytek fluorescencyjnych przy długości fali 535 nm.
    2. Przeanalizuj dane zgodnie z opisem (krok 2.5.2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W reakcji Lnt kwas tłuszczowy z pozycji sn-1 fosfolipidów jest przenoszony na peptyd diacyloglicerylowy, w wyniku czego powstaje dojrzały peptyd triacylowany8. Opisany tutaj test Lnt in vitro został zaprojektowany tak, aby wykorzystać jako substraty fosfolipidy zawierające kwas tłuszczowy z grupą alkadową (alkyne-POPE) oraz FSL-1-biotin, co prowadzi do powstania alkyne-FSL-1-biotin. W wyniku reakcji chemii klikowej z azido-FAM produkt ten powinien zostać znakowany fluorescencyjnie i wykry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół testu Lnt, oparty na wykrywaniu fluorescencji produktu triacylowanego, jest czuły i powtarzalny. Specyficzne i skuteczne wiązanie biotyny ze streptawidyną jest kluczowym elementem testu. Substrat Alkine-POPE pozostały po zakończeniu reakcji Lnt jest również znakowany fluorescencyjnie FAM, ale jest skutecznie usuwany po związaniu z płytkami streptawidyny przez wiele etapów mycia. Ponadto dodanie DMSO nie wpływa na aktywność Lnt i nie ma wpływu na test. Zarówno substrat, jak i enzym są wysoce lipofil...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Fabrice'owi Agou i Alix Boucharlat z Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) w Instytucie Pasteura w Paryżu za pomocne sugestie dotyczące protokołu, wszystkim członkom BGPB Unit za wsparcie i dyskusje naukowe, oraz Simonowi Legoodowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace zostały sfinansowane przez Globalne Inicjatywy Opiekuńcze Instytutu Chorób Zakaźnych Carnota oraz Instytutu Carnot, Mikrobów i Zdrowia (15 CARN 0017-01 i 16 CARN 0023-01).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ä kta Purifier System FPLCGE HealthcareNACzystość: NA
Lnt oczyszczanie
alkinowo-POPEAvanti Polar Lipids900414PCzystość: >99%
Lnt Podłoże
Azido-FAMLumiprobeA4130Czystość: 100% (czysta)
Odczynnik Click
BioPhotometer PlusEppendorfN/ACzystość: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Wybierz podkładkę do płytBioTekN° seria 115800, n° materiel 405 SelectCzystość: NA
Etapy mycia
biotyna-fluoresceinaSigma53608Czystość: ≥ 90%
Kontrola fluorescencji
Siarczan miedzi(II) pentahydratSigmaC3036Czystość: ≥ 98%
Odczynnik Click
DDMAnatraceD310ACzystość: ≥ 99% β+α; < 15% α
Detergent do oczyszczania Lnt
Dimetylosulfotlenek (DMSO)InvitrogenD12435Czystość: bezwodny
Odczynnik do solbilizacji Kliknij
Pipeta elektroniczna Voyager 8 kanałów 0,5-12,5 uLINTEGRA4721Czystość: NA
Postępowanie z odczynnikami
Francuska komórka ciśnieniowaN/A N/ACzystość: NA
Rozbijanie komórek
FSL-1-biotynaMikrokolekcje EMCL7030Czystość: NA
Podłoże Lnt
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR mikropłytka polistyrenowaGreiner781091Czystość: NA
z przezroczystym dnem (odczyt górny lub dolny)
Greiner Bio-One 96-dołkowa sterylna płytka polistyrenowa, wysoka wiązanieGreiner655097Czystość: NA
z przezroczystym dnem (odczyt górny lub dolny)
Czytnik mikropłytek Infinite M1000 proTecanN/ACzystość: NA
Detekcja fluorescencji
MTSES (2-sulfonianoetylo)metanoethiosulfonian sodu)AnatraceS110MTCzystość: ~100%
Inhibitor specyficzny dla tiolu
Optycznie przezroczyste arkusze uszczelniające z klejuThermo ScientificAB-1170Czystość: NA
Folia do uszczelniania płytki wielodołkowej
Sephacryl S400 HR 16/60 żel kolumna filtracyjnaGE HealthcareGE28-9356-04Czystość: NA
Oczyszczanie Lnt
StrepTactin Sepharose 50IBA Biotechnology2-1201-010Czystość: NA
Lnt oczyszczanie
streptawidynaSigmaS4762-1MGCzystość: ≥ 13 jednostek/mg białko
Wiązanie biotyny
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]aminaSigma678937Czystość: 97%
Odczynnik Click
TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfinySigma75259Czystość: ≥ 98%
Odczynnik Click
TECAN Infinite F500TecanN/ACzystość: NA
Detekcja fluorescencji
TECAN Infinite M1000 proTecanN/ACzystość: NA
Detekcja fluorescencji
Thermomixer CEppendorf5382000015Czystość: NA
Podgrzewana pokrywa
Triton X-100Sigma93443Czystość: 10% w H2O
Bufor reakcyjny Lnt
Ultra wirówkaBeckman LCN/ACzystość: NA
Frakcjonowanie komórek
%

Bibliografia

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147(2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978(2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198(2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952(2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza z wykorzystaniem chemii klikfluorometryczny test enzymatycznysubstraty alkiniowo fosfolipidowep ytki pokryte streptawidyndetekcja azydow FAMformat wielodo kowyoczyszczanie bia ek b onowychczynnik Z prime

Powiązane artykuły