Method Article

Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)

DOI:

10.3791/61147

⸱

May 8th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Science and Technology Austria

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół do śledzenia linii i funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki za pomocą analizy mozaikowej z podwójnymi markerami (MADM). Analiza klonalna MADM zapewnia ilościowe ramy do pomiaru zachowania proliferacyjnego, produkcji komórkowej i pokrewieństwa liniowego poszczególnych komórek progenitorowych i ich komórek potomnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaczynając od ograniczonej puli przodków, kora mózgowa ssaków tworzy wysoce zorganizowane funkcjonalne obwody neuronowe. Jednak podstawowe mechanizmy komórkowe i molekularne regulujące przejścia między liniami nerwowych komórek macierzystych (NSC) oraz ostateczną produkcję neuronów i komórek glejowych w rozwijającym się nabłonku nerwowym pozostają niejasne. Metody śledzenia wzorców podziału NSC i mapowania linii komórek spokrewnionych klonalnie znacznie się rozwinęły. Jednak wiele współczesnych technik śledzenia linii genetycznych cierpi z powodu braku komórkowej rozdzielczości losu komórek potomnych, co jest niezbędne do rozszyfrowania wzorców podziału komórek progenitorowych. Przedstawiono protokół wykorzystujący analizę mozaikową z podwójnymi markerami (MADM) do przeprowadzenia analizy klonalnej in vivo. MADM jednocześnie manipuluje pojedynczymi komórkami progenitorowymi i wizualizuje precyzyjne wzorce podziału i progresję linii w niespotykanej dotąd rozdzielczości pojedynczej komórki. Zdarzenia rekombinacji międzychromosomowej oparte na MADM podczas fazy G2-X mitozy, wraz z czasowo indukowanym CreERT2, dostarczają dokładnych informacji na temat dat urodzenia klonów i ich wzorców podziału. W ten sposób śledzenie linii MADM zapewnia bezprecedensowe jakościowe i ilościowe odczyty optyczne sposobu proliferacji komórek progenitorowych komórek macierzystych na poziomie pojedynczej komórki. MADM pozwala również na badanie mechanizmów i wymagań funkcjonalnych genów kandydujących w progresji linii NSC. Wyjątkowość tej metody polega na tym, że analizę porównawczą subklonów kontrolnych i zmutowanych można przeprowadzić w tym samym środowisku tkankowym in vivo. W tym miejscu szczegółowo opisano protokół i zademonstrowano eksperymentalne paradygmaty wykorzystania MADM do analizy klonalnej i śledzenia linii w rozwijającej się korze mózgowej. Co ważne, protokół ten można dostosować do przeprowadzania analizy klonalnej MADM w dowolnej niszy mysich komórek macierzystych, o ile obecny jest sterownik CreERT2.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kora mózgowa to wysoce zorganizowana struktura złożona z sześciu odrębnych warstw. Kora zawiera różnorodny wachlarz typów komórek, w tym neurony i komórki glejowe, które oddziałują na siebie, tworząc funkcjonalne obwody neuronowe. Większość, jeśli nie wszystkie, korowe neurony projekcyjne i glej pochodzą ze wspólnej puli nerwowych komórek macierzystych (NSC) znanych jako promieniste komórki progenitorowe gleju (RGPs)1,2,3. Same RGP pochodzą z neuroepitelialnych komórek macierzystych (NESC) tworzących wczesny embrionalny nabłonek nerwowy. Do 9 dnia embrionalnego (E9) u myszy, NESC zaczynają przechodzić w RGPs4. Progresja linii RGP wymaga precyzyjnej regulacji czasowej i przestrzennej, a gdy proces ten jest utrudniony, mogą wystąpić poważne zaburzenia neurologiczne, takie jak megalencefalia, małogłowie, lizencefalia lub upośledzenia, takie jak schizofrenia i autyzm5,6. W E10 większość RGP ulega symetrycznym podziałom proliferacyjnym, co skutkuje rozszerzeniem puli neuronalnych progenitorów4,7. RGP w końcu zaczynają dzielić się asymetrycznie, wytwarzając neurony projekcyjne kory mózgowej w określony czasowo sposób. Poprzez kolejne fale neurogenezy nowonarodzone neurony migrują do płytki korowej, tworząc blaszki korowe, przy czym wcześnie urodzone neurony zajmują głębokie warstwy, a późno urodzone neurony znajdują się w warstwach powierzchownych8,9,10. Ponieważ klonalnie spokrewnione neurony piramidowe migrują promieniście do kory z bardzo małą dyspersją styczną, komórki potomne mają tendencję do tworzenia struktury w kształcie kolumny lub stożka, określanej jako neuronalna jednostka promieniowa4,11,12,13. Przez E17 embrionalna ekspansja neurogenna jest zakończona u myszy14. RGP mogą również wytwarzać komórki wyściółki i niektóre klasy gleju, w tym astrocyty i oligodendrocyty1,15,16,17,18,19. Potencjał RGP do powstawania zarówno neuronów, jak i astrocytów wydaje się być spójny we wszystkich regionach kory mózgowej18, przy czym około 1/6 neurogennych RGP wytwarza również glej11.

Obecnie, czynniki genetyczne i epigenetyczne regulujące postęp czasowy komórki macierzystej wzdłuż jej linii są w większości nieznane. Czasowe wzorce ekspresji genów mogą mieć znaczący wpływ na decyzje dotyczące linii w RGPs20,21,22,23,24. Nie wiadomo, w jaki sposób ten ściśle powiązany związek między wzorcami czasowymi i przestrzennymi prowadzi do różnorodności molekularnej typów neuronów dorosłych w obszarach kory mózgowej. Podobnie, w jaki sposób potencjał poszczególnych komórek macierzystych i ich produkcja komórkowa są modulowane na poziomie komórkowym i molekularnym, jest ważnym pytaniem bez odpowiedzi. Miejmy nadzieję, że przyszłe badania odpowiedzą na niektóre z tych pytań, ostatecznie poszerzając naszą wiedzę na temat tworzenia funkcjonalnych obwodów korowych.

Neurobiologia rozwojowa stara się zrozumieć relacje między komórkami w mózgu. Początkowo dostępnych było bardzo niewiele narzędzi badawczych w tym zakresie, a wiele wczesnych badań opierało się na wizualnych obserwacjach wzorców podziałów w przezroczystych organizmach, takich jak Caenorhabditis elegans25. W ostatnich dziesięcioleciach nastąpił dramatyczny wzrost liczby i wyrafinowania dostępnych technik13,26,27,28,29. Pojawienie się systemu edycji genomu CRISPR-Cas9 pozwala na syntetyczną rekonstrukcję powiązań między liniami komórkowymi poprzez wprowadzenie ewoluujących kodów kreskowych DNA27,30. Dwa ostatnie przykłady strategii kodowania kreskowego obejmują użycie przewodnika naprowadzającego RNA, który kieruje CRISPR-Cas9 do określonych loci kodu kreskowego DNA lub deaminazy cytydyny połączonej z nickazą Cas9 w celu celowania w endogenne przeplatane regiony powtórzeń31,32. Technologie te zapewniają wysoce zmultipleksowane podejścia poprzez wprowadzenie kodów kreskowych, które stopniowo i stabilnie gromadzą unikalne mutacje w czasie. Metody edycji genomu są bardzo cenne, ponieważ umożliwiają retroaktywną analizę relacji między dowolnymi dwiema komórkami w oparciu o wspólne dziedziczenie tych kodów kreskowych. Jednak, aby odczytać kody kreskowe w poszczególnych komórkach, tkanka zwykle musi zostać rozerwana, a zatem informacje dotyczące położenia, morfologii i bezwzględnej liczby komórek od pojedynczego przodka są tracone.

Kombinatoryczne paradygmaty etykietowania zachowują informacje przestrzenne i w zasadzie pozwalają również na rozróżnienie między blisko zlokalizowanymi lub nawet nakładającymi się klonami33,34. Aby metoda śledzenia linii była pouczająca, musi oznaczać poszczególnych przodków i ich potomstwo w rzadki i nieusuwalny sposób. Warto zauważyć, że podejścia Brainbow35 i Confetti36,37 wykorzystują stochastyczne, wielokolorowe reportery oparte na rekombinazie Cre, które wyrażają kombinację białek fluorescencyjnych z pojedynczego locus. Ogromna liczba jednoczesnych kombinacji kolorów, które można uzyskać in vivo, sprawia, że jest to potężne narzędzie do śledzenia korowych klonów RGP i astrocytów34. Opracowano również systemy oparte na transpozonach, zapewniające stabilną integrację genomową transgenów, kodujące reportery fluorescencyjne i umożliwiające śledzenie linii przodków kory mózgowej33,38,39,40,41. Systemy oparte na transpozonach mają dodatkową zaletę polegającą na tym, że konstrukty reporterowe stabilnie integrują się z genomem, a tym samym niezawodnie znakują komórki potomne spokrewnione liniowo. Aby prześledzić konkretne linie astrocytów, opracowano szereg metod, które obejmują elektroporację transpozaz piggyBac, w tym Star Track, która wykorzystuje kombinację konstruktów kodujących różne białka fluorescencyjne40,42. Inne podejście, markery MAGIC, wprowadza wektory Brainbow jako transgeny transponowalne. Zostało to z powodzeniem wykorzystane do śledzenia embrionalnych progenitorów neuronalnych i astrocytów34,43. Niedawno odkryto, że analiza mozaiki za pomocą podwójnej wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy (MADR) stabilnie oznacza zmutowane komórki wyrażające elementy transgeniczne z precyzyjnie zdefiniowanych loci chromosomowych44. Te potężne techniki znakowania kombinatorycznego in vivo dostarczyły wielu informacji na temat dynamiki linii komórek progenitorowych. Jednak analizy te są wykonywane na utrwalonej tkance, zapewniając migawkę poszczególnych klonów na określonym etapie rozwoju. Aby zaobserwować zmiany w dynamice linii pojedynczych klonów w czasie, należy zastosować metody przewlekłego obrazowania in vivo podobne do tych wykonywanych w zakręcie zębatym dorosłego osobnika45.

Analiza mozaiki z podwójnymi markerami (MADM) to potężna metoda dwukolorowego znakowania, która umożliwia śledzenie in vivo linii poszczególnych komórek progenitorowych u myszy46,47. Dwa składniki są niezbędne do zaistnienia zdarzeń znakowania MADM: Po pierwsze, kasety MADM muszą być ukierunkowane na identyczne loci na chromosomach homologicznych. Kasety składają się z dwóch chimerycznych fluorescencyjnych genów reporterowych, eGFP (zielony, [G]) i tandemowy dimer pomidora (czerwony, tdT[T]). Kaseta GT zawiera N-koniec eGFP i C-koniec tdT, oddzielone intronem zawierającym miejsce loxP. Kaseta TG jest skonstruowana odwrotnie, z N-końcem tdT i C-końcem eGFP. Po drugie, niezbędna jest ekspresja rekombinazy Cre w tej samej komórce, w której znajdują się docelowe kasety MADM. Pod nieobecność Cre kasety chimeryczne nie wyrażają funkcjonalnego eGFP lub tdT, ponieważ ich sekwencje kodujące są zakłócone. Miejsca loxP służą jako cel rekombinacji międzychromosomowej za pośrednictwem Cre, w wyniku której obie kasety ekspresyjne są odtwarzane jednocześnie. Jeśli rekombinacja nastąpi podczas fazy G2 cyklu komórkowego, po której następuje segregacja X (G2-X), każda z dwóch komórek potomnych będzie wyrażać jedno z dwóch białek fluorescencyjnych. Czasowa regulacja aktywności CreERT2 za pomocą tamoksyfenu (TM) dostarcza precyzyjnych informacji na temat daty urodzenia klonów MADM i wzorców podziału ich potomstwa (Figura 1A)29,46,47.

MADM może potencjalnie systematycznie oznaczać pojedyncze klony o wysokiej rozdzielczości pojedynczej komórki w mózgu myszy, podobnie jak tradycyjne, ale niespecyficzne i pracochłonne metody, takie jak barwienie metodą Golgiego48 lub wypełnianie barwnikiem49. Ponieważ tylko promotor napędzający CreERT2 określa specyficzność typu komórki klonalnego znakowania MADM, MADM może być w zasadzie stosowany do śledzenia linii klonalnej w dowolnym narządzie i tkance myszy47,50,51,52. Rzeczywiście, w badaniach wykorzystano już MADM do ujawnienia powiązań linii w klonach pochodzących z różnych tkanek47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. Eksperymentalne paradygmaty MADM zostały zastosowane do badania linii w neuronach projekcyjnych kory mózgowej, gleju i pourodzeniowych komórkach macierzystych w rozwijającej się korze nowej7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM został również wykorzystany do badania linii komórkowej w dorosłym zakręcie zębatym, wzgórzu, komórkach ziarnistych móżdżku i interneuronach na poziomie klonalnym (zobacz Tabelę 1, aby uzyskać pełną listę)47,53,54,56,57,66.

Unikalną cechą MADM jest możliwość genetycznego powiązania mutacji dystalnych z jedną kasetą MADM, tworząc w ten sposób mozaikę genetyczną (Rysunek 1B i Rysunek 2). Powoduje to powstanie komórek potomnych typu dzikiego znakowanych jednym markerem fluorescencyjnym (tdT na rysunku 1B) i homozygotycznego zmutowanego rodzeństwa drugim (eGFP na rysunku 1B) w nieznakowanym heterozygotycznym środowisku. Wyjątkowość MADM polega na tym, że analiza porównawcza subklonów kontrolnych i zmutowanych może być przeprowadzana w tym samym środowisku tkankowym in vivo. Pierwotnie, kasety MADM były ukierunkowane na locus47, ale analiza funkcji genów MADM była ograniczona do genów dystalnych do locus. Aby przezwyciężyć (przynajmniej częściowo) to ograniczenie i rozszerzyć możliwości analiz genów opartych na MADM, kasety MADM zostały wbite w pobliże centromerów Chr. 751, Chr. 1146 i Chr. 1251. Celowanie we wszystkie 19 mysich autosomów za pomocą kaset MADM jest w toku i pozwoli na badanie praktycznie każdego genu w przyszłości, zapewniając niezrównaną platformę do badania powiązań między liniami rozwojowymi w połączeniu z funkcjonalną analizą genetyczną.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły myszy zostały sprawdzone przez instytucjonalny ośrodek przedkliniczny (PCF) i wewnętrzną komisję etyczną w IST Austria. Wszystkie hodowle i eksperymenty były prowadzone na podstawie licencji zatwierdzonej przez austriackie Federalne Ministerstwo Nauki i Badań Naukowych zgodnie z austriackim i unijnym prawem dotyczącym zwierząt.

1. Hodowla myszy doświadczalnych do analizy klonalnej MADM

  1. Ustawianie czasowych eksperymentalnych wiązań MADM (>P56; CD-1) późnym popołudniem (17:00) i sprawdź, czy nie ma zatyczek dopochwowych następnego ranka (8:00). Poranek, w którym wtyczka jest obecna, liczy się jako dzień 0,5. Zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z eksperymentalnym układem kojarzenia myszy. Upewnij się, że punkty czasowe dla indukcji i analizy aktywności CreERT2 metodą TM są odpowiednie do odpowiedzi na pytania eksperymentalne.
    UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z Rysunek 3 i reprezentatywne wyniki poniżej.
  2. W przypadku pobierania próbek po porodzie skonfiguruj hodowle, aby równolegle generować matki zastępcze.
    UWAGA: Należy je rozpocząć do 1-2 dni przed założeniem hodowli doświadczalnych.

2. Indukcja TM u myszy MADM

  1. Przygotuj roztwór roboczy TM o stężeniu 20 mg/ml, rozpuszczając go w oleju kukurydzianym w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml lub 50 ml i umieszczając na platformie bujanej na ~ 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT), upewniając się, że TM jest całkowicie rozpuszczony. Roztwór roboczy przechowywać w temperaturze 4 °C przykryty folią aluminiową i zużyć w ciągu 2 tygodni.
  2. Aby wywołać rekombinację MADM, należy podać pojedyncze wstrzyknięcie TM dootrzewnowo (IP) za pomocą 1 ml strzykawki tuberkulinowej i igły 25 G do ciężarnej matki w czasie. W zależności od stadium neurogenezy korowej należy wstrzyknąć TM między E10-E15 w dawce 1-2 mg/ciężarną matkę. W przypadku wczesnych punktów czasowych (np. E10) należy stosować maksymalnie 1 mg/ciężarną matkę (25 mg/kg), aby zapobiec powikłaniom podczas ciąży11. Dla punktów czasowych między E11 a E15 użyj 2 mg/ciężarna matka (50 mg/kg)7.
    UWAGA: Alternatywnie, TM może być podawana przez zgłębnik doustny w przypadku późnych ciąż.
  3. W celu analizy klonalnej MADM do postnatalnych punktów czasowych, odzyskaj żywe zarodki w E18−E19 przez cesarskie cięcie, a następnie wychowuj młode z matką zastępczą.
    UWAGA: W zależności od stanu zdrowia ciężarnej samicy wykonanie cesarskiego cięcia może nie być konieczne, ale wychowywanie młodych z matką zastępczą jest nadal wymagane, ponieważ pierwotna matka leczona TM może mieć problemy z laktacją.
  4. Aby odzyskać żywe zarodki przez cesarskie cięcie lub pobrać embrionalne punkty czasowe do analizy, należy złożyć ciężarną matkę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
  5. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i zdezynfekuj sierść 70% etanolem. Wykonaj małe nacięcie w skórze w dolnej części brzucha nad macicą za pomocą kleszczy chirurgicznych i nożyczek. Wykonaj drugie nacięcie przez mięśnie i ścianę mięśni brzucha, aby odsłonić otrzewną.
  6. Usuń macicę, oddzielając się od otaczających tkanek nożyczkami. Przenieś nienaruszoną macicę na rękawicę wypełnioną ciepłą wodą, aby zwiększyć przeżywalność zarodka do momentu indywidualnego usunięcia każdego z nich z owodni.
  7. Użyj nożyczek i palców z cienką końcówką, aby ostrożnie otworzyć ściany macicy, aby uwolnić zarodki. Nie przecinaj pępowiny zbyt blisko ciała, aby zapobiec rozległej utracie krwi. Jeżeli do analizy mają zostać wykorzystane zarodki, należy przejść do kroku 3.9. Jeśli szczenięta mają być przygarnięte, przejdź do kroku 2.8.
  8. Jeśli wymagana jest opieka zastępcza, oczyść szczenięta przed przekazaniem ich matce zastępczej. Podczas czyszczenia szczeniąt delikatnie naciskaj od czasu do czasu klatkę piersiową, aby zainicjować oddychanie. Załóż z powrotem drugą rękawicę wypełnioną ciepłą wodą, aby poprawić przeżywalność.
    UWAGA: Ważne jest, aby delikatnie usunąć pozostałą owodnię i/lub łożysko ręcznikiem papierowym.
  9. Przed przekazaniem szczeniąt matce zastępczej wyjmij matkę zastępczą z klatki, usuń oryginalne młode i zastąp je młodymi eksperymentalnymi. Wróć przybraną matkę do jej klatki.
    UWAGA: Zobacz dyskusję, aby uzyskać dodatkowe sugestie dotyczące poprawy wskaźników akceptacji wspierania.
  10. Jeśli wymagane jest genotypowanie, należy pobrać biopsję palca u nogi lub ogona między P6−P8.
    UWAGA: Wykonaj ten krok tylko wtedy, gdy licencje doświadczalne na zwierzętach zatwierdzają tę praktykę.

3. Przygotowanie tkanek dla klonów MADM w mózgu

UWAGA: W przypadku eksperymentów obejmujących tkanki poporodowe (≥P4), przejdź do kroku 3.1. W przypadku embrionalnych punktów czasowych i wczesnego okresu poporodowego (P0−P3) przejdź do kroku 3.9.

  1. Znieczulić doświadczalne zwierzę MADM wstrzyknięciem IP roztworu ketaminy/ksylazyny/acepromazyny (odpowiednio 65 mg, 13 mg i 2 mg/kg masy ciała) i potwierdzić, że mysz nie reaguje, szczypiąc tylną łapę.
    UWAGA: Do analizy używa się zarówno samców, jak i samic myszy MADM (tło CD-1). Jeśli wymagane jest genotypowanie, w tym momencie należy pobrać biopsję ucha.
  2. Umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na tacce do operacji perfuzji i zdezynfekuj sierść 70% etanolem. Aby rozpocząć operację, ostrożnie wykonaj nacięcie nożyczkami i kleszczami chirurgicznymi przez zewnętrzną warstwę skóry, a następnie drugie nacięcie przez warstwę mięśniową. Podnieś czubek mostka i przetnij tkankę łączną po bokach, zachowując szczególną ostrożność, aby uniknąć przecięcia wątroby. Jama piersiowa będzie widoczna.
  3. Przetnij przeponę i unieś, aby odsłonić serce. Ostrożnie przytnij klatkę piersiową i przypnij do tacki chirurgicznej, aby odsłonić serce. W przypadku szczeniąt całkowicie usuń klatkę piersiową.
  4. Wprowadzić igłę z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do lewej dolnej komory (jaśniejsza tkanka). Za pomocą małych nożyczek do tęczówki wykonaj nacięcie na tylnym końcu prawego przedsionka (ciemnoczerwona tkanka), aby krew mogła spłynąć.
  5. Przeprowadzić perfuzję za pomocą PBS, a następnie natychmiast świeżo przygotowany, lodowaty 4% paraformaldehyd (PFA) przygotowany w PBS. W przypadku szczeniąt (P4−P10) użyj strzykawek do wykonania perfuzji. Napełnij jedną strzykawkę 10 ml PBS, a drugą 10 ml 4% PFA. Upewnij się, że wszystkie pęcherzyki powietrza ze strzykawek zostały usunięte. W przypadku starszych zwierząt należy użyć pompy perystaltycznej.
  6. Rozpocznij perfuzję od PBS (10 ml przy 2-4 ml / min u szczeniąt; 20 ml przy 4-6 ml / min dla dorosłych za pomocą pompy perystaltycznej). Wątroba stanie się przezroczysta i bladożółta, jeśli igła zostanie prawidłowo umieszczona.
  7. Po zakończeniu wyjmij igłę z młodych i włóż igłę zawierającą PFA do tego samego otworu. W przypadku dorosłych należy zatrzymać pompę perystaltyczną przed wymianą roztworu PBS na lodowaty PFA, upewniając się, że nie ma pęcherzyków w rurce wychwytowej. Wznowić perfuzję z PFA (10 ml przy 2−4 ml/min u młodych; 30 ml przy 4−6 ml/min dla dorosłych przy użyciu pompy perystaltycznej).
  8. Po zakończeniu perfuzji odetnij głowę myszy i usuń mózg poprzez staranną sekcję. Przenieś mózg do 4% PFA. Użyj co najmniej 5 razy większej objętości mózgu (tj. ~ 5-10 ml PFA w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml) i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia po perfuzji, aby zapewnić całkowite utrwalenie tkanki. Przejdź do kroku 3.10.
  9. W przypadku tkanki embrionalnej i wczesnej tkanki postnatalnej (tj. P0−P3), po wykonaniu cięcia cesarskiego, należy odciąć zarodki nożyczkami. Jeśli wymagane jest genotypowanie, w tym momencie zbierz ogon zarodka. Natychmiast wypreparuj mózg i przenieś na 12-dołkową płytkę zawierającą 2-3 ml 4% PFA/studzienkę. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w celu późniejszego utrwalenia.
  10. Następnego ranka wymienić PFA na 10 ml (dorosły) lub 2-3 ml (zarodek) PBS i powtórzyć płukanie 3x przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść tkankę do 30% roztworu sacharozy w buforze fosforanowym (PB) i przechowywać w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej, aż tkanka zanurzy się w roztworze.
  11. Osadź mózg w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w formie do zatapiania, uważając, aby zorientować mózg na przekrój koronalny lub strzałkowy. Zamrozić, umieszczając formę do zatapiania na suchym lodzie, aż OCT stanie się całkowicie nieprzezroczysty (~10−15 min). Przechowywać tkankę w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

4. Przygotowanie tkanki MADM do immunohistochemii

  1. Przymocuj blok tkankowy do dysku próbki w kriostatu, przykładając pierścień OCT do dysku i umieszczając blok bezpośrednio w OCT, gdy zacznie zamarzać. Upewnij się, że blok jest prawidłowo zorientowany na żądaną płaszczyznę cięcia.
    UWAGA: Tutaj szczegółowo opisano przekroje koronalne w celu zbadania korowych klonów MADM.
  2. Ustaw temperaturę bloku w kriostacie na -20 °C, a temperaturę ostrza na -21 °C.
  3. Pozwól, aby blok tkankowy dostosował się do temperatury komory, montując krążek próbki do uchwytu próbki i pozostaw w kriostacie na ~ 5 minut przed rozpoczęciem cięcia.
  4. Przycinaj blok w grubych odcinkach (45−60 μm), aż do osiągnięcia obszaru tkanki będącego przedmiotem zainteresowania.
  5. Gdy krawędź kory będzie wyraźnie widoczna, przerwij cięcie i zablokuj ostrze. Upewnij się, że ostrze jest osłonięte przed przycięciem bloku.
  6. Przytnij nadmiar OCT otaczający tkankę za pomocą ostrza, pozostawiając ~1−2 mm OCT ze wszystkich stron mózgu.
  7. Następnie ustaw blok tak, aby jedna z bocznych krawędzi kory była zorientowana w dół, a druga w górę (tj. najbardziej rostralna krawędź kory była skierowana w prawo).
  8. Rozpocznij cięcie z grubością 45 μm dla dorosłych klonów i 30 μm dla klonów embrionalnych. Wykonaj każdą sekcję osobno i użyj małej szczotki, aby utrzymać obszar pod nożem w czystości z wszelkich zanieczyszczeń pozostawionych podczas przycinania bloku.
    UWAGA: Jeśli nie zostanie to zrobione i sekcja spadnie, określenie prawidłowej kolejności plasterków może być trudne.
  9. Jeśli sekcje zaczną się zwijać, przytnij krawędzie bloku i/lub ostrożnie wyreguluj szklaną płytkę zapobiegającą zwijaniu się.
  10. W przypadku analizy klonów embrionalnych należy zamontować sekcje bezpośrednio na matowym szkiełku. Wysuszyć na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C przed bezpośrednim przejściem do kroku 5.6.
    UWAGA: Do jednego slajdu można dodać kilka sekcji, ale należy zachować kolejność sekwencyjną.
  11. Aby zebrać dorosłe klony, przygotuj 24-dołkowe płytki zawierające 1 ml PBS / dołek (zwykle 5-6 płytek na mózg). Zaczynając od pierwszego dołka, za pomocą zimnych kleszczy zbierz poszczególne odcinki szeregowe w PBS w kolejności cięcia.
    UWAGA: Metoda przekroju pływającego jest stosowana dla tkanek dorosłych, aby zapewnić, że żadne sekcje nie zostaną pominięte i że zamontowane sekcje nie zawierają zmarszczek.
  12. Przerwij cięcie po osiągnięciu końca kory nowej.
  13. W przypadku dorosłych klonów przystąp do montażu sekcji pływających.
    UWAGA: Sekcje można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do 24 godzin.

5. Montaż dorosłej tkanki do obrazowania

UWAGA: Wymagane są następujące narzędzia: mały pędzel, szalka Petriego, PBS z 0,5% Tween (PBS-T), szkiełka adhezyjne (Tabela materiałów), medium montażowe (Tabela materiałów), szkiełka nakrywkowe i kleszcze.

  1. Napełnij szalkę Petriego PBS-T.
    UWAGA: Detergent służy do pomocy w procesie montażu. Jeśli konieczne jest barwienie w poszukiwaniu dodatkowych antygenów, które są wrażliwe na detergenty (tj. glikoproteiny), najlepiej pominąć dodawanie Tween.
  2. Umieść szkiełko adhezyjne w PBS-T tak, aby było prawie zakryte aż do etykiety.
  3. Przenieś pierwszą sekcję do PBS-T.
  4. Za pomocą małego pędzla manewruj sekcją na szkiełku i ułóż ją tak, aby zachować kolejność cięcia. Postępuj w ten sam sposób ze wszystkimi dalszymi sekcjami.
  5. Gdy wszystkie sekcje znajdą się na swoim miejscu, umieść szkiełko (~12−16 sekcji/szkiełko) w ciemnej komorze szkiełka. Lekko podnieś pokrywę, aby sekcje całkowicie wyschły (~10−20 min), upewniając się, że pozostają przyklejone w kolejnych krokach.
  6. W przypadku wykonywania immunohistochemii dla dodatkowych antygenów należy przejść bezpośrednio do sekcji 6 lub 7,
    UWAGA: W przypadku embrionalnych punktów czasowych konieczne jest wykonanie etapów barwienia immunologicznego przynajmniej dla GFP i tdT (sekcja 6). W przypadku dorosłych klonów jest to wymagane tylko w przypadku równoległego barwienia w poszukiwaniu dodatkowych antygenów (sekcje 6 i 7).
  7. Ponownie nawodnić i umyć sekcje 1x za pomocą 1x PBS przez 5 minut, aby usunąć resztki PBS-T. Nałóż ~ 1 ml 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) rozcieńczonego w 1x PBS (1 μg / ml) na szkiełko, upewniając się, że wszystkie sekcje są przykryte i inkubować przez 15 minut.
  8. Ostrożnie wyjmij DAPI i umyj 1x 1x PBS przez 5 min. Usuń nadmiar PBS i susz przez ~1−2 min przed zatopieniem w 110 μL podłoża montażowego. Uszczelnić szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 x 60 mm i pozostawić do wyschnięcia na co najmniej 3 godziny przed obrazowaniem.

6. Barwienie immunologiczne tylko dla GFP i tdT

UWAGA: Ta sekcja jest niezbędna dla embrionalnych klonów.

  1. Umieść szkiełka poziomo w wilgotnej komorze inkubacyjnej szkiełka. Zaznacz granice slajdów markerem woskowym, aby zminimalizować wymaganą ilość bufora.
  2. Nawadniaj sekcje za pomocą 1x PBS. Aby poprawić jakość barwienia, pracuj ze świeżo pociętą tkanką.
  3. Dodaj 250−400 μl buforu blokującego (0,5% Triton X-100, 2−3% normalnej surowicy osła w 1x PBS) na szkiełko, upewniając się, że wszystkie sekcje są pokryte. Inkubować przez 1 godz.
    UWAGA: Stężenie detergentu (Triton X-100 lub Tween-20) będzie się różnić w zależności od zastosowanych dodatkowych przeciwciał pierwszorzędowych, ponieważ niektóre antygeny są bardziej wrażliwe na detergenty niż inne.
  4. Usunąć bufor blokujący i dodać przeciwciała pierwszorzędowe w buforze blokującym do szkiełka (300−400 μL/szkiełko).
    UWAGA: Przykładem standardowej pierwszorzędowej reakcji przeciwciała dla anty-GFP/anty-tdT (MADM) może być użycie anty-GFP kurczaka (1:500) i anty-RFP królika (1:500).
  5. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Szkiełka muszą być inkubowane idealnie poziomo z buforem pokrywającym wszystkie sekcje. W przeciwnym razie może dojść do nierównego lub słabego zabarwienia.
  6. Następnego ranka należy upewnić się, że bufor blokujący z przeciwciałami pierwszorzędowymi nadal pokrywa wszystkie sekcje na szkiełku. Jeśli nie, powtórz etap inkubacji przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej.
  7. Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć 4x 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Dodaj przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w buforze blokującym do szkiełka (300−400 μl / szkiełko): Alexa Fluor 488 anty-kurczak IgG (1:500) i Cy3 anty-królik IgG (1:500).
  9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Szkiełka należy przykryć przed światłem, aby zapobiec bieleniu fluoroforów.
  10. Usuń przeciwciała drugorzędowe i przemyj 2x 1x PBS przez 10 min.
  11. Inkubować z DAPI rozcieńczonym w PBS (1:5 000) przez 15 minut.
  12. Myć sekcje 1x za pomocą 1x PBS przez 10 min.
  13. Usuń nadmiar PBS i susz przez ~1−2 minuty przed zatopieniem w 110 μl podłoża montażowego.
  14. Uszczelnić szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 x 60 mm i pozostawić do wyschnięcia na co najmniej 3 godziny przed obrazowaniem. Obraz przesuwa się w ciągu 1-2 tygodni po wykonaniu immunohistochemii, aby zapewnić optymalny sygnał.

7. Barwienie immunologiczne dla GFP, tdT i dodatkowych antygenów

  1. Wykonaj kroki 6.1−6.3.
  2. Usunąć bufor blokujący i dodać przeciwciała pierwszorzędowe w buforze blokującym do szkiełka (300−400 μL/szkiełko).
    UWAGA: Podczas barwienia pod kątem trzech lub więcej antygenów (tj. GFP, tdT i białka będącego przedmiotem zainteresowania), a przeciwciało dla białka będącego przedmiotem zainteresowania zostało podwyższone u królika, zaleca się użycie pierwszorzędowego przeciwciała anty-tdT (kozy) w rozcieńczeniu 1:500. Przykładem pierwszorzędowej reakcji przeciwciał dla trzech antygenów z alternatywnym barwieniem tdT może być użycie anty-GFP kurczaka (1:500), anty-tdT kóz (1:500) i przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania (tj. królikowi).
  3. Wykonaj kroki 6.5−6.7.
  4. Dodaj drugorzędową mieszaninę przeciwciał rozcieńczoną w buforze blokującym do szkiełka (300−400 μl / szkiełko): Alexa Fluor 488 anty-kurczak IgG (1:500), Cy3 anty-kozia IgG (1:500) i Alexa Fluor 647 anty-królicza IgG (1:500).
  5. Wykonaj kroki 6.9−6.14.

8. Konfokalna akwizycja obrazów i kwantyfikacja klonów MADM

  1. Zidentyfikuj i udokumentuj sekcje mózgu zawierające klony i ich lokalizację w korze mózgowej.
    UWAGA: Liczba sekcji, które obejmuje klon, będzie się różnić w zależności od tego, kiedy klon został wyindukowany, sterownika CreERT2 i czasu analizy. Ten krok można wykonać zarówno pod mikroskopem konfokalnym, jak i mikroskopem epifluorescencyjnym.
  2. Korzystając z odwróconego mikroskopu konfokalnego, zacznij od wybrania i skonfigurowania odpowiednich linii laserowych i filtrów. Dla mózgów MADM wybierz DAPI, GFP i tdT (wzbudzenie: odpowiednio 358 nm, 488 nm i 554 nm; emisja szczytowa: odpowiednio 461 nm, 507 nm i 581 nm). Upewnij się, że otwór jest ustawiony na 1 przewiewną jednostkę, aby uzyskać optymalną jakość obrazowania.
  3. W przypadku ustawień specyficznych dla konfokalizmu klonuje się obraz z obiektywem 20x i zoomem 1x. W przypadku obrazów, które będą używane w kwantyfikacjach, należy użyć wartości zatrzymania piksela prędkości skanowania wynoszącej 1,52-2,06 μs (wartości 7-8 w oprogramowaniu do akwizycji obrazu) bez uśredniania. Dostosuj odpowiednio intensywność lasera i ustawienia wzmocnienia dla każdego kanału.
    UWAGA: W zależności od wymaganej jakości obrazu ustawienia szybkości skanowania i uśredniania mogą się różnić.
  4. Gdy klon zostanie wyraźnie zidentyfikowany, ułóż kafelki obrazowania tak, aby obejmowały wszystkie odpowiednie sekcje w klonie. Dostosuj stos z tak, aby wszystkie komórki oznaczone znacznikiem MADM w klonie były przechwytywane w odstępie 1,5 μm/z-stack slice. Dostosuj obszar kafelkowy tak, aby cała szerokość kory została uchwycona podczas obrazowania klonu (tj. od powierzchni kości do ciała modzelowatego).
  5. Obrazuj poszczególne klony obejmujące kolejno wiele sekcji, upewniając się, że wszystkie sekcje bez komórek w klonie są nadal obrazowane w celu rekonstrukcji 3D i prawidłowej interpretacji informacji przestrzennych komórek.
  6. Przeanalizuj każdą sekcję zawierającą komórki klonu MADM sekwencyjnie od rostralu do ogonowego końca kory. Rozróżniaj poszczególne neurony i komórki glejowe na podstawie ich morfologii i/lub barwienia markerami. Rejestruj informacje o położeniu równolegle w oparciu o odpowiednie granice warstw zdefiniowane przez barwienie jądrowe (DAPI).
    UWAGA: Zobacz Rysunek 4 dla reprezentatywnych wyników dla analizy embrionalnej i Rysunek 5 dla reprezentatywnych wyników dla analizy dorosłych.

9. Seryjna rekonstrukcja 3D klonów

UWAGA: Rekonstrukcja 3D indywidualnych klonów zobrazowanych na seryjnych odcinkach mózgu jest przydatna do wizualnego wyświetlania, jak również do analizy architektur klonalnych 3D i może być wykonana zgodnie z poniższymi krokami.

  1. Zszywanie i łączenie konfokalnych obrazów kafelkowych na podstawie parametrów akwizycji za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów. Otwórz plik .czi, a następnie uruchom metodę Stitching w zakładce Processing w oprogramowaniu ZEN (Zeiss).
  2. Zszyte stosy obrazów można eksportować jako pojedyncze płaszczyzny Z w formacie TIFF. Otwórz zszyty plik .czi, a następnie uruchom metodę Eksport obrazu na karcie Przetwarzanie. W przypadku obrazów wielokanałowych można je eksportować jako obrazy czerwone/zielone/niebieskie w celu późniejszego przetwarzania obrazu.
  3. Powtórz kroki 9.1 i 9.2 dla każdej szeregowej sekcji mózgu klona.
    UWAGA: Aby uzyskać dokładną rekonstrukcję 3D, wszystkie sekcje mózgu w klonie, w tym te bez oznakowanych komórek, muszą być również przetworzone.
  4. Połącz poszczególne obrazy w jeden stos w kolejności, zaczynając od najbardziej rostralnej do najbardziej ogonowej płaszczyzny z, korzystając z oprogramowania do przetwarzania obrazów typu open source, takiego jak ImageJ/Fiji67,68.
    UWAGA: W tym momencie należy usunąć wszelkie puste obrazy na krawędziach każdej sekcji mózgu.
  5. W razie potrzeby popraw stos obrazów uzyskany w kroku 9.4 pod kątem niewspółosiowości za pomocą wtyczki ImageJ o nazwie "MultiStackReg", wykonując kroki 9.5.1−9.5.5. Jeśli wyrównanie obrazu nie jest wymagane, przejdź do kroku 9.6.
    UWAGA: Ta wtyczka wykonuje wyrównanie obrazu kanału o najwyższym kontraście (zwykle DAPI), a następnie stosuje nagraną transformację do innych kanałów, umożliwiając w ten sposób niezawodne wyrównanie obrazu stosów wielokanałowych. Wtyczka pomocnicza o nazwie "TurboReg" musi być preinstalowana.
    1. W ImageJ zainstaluj wtyczki "MultiStackReg" i "TurboReg".
    2. Otwórz stos obrazów sklonowanych obrazów uzyskanych w kroku 9.4, aby je wyrównać. Podziel kanały na DAPI (niebieski), GFP (zielony) i tdT (czerwony) w opcji Kolor na karcie Obraz.
    3. Uruchom wtyczkę "MultiStackReg", aby wyrównać kanał DAPI za pomocą transformacji "Rigid Body" i zapisać plik transformacji.
    4. Zastosuj zapisany plik transformacji do pozostałych dwóch kanałów za pomocą "MultiStackReg".
    5. Scal wszystkie trzy wyrównane kanały i zapisz wyrównany stos.
  6. Aby zorientować klon w ImageJ, obróć stos sklonowanych obrazów uzyskanych w kroku 9.4 (lub kroku 9.5.5 po wyrównaniu) w orientacji pionowej, z powierzchnią pial na górze i ciałem modzelowatym na dole. W razie potrzeby przyciąć w płaszczyźnie xy.
  7. Zarówno w przypadku prezentacji jakościowej, jak i analizy ilościowej, wygeneruj maksymalny obraz projekcji z (krok 9.8) lub wykonaj renderowanie 3D (krok 9.9) klonu.
  8. W ImageJ otwórz stos obrazów z kroku 9.6 i wybierz opcję Projekcja Z z typem projekcji Maksymalna intensywność. Spowoduje to wygenerowanie obrazu całego klonu rzutowanego na tę samą płaszczyznę.
  9. W ImageJ otwórz stos obrazów z kroku 9.6 i wybierz opcję Funkcja Z projektu 3D, aby wygenerować wizualizację 3D klonu, który można obrócić.
    UWAGA: Na tym etapie ważne jest, aby wprowadzić prawidłowy interwał wycinków odpowiadający grubości poszczególnych stosów z podczas akwizycji obrazu. Narzędzie do interpolacji powinno być używane do usuwania przerw między plasterkami.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MADM powoduje rekonstytucję funkcjonalnych zielonych i czerwonych białek fluorescencyjnych z dwiema komórkami potomnymi, z których każda wyraża jedno z dwóch białek fluorescencyjnych podczas segregacji chromosomów G2-X (Rysunek 1A). Ponieważ zdarzenia MADM skutkują trwałym i odrębnym oznakowaniem dwóch linii potomnych, można przeprowadzić ilościową ocenę zielonych i czerwonych linii komórek potomnych (subklonów). Można określić zmienne, w tym wzorzec podziału (np. symetryczny kontra asymetryczny) i potencjał (np. liczbę potomstwa) pierwotnego przodka. Kwantyfikacja każdego znakowanego fluorescencyjnie subklonu jest pouczająca przy retroaktywnym określaniu, czy oryginalna komórka progenitorowa przechodzi symetryczne podziały proliferacyjne, czy asymetryczne, neurogenne podziały w czasie indukcji TM. Poprzednie badania pogrupowały klony projekcji pobudzającej Emx1-CreERT2 lub Nestin-CreERT2 pochodzące z kory mózgowej w dwie szerokie klasy7,11,46. Pierwsze, określane jako "symetryczne klony proliferacyjne", składają się średnio ze znacznej liczby neuronów, przy czym zarówno zielone, jak i czerwone subklony zawierają po cztery lub więcej neuronów. Druga grupa, "klony asymetryczne" definiuje klasę klonów, w której subklon "mniejszościowy" zawiera mniej niż trzy neurony, a subklon "większościowy" cztery lub więcej11. Definicje te są specyficzne dla korowych RGP i mogą wymagać ponownego przeglądu dla innych regionów mózgu i tkanek. W przypadku obu klas klonów korowych potomstwo będzie rozmieszczone w warstwach powierzchownych i głębokich.

Podczas projektowania badań klonalnych MADM należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Czas, w którym zdarzenia MADM są indukowane przez podanie TM, jest kluczowym czynnikiem (Rysunek 3). W przypadku korowych klonów neuronów projekcyjnych MADM (tj. przy użyciu Emx1-CreERT2 lub Nestin-CreERT2) w E10 prawie wszystkie RGP nadal przechodziły symetryczne podziały11. Dlatego indukcja w E10 z TM uchwyciła wiele rund proliferacyjnej amplifikacji RGP i skutkowała klonami o wysokiej liczbie neuronów. Jednak liczba RGP w E10 była na ogół niewielka, a zatem podanie TM powodowało bardzo mało zdarzeń MADM (czasami mniej niż jedno na mózg). Większość RGP przeszła z symetrycznych na asymetryczne podziały neurogenne około E12. Aby celować w ściśle asymetryczne klony neurogenne, najlepiej było indukować w E12 lub później (Ryc. 3). Czas między indukcją TM a obserwacją zdarzeń rekombinacji MADM w korze mózgowej wynosił zwykle mniej niż 24 godziny. Iniekcje IP były preferowaną metodą podawania TM w stadiach embrionalnych dla tej metody, ponieważ prowadziły do większej odtwarzalności w indukcji klonalnej. Ważne jest również, aby ograniczyć dawkę TM do minimum z dwóch powodów. Po pierwsze, jeśli szybkość rekombinacji MADM wzrośnie, prawdopodobieństwo wywołania wielu, być może nakładających się na siebie, klonów jest większe. Po drugie, jeśli dostarczy się zbyt dużo TM, można zaobserwować zwiększony wskaźnik poronień, reabsorpcji zarodków i mniejsze rozmiary miotów. Poronienia zaobserwowano u około połowy wszystkich ciężarnych matek, gdy zastrzyki TM zostały dostarczone w E10. Częstość ta zmniejszała się od E11 i zmniejszała się do około 1/3 ciężarnych matek, które przerywają ciążę. Podsumowanie dawek TM, czasów indukcji i sterowników CreERT2 stosowanych w poprzednich badaniach MADM znajduje się w Tabeli 1. Aktywność reportera przy braku TM zaobserwowano u niektórych sterowników CreERT2 indukowanych przez TM69. Nie obserwowano ekspresji ektopowej lub zdarzeń rekombinacji MADM przy braku TM w przypadku Emx1-CreERT2 sterowników Nestin-CreERT2. Może to częściowo wynikać z faktu, że trans-rekombinacje chromosomowe za pośrednictwem TM występują z około 1:1 000 do 1:10 000 mniejszą częstością niż rekombinacje cis, zmniejszając prawdopodobieństwo ektopowego znakowania MADM.

Kolejnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę przy planowaniu eksperymentu z analizą klonalną MADM, jest czas trwania badania. Zmiana długości czasu między indukcją TM a momentem, w którym eksperyment został przeanalizowany (A) (okno czasowe) wyświetla dynamikę komórek macierzystych w czasie64. Krótkie okna czasowe embrionalne (tj. TM/E11−A/E13; TM/E11−A/E16) uchwycił dynamikę neurogenezy embrionalnej (Ryc. 4). Porównanie klonów z dwóch lub więcej okien czasowych dostarcza ilościowego wglądu w liczbę wytworzonych komórek i to, jak rozkład neuronów zmienia się na różnych etapach progresji linii64. Aby uchwycić cały potencjał poszczególnych klonów, konieczne jest rozszerzenie analizowanego okna czasowego na punkty czasowe postnatalne lub dorosłe7,11,12. Przykłady klonów kory nowej indukowanych w zarodku i analizowanych u osoby dorosłej przedstawiono w Ryc. 5. Warto zauważyć, że neurogeneza korowa jest w większości zakończona, a glejogeneza wzrasta o E17. Około 1/6 neurogennych RGP również przystępuje do generowania astrocytów i/lub oligodendrocytów11.

Symetryczne klony występują, gdy RGP przechodzą jedną lub więcej rund dystrybucji proliferacyjnej11. Klony RGP indukowane między E10−E12 były średnio większe i zapewniały więcej cech przestrzennych końcowego rozkładu neuronów (Ryc. 4 A-C). Klony z neuronami względnie równomiernie rozmieszczonymi w głębokich i powierzchownych warstwach przyjmowały kształt "cylindra", podczas gdy klony z neuronami bardziej rozproszonymi w warstwach powierzchownych niż głębszych rozwinęły kształt "stożka"11. Aby w pełni uchwycić informacje przestrzenne i morfologiczne klonu, konieczne było obliczeniowe zrekonstruowanie każdego klonu przy użyciu sekwencyjnych obrazów. Aby zmierzyć dyspersję klonalną, porównano maksymalną dyspersję boczną (mierzoną we wszystkich wymiarach) w warstwach powierzchownych (LII−VI) klonu z dyspersją neuronów w głębokich warstwach (LV/LIV). Ten stosunek (rozkład górny:rozkład dolny) zapewnił wymierny odczyt ogólnego kształtu klonu.

Asymetryczne klony, w których podklon mniejszościowy liczył trzy lub mniej, dostarczyły wglądu w neuronalne wyjście pojedynczego RGP (Rysunek 4D-F i Rysunek 5A-F)7,11,12. Populacja większościowa (duży subklon) może być oznaczona na czerwono lub zielono, ze średnią około siedmiu pobudzających neuronów projekcyjnych na klon, gdy jest indukowana za pomocą Emx1-CreERT2 lub Nestin-CreERT2(Rysunek 5G)7,11,12. Całkowita liczba komórek w klonie MADM może być dalej analizowana, analizując rozmieszczenie neuronów w dużym subklonie w powierzchownych i głębokich warstwach. Populacja mniejszościowa (mały subklon) była oznaczona odwrotnym kolorem i wynosiła średnio 1−2 komórki na klon (Ryc. 5H). Całkowity "rozmiar jednostki", który wynosił średnio 8−9 neuronów, można obliczyć, dodając do siebie małe i duże subklony (Rysunek 5I)7,11,12. Ważne jest, aby zauważyć, że podczas gdy neuronalne wyjście RGP było wysoce przewidywalne, istniał pewien stopień heterogeniczności klonalnej12,70.

Wprowadzenie dystalnej mutacji do kasety MADM umożliwia generowanie mozaik genetycznych, zapewniając unikalną metodę analizy molekularnych regulatorów progresji linii komórek macierzystych. W związku z tym MADM stanowi niezrównaną platformę eksperymentalną do badania autonomicznej funkcji genu w komórce (np. jego związku z małogłowiem lub makrocefalią). Porównując klony indukowane w mozaice genetycznej MADM z klonami indukowanymi w kontrolnym MADM, można uzyskać wysoce ilościowy odczyt zmian w liczbie neuronów i rozmieszczeniu. Poprzednie badania oparte na MADM określały ilościowo autonomiczną funkcję komórkową Otx1 w tworzeniu małogłowia na poziomie klonalnym (patrz Rysunek 6A-E dla reprezentatywnego przykładu)11. W innym badaniu analiza klonalna MADM wykazała, że Ndel1 nie reguluje autonomicznie komórki liczby neuronów projekcyjnych, ale zamiast tego zdolność nowonarodzonych neuronów do wchodzenia lub migrowania w obrębie płytki korowej, która później tworzy dorosłą korę mózgową 46. Badania te wykazały wysoce ilościowy charakter analizy klonalnej MADM w badaniu autonomicznych funkcji genów regulujących rozwój kory mózgowej. Obecnie w literaturze nie ma przykładów wykorzystania MADM do badania genów związanych z makrocefalią na poziomie klonalnym. Jednak w przyszłych badaniach analiza genów istotnych dla ogólnej kontroli wielkości kory mózgowej może dostarczyć bardzo pożądanych spostrzeżeń na poziomie molekularnym i komórkowym.

figure-results-1
Rysunek 1: Zasada MADM do śledzenia linii i analizy klonalnej na poziomie pojedynczych komórek macierzystych. (A) Aby przeprowadzić śledzenie pochodzenia i analizę klonalną za pomocą MADM, muszą być obecne dwa komponenty. Po pierwsze, kasety MADM muszą być ukierunkowane na identyczne loci na chromosomach homologicznych. Kasety składają się z dwóch chimerycznych fluorescencyjnych genów reporterowych, eGFP (zielony, [G]) i tandemowy dimer pomidora (czerwony, tdT[T]). Kaseta GT zawiera N-koniec eGFP i C-koniec tdT, oddzielone intronem zawierającym miejsce loxP. Kaseta TG jest skonstruowana odwrotnie, z N-końcem tdT i C-końcem eGFP. Po drugie, ekspresja rekombinazy Cre musi wystąpić w komórce zawierającej docelowe kasety MADM. Miejsca loxP służą jako cel dla rekombinacji międzychromosomowej za pośrednictwem Cre, w wyniku której obie kasety ekspresyjne są odtwarzane jednocześnie. Jeśli rekombinacja nastąpi podczas fazy G2 cyklu komórkowego, po której następuje segregacja X (G2-X), dwie komórki potomne będą wyrażać jedno z dwóch białek fluorescencyjnych. (B) Zasada MADM dla analizy mozaiki genetycznej na poziomie pojedynczego klonu. Zmutowane allele (mutacje punktowe, delecje, insercje, allele warunkowe po bokach loxP, jak pokazano na rysunku 1B itp.) mogą być wprowadzane dystalnie do kasety TG-MADM poprzez rekombinację mejotyczną (patrz Figura 2 i Hippenmeyer i wsp.46 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat wprowadzania zmutowanych alleli do systemu MADM). Jeśli międzychromosomowa rekombinacja trans-trans za pośrednictwem rekombinazy G2-X Cre zachodzi między kasetami MADM, skutkuje to jedną homozygotyczną zmutowaną komórką GFP+ (GeneX-/-) dla genu będącego przedmiotem zainteresowania i jedną homozygotyczną komórką tdT+ typu dzikiego (GeneX+/+) w nieoznakowanym środowisku heterozygotycznym46,47,71. Alternatywne wyniki etykietowania, które nie zostały wykorzystane w analizie klonalnej (tj. żółte krwinki) zostały wcześniej szczegółowo opisane11,46,47. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schematy hodowlane w celu generowania eksperymentalnych myszy MADM do śledzenia linii. Schemat hodowlany dla generacji kontrolnych myszy MADM (A) i Gene X MADM (B) eksperymentalnych myszy MADM do analizy klonalnej. Więcej informacji na temat paradygmatów hodowlanych MADM można znaleźć w Beattie et al.7 i Hippenmeyer et al.7,46. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Paradygmaty przebiegu czasowego dla analizy pochodzenia klonalnego opartej na MADM. Schemat eksperymentalnych okien czasowych projektu. W przypadku paradygmatów próbkowania podłużnego punkt czasowy indukcji klonów pozostawał stały, a czas przed analizą był różny. W progresywnym próbkowaniu interwałowym punkt czasowy analizy pozostawał stały, ale czas indukcji był różny. W zależności od poruszanych pytań można zastosować kombinację jednego lub obu podejść. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Analiza klonalna MADM w rozwijającej się i dorosłej korze nowej. Indukcja klonów MADM za pośrednictwem TM w symetrycznie proliferacyjnych (TM w E10) (A-C) i asymetrycznie neurogennych (TM w E12) (D-F) dzielących RGP. Przedstawiono pojedyncze klony MADM in vivo w rozwijającym się (TM/E10−A/E16 i TM/E12−A/E16) (B,E) i dorosłym (TM/E10−A/P21 i TM/E12−A/P21) (C, F) w MADM-11GT/TG; Nestin-CreERT2+/- (B,E) oraz MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- (C,F). Wynik neuronu był niezależny od koloru subklonu, a zielone subklony większości/mniejszości można było porównać z czerwonymi subklonami większości/mniejszości w warunkach kontrolnych7,11. Około 1/6 dorosłych klonów zawierała również astrocyty i/lub oligodendrocyty, oznaczone białymi gwiazdkami. Panele B i F są reprodukowane za zgodą Hippenmeyer et al.46 oraz Rulands i Simons72, odpowiednio. CP = płytka korowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Ryc. 5: Analiza klonalna MADM w celu ilościowego określenia wyjścia neuronów za pośrednictwem RGP. Analiza produkcji neuronów pobudzających (jednostek) przez poszczególne neurogenne RGP na poziomie klonalnym przy użyciu MADM7,11. (A) Eksperymentalny paradygmat indukowania głównie asymetrycznych klonów MADM w rozwijającej się korze mózgowej. (B) Możliwe asymetryczne wyniki klonowania, w których większość subklonów jest oznaczona na zielono lub czerwono (C) Reprezentatywne kolejne sekcje obejmujące pojedynczy neurogenny asymetryczny klon (D,E): obrazy rekonstrukcji 3D reprezentatywnych asymetrycznych klonów G2-X MADM z populacją większościową na czerwono (D) lub zielono (E) w MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- z indukcją TM w E12 i analizą w P21. Zauważ, że zarówno zielone, jak i czerwone oznaczone komórki są dzikie. (F) Schemat wskazujący dwa możliwe wyniki eksperymentalnego klonowania MADM. (G) Kwantyfikacja liczebności populacji większościowej wynikającej z odnowienia RGP w klonach MADM-11. (H) Kwantyfikacja wielkości populacji mniejszościowej wynikającej z odnowienia RGP w klonach MADM-11. (I) Kwantyfikacja jednostkowej wielkości asymetrycznych neurogennych klonów MADM-11. Hipotetyczne wartości mogą reprezentować średnią ± SEM. Podziałka = 100 μm (D i E). TM = tamoksyfen. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Analiza klonalna MADM w celu zbadania genów prowadzących do małogłowia i makrocefalii. Hipotetyczne wyniki analizy klonalnej MADM podczas wykonywania funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydujących, które prowadzą do małogłowia lub makrocefalii. Aby przeanalizować autonomiczne funkcje komórki genu będącego przedmiotem zainteresowania (gen X) na wyjściu neuronów, MADM wymaga wprowadzenia zmutowanych alleli dystalnie do kaset MADM poprzez rekombinację mejotyczną (szczegółowe informacje na temat wprowadzania zmutowanych alleli do systemu MADM można znaleźć również na rysunku 2, Hippenmeyer et al.46, oraz Laukoter et al.46,73). Panie przewodniczący, panie i panowie! Schemat przedstawiający eksperymentalny paradygmat MADM do analizy funkcjonalnej klonalnych jednostek RGP. Subklon mutanta może stanowić populację mniejszościową (A) lub większościową (B). (C-E) Wyniki hipotetycznej analizy klonalnej MADM przy ilościowym określaniu kontrolnych klonów MADM (białe paski), mikrocefalia Gene-X MADM (szare paski) i czarne paski makrocefalii Gene-X MADM). (C) Kwantyfikacja wielkości populacji większościowej. (D) Kwantyfikacja wielkości populacji mniejszościowej. (E) Kwantyfikacja jednostkowej wielkości asymetrycznych klonów neurogennych. Hipotetyczne wartości mogą reprezentować średnią ± SEM. S = Hipotetyczny scenariusz, w którym różnica w liczbie komórek subklonów może osiągnąć istotność w stosunku do kontroli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Badania klonów MADM w literaturze. Podsumowanie badań w literaturze zawierających eksperymenty z linią klonalną MADM, w tym zastosowany sterownik CreERT2, dawka TM i czas wstrzyknięcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę wykorzystania MADM do śledzenia linii komórkowej poszczególnych RGP in vivo w rozwijającej się korze nowej. W połączeniu z indukowanym TM CreERT2, zdarzenia MADM mogą być precyzyjnie mierzone w czasie, zapewniając wysoce jakościowy i ilościowy wizualny odczyt wzorców podziałów komórek macierzystych na poziomie pojedynczej komórki. Poprzez miareczkowanie dawki dostarczonej TM, w idealnej sytuacji można uzyskać średnio mniej niż jeden klon na półkulę korową, zapewniając odpowiednią separację przestrzenną w celu jednoznacznego rozróżnienia poszczególnych klonów. Zachowując integralność tkanki, metoda ta przechwytuje również istotne informacje dotyczące położenia, morfologii i bezwzględnej liczby komórek. Kasety MADM na Chr. 11 7,11,12,46,56,57, na Chr. 751 i oryginalne MADM na Rosa26 47,53,59 były używane w badaniach analizy klonalnej MADM. Wysoka rozdzielczość pojedynczych komórek zapewnia bezprecedensowy wgląd zarówno w morfologię, jak i pokrewieństwo klonalne komórek potomnych oraz umożliwia obrazowanie na żywo proliferujących komórek macierzystych i pojawiających się klonów46,52.

Cesarskie cięcie i opieka nad młodymi w celu analizy klonów w postnatalnych punktach czasowych jest koniecznym i krytycznym krokiem w protokole. W zależności od stanu zdrowia ciężarnej matki leczonej TM, wykonanie cesarskiego cięcia może nie być konieczne. Jednak wychowywanie szczeniąt z matką zastępczą jest nadal wymagane, ponieważ matka leczona TM może mieć problemy z laktacją. Nie zaobserwowano różnic w potrzebie wspierania z różnymi sterownikami CreERT2 . Zarówno linie MADM, jak i matki zastępcze są utrzymywane na tle niekrewniaczym CD-1. Jeżeli cesarskie cięcie nie jest konieczne, ciężarna matka poddana TM wykorzystana do uzyskania doświadczalnych młodych może być ponownie wykorzystana do dodatkowych hodowli doświadczalnych zgodnie z zasadami 3R (należy zauważyć, że można to zrobić tylko wtedy, gdy licencje doświadczalne na zwierzętach zatwierdzają tę praktykę). Matki zastępcze mogą być wykorzystywane do wychowywania szczeniąt w ciągu 2 dni po porodzie, ale wyższe wskaźniki sukcesu zaobserwowano, gdy matki zastępcze rodzą tego samego dnia, co myszy eksperymentalne, które muszą być przygarnięte. Dlatego ważne jest, aby ustalić krycie w określonym czasie dla matek zastępczych równolegle z kryciami eksperymentalnymi w kroku 1.1. Utrzymanie podobnej liczby miotu, jak w miocie pierwotnej matki zastępczej, może poprawić przeżywalność przybranych szczeniąt, dlatego może być konieczne usunięcie części z całego oryginalnego miotu. Dodatkowe kroki, które mogą poprawić wychowanie, obejmują pocieranie rękawiczek eksperymentatora ściółką i jedzeniem (w celu usunięcia zapachu rękawiczek); delikatne pocieranie szczeniąt po cesarskim cięciu fragmentami zabrudzonego miotu i gniazda matki zastępczej; oraz umieszczanie szczeniąt w bliskim kontakcie ze szczeniętami matki zastępczej przed umieszczeniem ich w klatce dla myszy zastępczych.

Podobnie jak w przypadku innych metod śledzenia pochodzenia opartych na reporterach, należy dokładnie rozważyć wybór optymalnego sterownika CreERT2 do eksperymentów klonalnych MADM. Po pierwsze, zastosowany promotor musi wyrażać rekombinazę zarówno czasowo, jak i przestrzennie w populacji progenitorowej będącej przedmiotem zainteresowania. Znalezienie tego promotora może być trudne, ponieważ niektóre promotory mogą zmieniać wzorce ekspresji lub uciszać się na różnych etapach rozwoju. Aby poprawić specyficzność typu komórki, zastosowano wiele rekombinaz specyficznych dla lokalizacji, z których każda jest napędzana przez oddzielne promotory. Kiedy jedna lub obie rekombinazy ulegają ekspresji w tej samej komórce, oznacza to komórkę i jej potomstwo fluorescencyjnym reporterem 74,75,76,77. Podsumowując, ważne jest, aby wybrać sterownik CreERT2, który jest specyficzny dla populacji analizowanych komórek progenitorowych.

Najważniejszym krokiem w tej metodzie jest identyfikacja klonu, ponieważ wszystkie komórki muszą jednoznacznie pochodzić z pojedynczego zdarzenia rekombinacji (krok 8.1). Miareczkowanie stężenia TM zapewnia mniej niż jedno skupisko czerwonych/zielonych komórek na półkulę mózgu i maksymalizuje prawdopodobieństwo analizy pojedynczego klonu (krok 2.2)7,11. Klony należy odrzucić, jeśli sąsiednie skupiska komórek występują w promieniu 500 μm od klonu będącego przedmiotem zainteresowania. Dlatego ważne jest, aby zbadać kilka sekcji przed i po pojawieniu się klonu, aby upewnić się, że w pobliżu nie ma żadnych dodatkowych zdarzeń rekombinacji. Ze względu na słabszy sygnał fluoroforów konieczne jest wykonanie immunohistochemii eGFP i tdT u klonów embrionalnych (patrz punkt 6). Jest to zalecane u dorosłych klonów tylko wtedy, gdy dodatkowe antygeny będą koznakowane. Podczas obrazowania klonów ważne jest, aby uchwycić całą szerokość kory mózgowej, w której znajduje się klon (tj. od powierzchni kości do ciała modzelowatego; patrz krok 8.4), aby nie pominąć żadnej komórki. Ułatwia to również wyrównanie obrazu podczas przetwarzania obrazu (rozdział 9). Sekcja 8 protokołu wymaga odwróconego mikroskopu konfokalnego, ale można go dostosować w zależności od dostępnej konfiguracji mikroskopu. Można zastosować mikroskopię epifluorescencyjną, ale zalecana jest mikroskopia konfokalna, ponieważ prowadzi to do zmniejszenia zanieczyszczenia światłem spoza płaszczyzny ostrości. Ważne jest również, aby intensywność i wzmocnienie lasera były dostosowane tak, aby można było jednoznacznie zidentyfikować krwinki zielone, czerwone i żółte. Niezależnie od konfiguracji, zaleca się użycie obiektywu o powiększeniu co najmniej 20x, aby zapewnić pełną separację przestrzenną blisko rozmieszczonych komórek. Oprócz rejestrowania głębokości kory mózgowej wszystkich komórek (krok 8.6), obszary kory mózgowej, w których znajdują się klony, muszą być zidentyfikowane za pomocą atlasu mózgu, takiego jak atlas mózgu Allena lub inne stereotaktyczne mapy współrzędnych. Należy również przyjąć paradygmat nazewnictwa plików, aby upewnić się, że sklonowane obrazy są łatwe do zidentyfikowania. W nazewnictwie pliku można zawrzeć następujące informacje: unikalny identyfikator obrazu, datę wykonania zdjęcia, genotyp zwierzęcia, wiek indukcji, wiek analizy, numer obrazu w stosunku do pozostałych obrazów z tego samego klonu.

Wprowadzenie mutacji dystalnej do jednej kasety MADM wyraźnie pozwala na generowanie mozaik genetycznych71 i pozwala na rozbiór molekularnych regulatorów różnorodności linii i typów komórek na poziomie klonalnym 7,11,46,62. Aby wygenerować mozaikę genetyczną za pomocą MADM, kasety MADM muszą być meiotycznie połączone z tym samym chromosomem, co gen będący przedmiotem zainteresowania (patrz rysunek 2 dla schematu hodowlanego). Ogranicza to obecną analizę klonalną za pomocą MADM do genów zlokalizowanych na Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251 i Chr. 6 dystalnie do locus Rosa26 47. Przyszłe badania będą wykorzystywać kasety MADM ukierunkowane na dowolny chromosom, co pozwoli na analizę mozaikową praktycznie wszystkich genów genomu myszy na poziomie klonalnym.

Wreszcie, MADM nie ogranicza się do analizy komórek progenitorowych w rozwijającej się korze nowej. Badanie wielu nisz komórek macierzystych może skorzystać z możliwości rozróżnienia czasoprzestrzennych układów komórek spokrewnionych klonalnie. Stosując MADM do innych obszarów mózgu, stanów chorobowych (np. raka) lub w innych tkankach 47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59, badania ujawniły pokrewieństwo linii w klonach pochodzących z różnych klas komórek progenitorowych i macierzystych (patrz Tabela 1 zawiera aktualny wykaz badań klonalnych MADM). Innym interesującym przyszłym zastosowaniem MADM jest połączenie go z dodatkowymi funkcjonalnymi lub subkomórkowymi reporterami, co zwiększyłoby stopień informacji, które można uzyskać od klonów.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Hippenmeyer za dyskusję, Ośrodku Bioobrazowania, Ośrodku Nauk Przyrodniczych i Ośrodku Przedklinicznym IST Austria za wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez fundusze instytucjonalne IST Austria; R.B. otrzymał wsparcie z programu Lise-Meitner z Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF) (M 2416); N.A. otrzymała wsparcie z Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC otrzymała wsparcie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy grantowej nr 754411 w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie" jako stypendysta podoktorski ISTplus; A.H. otrzymał wsparcie od ÖAW DOC (Doctoral Fellowship Austriackiej Akademii Nauk). Badanie to było również wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa o udzielenie dotacji nr 725780 LinPro) dla S.H.

Materials

Przeciwciała pierwszorzędowe: <

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Strzykawka tuberkulinowa 1 ml (Omnifix Luer Lock)Braun9204512N
1,4-diazabicykloktan (DABCO)Roth0718.2
Strzykawka 10 ml (Omnifix Luer Lock)Braun8508429N
Wirówka stożkowa 15 mlSarstedt65.554.502
24 naczynia wielodołkoweRoth/Greiner Bio-oneCE56.1
Igła 3/4 o rozmiarze 27 (Sterican)Braun16010256E
Olej kukurydzianySigmaC8267-500ML
Szkiełka nakrywkowe (24 x 60 mm #1)Thermo Fisher Scientific (Menzel)15747592
Cryostat Cryostar NX70Thermo Fisher Scientific957000H
Dako Pen (Marker woskowy)AgilentS200230-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek)InvitrogenD1306
Jednorazowe ostrze do mikrotomów (MX35 Ultra)Thermo Fisher Scientific705830
Cienkie kleszcze (Dumont #5)Fine Science Tools (FST)11254-20
Szklana płyta anty-roll-rollHistocomM 449980
GlycerolSigmaG5516
LSM 800 ConfocalZeiss
25 mg/ml DAPCO, 6 g glicerol, 2,4 g Mowiol 4-88, 6 ml dH2O, 12 mL 0,2 M Tris-HCl (pH 8,5)
Pompa perystaltyczna 323E/D 400RPMWatson-Marlow036.3124.00A
SacharozaSigma S8501-5KG
Szkiełka Superfrost plusThermo Fisher ScientificJ1800AMNT
TamoxifenSigmaT5648
Forma do zatapiania tkanek T-12 (kwadrat 22 mm)Polysciences Inc.18986-1
Tissue-Tek OCTSakura4583
Triton X-100SigmaT8787-250ML
Chlorowodorek TrizmaSigma93363
Tween-20SigmaP9416-100ML
strong>Oprogramowanie i wtyczki:
Fiji1.52pFidżi
MultiStackReg1.45Link do pobrania
TurboRegEPFL Bioimaging
Zen Blue2.6Zeiss
Modele eksperymentalne: Organizmy/Szczepy:
Mouse: Emx1-CreERThe Jackson LaboratoryJAX:027784
Mysz: MADM-11-GTThe Jackson LaboratoryJAX:013749
Mysz: MADM-11-TGThe Jackson LaboratoryJAX:013751
/strong>
Chicken anty-GFP 1:500Aves LabsGFP-1020
Goat anty-tdPomidor 1:500PrzeciwciałaSicgenAB8181-200
Królik anty-RFP 1:500MBLPM005
Przeciwciała wtórne:< / silny>
osioł Anty-kurczak Alexa Fluor 488 1:500Jackson Immuno Research715-475-150
Osioł Anti-Goat Cy3 1:500Jackson Immuno Research705-165-147
Osioł Anty-Królik Cy3 1:500Badania immunologiczne Jacksona711-165-152
Pożywka montażowa Mowiol 4-88 Roth 0713.2 Normalna surowica osła Innowacyjne badania IGDNSER100ML Paraformaldehyd Sigma 441244-1KG <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neuronal or glial progeny: regional differences in radial glia fate. Neuron. 37 (5), 751-764 (2003).">Malatesta, P., et al. Neuronal or glial progeny: regional differences in radial glia fate. Neuron. 37 (5), 751-764 (2003).
  2. Asymmetric inheritance of radial glial fibers by cortical neurons. Neuron. 31 (5), 727-741 (2001).">Miyata, T., Kawaguchi, A., Okano, H., Ogawa, M. Asymmetric inheritance of radial glial fibers by cortical neurons. Neuron. 31 (5), 727-741 (2001).
  3. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).">Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  4. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 465-502 (2014).">Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 465-502 (2014).
  5. Malformations of cortical development. Annals of Neurology. 80 (6), 797-810 (2016).">Desikan, R. S., Barkovich, A. J. Malformations of cortical development. Annals of Neurology. 80 (6), 797-810 (2016).
  6. Common mechanisms of excitatory and inhibitory imbalance in schizophrenia and autism spectrum disorders. Current Molecular Medicine. 15 (2), 146-167 (2015).">Gao, R., Penzes, P. Common mechanisms of excitatory and inhibitory imbalance in schizophrenia and autism spectrum disorders. Current Molecular Medicine. 15 (2), 146-167 (2015).
  7. Mosaic Analysis with Double Markers Reveals Distinct Sequential Functions of Lgl1 in Neural Stem Cells. Neuron. 94 (3), 517-533 (2017).">Beattie, R., et al. Mosaic Analysis with Double Markers Reveals Distinct Sequential Functions of Lgl1 in Neural Stem Cells. Neuron. 94 (3), 517-533 (2017).
  8. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 800, 1-24 (2014).">Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 800, 1-24 (2014).
  9. Generating neuronal diversity in the mammalian cerebral cortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 699-720 (2015).">Lodato, S., Arlotta, P. Generating neuronal diversity in the mammalian cerebral cortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 699-720 (2015).
  10. Cell Polarity in Cerebral Cortex Development-Cellular Architecture Shaped by Biochemical Networks. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 176(2017).">Hansen, A. H., Duellberg, C., Mieck, C., Loose, M., Hippenmeyer, S. Cell Polarity in Cerebral Cortex Development-Cellular Architecture Shaped by Biochemical Networks. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 176(2017).
  11. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).">Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  12. A stochastic framework of neurogenesis underlies the assembly of neocortical cytoarchitecture. eLife. 8, e51381(2019).">Llorca, A., et al. A stochastic framework of neurogenesis underlies the assembly of neocortical cytoarchitecture. eLife. 8, e51381(2019).
  13. Neural lineage tracing in the mammalian brain. Current Opinion in Neurobiology. 50, 7-16 (2018).">Ma, J., Shen, Z., Yu, Y. C., Shi, S. H. Neural lineage tracing in the mammalian brain. Current Opinion in Neurobiology. 50, 7-16 (2018).
  14. Numbers, time and neocortical neuronogenesis: a general developmental and evolutionary model. Trends in Neurosciences. 18 (9), 379-383 (1995).">Caviness, V., Takahashi, T., Nowakowski, R. Numbers, time and neocortical neuronogenesis: a general developmental and evolutionary model. Trends in Neurosciences. 18 (9), 379-383 (1995).
  15. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anatomy and Embryology. 156 (2), 115-152 (1979).">Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anatomy and Embryology. 156 (2), 115-152 (1979).
  16. Competing waves of oligodendrocytes in the forebrain and postnatal elimination of an embryonic lineage. Nature Neuroscience. 9 (2), 173-179 (2006).">Kessaris, N., et al. Competing waves of oligodendrocytes in the forebrain and postnatal elimination of an embryonic lineage. Nature Neuroscience. 9 (2), 173-179 (2006).
  17. Coincident generation of pyramidal neurons and protoplasmic astrocytes in neocortical columns. The Journal of Neuroscience. 32 (14), 4762-4772 (2012).">Magavi, S., Friedmann, D., Banks, G., Stolfi, A., Lois, C. Coincident generation of pyramidal neurons and protoplasmic astrocytes in neocortical columns. The Journal of Neuroscience. 32 (14), 4762-4772 (2012).
  18. Radial glia serve as neuronal progenitors in all regions of the central nervous system. Neuron. 41 (6), 881-890 (2004).">Anthony, T. E., Klein, C., Fishell, G., Heintz, N. Radial glia serve as neuronal progenitors in all regions of the central nervous system. Neuron. 41 (6), 881-890 (2004).
  19. Development of glial cells in the cerebral wall of ferrets: direct tracing of their transformation from radial glia into astrocytes. The Journal of Comparative Neurology. 289 (1), 74-88 (1989).">Voigt, T. Development of glial cells in the cerebral wall of ferrets: direct tracing of their transformation from radial glia into astrocytes. The Journal of Comparative Neurology. 289 (1), 74-88 (1989).
  20. Epigenetic cues modulating the generation of cell-type diversity in the cerebral cortex. Journal of Neurochemistry. 149 (1), 12-26 (2019).">Amberg, N., Laukoter, S., Hippenmeyer, S. Epigenetic cues modulating the generation of cell-type diversity in the cerebral cortex. Journal of Neurochemistry. 149 (1), 12-26 (2019).
  21. Mechanisms of Radial Glia Progenitor Cell Lineage Progression. FEBS letters. 591 (24), 3993-4008 (2017).">Beattie, R., Hippenmeyer, S. Mechanisms of Radial Glia Progenitor Cell Lineage Progression. FEBS letters. 591 (24), 3993-4008 (2017).
  22. Temporal patterning of apical progenitors and their daughter neurons in the developing neocortex. Science. 364 (6440), eaav2522(2019).">Telley, L., et al. Temporal patterning of apical progenitors and their daughter neurons in the developing neocortex. Science. 364 (6440), eaav2522(2019).
  23. Temporal plasticity of apical progenitors in the developing mouse neocortex. Nature. 573 (7774), 370-374 (2019).">Oberst, P., et al. Temporal plasticity of apical progenitors in the developing mouse neocortex. Nature. 573 (7774), 370-374 (2019).
  24. Sequential transcriptional waves direct the differentiation of newborn neurons in the mouse neocortex. Science. 351 (6280), 1443(2016).">Telley, L., et al. Sequential transcriptional waves direct the differentiation of newborn neurons in the mouse neocortex. Science. 351 (6280), 1443(2016).
  25. Cell lineages of the embryo of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (1), 376-380 (1978).">Deppe, U., et al. Cell lineages of the embryo of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (1), 376-380 (1978).
  26. Building a lineage from single cells: genetic techniques for cell lineage tracking. Nature Reviews Genetics. 18 (4), 230-244 (2017).">Woodworth, M. B., Girskis, K. M., Walsh, C. A. Building a lineage from single cells: genetic techniques for cell lineage tracking. Nature Reviews Genetics. 18 (4), 230-244 (2017).
  27. DNA barcodes evolve for high-resolution cell lineage tracing. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 63-71 (2019).">Masuyama, N., Mori, H., Yachie, N. DNA barcodes evolve for high-resolution cell lineage tracing. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 63-71 (2019).
  28. Chapter Ten-Genetic Fate Mapping Using Site-Specific Recombinases. Methods in Enzymology. 477, 153-181 (2010).">Legue, E., Joyner, A. L. Chapter Ten-Genetic Fate Mapping Using Site-Specific Recombinases. Methods in Enzymology. 477, 153-181 (2010).
  29. Monitoring neurogenesis in the cerebral cortex: an update. Future Neurology. 9 (3), 323-340 (2014).">Postiglione, M. P., Hippenmeyer, S. Monitoring neurogenesis in the cerebral cortex: an update. Future Neurology. 9 (3), 323-340 (2014).
  30. High-throughput dense reconstruction of cell lineages. Open Biology. 9 (12), 190229(2019).">Espinosa-Medina, I., Garcia-Marques, J., Cepko, C., Lee, T. High-throughput dense reconstruction of cell lineages. Open Biology. 9 (12), 190229(2019).
  31. Lineage tracing using a Cas9-deaminase barcoding system targeting endogenous L1 elements. Nature Communications. 10 (1), 1234(2019).">Hwang, B., et al. Lineage tracing using a Cas9-deaminase barcoding system targeting endogenous L1 elements. Nature Communications. 10 (1), 1234(2019).
  32. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804(2018).">Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804(2018).
  33. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. 141 (7), 1589-1598 (2014).">García-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnár, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. 141 (7), 1589-1598 (2014).
  34. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).">Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  35. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).">Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  36. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).">Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  37. A method for lineage tracing of corneal cells using multi-color fluorescent reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370(2015).">Amitai-Lange, A., et al. A method for lineage tracing of corneal cells using multi-color fluorescent reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370(2015).
  38. Cortical and Clonal Contribution of Tbr2 Expressing Progenitors in the Developing Mouse Brain. Cerebral Cortex. 25 (10), 3290-3302 (2015).">Vasistha, N. A., et al. Cortical and Clonal Contribution of Tbr2 Expressing Progenitors in the Developing Mouse Brain. Cerebral Cortex. 25 (10), 3290-3302 (2015).
  39. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).">Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  40. Fate mapping by piggyBac transposase reveals that neocortical GLAST+ progenitors generate more astrocytes than Nestin+ progenitors in rat neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).">Siddiqi, F., et al. Fate mapping by piggyBac transposase reveals that neocortical GLAST+ progenitors generate more astrocytes than Nestin+ progenitors in rat neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
  41. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-512 (2010).">Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  42. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).">García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
  43. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).">Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).
  44. Rapid Generation of Somatic Mouse Mosaics with Locus-Specific, Stably Integrated Transgenic Elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).">Kim, G. B., et al. Rapid Generation of Somatic Mouse Mosaics with Locus-Specific, Stably Integrated Transgenic Elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
  45. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658(2018).">Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658(2018).
  46. Genetic Mosaic Dissection of Lis1 and Ndel1 in Neuronal Migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).">Hippenmeyer, S., et al. Genetic Mosaic Dissection of Lis1 and Ndel1 in Neuronal Migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  47. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).">Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  48. Histologie du système nerveux de l'homme et des vertébrés. , Maloine. Paris, France. (1911).">Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'homme et des vertébrés. , Maloine. Paris, France. (1911).
  49. The emergence of modern neuroanatomy and developmental neurobiology. Neuron. 20 (3), 413-426 (1998).">Cowan, W. M. The emergence of modern neuroanatomy and developmental neurobiology. Neuron. 20 (3), 413-426 (1998).
  50. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8850-8855 (2014).">Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  51. Mosaic analysis with double markers reveals cell-type-specific paternal growth dominance. Cell Reports. 3 (3), 960-967 (2013).">Hippenmeyer, S., Johnson, R. L., Luo, L. Mosaic analysis with double markers reveals cell-type-specific paternal growth dominance. Cell Reports. 3 (3), 960-967 (2013).
  52. Ret and Etv4 promote directed movements of progenitor cells during renal branching morphogenesis. PLoS Biology. 14 (2), e1002382(2016).">Riccio, P., Cebrian, C., Zong, H., Hippenmeyer, S., Costantini, F. Ret and Etv4 promote directed movements of progenitor cells during renal branching morphogenesis. PLoS Biology. 14 (2), e1002382(2016).
  53. In vivo clonal analysis reveals self-renewing and multipotent adult neural stem cell characteristics. Cell. 145 (7), 1142-1155 (2011).">Bonaguidi, M. A., et al. In vivo clonal analysis reveals self-renewing and multipotent adult neural stem cell characteristics. Cell. 145 (7), 1142-1155 (2011).
  54. Clonally Related Forebrain Interneurons Disperse Broadly across Both Functional Areas and Structural Boundaries. Neuron. 87 (5), 989-998 (2015).">Mayer, C., et al. Clonally Related Forebrain Interneurons Disperse Broadly across Both Functional Areas and Structural Boundaries. Neuron. 87 (5), 989-998 (2015).
  55. Clonal dynamics following p53 loss of heterozygosity in Kras-driven cancers. Nature Communications. 7, 12685(2016).">Muzumdar, M. D., et al. Clonal dynamics following p53 loss of heterozygosity in Kras-driven cancers. Nature Communications. 7, 12685(2016).
  56. Ontogenetic establishment of order-specific nuclear organization in the mammalian thalamus. Nature Neuroscience. 20, 516(2017).">Shi, W., et al. Ontogenetic establishment of order-specific nuclear organization in the mammalian thalamus. Nature Neuroscience. 20, 516(2017).
  57. In vivo clonal analysis reveals spatiotemporal regulation of thalamic nucleogenesis. PLoS Biology. 16 (4), e2005211(2018).">Wong, S. Z. H., et al. In vivo clonal analysis reveals spatiotemporal regulation of thalamic nucleogenesis. PLoS Biology. 16 (4), e2005211(2018).
  58. Distinct Lineage-Dependent Structural and Functional Organization of the Hippocampus. Cell. 157 (7), 1552-1564 (2014).">Xu, H. T., et al. Distinct Lineage-Dependent Structural and Functional Organization of the Hippocampus. Cell. 157 (7), 1552-1564 (2014).
  59. All β Cells Contribute Equally to Islet Growth and Maintenance. PLoS Biology. 5 (7), e163(2007).">Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All β Cells Contribute Equally to Islet Growth and Maintenance. PLoS Biology. 5 (7), e163(2007).
  60. Adult neural stem cells and multiciliated ependymal cells share a common lineage regulated by the geminin family members. Neuron. 102 (1), 159-172 (2019).">Ortiz-Alvarez, G., et al. Adult neural stem cells and multiciliated ependymal cells share a common lineage regulated by the geminin family members. Neuron. 102 (1), 159-172 (2019).
  61. Neocortical Sox9+ radial glia generate glutamatergic neurons for all layers, but lack discernible evidence of early laminar fate restriction. Neural Development. 12 (1), 14(2017).">Kaplan, E. S., Ramos-Laguna, K. A., Mihalas, A. B., Daza, R. A. M., Hevner, R. F. Neocortical Sox9+ radial glia generate glutamatergic neurons for all layers, but lack discernible evidence of early laminar fate restriction. Neural Development. 12 (1), 14(2017).
  62. TBR2 coordinates neurogenesis expansion and precise microcircuit organization via Protocadherin 19 in the mammalian cortex. Nature Communications. 10 (1), 3946(2019).">Lv, X., et al. TBR2 coordinates neurogenesis expansion and precise microcircuit organization via Protocadherin 19 in the mammalian cortex. Nature Communications. 10 (1), 3946(2019).
  63. Clonal analysis reveals laminar fate multipotency and daughter cell apoptosis of mouse cortical intermediate progenitors. Development. 145 (17), dev164335(2018).">Mihalas, A. B., Hevner, R. F. Clonal analysis reveals laminar fate multipotency and daughter cell apoptosis of mouse cortical intermediate progenitors. Development. 145 (17), dev164335(2018).
  64. A mathematical insight into cell labelling experiments for clonal analysis. Journal of Anatomy. 235 (3), 687-696 (2019).">Picco, N., et al. A mathematical insight into cell labelling experiments for clonal analysis. Journal of Anatomy. 235 (3), 687-696 (2019).
  65. Sp2 regulates late neurogenic but not early expansive divisions of neural stem cells underlying population growth in the mouse cortex. Development. , (2020).">Johnson, C. A., Ghashghaei, H. T. Sp2 regulates late neurogenic but not early expansive divisions of neural stem cells underlying population growth in the mouse cortex. Development. , (2020).
  66. Timing Neurogenesis and Differentiation: Insights from Quantitative Clonal Analyses of Cerebellar Granule Cells. The Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301(2008).">Espinosa, J. S., Luo, L. Timing Neurogenesis and Differentiation: Insights from Quantitative Clonal Analyses of Cerebellar Granule Cells. The Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301(2008).
  67. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).">Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  68. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  69. Tamoxifen-independent recombination in the RIP-CreER mouse. PLoS One. 5 (10), e13533(2010).">Liu, Y., et al. Tamoxifen-independent recombination in the RIP-CreER mouse. PLoS One. 5 (10), e13533(2010).
  70. Do progenitors play dice? eLife. 9, e54042(2020).">Klingler, E., Jabaudon, D. Do progenitors play dice? eLife. 9, e54042(2020).
  71. Dissection of gene function at clonal level using mosaic analysis with double markers. Frontiers in Biology. 8 (6), 557-568 (2013).">Hippenmeyer, S. Dissection of gene function at clonal level using mosaic analysis with double markers. Frontiers in Biology. 8 (6), 557-568 (2013).
  72. Tracing cellular dynamics in tissue development, maintenance and disease. Current Opinion in Cell Biology. 43, 38-45 (2016).">Rulands, S., Simons, B. D. Tracing cellular dynamics in tissue development, maintenance and disease. Current Opinion in Cell Biology. 43, 38-45 (2016).
  73. Imprinted Cdkn1c genomic locus cell-autonomously promotes cell survival in cerebral cortex development. Nature Communications. 11 (1), 195(2020).">Laukoter, S., et al. Imprinted Cdkn1c genomic locus cell-autonomously promotes cell survival in cerebral cortex development. Nature Communications. 11 (1), 195(2020).
  74. A Suite of Transgenic Driver and Reporter Mouse Lines with Enhanced Brain-Cell-Type Targeting and Functionality. Cell. 174 (2), 465-480 (2018).">Daigle, T. L., et al. A Suite of Transgenic Driver and Reporter Mouse Lines with Enhanced Brain-Cell-Type Targeting and Functionality. Cell. 174 (2), 465-480 (2018).
  75. Strategies and Tools for Combinatorial Targeting of GABAergic Neurons in Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 91 (6), 1228-1243 (2016).">He, M., et al. Strategies and Tools for Combinatorial Targeting of GABAergic Neurons in Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 91 (6), 1228-1243 (2016).
  76. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).">Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  77. Expanding the power of recombinase-based labeling to uncover cellular diversity. Development. 142 (24), 4385(2015).">Plummer, N. W., et al. Expanding the power of recombinase-based labeling to uncover cellular diversity. Development. 142 (24), 4385(2015).
  78. Temporal regulation of Cre recombinase activity in neural stem cells. Genesis. 44 (5), 233-238 (2006).">Imayoshi, I., Ohtsuka, T., Metzger, D., Chambon, P., Kageyama, R. Temporal regulation of Cre recombinase activity in neural stem cells. Genesis. 44 (5), 233-238 (2006).
  79. Complete loss of Ndel1 results in neuronal migration defects and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7812-7827 (2005).">Sasaki, S., et al. Complete loss of Ndel1 results in neuronal migration defects and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7812-7827 (2005).
  80. Epilepsy and brain abnormalities in mice lacking the Otx1 gene. Nature Genetics. 14 (2), 218-222 (1996).">Acampora, D., et al. Epilepsy and brain abnormalities in mice lacking the Otx1 gene. Nature Genetics. 14 (2), 218-222 (1996).
  81. Sox9-expressing precursors are the cellular origin of the cruciate ligament of the knee joint and the limb tendons. Genesis. 48 (11), 635-644 (2010).">Soeda, T., et al. Sox9-expressing precursors are the cellular origin of the cruciate ligament of the knee joint and the limb tendons. Genesis. 48 (11), 635-644 (2010).
  82. Loss of cell polarity causes severe brain dysplasia in Lgl1 knockout mice. Genes & Development. 18 (5), 559-571 (2004).">Klezovitch, O., Fernandez, T. E., Tapscott, S. J., Vasioukhin, V. Loss of cell polarity causes severe brain dysplasia in Lgl1 knockout mice. Genes & Development. 18 (5), 559-571 (2004).
  83. Generation and characterization of a tamoxifen-inducible EomesCreER mouse line. Genesis. 51 (10), 725-733 (2013).">Pimeisl, I. M., et al. Generation and characterization of a tamoxifen-inducible EomesCreER mouse line. Genesis. 51 (10), 725-733 (2013).
  84. Memo1-Mediated Tiling of Radial Glial Cells Facilitates Cerebral Cortical Development. Neuron. 103 (5), 836-852 (2019).">Nakagawa, N., et al. Memo1-Mediated Tiling of Radial Glial Cells Facilitates Cerebral Cortical Development. Neuron. 103 (5), 836-852 (2019).
  85. The T-box transcription factor Eomesodermin is essential for AVE induction in the mouse embryo. Genes & Development. 27 (9), 997-1002 (2013).">Nowotschin, S., et al. The T-box transcription factor Eomesodermin is essential for AVE induction in the mouse embryo. Genes & Development. 27 (9), 997-1002 (2013).
  86. Mosaic removal of hedgehog signaling in the adult SVZ reveals that the residual wild-type stem cells have a limited capacity for self-renewal. Journal of Neuroscience. 27 (52), 14248-14259 (2007).">Balordi, F., Fishell, G. Mosaic removal of hedgehog signaling in the adult SVZ reveals that the residual wild-type stem cells have a limited capacity for self-renewal. Journal of Neuroscience. 27 (52), 14248-14259 (2007).
  87. Neural development is dependent on the function of specificity protein 2 in cell cycle progression. Development. 140 (3), 552-561 (2013).">Liang, H., et al. Neural development is dependent on the function of specificity protein 2 in cell cycle progression. Development. 140 (3), 552-561 (2013).
  88. A Cre recombinase transgene with mosaic, widespread tamoxifen-inducible action. Genesis. 32 (1), 8-18 (2002).">Guo, C., Yang, W., Lobe, C. G. A Cre recombinase transgene with mosaic, widespread tamoxifen-inducible action. Genesis. 32 (1), 8-18 (2002).
  89. In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog. Nature. 437 (7060), 894-897 (2005).">Ahn, S., Joyner, A. L. In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog. Nature. 437 (7060), 894-897 (2005).
  90. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136 (2), 295-305 (2009).">Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136 (2), 295-305 (2009).
  91. Auditory neurons make stereotyped wiring decisions before maturation of their targets. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14078-14088 (2007).">Koundakjian, E. J., Appler, J. L., Goodrich, L. V. Auditory neurons make stereotyped wiring decisions before maturation of their targets. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14078-14088 (2007).
  92. Adult pancreatic β-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).">Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic β-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  93. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circulation Research. 89 (1), 20-25 (2001).">Sohal, D. S., et al. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circulation Research. 89 (1), 20-25 (2001).
  94. Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature. 445 (7128), 661-665 (2007).">Ventura, A., et al. Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature. 445 (7128), 661-665 (2007).
  95. Somatic activation of the K-ras oncogene causes early onset lung cancer in mice. Nature. 410 (6832), 1111-1116 (2001).">Johnson, L., et al. Somatic activation of the K-ras oncogene causes early onset lung cancer in mice. Nature. 410 (6832), 1111-1116 (2001).
  96. Extensions of MADM (mosaic analysis with double markers) in mice. PLoS One. 7 (3), e33332(2012).">Tasic, B., et al. Extensions of MADM (mosaic analysis with double markers) in mice. PLoS One. 7 (3), e33332(2012).
  97. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129 (22), 5301-5312 (2002).">Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129 (22), 5301-5312 (2002).
  98. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).">Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
  99. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret. Nature. 367 (6461), 380-383 (1994).">Schuchardt, A., D'Agati, V., Larsson-Blomberg, L., Costantini, F., Pachnis, V. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret. Nature. 367 (6461), 380-383 (1994).
  100. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 877-892 (2002).">Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 877-892 (2002).
  101. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. eLife. 4, e10036(2015).">Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. eLife. 4, e10036(2015).
  102. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454 (7200), 104-108 (2008).">Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454 (7200), 104-108 (2008).
  103. Lineage-dependent spatial and functional organization of the mammalian enteric nervous system. Science. 356 (6339), 722-726 (2017).">Lasrado, R., et al. Lineage-dependent spatial and functional organization of the mammalian enteric nervous system. Science. 356 (6339), 722-726 (2017).
  104. Neural crest origins of the neck and shoulder. Nature. 436 (7049), 347-355 (2005).">Matsuoka, T., et al. Neural crest origins of the neck and shoulder. Nature. 436 (7049), 347-355 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mosaic Analysis Double MarkersMADM Clonal AnalysisCerebral Cortex DevelopmentNeural Stem Cell LineageSingle Cell ResolutionTamoxifen Inducible CreERInterchromosomal Recombination G2XProgenitor Cell Division PatternsIn Vivo Lineage TracingMurine Stem Cell Niche

Related Articles