Artykuł metodologiczny

System gnotobiotyczny do badania składania mikrobiomu w filosferze i fermentacji warzywnej

DOI:

10.3791/61149

⸱

3 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Tufts University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano metodę uprawy kapusty pekińskiej wolnej od zarazków, która umożliwia badaczom ocenę, jak pojedyncze gatunki mikroorganizmów lub wielogatunkowe społeczności mikroorganizmów oddziałują na powierzchnię liści kapusty. Przedstawiono również sterylny ekstrakt roślinny, który można wykorzystać do pomiaru zmian w składzie zbiorowiska podczas fermentacji warzyw.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Filosfera, nadziemna część rośliny, która może być skolonizowana przez mikroby, jest użytecznym systemem modelowym do identyfikacji procesów tworzenia się społeczności mikroorganizmów. Protokół ten przedstawia system badania dynamiki zbiorowisk drobnoustrojów w fyllosferze roślin kapusty pekińskiej. Opisuje, jak uprawiać rośliny wolne od zarazków w probówkach z kalcynowaną gliną i podłożem z bulionu odżywczego. Inokulacja roślin wolnych od zarazków określonymi kulturami mikrobiologicznymi daje możliwość pomiaru wzrostu drobnoustrojów i dynamiki zbiorowisk w filosferze. Dzięki zastosowaniu sterylnego ekstraktu roślinnego wytwarzanego z kapusty można również ocenić zmiany w zbiorowiskach drobnoustrojów, które zachodzą podczas fermentacji. System ten jest stosunkowo prosty i niedrogi do skonfigurowania w laboratorium i może być używany do rozwiązywania kluczowych problemów ekologicznych w tworzeniu społeczności mikrobiologicznych. Daje również możliwość zrozumienia, w jaki sposób skład zbiorowiska filosfery może wpływać na różnorodność mikrobiologiczną i jakość fermentacji warzyw. To podejście do rozwoju gnotobiotycznych zbiorowisk filosfery kapusty może być zastosowane do innych dzikich i rolniczych gatunków roślin.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnorodność mikrobiologiczna fyllosfery odgrywa ważną rolę w utrzymaniu zdrowia roślin i może również wpływać na zdolność roślin do wytrzymywania stresu środowiskowego1,2,3,4,5. Z kolei zdrowotność upraw ma bezpośredni wpływ na bezpieczeństwo i jakość żywności6,7. Rośliny odgrywają rolę w funkcjonowaniu ekosystemu, a związane z nimi mikrobiomy wpływają zarówno na zdolność roślin do wykonywania tych czynności, jak i bezpośrednio wpływają na samo środowisko8. Podczas gdy naukowcy zaczęli rozszyfrowywać funkcję i skład filosfery, procesy ekologiczne, które wpływają na gromadzenie się społeczności mikroorganizmów w filosferze, nie są w pełni zrozumiałe9,10. Mikrobiom filosfery jest doskonałym systemem eksperymentalnym do badania ekologii mikrobiomów11. Społeczności te są stosunkowo proste, a wielu członków społeczności można rozwijać na standardowych nośnikach laboratoryjnych10,12,13.

Fermentowane warzywa to system, w którym struktura społeczności filosfery ma ważne konsekwencje. Zarówno w kiszonej kapuście, jak i kimchi, drobnoustroje, które naturalnie występują na liściach warzyw (fyllosfera gatunków Brassica) służą jako inokulum do fermentacji14,15. Bakterie kwasu mlekowego (LAB) są uważane za wszechobecnych członków mikrobiomów roślinnych, jednak mogą występować w niskiej liczebności w filosferze16. Silna selekcja abiotyczna podczas fermentacji powoduje zmianę składu społeczności mikrobiologicznej, umożliwiając wzrost liczebności bakterii kwasu mlekowego. W miarę wzrostu LAB wytwarzają kwas mlekowy, który tworzy kwaśne środowisko fermentowanych produktów roślinnych17. Związek między filosferą a fermentem daje możliwość wykorzystania warzyw jako modelu do zrozumienia, jak zbudowane są mikrobiomy.

Opracowaliśmy metody uprawy wolnej od zarazków kapusty pekińskiej i zaszczepienia jej specyficznymi zbiorowiskami mikroorganizmów za pomocą butelek z rozpylaczem. Jest to niedroga i niezawodna metoda równomiernego zaszczepiania kapusty pojedynczymi drobnoustrojami lub mieszanymi zbiorowiskami. Opracowano również sterylny ekstrakt roślinny (SVE) z trzech różnych rodzajów/odmian kapusty: czerwonej i zielonej kapusty (Brassica oleracea) oraz kapusty pekińskiej (B. rapa). Dodanie soli do tych SVE odwzorowuje środowisko fermentacji i pozwala na przeprowadzenie na małą skalę i stosunkowo wysokoprzepustowych badań eksperymentalnych nad tworzeniem mikrobiomu fermentacyjnego. Metody te można wykorzystać do badania gromadzenia się zbiorowisk drobnoustrojów w filosferze oraz tego, w jaki sposób dynamika społeczności drobnoustrojów w filosferze może być powiązana z sukcesem fermentacji warzywnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uprawa kapusty wolnej od zarazków

  1. Przygotowanie sprzętu do uprawy kapusty wolnej od zarazków
    1. Czyszczenie kalcynowanej gliny w celu usunięcia drobnych cząstek pyłu
      1. Glinę kalcynowaną (Tabela Materiałów) spłucz co najmniej 3x wodą z kranu; odcedź wodę.
        UWAGA: Glinka kalcynowana wytwarza bardzo drobny pył i zaleca się noszenie maski ochronnej (Tabela materiałów) podczas prania.
      2. Rozprowadź kalcynowaną glinę cienką warstwą (~4 cm) na tacce autoklawu i autoklaw w suchym cyklu (ogrzewanie w temperaturze 121 °C przez 20 minut i 20 minut schnięcia) w celu sterylizacji.
      3. Pozostaw kalcynowaną glinę do całkowitego wyschnięcia przed użyciem, rozkładając ją na tacach i umieszczając w ciepłym inkubatorze (30−37 °C) na co najmniej tydzień. Mieszać co 3 dni, aby całkowicie wysuszyć kalcynowaną glinę, tak aby wchłonęła równomierną ilość bulionu odżywczego Murashige i Skoog (MS) (sekcja 1.2).
        UWAGA: Suszenie pomaga również utrzymać objętość kalcynowanej gliny nawet po jej zważeniu do probówek. Odpowiednie byłoby również suszenie w inny sposób, taki jak suszarka w piecu.
    2. Czyszczenie szkła do uprawy kapusty wolnej od zarazków
      1. Dokładnie wyczyść i wysterylizuj szklane probówki (tabela materiałów) między każdym użyciem. Namocz probówki przez 30 minut w 30% roztworze wybielacza i dobrze spłucz wodą z kranu przed czyszczeniem w kwaśnym płynie na ustawieniu bakteriologicznym. Dwukierunkowe nakrętki do probówek z kwasem (tabela materiałów) między użyciami.
    3. Sterylizacja powierzchniowa nasion kapusty
      1. Umieść do 100 nasion kapusty pekińskiej (B. rapa var pekinensis) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
        UWAGA: Dodanie więcej niż 100 nasion do jednej probówki mikrowirówki lub zmiana rozmiaru probówki może wpłynąć na szybkość kiełkowania nasion z powodu braku usuwania okrywy nasiennej.
      2. Dodaj 1 ml 70% etanolu do nasion i wiruj przez 5 minut. Wyrzuć etanol za pomocą pipety.
      3. Dodaj 1 ml 50% wybielacza i wiruj przez 5 minut. Wylej roztwór wybielacza za pomocą pipety.
      4. Dodaj 1 ml autoklawowanej wody dejonizowanej i wiruj przez 5 minut. Wylej wodę dejonizowaną za pomocą pipety.
      5. Powtórz krok 1.1.3.4 3x, aby spłukać cały wybielacz. Namocz nasiona w sterylnej wodzie dejonizowanej przez 2-8 godzin przed sadzeniem, aby zmiękczyć okrywę nasienną.
  2. Uprawa kapusty wolnej od zarazków
    UWAGA: Kapusta pekińska (B. rapa var pekinensis) jest uprawiana w szklanych tubach (15 cm x 2,5 cm) zawierających kalcynowaną glinę nasączoną bulionem odżywczym Murashige and Skoog (MS) (Rysunek 1).
    1. Odważyć 10 g czystej kalcynowanej gliny do czystej szklanej rurki (15 cm x 2,5 cm).
    2. Przygotuj bulion odżywczy MS, rozpuszczając 4,4 g pożywki MS w 1 l wody dejonizowanej. Dodaj bulion odżywczy MS (~ 9 ml) do każdej szklanej probówki, aby przykryć kalcynowaną glinę za pomocą pipety.
      UWAGA: Stojący płyn w tubie zapobiegnie kiełkowaniu nasion, więc może być konieczne dodanie nieco mniej bulionu MS do niektórych probówek.
    3. Luźno zakręć szklane probówki dwukierunkowymi nakrętkami probówek 22 mm i autoklaw (121 °C przez 60 min). Wyjmując je z autoklawu, wciśnij nakrętki na szklane rurki, aby je uszczelnić. Przed użyciem schłodzić rurki do temperatury pokojowej.
    4. Delikatnie umieść jedno sterylne nasiono kapusty na środku każdej probówki za pomocą sterylnych, bardzo długich (25,4 cm) kleszczyków. Umieść probówki w 7-kierunkowej tacy, a następnie umieść pod stojakami na światło (żarówki fluorescencyjne T5 o pełnym spektrum lub inny zestaw oświetleniowy do wzrostu roślin) z 16-godzinnym cyklem świetlnym w temperaturze 24 °C.
      UWAGA: Nasiona kiełkują w ciągu nocy i rozwijają swój pierwszy prawdziwy liść po 5 dniach. Prawdziwy liść to pierwszy liść naczyniowy po uformowaniu się liścieni. Ma bardziej pomarszczoną krawędź, a u Brassica rapa jest pokryta włoskami.
  3. Badanie sterylności kapusty wolnej od zarazków
    UWAGA: Aby sprawdzić, czy kapusta jest wolna od zarazków, wybierz kilka (5-10) kapusty z każdej partii i rozłóż na talerzu, aby ustalić, czy obecne są jakiekolwiek kolonie hodowlane.
    1. Delikatnie wyjmij kapustę ze szklanych rurek, chwytając podstawę rośliny wysterylizowanymi kleszczami i wyciągając ją. Przed całkowitym wyjęciem kapusty z rurki ostrożnie odetnij korzenie za pomocą wysterylizowanych nożyczek do preparowania. Zagęścić liście kapusty w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Większa kapusta może wymagać usunięcia jednego lub dwóch większych liści, gdy kapusta jest jeszcze w probówce, aby ułatwić włożenie kapusty do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Te większe liście można dodać do probówki o pojemności 1,5 ml po umieszczeniu reszty kapusty w probówce, jeśli wymagana jest cała kapusta.
    2. Dodać 400 μl 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) do każdej 1,5 ml probówki mikrowirówkowej. Za pomocą sterylnego mikrotłuczka homogenizuj kapustę, tłucząc 30 razy.
    3. Umieść 100 μl homogenacji kapusty na płytkach agarowych w celu ustalenia, czy w próbce znajdują się jakiekolwiek zanieczyszczenia. Większość bakterii znajdujących się w filosferze będzie rosła na płytkach agarowych z soi tryptycznej (TS). Podczas powlekania homogenatu kapusty należy używać końcówek do pipet z szerokim otworem, ponieważ homogenat do kapusty jest gęsty i może zatkać zwykłe końcówki pipet.

2. Inokulacja filosfery roztworami mikrobiologicznymi

  1. Wytwarzanie zapasów glicerolu szczepów inokulacyjnych
    UWAGA: W tabeli 1 wymieniono izolaty drobnoustrojów, które można zastosować na tym etapie. Można tu również zastosować inne izolaty filosfery.
    1. Gęsto rozprowadź pojedyncze kolonie ze świeżej smugi na dwóch/trzech nowych płytkach tego samego podłoża, aby uzyskać wiele kolonii.
    2. Pozwól smugom rosnąć przez 2-5 dni, a następnie zeskrob kolonie ze wszystkich płytek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 15 ml 15% glicerolu i dokładnie wymieszaj.
    3. Przenieść podwielokrotność 1 ml dobrze wymieszanego bulionu glicerolowego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać zapasy glicerolu w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Zachowaj pozostałe 14 ml glicerolu w temperaturze -80 °C, ponieważ do zaszczepiania kapusty wymagane są stosunkowo duże objętości roztworu inokulacyjnego.
    4. Na tydzień przed użyciem rozmrozić 1,5 ml probówkę zawierającą 1 ml bulionu glicerolu (z kroku 2.1.3) na lodzie, rozcieńczyć i rozcieńczyć w kilku różnych rozcieńczeniach (np. 10-4, 10-5 i 10-6) w celu określenia stężenia (jednostka tworząca kolonię [CFU] na μl) w 14 ml roztworu do inokulacji.
  2. Sterylizacja butelek z rozpylaczem do inokulacji
    1. Zdemontuj bursztynowe okrągłe butelki z pompką Boston (59 ml) i namocz wszystkie elementy (pompkę, rurkę, nakrętkę i butelkę) w 30% roztworze wybielacza na 30 minut w dużym plastikowym pojemniku z ciasno przylegającą pokrywką.
    2. Po namoczeniu ostrożnie wylej cały wybielacz z pojemnika, podnosząc tylko jeden róg pokrywy pojemnika.
    3. Wypłucz butelki, napełniając plastikowy pojemnik autoklawowaną wodą dejonizowaną (~1 l w zależności od wielkości pojemnika) i ostrożnie wylej wodę dejonizowaną, ponownie podnosząc pokrywkę w jednym rogu.
    4. Wysterylizuj komorę bezpieczeństwa biologicznego, spryskując ją 70% roztworem etanolu i włączając światło UV na 30 min.
      UWAGA: Kontynuuj tę pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby nie było ryzyka zanieczyszczenia mikrobiologicznego butelek podczas suszenia na powietrzu.
    5. Wyjmij butelki z dużego plastikowego pojemnika i napełnij każdą butelkę autoklawowaną wodą dejonizowaną za pomocą pipety. Zmontuj pompki i umieść po jednej w każdej butelce. Przepompuj wodę dejonizowaną przez każdą butelkę (10 rozpyleń na butelkę), aby usunąć wybielacz z elementu pompy butelki.
    6. Powtórz krok 2.2.5, aby upewnić się, że cały wybielacz został usunięty ze szklanych butelek.
    7. Przetestuj, czy butelki są sterylne, umieszczając numer na każdej butelce (przyklejając taśmę laboratoryjną z boku butelki, gdy jest całkowicie sucha), a następnie dodaj 10 ml 1x PBS do każdej z butelek i przepompuj 3 spraye na płytkę agarową TS. Po rozpyleniu inkubować płytki przez tydzień w temperaturze pokojowej. Jeśli na talerzu wyrosną jakieś kolonie, oznacza to, że odpowiednia butelka nie była sterylna i nie powinna być używana do eksperymentów.
    8. Przed przechowywaniem sterylnych butelek należy usunąć wszystkie pozostałe PBS i pozostawić butelki do całkowitego wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Sterylne butelki należy przechowywać w sterylnym plastikowym pojemniku (zwykle pojemniku używanym do wybielania butelek) do czasu użycia.
  3. Przygotowanie inokulum mikrobiologicznego i opryskiwanie kapusty wolnej od zarazków
    UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego, ponieważ rozpylanie aerozoluje roztwory mikrobiologiczne, które mogą zanieczyścić powierzchnie robocze lub stanowić zagrożenie dla zdrowia, jeśli są przeprowadzane na stole laboratoryjnym.
    UWAGA: Kapusta utworzy prawdziwe liście po 5 dniach, dlatego zaleca się odczekanie tygodnia po posadzeniu kapusty przed zaszczepieniem jakimikolwiek roztworami mikrobiologicznymi. Ponieważ rurki są uszczelnione, nie ma potrzeby podlewania kapusty. Eksperymenty najlepiej przeprowadzać w ciągu miesiąca od posadzenia, ponieważ małe rurki ograniczają wzrost kapusty.
    1. Rozmrozić zapasy glicerolu na lodzie i rozcieńczyć w 1x PBS do pożądanego stężenia inokulacji (stężenie określone przez rozmrożenie i posiew 1 ml podwielokrotności w kroku 2.1.4).
      UWAGA: Można stosować różne poziomy inokulacji, ale izolaty filosfery mogą wzrosnąć z 104 do 108 CFU/ml gnojowicy kapusty w ciągu 10 dni.
    2. Dodać 10 ml rozcieńczonego bulionu glicerolowego do sterylnej butelki z pompką i przepompować 5 aerozoli do dużej zlewki do zbierania odpadów, aby usunąć wszelkie pozostałości PBS z elementu pompy do butelki.
    3. Zdejmij pokrywkę z rurki do kapusty, przechyl kapustę w kierunku butelki z rozpylaczem i spryskaj każdą kapustę 3 pompkami roztworu do zaszczepiania, który zapewnia ~600 μL inokulum.
    4. Po zaszczepieniu zbierz podzbiór kapusty, aby ocenić rzeczywiste stężenie inokulacji wejściowej. Wyjmij kapustę z rurki za pomocą wysterylizowanych kleszczy. Odetnij korzenie sterylnymi nożyczkami do preparowania, a następnie ostrożnie umieść kapustę w zważonej sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Należy zapisać masę kapusty do przyszłych obliczeń, jeżeli do obliczeń wymagane są jtk/g kapusty.
    5. Dodaj 400 μl 1x PBS do każdej 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej kapustę i użyj sterylnego mikrotłuczka do homogenizacji kapusty do 1x PBS, mieląc ją 30x.
    6. Rozcieńczyć homogenat kapusty (jeśli jest to wymagane) i wyłożyć mieszankę z kapustą z pocierakiem. Do pipetowania gnojowicy z kapusty używaj końcówek z szerokimi otworami, ponieważ będzie ona gęsta i pełna kawałków tkanki roślinnej.

3. Przygotowanie sterylnego ekstraktu warzywnego

UWAGA: Ta metoda jest zmodyfikowaną wersją produkcji sterylnych pożywek z kapusty18,19.

  1. Kup kapustę w supermarkecie. W laboratorium usuń i wyrzuć najbardziej zewnętrzne liście kapusty. Posiekaj całą pozostałą kapustę, aby zmieściła się w blenderze i zhomogenizuj kapustę na drobny miąższ, tj. kapusta nie stanie się drobniejsza przy dalszym miksowaniu.
    UWAGA: Każdy blender, który może posiekać kapustę na gładką, jednorodną miazgę, powinien być odpowiedni do tej metody.
  2. Zważ homogenat zmiksowanej kapusty i dodaj 2 ml wody destylowanej na gram kapusty. Przefiltruj zmiksowaną gnojowicę z kapusty przez 2 warstwy filtrów do kawy w koszu (niebielony papier).
  3. Wlej gnojowicę z kapusty do probówek wirówkowych (wielkość zależy od wirówki). Odwirować przefiltrowaną gnojowicę kapusty o sile 20 000 x g przez 20 minut, aż duże cząstki opadną z roztworu.
    UWAGA: Konieczne jest odwirowywanie gnojowicy kapusty przez długi czas, ponieważ cząstki kapusty szybko zatykają sterylizator z filtrem.
  4. Za pomocą pipety serologicznej usunąć supernatant z resztek kapusty ogranulowanej, uważając, aby nie naruszyć kapusty ogranulowanej. Jeśli chcesz odtworzyć warunki fermentacji, w których stosuje się standardowe stężenia soli, dodaj 2% w/v NaCl na tym etapie (tj. przed sterylizacją filtra).
  5. Filtr Wysterylizuj ekstrakt warzywny za pomocą filtra 0,2 μm (500 ml lub 1 l) podłączonego do próżni. Dozować do sterylnych probówek (probówek wirówkowych o pojemności 50 ml lub probówek wirówkowych o pojemności 15 ml) i zamrażać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

4. Inokulacja sterylnego ekstraktu roślinnego

  1. Rozmrozić SVE i rozlać 490 μl do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Należy użyć wystarczającej liczby probówek, aby uzyskać co najmniej pięć powtórzeń na zabieg na punkt czasowy, ponieważ każdy pomiar punktu czasowego jest destrukcyjny.
  2. Rozmrozić zapasy glicerolu izolatów mikrobiologicznych na lodzie i rozcieńczyć 1x PBS do pożądanego stężenia. Stężenie bakterii kwasu mlekowego może wynosić zaledwie 5 000 CFU na ml SVE. Aby osiągnąć to stężenie, należy rozcieńczyć zapasy do 250 jtk/μl, ponieważ 10 μl zostanie użyte do zaszczepienia o całkowitej objętości 500 μl.
  3. Zaszczepić SVE 10 μl rozcieńczonego izolatu drobnoustrojów. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Inkubować w żądanej temperaturze (14 °C dla temperatury produkcji kimchi lub 24 °C dla najcieplejszej fermentacji kiszonej kapusty).
  4. Zmierz tempo wzrostu izolatu drobnoustrojów w SVE, zbierając probówki z replikami w dniu 1, dniu 2, dniu 4, dniu 7 i dniu 14,
    UWAGA: Fermentacja przebiega szybko na początku i zwalnia z czasem. W związku z tym posiadanie większej liczby początkowych punktów czasowych daje większą rozdzielczość dynamiki przebiegu fermentacji.
  5. W każdym punkcie czasowym dobrze wymieszaj zaszczepiony SVE, pipetując kilka razy w górę i w dół. Seryjnie rozcieńczyć zaszczepiony SVE w 1x PBS i umieścić na płytkach agarowych. Inkubuj płytki agarowe przez 4−7 dni przed zliczeniem kolonii.
    UWAGA: Agar Man, Rogosa i Sharpe (MRS) powinien być używany do wyliczania wszystkich bakterii kwasu mlekowego, dekstroza peptonu drożdżowego (YPD) powinna być używana do drożdży, a agar TS do większości innych izolatów bakterii z filosfery.
  6. Rejestruj pH próbek w każdym punkcie czasowym za pomocą mikrosondy pH.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać po posiewaniu, ponieważ sonda pH będzie przenosić komórki między probówkami/zabiegami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tempo wzrostu kapusty pekińskiej
Metodę sterylizacji nasion przetestowano na kilku różnych kapustach pekińskich (B. rapa var pekinese; Rysunek uzupełniający 1) od wielu różnych dostawców i wszyscy rozwijali się konsekwentnie z podobnymi stopami wzrostu. Jednak testowanie metod z różnymi gatunkami Brassica (B. rapa: Rzepa Purple Top; B. oleracea: Hybryda Kairska, tropikalna hybryda gigantyczna; B. campestris:

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wolne od zarazków rośliny kapusty pekińskiej wykorzystano do badania ograniczenia rozprzestrzeniania się bakterii kwasu mlekowego w filosferze kapusty napa17. Wolna od zarazków kapusta pekińska może być również używana do testowania indywidualnego lub parzystego wzrostu w fyllosferze (ryc. 1). Metody wytwarzania sterylnego ekstraktu warzywnego zostały przetestowane dla trzech różnych odmian kapusty: czerwonej, zielonej i Napa. Każdy z tych SVE działa jako niezawodna p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport i Claire Fogan zapewniły wsparcie techniczne, a Ruby Ye i Casey Cosetta dostarczyły pomocnych komentarzy na temat wczesnych wersji tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlVWR20170-650
Probówki stożkowe 15 mlFalcon352096
7-kierunkowa tacapółkowa Sigma MagentaT8654
Bursztynowa okrągła szklana butelkaGPS 712OZSPPK12BRZamawiane na Amazon.com od różnych dostawców
Filtry do kawy z koszemJeśli Ci zależy(papier niebielony) Zakupiony od Wholefoods
Bleach (bez rtęci)Rurki50-010-45
VWR47729-586
Calcined clayTurfaceMVPZamówione Amazon.com w Root Naturally 6 Quart Bags. Wielkość cząstek około 3-5 mm
Blender CuisinartCuisinart Robot kuchenny Cuisinart Mini-Prep Plus, nożyczki
Scientific56-81-5
KleenGuard M10Kimberley-Clark64240
Duży plastikowy pojemnikRubbermaidZamówione na
Amazon.com Stojaki na światłaGardner's Supply39-357Żarówki fluorescencyjne T5 o pełnym spektrum
Magenta tm 2-drożne nasadkiMillipore SigmaC1934
Mężczyzna, Rogosa i SharpeFisher ScientificDF0881-17-5To podłoże jest przeznaczone do bulionu i dodaje się 15 g agaru w celu przygotowania talerzy Sonda
Micro pHThermo Scientific8220BNWP
MikropestleCarolina215828Nazywana również tłuczkiem do peletów
Bulion odżywczy MSMillipore SigmaM5519Murashige and Skoog Basal Medium
NaClSigma AldrichS9888
Nasiona kapusty pekińskiejJohnny's Select Seeds2814GB. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri szalka 100 mm x 15 mmFisherFB0875712Służy do produkcji płytek agarowych
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaFisher Scientific50-842-941Teknova
Pudełko do hodowli tkanek roślinnychSigmaMagenta GA-7
Pipety serologiczneVWR89130-900
Sterylny kołekPuritan10805-018Autoklaw przed użyciem do sterylizacji
Sterylizacja 0,2 i mikro; m filtrNalgene974103
Tryptyczny agar sojowyFisher ScientificDF0370-17-3To podłoże jest przeznaczone do bulionu i dodaje się 15 g agaru do przygotowania talerzy
Końcówki do pipet z szerokim otworemRainin17007102
Drożdże, pepton i dekstrozaFisher ScientificDF0428-17-5Ta pożywka jest odpowiednia, ale pożywki można również przygotować przy użyciu drożdży, peptonu i dekstrozy, podczas robienia talerzy dodaj 15 g agaru
Boston ze szkła borokrzemianowego Austin do rozwarstwiania na 3 filiżanki 7-389-A Amerykańskie produkty edukacyjne zamówione na Amazon.com Etanol VWR 89125-172 Kleszcze Aven 18434 Zamówione na Amazon.com Glycerol Fisher

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135(2019).
  2. Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
  5. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  6. Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
  7. Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
  8. Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486(2015).
  9. Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682(2014).
  10. Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
  11. Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
  12. Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
  13. Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564(2014).
  14. Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
  15. Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461(2019).
  16. Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
  17. Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269(2019).
  18. Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
  19. Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
  20. Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77(2018).
  21. Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871(2015).
  22. Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
  23. Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
  24. Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134(2018).
  25. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
  26. Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrobiom fyllosferysk adanie si spo eczno ci mikrobiologicznychro liny wolne od drobnoustroj wsterylny ekstrakt warzywnysterylizacja nasionpod o e z gliny wapniowejpo ywka MS Brothprotok inokulacjianaliza fermentacji

Powiązane artykuły