Method Article

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

DOI:

10.3791/61152

⸱

May 10th, 2020

 ,  , 
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specjalnie zaprojektowane endonukleazy, takie jak CRISPR-guided RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (Cas9), umożliwiają efektywną edycję genomu w komórkach ssaków. Tutaj opisujemy szczegółowe procedury bezproblemowej edycji genomu locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) jako przykład w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych. Łącząc plazmid dawcy oparty na piggyBac i mutanta nickazy CRISPR-Cas9 w dwuetapowej selekcji genetycznej, wykazujemy prawidłowe i skuteczne celowanie w locus HNF4α.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) stanowią nieograniczone źródło komórek somatycznych do badań lub kliniki1. Celowanie genowe w hPSC stanowi potężną metodę badania funkcji genów podczas specyfikacji komórek i zrozumienia mechanizmów choroby. Chociaż istnieją skuteczne metody edycji genomu, modyfikacja genów w hPSC pozostaje wyzwaniem technicznym. Standardowe celowanie w geny za pomocą rekombinacji homologicznej w hPSC występuje z niską częstotliwością lub jest nawet niewykrywalne w przypadku niektórych genów2, a zatem w tych komórkach konieczne jest celowanie w geny stymulowane podwójnym pęknięciem nici DNA (DSB) (zwane edycją genów)2,3. Dodatkowo, transfekcja hPSC i późniejsze klonowanie pojedynczych komórek nie jest zbyt wydajne, mimo że apoptozę związaną z pojedynczymi komórkami można zmniejszyć poprzez zastosowanie inhibitora kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK)4. Wreszcie, potencjalne mutacje on-target i off-target w genie będącym przedmiotem zainteresowania mogą być również problematyczne. W związku z tym niezawodny protokół jest niezbędny do dokonywania dostosowanych zmian genetycznych w hPSC.

Technologia CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) i CRISPR associated protein 9 (Cas9) jest obecnie dobrze znanym narzędziem w edycji genów. Transkrybowane CRISPR RNA (crRNA) i trans-aktywujące RNA (tracrRNA) tworzą pojedynczy przewodnik RNA (sgRNA), który kompleksuje się z białkiem Cas9, umożliwiając specyficzne dla genu rozszczepienie5. System CRISPR/Cas9 jest programowalny poprzez zmianę sekwencji prowadzącej sgRNA o 20 pz, co oznacza, że prawie każdy locus, który spełnia wymóg motywu przylegającego do protospaceru (PAM), może być edytowany. Jednak dziki typ Cas9 może tolerować pewne niezgodności między jego sekwencją prowadzącą a celem DNA, co może powodować niepożądane efekty poza celem. Aby poprawić jego specyficzność, opracowano mutanta nickazy (Cas9n). Cas9n zawierający mutację D10A lub N863A posiada tylko jedną funkcjonalną domenę nukleazy i w rezultacie może naciąć DNA tylko na jednej nici. Para Cas9n odpowiednio rozmieszczona i zorientowana może skutecznie indukować DNA DSB, a efekty off-target są znacznie zmniejszone6. Aby zapewnić efektywną modyfikację Cas9n, wykazano, że dwa Cas9n-sgRNA powinny być idealnie umieszczone z przesunięciem od -4 do 20 pz i zawsze tworzyć zwis 5'6.

DSB indukowany Cas9(n)-sgRNA może być wykorzystany do edycji genomu w hPSCs7,8. Może powodować nokaut genu poprzez naprawę łączenia niehomologicznych końców lub wprowadzać modyfikację genu poprzez naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR), jeśli obecna jest matryca DNA dawcy. Opisany tutaj protokół wykorzystuje plazmid dawcy oparty na transpozonach piggyBac (lub wektor celujący) do HDR, w którym marker oporności na leki jest otoczony powtórzeniami odwróconymi transpozonami. Zaletą tego podejścia jest wydajne badanie przesiewowe i bezproblemowa edycja genów, co po raz pierwszy zademonstrowali Yusa et al.9,10. Kaseta selekcyjna umożliwia wzbogacenie komórek w zintegrowany wektor, które są następnie badane metodą PCR złącza w celu zidentyfikowania komórek pochodzących z HDR. Ponadto kaseta wyboru leku może być ustawiona tak, aby zastąpić sekwencje docelowe dla rozszczepienia Cas9(n), dzięki czemu po HDR nie dochodzi do dalszego pękania DNA, eliminując w ten sposób mutacje "na" celu wynikające z ponownego rozszczepienia Cas9(n). Ponadto, wykorzystując precyzyjne wycinanie katalizowane przez transpozazę piggyBac, marker selekcyjny jest następnie wycinany z genomu bez pozostawiania blizny. Po usunięciu markera wyboru leku pozostaje tylko oryginalna endogenna sekwencja TTAA do insercji piggyBac9. Nawet jeśli strony TTAA muszą zostać utworzone poprzez wprowadzenie podstawień, szanse na zakłócenie elementów regulacyjnych są zmniejszone w porównaniu z innymi metodami10.

Tutaj opisujemy szczegółowe procedury implementacji bezproblemowej edycji genomu w hPSC. Łącząc plazmid dawcy oparty na piggyBac i mutanta nickazy CRISPR-Cas9 w dwuetapowej selekcji genetycznej, wprowadziliśmy dwie z góry określone mutacje punktowe do genu czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) 11. Podejście to jest niezawodne i wydajne, a także umożliwiło dogłębne analizy ważnych ról odgrywanych przez HNF4α w specyfikacji endodermy i hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i konstruowanie plazmidów ekspresyjnych CRISPR/Cas9n-sgRNA

  1. Szukaj sekwencji prowadzących 20-bp bezpośrednio przed dowolnym 5'-NGG w pobliżu miejsca, które ma być modyfikowane. Para jednoprzewodnikowych RNA (sgRNA) jest potrzebna, gdy używana jest nickaza Cas9 (Cas9n) ze Streptococcus pyogenes. Para sgRNA musi być w stanie wygenerować zwisy 5' po nacięciu z offsetem od -4 do 20 pz6.
  2. Zamów niezbędne oligonukleotydy i wektor pSpCas9n-2A-puro.
  3. Sklonuj sgRNA do wektora pSpCas9n w celu koekspresji z Cas9n zgodnie z opublikowanym protokołem12.

2. Projektowanie i konstruowanie wektora kierowania opartego na piggyBac

  1. Pobierz docelową sekwencję genu i wyszukaj lokalizację TTAA w pobliżu miejsca, które ma zostać zmodyfikowane.
    UWAGA: Odległość między lokalizacją TTAA a lokalizacją, która ma być modyfikowana, powinna być jak najmniejsza. Jeśli w sekwencji kodującej i w odległości 100 pz nie ma miejsca TTAA, konieczne jest wprowadzenie go poprzez dokonanie synonimicznych podstawień nukleotydów.
  2. Zaprojektuj ramiona homologii (HA) i uwzględnij pożądane mutacje punktowe w HA. Optymalna długość kwasu hialuronowego powinna wynosić około 500 - 1200 bp.
    UWAGA: Zaleca się wprowadzenie synonimicznych podstawień nukleotydów w celu mutacji sekwencji PAM w celu uniknięcia potencjalnego ponownego rozszczepienia Cas9n.
  3. Skonstruuj ostateczny wektor kierowania zgodnie z ustalonym protokołem10.
    UWAGA: W zastosowanym tutaj wektorze docelowym, kaseta selekcyjna puro-deltaTK napędzana promotorem PGK jest otoczona powtórzeniami odwróconymi transpozonami.

3. Edycja genetyczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

  1. Utrzymuj ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na powierzchniach pokrytych rekombinowaną lamininą 521 (5 μg/ml) w mTeSR1 medium13. Komórki powinny osiągnąć zbieżność 70-85% po 72 godzinach po podziale 1:3.
    UWAGA: Jeśli są obecne, usuń spontanicznie zróżnicowane komórki przed codzienną zmianą pożywki, delikatnie je odsysając.
  2. W dniu transfekcji pokryć wystarczającą ilość studzienek na płytce 24-dołkowej 300 μl roztworu lamininy 521 (5 μg/ml) w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny.
  3. Delikatnie usunąć roztwór powlekający i dodać 300 μl świeżej pożywki mTeSR1 uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK do każdej studzienki, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w celu pobrania komórek.
    UWAGA: Nie dopuścić do wyschnięcia płytek w żadnym momencie po usunięciu roztworu powlekającego lamininę.
  4. Przenieś podstawowe hPSC z inkubatora, usuń zużytą pożywkę, a następnie umyj komórki za pomocą 1 ml sterylnego 1x DPBS.
  5. Dodać 1 ml delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek do każdego dołka na 6-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 37 °C przez 6-8 minut w celu dysocjacji komórek.
    UWAGA: Delikatnie postukaj w płytkę i sprawdź, czy komórki mogą się łatwo oderwać, aby zdecydować, czy trawienie jest wystarczająco długie.
  6. Delikatnie pipetuj w górę i w dół za pomocą końcówki P1000, aby zdjąć wszystkie hPSC.
  7. Zakończ dysocjację, dodając 2 ml świeżej pożywki mTeSR1 uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK (Y-27632) do zawiesiny komórki.
  8. Dobrze wymieszać i przenieść zawiesinę jednokomórkową do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml świeżej pożywki mTeSR1 uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK.
  10. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru. Użyj Trypan Blue do barwienia i wykluczania martwych komórek.
  11. Przenieść 8 x 105 do 1 x 106 żywych komórek do probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej reakcji nukleofekcji i odwirować przy 200 x g przez 3 min. Następnie ostrożnie odessać supernatant.
  12. Wymieszaj 3 μg sparowanych plazmidów ekspresyjnych Cas9n-sgRNA i 5 μg plazmidu wektora docelowego w 100 μl mieszanego roztworu/suplementu nukleofekcji z zestawu do nukleofekcji ludzkich komórek macierzystych. Użyj plazmidu kontrolnego GFP z zestawu i przygotuj również mieszankę plazmidów kontrolnych GFP.
    UWAGA: Ważne jest, aby wykonać maxi-prep wszystkich plazmidów, aby zmniejszyć zanieczyszczenie endotoksynami przed nukleofekcją. Stężenie plazmidów powinno wynosić około 1 μg/μl.
  13. Użyj mieszanki DNA (objętość ~111 μL), aby ponownie zawiesić przygotowane komórki i przenieść je do kuwety elektroporacyjnej (dostarczonej z zestawem do nukleofekcji), unikając pęcherzyków.
  14. Elektrorazować komórki za pomocą urządzenia do nukleofekcji, wybierając optymalne warunki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.
    UWAGA: Jeśli po raz pierwszy używasz zestawu do nukleofekcji dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, konieczne jest przetestowanie programu elektroporacji i wybranie najbardziej wydajnego.
  15. Natychmiast dodać 500 μl świeżej i ciepłej do 37 °C pożywki mTeSR1 uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK do elektroporowanych ogniw. Przenieść mieszaninę do 2 dołków na 24-dołkowej płytce przygotowanej z etapów 3.2 i 3.3.
  16. Szybko włóż płytkę z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 °C/5% CO2 i pozwól komórkom dojść do siebie.
  17. 12-16 godzin później wymień pożywkę do konserwacji ogniw. Jeśli komórki nawiązały kontakt komórka-komórka, należy wycofać inhibitor ROCK, jeśli nie, kontynuować uzupełnianie pożywki inhibitorem.
  18. W ciągu 24-48 godzin sprawdź wydajność nukleofekcji, badając ekspresję GFP w komórkach kontrolnych. Komórki GFP dodatnie powinny wynosić co najmniej 30 procent.
  19. 48 godzin po nukleofekcji rozpocznij selekcję komórek, uzupełniając pożywkę mTeSR1 o 1 μg/ml puromycyny.
  20. 72 godziny po nukleofekcji uzupełnić pożywkę mTeSR1 o 0,5 μg/ml puromycyny. Jeśli konfluencja komórek jest mniejsza niż 30%, uzupełnij również pożywkę inhibitorem 10 μM ROCK.
  21. 4-6 dni po nukleofekcji, przejść komórki oporne na puromycynę do 10-15 x 96-dołkowych płytek w stężeniu 0,8 komórki/dołek.
    UWAGA: Konieczne jest uzupełnienie pożywki o 10 μM inhibitor ROCK i 0,5 μg/ml puromycyny.
  22. Utrzymuj te komórki w temperaturze 37 °C/10% CO2 przez 10-12 dni, aby utworzyć kolonie pochodzące z pojedynczych komórek. Uzupełnij podłoże raz 7 dni po wysianiu.
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że zwiększony poziom CO2 pomaga pojedynczym hPSC w tworzeniu kolonii.
  23. Oznaczyć studzienki zawierające pojedynczą kolonię i zastąpić pożywkę świeżą pożywką mTeSR1 zawierającą 0,5 μg/ml puromycyny, ale bez inhibitora ROCK.
    UWAGA: Od tego momentu komórki będą hodowane w temperaturze poniżej 37 °C/5% CO2 .
  24. Dwa dni później zmień podłoże dla studzienek zawierających niezróżnicowane kolonie. Uzupełnij pożywkę 10 μM inhibitorem ROCK i 0,5 μg/ml puromycyny.
    UWAGA: W niektórych studzienkach komórki mogły się różnicować i wymagać odrzucenia.
  25. Użyj końcówek pipet P2, aby delikatnie zeskrobać kolonie. Przenieś zawiesinę komórkową pochodzącą z jednej kolonii do 2 nowych studzienek na oddzielnych 96-dołkowych płytkach i użyj jednej do genotypowania, a drugiej do utrzymania.
    UWAGA: Ważne jest, aby starannie utrzymywać kolonie i utrzymywać poziom spontanicznego różnicowania do minimum.
  26. Weź płytkę zawierającą komórki do genotypowania, gdy zbieg w większości studzienek osiągnie 50% lub więcej. Wylej zużyte podłoże, a następnie umyj komórki raz za pomocą DPBS.
  27. Poddać komórki lizie w studzience za pomocą buforu do lizy Bradleya i wyizolować genomowe DNA z każdej studzienki na płytce zgodnie z powiązanym protokołem (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).
  28. Użyj metody PCR z trzema starterami, aby niezależnie genotypować zarówno lewe, jak i prawe ramię homologii10.
    UWAGA: Schemat przedstawiający metodę PCR jest przedstawiony w Rysunek 2.
  29. Wyślij produkty PCR skrzyżowania dla obu ramion homologii z 4-5 kolonii do sekwencjonowania Sangera i uzyskaj sekwencje.
    UWAGA: Wynik sekwencjonowania 2 założonych kolonii jest pokazany w Rysunek 3A.
  30. Utrzymuj kolonie z prawidłowym genotypem i wyrzuć resztę.
  31. Rozwiń odpowiednie kolonie pod ciągłą selekcją puromycyny i zamroź je przy najwcześniejszym możliwym pasażu.

4. Usuwanie transpozonu z docelowych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

  1. Utrzymuj jedną rodzinę z prawidłowym genotypem poniżej 0,5 μg/ml selekcji puromycyny.
  2. Nucleofect 8 x 105 do 1 x 106 komórek z 5 μg nadpobudliwej transpozazy (pCMV-hyPBaza), jak opisano powyżej (sekcja 3, kroki 3.4-3.18). Wykonaj równolegle nukleofekcję kontrolną GFP.
    UWAGA: Puromycyna powinna zostać usunięta z pożywki mTeSR1 natychmiast po nukleofekcji tych komórek.
  3. Hoduj i przesiewaj komórki z usuniętą kasetą selekcyjną puro-deltaTK zgodnie z opublikowanymi procedurami10.
    UWAGA: Ważne jest, aby dokładnie przestrzegać oryginalnych procedur. FIAU, czyli 1-(2-deoksy-2-fluoro-β-d-arabinofuranozylo)-5-jodouracyl) był używany jako analog tymidyny do selekcji negatywnej opartej na kinazie tymidynowej pochodzącej z wirusa opryszczki pospolitej (HSV-tk).
  4. Ułóż sekwencję zmodyfikowanego obszaru, aby potwierdzić usunięcie transpozonu.
    UWAGA: Wynik sekwencjonowania 3 założonych kolonii jest pokazany w Rysunek 3B.
  5. Utrzymuj kolonie z prawidłowym genotypem i rozwijaj się w celu dalszego wykorzystania.
  6. Wykonaj charakterystykę markerów pluripotencji w wybranych koloniach przed użyciem ich do dalszej analizy.
    UWAGA: Charakterystyka dwóch założonych kolonii jest pokazana w Rysunek 4.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategia wektorowa oparta na wektorach
Gen czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) został wybrany do celowanej edycji genomu w celu wprowadzenia dwóch mutacji punktowych do eksonu 8. Para Cas9n-sgRNA z przesunięciem 11 pz została zaprojektowana w pobliżu miejsca, które ma być modyfikowane. Wektor celowania oparty na piggyBac działał jako szablon naprawy ukierunkowany na homologię do wprowadzania pożądanych mutacji punktowych. 967 bp 5'-HA i 1142 bp 3'-HA zawierające synonimiczne podstawienia nukleotydów lub pożądane mutacje punktowe amplifikowano i sklonowano do końcowego wektora docelowego. Miejsce insercji piggyBac było oddalone o 16 pz i 22 pz od dwóch pożądanych mutacji punktowych. Kolonie zawierające kasetę selekcyjną puro-deltaTK wyselekcjonowano z puromycyną w pierwszej rundzie. Po usunięciu kasety selekcyjnej przez wycięcie transpozazy w drugiej rundzie, docelowe miejsce zostało bezproblemowo zmodyfikowane tylko z pożądanymi mutacjami punktowymi włączonymi do genu (Ryc. 1).

Edycja genetyczna w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych
Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem prawidłowo ukierunkowanych komórek, do genotypowania zastosowano metodę PCR opartą na trzech starterach (Rysunek 2). Sekwencjonowanie Sangera przeprowadzono w celu potwierdzenia wyników PCR (Rysunek 3A). Po wyjęciu kasety selekcyjnej, zmodyfikowany region został ponownie zsekwencjonowany, aby potwierdzić poprawne wprowadzenie pożądanych mutacji punktowych (Rysunek 3B).

Zakładanie kolonii i charakterystyka edytowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
Kolonie o prawidłowym genotypie były selekcjonowane i rozbudowywane w zależności od potrzeb. Założone kolonie muszą zostać scharakteryzowane przed wykorzystaniem do dalszej analizy. Edytowane komórki mają taką samą morfologię jak komórki rodzicielskie (Rysunek 4A). Wyrażają również reprezentatywne ludzkie pluripotencjalne markery komórek macierzystych, w tym czynniki transkrypcyjne NANOG i OCT4 (Figura 4B), a także markery powierzchni komórek SSEA4 i TRA-1-60 (Figura 4C).

figure-results-1
Rysunek 1: Strategia wektorowa oparta na wektorach11. Para plazmidów ekspresyjnych Cas9n-sgRNA została użyta do wywołania pęknięcia podwójnej nici DNA w eksonie 8 genu HNF4α. Wektor celowniczy z kasetą selekcyjną został wykorzystany do wprowadzenia z góry określonych mutacji punktowych zlokalizowanych w odległości 16 pz i 22 pz. Ta kaseta selekcyjna była zawarta w transpozonie piggyBac, składającym się z dodatnio-ujemnego markera selekcyjnego (puro-deltaTK) napędzanego przez konstytutywnie aktywny promotor (PGK). Poprzez szlak naprawy ukierunkowany na homologię, docelowe komórki włączyły kasetę selekcyjną. Wycięcie transpozonu, w którym pośredniczy transpozaza, powoduje bezproblemową modyfikację, w której obecne są tylko mutacje punktowe. Czerwony krzyż wskazuje lokalizację pożądanych mutacji punktowych. HA = ramię homologiczne; PB = świnka Bac; PM = mutacja punktowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Metoda PCR oparta na trzech starterach. Do badań przesiewowych komórek ukierunkowanych genowo zastosowano genotypowanie oparte na PCR. Trzy startery, LA-F1, -R1 i -R2 zostały użyte do amplifikacji obszaru lewego ramienia homologicznego. Niezależnie, RA-F1, -F2 i -R1 zostały użyte do wzmocnienia prawego obszaru ramienia homologii. Na podstawie wyniku elektroforezy żelowej wyodrębniono od siebie komórki niedocelowe oraz komórki heterozygotyczne i homozygotyczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wyniki sekwencjonowania komórek modyfikowanych genetycznie11. Produkty PCR z dwóch klonów zsekwencjonowano i potwierdzono prawidłowe wprowadzenie kasety selekcyjnej do docelowego locus (A). 5' i 3' piggyBac z odwróconym zakończeniem (ITR) były otoczone przez bezpośrednie powtórzenia TTAA. Trzy klony zsekwencjonowano po wycięciu transpozonu (B). Para Cas9n-sgRNA z przesunięciem 11 pz została użyta do wprowadzenia pęknięcia podwójnej nici DNA. Do genu wprowadzono dwie z góry określone mutacje punktowe (A do G i A do C). Jedna mutacja synonimiczna została wprowadzona w celu mutacji motywu przylegającego do protospaceru (PAM), a druga w celu stworzenia miejsca TTAA niezbędnego do wycięcia piggyBac. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Charakterystyka edytowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Morfologia dwóch edytowanych linii komórkowych i komórek rodzicielskich (A), podziałka = 100 μm. Ekspresja markerów pluripotencjalnych komórek macierzystych NANOG i OCT4 badana przez barwienie immunologiczne (B, podziałka = 50 μm), oprócz SSEA4 i TRA-1-60 za pomocą cytometrii przepływowej (C) w dwóch zmodyfikowanych liniach komórkowych i komórkach rodzicielskich. IgG stosowano jako kontrolę negatywną. DAPI użyto do barwienia jądra. Wartości procentowe zostały obliczone jako średnia z trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany w niniejszym dokumencie protokół może być wykorzystany do wprowadzenia z góry określonych mutacji punktowych do endogennego locus w hPSC. Połączenie wektora celowniczego opartego na piggyBac i sparowanych plazmidów ekspresyjnych CRISPR/Cas9n okazało się niezawodne i wydajne11. Po edycji genu HNF4α 12 z 43 analizowanych klonów było prawidłowo ukierunkowanych, jak określono za pomocą badania przesiewowego PCR złącza. W szczególności skuteczność celowania biallelicznego wynosiła około 21% (9/43), a skuteczność celowania monoallelicznego wynosiła około 7% (3/43).

Po eksperymentach celujących kluczowe znaczenie ma utrzymanie selekcji puromycyny, aby utrzymać docelowy locus dostępny dla transpozazy piggyBac podczas pierwszej rundy badań przesiewowych. Zminimalizuje to wyciszenie kasety selekcyjnej puro-deltaTK napędzanej przez promotora PGK i zmniejszy tło w drugiej rundzie pokazu10. Niedawny raport wykazał, że promotor CAG jest bardziej odporny na wyciszenie niż promotor PGK w hPSC14. Zmiana promotora kasety selekcyjnej mogłaby zatem udoskonalić ten system w przyszłości. Ważne jest również porównanie liczby opornych kolonii z komórek transfekowanych hyPBazą i GFP. Po pomyślnym usunięciu transpozonu powinno być więcej kolonii z komórek transfekowanych hyPBazą niż z komórek transfekowanych GFP. Oprócz analizy PCR wycięcia transpozonu, wymagane jest bezpośrednie sekwencjonowanie zmodyfikowanego regionu w celu potwierdzenia wierności wycięcia.

Opierając się na strategii wektora celowania opartej na transpozonach piggyBac 9,10 firmy Yusa, procedury opisane powyżej koncentrowały się na poprawie nukleofekcji hPSC i wydajności klonowania pojedynczych komórek. Gęstość wysiewu komórek została zoptymalizowana w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa tworzenia się heterogenicznych kolonii. Zastosowaliśmy również 10-12-dniową hodowlę poniżej 10% CO2 w celu zwiększenia produkcji kolonii do badań przesiewowych genotypu. Z naszego doświadczenia wynika, że z każdej 96-dołkowej płytki można uzyskać około 20 kolonii. Chociaż ten krok może zająć więcej czasu niż inne metody, jest niezawodny i bardzo wydajny.

W zależności od potrzeb, wektory celujące mogą być zaprojektowane tak, aby wprowadzać lub korygować mutacje punktowe, tworzyć reporterowe linie komórkowe, a także ekspresję genów nokautujących. Podsumowując, połączenie systemu CRISPR/Cas9(n) i wektora celowania jest skutecznym sposobem dostarczania różnych typów genetycznie zmodyfikowanych hPSC.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.C.H jest współzałożycielem, udziałowcem i dyrektorem Stemnovate Limited.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Kosuke Yusa za udostępnienie plazmidów pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK i pCMV-hyPBazy. Dziękujemy Jia-Yin Yangowi i Karamjit Singh-Doltowi za pomocne dyskusje na temat edycji genomu. Laboratorium D.C.H. jest wspierane przez nagrodę Biura Głównego Naukowca (TC/16/37) oraz Brytyjskiej Platformy Medycyny Regeneracyjnej (MR/L022974/1). Y.W. otrzymał stypendium doktoranckie ufundowane przez Chińską Radę Stypendialną i Uniwersytet w Edynburgu.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anty-Human SSEA4 PEeBioscience12-8843-42
Anty-Human TRA-1-60 PEeBioscience11-0159-42
DPBSThermo Fisher Scientific14190144
DPBS z wapniem i magnezemThermo Fisher Scientific14040133
FIAUMoravekM251
Delikatna komórka odczynnik dysocjacyjnyStem Cell Technologies07174
H9 ludzkie embrionalne komórki macierzysteWiCellWA09
Ludzkie przeciwciało NANOGR& Systemy DAF1997
Ludzkie przeciwciało OCT4AbcamAB19857
Zestaw nukleofektorów ludzkich komórek macierzystych 1LonzaVPH-5012
Mysia kontrola izotypu IgG3 PEeBioscience12-4742-41
mTeSR1 mediumStem Cell Technologies85850
Urządzenie Nucleofector 2bLonzaAAB-1001
pCMV-hyPBaseWellcome Trust Sanger InstituteN/A
Wellcome Trust Sanger InstituteN/A
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)AddgenePX462
Dichlorowodorek puromycynyThermo Fisher ScientificA11138-03
QIAprep spin maxiprep kitQiagen12162
QIAprep spin miniprep kitQiagen27106
Rekombinowana laminina 521BioLaminaLN521
Niebieski roztwór trypanu, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061
Y-27632 (Dichlorowodorek)MilliporeSCM075
pMCS-AAT_PBPGKpuroTK

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rashidi, H., et al. 3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
  2. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  3. Porteus, M. H., Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 300 (5620), 763(2003).
  4. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
  6. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  7. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-824 (2013).
  8. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Yusa, K., et al. Targeted gene correction of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).
  10. Yusa, K. Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon. Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).
  11. Wang, Y., et al. Multiomics Analyses of HNF4α Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation. iScience. 16, 206-217 (2019).
  12. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).
  14. Eggenschwiler, R., et al. Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase. Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsCRISPR Cas9 NickaseSeamless Genome EditingHNF4A LocusPiggyBac Donor PlasmidTwo Step Genetic SelectionNucleofection ProcedurePuromycin SelectionROCK Inhibitor SupplementSanger Sequencing Confirmation

Related Articles