Śledzenie cząstek 3D do nieinwazyjnej analizy in vivo dynamiki mikrotubul synaptycznych w dendrytach i połączeniach nerwowo-mięśniowych Drosophila

Vivian  T. Chou; Hunkar  Gizem Yesilyurt; Hoyin Lai; Jennifer B. Long; Mercedes Arnes; Kamal Obbad; Michael Jones; Hideki Sasaki; Luciano  A.G. Lucas; Sam Alworth; James  Shih-Jong Lee; David Van Vactor

doi:10.3791/61159

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Śledzenie cząstek 3D do nieinwazyjnej analizy in vivo dynamiki mikrotubul synaptycznych w dendrytach i połączeniach nerwowo-mięśniowych Drosophila

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61159

⸱

12 maja 2020

Vivian T. Chou^*¹ , Hunkar Gizem Yesilyurt^*¹ , Hoyin Lai^*² , Jennifer B. Long¹ , Mercedes Arnes¹ , Kamal Obbad¹ , Michael Jones² , Hideki Sasaki² , Luciano A.G. Lucas² , Sam Alworth² , James Shih-Jong Lee² , David Van Vactor¹

¹Blavatnik Institute of Cell Biology and Program in Neuroscience, Harvard Medical School, ²DRVision Technologies LLC

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia nieinwazyjną strategię obrazowania neuronów w trybie przyżyciowym w połączeniu z nową strategią oprogramowania w celu osiągnięcia zautomatyzowanego, bezstronnego śledzenia i analizy dynamiki in vivo mikrotubul (MT) plus end w dendrytach czuciowych i połączeniach nerwowo-mięśniowych Drosophila.

Streszczenie

Mikrotubule (MT) odgrywają kluczową rolę w rozwoju neuronów, ale pozostaje wiele pytań dotyczących molekularnych mechanizmów ich regulacji i funkcji. Co więcej, pomimo postępów w zrozumieniu postsynaptycznych MT, znacznie mniej wiadomo na temat udziału presynaptycznych MT w morfogenezie neuronów. W szczególności badania dynamiki MT in vivo w dendrytach czuciowych Drosophila dostarczyły istotnych informacji na temat zachowania polimerów. Jednak wyzwania techniczne i analityczne związane z obrazowaniem na żywo połączenia nerwowo-mięśniowego muchy (NMJ) ograniczyły porównywalne badania dynamiki presynaptycznego MT. Co więcej, chociaż istnieje wiele bardzo skutecznych strategii oprogramowania do automatycznej analizy dynamiki MT in vitro i ex vivo, dane in vivo często wymagają znacznego wkładu operatora lub całkowicie ręcznej analizy ze względu na z natury gorszy stosunek sygnału do szumu na obrazach i złożoną morfologię komórkową. Aby rozwiązać ten problem, w ramach badania zoptymalizowano nową platformę oprogramowania do automatycznego i bezstronnego wykrywania cząstek in vivo. Przeprowadzono wieloparametryczną analizę poklatkowych obrazów konfokalnych na żywo MT znakowanych EB1-GFP zarówno w dendrytach, jak i NMJ larw Drosophila i stwierdzono uderzające różnice w zachowaniu MT. Dynamika MT została ponadto przeanalizowana po knockdown białka związanego z MT (MAP) dTACC, kluczowego regulatora rozwoju synaps Drosophila, i zidentyfikowano statystycznie istotne zmiany w dynamice MT w porównaniu z typem dzikim. Wyniki te pokazują, że ta nowatorska strategia zautomatyzowanej wieloparametrycznej analizy dynamiki MT zarówno pre-, jak i postsynaptycznej na poziomie polimerów znacznie zmniejsza kryteria human-in-the-loop. Badanie pokazuje ponadto przydatność tej metody w wykrywaniu różnych zachowań MT po knockdown dTACC, wskazując na możliwe przyszłe zastosowanie funkcjonalnych badań przesiewowych czynników regulujących dynamikę MT in vivo. Przyszłe zastosowania tej metody mogą również koncentrować się na wyjaśnianiu typów komórek i/lub specyficznych dla przedziałów zachowań MT oraz wielokolorowym obrazowaniu korelacyjnym EB1-GFP z innymi interesującymi markerami komórkowymi i subkomórkowymi.

Wprowadzenie

Komórki organizują się, tworząc funkcjonalne struktury poprzez koordynację zmian wewnątrz- i międzykomórkowych poprzez morfogenezę. Niezwykłym przykładem morfogenezy jest rozwój wysoce wyspecjalizowanej struktury neuronalnej. Neurony wykazują niezwykłą polaryzację, w której rozciągają dwa strukturalnie i funkcjonalnie odrębne typy procesów, dendryty i aksony¹, które mogą osiągać ogromne długości. Złożoność rozwoju neuronów wynika nie tylko z samej wielkości dendrytów i aksonów, ale także z trudności w tworzeniu ich misternie rozgałęzionych geometrii²^,³. Morfogeneza neuronów i jej konsek....