Method Article

Śledzenie cząstek 3D do nieinwazyjnej analizy in vivo dynamiki mikrotubul synaptycznych w dendrytach i połączeniach nerwowo-mięśniowych Drosophila

DOI:

10.3791/61159

⸱

May 12th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Blavatnik Institute of Cell Biology and Program in Neuroscience, Harvard Medical School, 2DRVision Technologies LLC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia nieinwazyjną strategię obrazowania neuronów w trybie przyżyciowym w połączeniu z nową strategią oprogramowania w celu osiągnięcia zautomatyzowanego, bezstronnego śledzenia i analizy dynamiki in vivo mikrotubul (MT) plus end w dendrytach czuciowych i połączeniach nerwowo-mięśniowych Drosophila.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrotubule (MT) odgrywają kluczową rolę w rozwoju neuronów, ale pozostaje wiele pytań dotyczących molekularnych mechanizmów ich regulacji i funkcji. Co więcej, pomimo postępów w zrozumieniu postsynaptycznych MT, znacznie mniej wiadomo na temat udziału presynaptycznych MT w morfogenezie neuronów. W szczególności badania dynamiki MT in vivo w dendrytach czuciowych Drosophila dostarczyły istotnych informacji na temat zachowania polimerów. Jednak wyzwania techniczne i analityczne związane z obrazowaniem na żywo połączenia nerwowo-mięśniowego muchy (NMJ) ograniczyły porównywalne badania dynamiki presynaptycznego MT. Co więcej, chociaż istnieje wiele bardzo skutecznych strategii oprogramowania do automatycznej analizy dynamiki MT in vitro i ex vivo, dane in vivo często wymagają znacznego wkładu operatora lub całkowicie ręcznej analizy ze względu na z natury gorszy stosunek sygnału do szumu na obrazach i złożoną morfologię komórkową. Aby rozwiązać ten problem, w ramach badania zoptymalizowano nową platformę oprogramowania do automatycznego i bezstronnego wykrywania cząstek in vivo. Przeprowadzono wieloparametryczną analizę poklatkowych obrazów konfokalnych na żywo MT znakowanych EB1-GFP zarówno w dendrytach, jak i NMJ larw Drosophila i stwierdzono uderzające różnice w zachowaniu MT. Dynamika MT została ponadto przeanalizowana po knockdown białka związanego z MT (MAP) dTACC, kluczowego regulatora rozwoju synaps Drosophila, i zidentyfikowano statystycznie istotne zmiany w dynamice MT w porównaniu z typem dzikim. Wyniki te pokazują, że ta nowatorska strategia zautomatyzowanej wieloparametrycznej analizy dynamiki MT zarówno pre-, jak i postsynaptycznej na poziomie polimerów znacznie zmniejsza kryteria human-in-the-loop. Badanie pokazuje ponadto przydatność tej metody w wykrywaniu różnych zachowań MT po knockdown dTACC, wskazując na możliwe przyszłe zastosowanie funkcjonalnych badań przesiewowych czynników regulujących dynamikę MT in vivo. Przyszłe zastosowania tej metody mogą również koncentrować się na wyjaśnianiu typów komórek i/lub specyficznych dla przedziałów zachowań MT oraz wielokolorowym obrazowaniu korelacyjnym EB1-GFP z innymi interesującymi markerami komórkowymi i subkomórkowymi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki organizują się, tworząc funkcjonalne struktury poprzez koordynację zmian wewnątrz- i międzykomórkowych poprzez morfogenezę. Niezwykłym przykładem morfogenezy jest rozwój wysoce wyspecjalizowanej struktury neuronalnej. Neurony wykazują niezwykłą polaryzację, w której rozciągają dwa strukturalnie i funkcjonalnie odrębne typy procesów, dendryty i aksony1, które mogą osiągać ogromne długości. Złożoność rozwoju neuronów wynika nie tylko z samej wielkości dendrytów i aksonów, ale także z trudności w tworzeniu ich misternie rozgałęzionych geometrii2,3. Morfogeneza neuronów i jej konsekwencje w uczeniu się i pamięci4 motywują do ciągłego badania zarówno kontroli genetycznej neuronów, jak i leżących u jej podstaw mechanizmów biologicznych komórki. Mechanizmy te obejmują między innymi transport błony wewnątrzkomórkowej i wiele przegrupowań cytoszkieletu potrzebnych do zmian w morfologii neuronów1,2,3.

Badania nad morfogenezą neuronów dostarczyły wielu zaawansowanych technik wizualizacji. Metody statyczne, takie jak mikroskopia elektronowa lub mikroskopia fluorescencyjna sond stacjonarnych, są szeroko stosowane do wykonywania analizy morfologicznej i strukturalnej o wysokiej rozdzielczości. Jednak oprócz artefaktów, które są nieuniknione dla każdej metody konserwacji, wizualizacja statyczna nie jest w stanie uchwycić dynamicznych zmian, które leżą u podstaw morfogenezy. W związku z tym wiele kluczowych spostrzeżeń pochodzi z poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej żywych tkanek. Wczesna praca Lichtmana i współpracowników5,6,7 wykorzystywała obrazowanie in vivo układu nerwowego ssaków do badania regeneracji/degeneracji aksonów, organizacji komponentów synaptycznych i transportu aksonów na duże odległości. Co więcej, nowatorskie badania nad pierwotnymi eksplantatami neuronalnymi miały kluczowe znaczenie dla ustalenia znaczenia dynamiki mikrotubul (MT) dla wydłużenia i ruchliwości aksonów8,9. Co najważniejsze, wczesne badania eksplantatów neuronalnych wykazały wykorzystanie znakowanych fluorescencyjnie białek rodzinnych wiążących końce (EB) w celu uzyskania bezcennych informacji na temat dynamiki plus-end MT w rozwoju neuronów na poziomie poszczególnych polimerów MT10. Badania te powstały na podstawie obserwacji, że członek rodziny EB1 preferencyjnie lokalizuje się na MT plus ends11 w S. cerevisiae12 i w hodowanych komórkach13. Od tego czasu EB1 i inne białka śledzące końcówki plus (+TIP)14,15 są szeroko stosowane w badaniach in vivo dynamicznej niestabilności MT16, w tym w kontekście rozwoju neuronów17.

Drosophila jest potężnym modelem do badań obrazowych in vivo dynamiki MT podczas rozwoju neuronów, dzięki szerokiemu dostępowi narzędzi genetycznych i obrazowania do badań nad muchami18,19 jak również podobieństwa w budowie i funkcji między neuronami Drosophila i kręgowców1. Kluczowe wczesne badanie połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) larw Drosophila polegało na wielokrotnym, nieinwazyjnym obrazowaniu markera błony fluorescencyjnej przez półprzezroczysty naskórek nienaruszonych zwierząt, aby udokumentować morfogenezę końcówki presynaptycznej20. Korzystając z podobnej metody do obrazowania całych, żywych larw Drosophila, przedstawiono wstępną demonstrację subkomórkowej analizy na poziomie cząstek procesowego ruchu ładunków motorowych w aksonach21. Niedawno skrupulatne badania przeprowadzone przez Rollsa i współpracowników na dendrytach sensorycznych nienaruszonych larw Drosophila 22,23,24,25,26,27 scharakteryzowały postsynaptyczną dynamikę plus-end MT, wykonując śledzenie cząstek i analizę EB1 znakowanego zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Takie badania w Drosophila22,23,24,25,26,27 i inne systemy28,29,30,31,32 mają znacznie pogłębioną wiedzę na temat zachowania pojedynczych polimerów końców MT plus w dendrytach rozwijających się neuronów33.

Pomimo imponujących badań in vivo postsynaptycznej dynamiki MT22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, przeprowadzono znacznie mniej porównywalnych badań dynamiki presynaptycznego MT w rozwijającym się terminalu aksonowym. Dynamika MT u larwy Drosophila NMJ została zbadana za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamkowej (FSM) i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)34. Techniki te oceniają ogólną kinetykę tubuliny, ale nie zachowanie poszczególnych końców MT plus. W chwili pisania tego tekstu przeprowadzono jedno jedyne badanie poszczególnych końców MT plus w Drosophila NMJ: Badanie to połączyło obrazowanie poklatkowe na żywo z ręczną analizą kymografów, aby scharakteryzować populację dynamicznych, oznaczonych jako EB1-GFP "pionierskich MT", które wydawały się odróżniać od szerszej populacji ustabilizowanych MTs35. Ten brak badań nad dynamiką presynaptycznego MT może być przynajmniej częściowo spowodowany anatomią: chociaż uzyskanie obrazów dendrytów jest stosunkowo proste ze względu na ich bliskość do naskórka larwy, NMJ są blokowane przez inne tkanki, co utrudnia uzyskanie obrazów o wystarczającym stosunku sygnału do szumu do analizy na poziomie cząstek. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę dobrze ugruntowane znaczenie presynaptycznych MT dla morfogenezy i stabilizacji synaptycznej36, a także ich powiązania z zaburzeniami neurorozwojowymi i neurodegeneracyjnymi37, wypełnienie tej luki między zrozumieniem pre- i postsynaptycznych MT prawdopodobnie przyniesie bezcenne spostrzeżenia.

Dodatkowym wyzwaniem dla analizy dynamiki MT in vivo w ogóle, w przeciwieństwie do analizy in vitro lub ex vivo, są ograniczone zautomatyzowane narzędzia programowe, które mogą wyodrębnić parametry dynamiki z danych in vivo. Obecnie jedną z najpopularniejszych i najpotężniejszych technik analizy końców MT plus oznaczonych +TIP jest plusTipTracker38,39, oprogramowanie oparte na MATLAB, które umożliwia automatyczne śledzenie i analizę wielu parametrów dynamicznych. Warto zauważyć, że plusTipTracker mierzy nie tylko wzrost MT, ale także kurczenie się i ratowanie: podczas gdy etykiety +TIP, takie jak EB1-GFP, kojarzą się tylko z rosnącymi końcami dodatnimi, plusTipTracker może algorytmicznie wnioskować o wskaźnikach kurczenia się i zdarzeniach ratunkowych. Jednakże, podczas gdy plusTripTracker został z powodzeniem zastosowany w wielu kontekstach, w tym w poprzedniej wieloparametrycznej analizie dynamiki MT ex vivo w komórkach Drosophila S240, plusTipTracker nie jest optymalny do analizy danych in vivo ze względu na ich niższy stosunek sygnału do szumu. W rezultacie, badania in vivo dynamiki plus-end w dendrytach22,23,24,25,26,27 oraz w NMJ35 z Drosophila polegały na ręcznym generowaniu i analizie kymografów za pomocą oprogramowania takiego jak ImageJ41lub na strategiach półautomatycznych, które obejmują liczne komponenty human-in-the-loop.

To badanie przedstawia eksperymentalny i analityczny przepływ pracy, który zmniejsza eksperymentalny i analityczny narzut wymagany do przeprowadzenia nieinwazyjnej analizy na poziomie polimeru dynamiki presynaptycznego MT zarówno w dendrytach czuciowych, jak i na końcu aksonu ruchowego larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym. Protokół wykorzystuje unieruchomione, nienaruszone larwy, dzięki czemu unika się urazów, o których wiadomo, że wywołują reakcje stresowe, a także inne niefizjologiczne stany, które mogą zaburzać dynamikę MT in vivo. Aby oznaczyć dynamiczne plus-endy MT, EB1-GFP jest wyrażany panneuronalnie za pomocą systemu Gal4/UAS42, co umożliwia wizualizację MT zarówno na dendrytach, jak i NMJ za pomocą jednego sterownika. Podczas gdy niektóre wczesne etapy, takie jak wybór próbek zwierząt i identyfikacja regionów do zobrazowania, są nieuchronnie uzależnione od podejmowania decyzji przez człowieka, kroki następujące po uzyskaniu danych są w dużej mierze zautomatyzowane. Co najważniejsze, optymalizacja nowego oprogramowania umożliwiła zautomatyzowaną, bezstronną analizę wymagającą minimalnego wkładu ludzkiego. Chociaż dostępne są inne metody śledzenia cząstek43,44,45, to badanie wykorzystuje zastrzeżone oprogramowanie, ponieważ było ono algorytmicznie dobrze dostosowane do konkretnych wyzwań związanych z tym konkretnym zestawem danych. Oprogramowanie jest teraz dostępne dla użytkowników do różnych zastosowań. W szczególności użycie filtrowania dyfuzyjnego zwiększającego koherencję46 jest integralną częścią automatycznej segmentacji i usuwania tła, a niestandardowe algorytmy są implementowane specjalnie w celu automatyzacji wykrywania i śledzenia cząstek. Strategia ta może skutecznie poradzić sobie z niskim stosunkiem sygnału do szumu nieodłącznie związanym z danymi w tym badaniu, a także z innymi wyzwaniami, takimi jak ruch komet EB1-GFP przez różne płaszczyzny ogniskowe. Chociaż nie jest możliwe wyczerpujące przetestowanie wydajności tego oprogramowania w porównaniu ze wszystkimi innymi programami do analizy cząstek, wydajność obecnej strategii dorównuje lub zbliża się do standardowej wydajności człowieka. Ponadto, zgodnie z wiedzą autorów, nie istniało żadne inne oprogramowanie specjalnie przeszkolone na danych in vivo z dendrytów sensorycznych i terminala presynaptycznego. Biorąc pod uwagę, że wydajność algorytmów analizy obrazu jest często wysoce specyficzna dla danych, dla których zostały zaprojektowane, a uogólnione widzenie komputerowe nie jest jeszcze możliwe, oczekuje się, że trenowanie opisanego oprogramowania do konkretnych danych in vivo, które są przedmiotem zainteresowania, jest najbardziej algorytmicznie uzasadnionym podejściem.

Biorąc pod uwagę intensywne prace nad dendrytycznymi MTs22,23,24,25,26,27 oraz stałą jakość danych, które można uzyskać z tego systemu, strategia pozyskiwania obrazów i analizy oprogramowania została po raz pierwszy zweryfikowana w dendrytach sensorycznych Drosophila. Co ważne, w dendrytach stwierdzono, że użycie różnych neuronalnych sterowników Gal4, nawet w identycznym tle typu dzikiego, powoduje znaczące różnice w dynamice EB1-GFP ze względu na różnice w tle genetycznym, podkreślając znaczenie użycia jednego sterownika Gal4 w celu uzyskania spójnych wyników. Strategia ta została następnie wykorzystana do wieloparametrycznej analizy dynamiki EB1-GFP w presynaptycznym końcu NMJ. Aby jeszcze bardziej zilustrować wartość badawczą tej metody, ta strategia obrazowania i oprogramowania została wykorzystana do oceny zarówno pre-, jak i postsynaptycznej dynamiki EB1-GFP po knockdown dTACC, homologu Drosophila z wysoce konserwatywnej rodziny TACC (transforming acidic coiled coil)47,48. Wcześniejsze prace na komórkach Drosophila S240, a także prace Lowery'ego i współpracowników w klasie Xenopus growth cone49,50,51, wykazały, że członkowie rodziny TACC regulują dynamikę MT plus-end. Co więcej, niedawno zgłoszone dowody z obrazowania immunofluorescencyjnego konfokalnego i superrozdzielczego wykazały, że dTACC jest kluczowym regulatorem presynaptycznych MT podczas morfogenezy neuronów52, co rodzi pytanie, czy dTACC reguluje dynamikę MT na żywo. Raport ten przedstawia metodę, która rzeczywiście może wykryć różnice w zachowaniu MT na żywo po powaleniu przez dTACC. W związku z tym badanie to przedstawia metodę in vivo, która może skutecznie zidentyfikować i scharakteryzować kluczowe regulatory dynamiki MT w rozwijającym się neuronie, szczególnie w przedziale presynaptycznym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generacja okazów Drosophila

  1. Wybrać odpowiedni oznacznik MT plus-end. W tym badaniu wykorzystano EB1 oznaczony GFP, dobrze scharakteryzowany marker końca plusa z silnym, wyraźnym sygnałem11,12. Alternatywy obejmują inne +TIPs, takie jak EB310,13, CLASP/Orbit53 i CLIP-17054.
  2. Pozyskiwanie lub generowanie much ze znacznikiem MT pod kontrolą promotora bezzałogowego systemu powietrznego (np. UAS-EB1-GFP).
  3. Wybierz odpowiedni sterownik Gal4 specyficzny dla danej tkanki. W tym badaniu wykorzystano pan-neuronalny sterownik elaV-Gal458,59 do kierowania ekspresją w obu dendrytach sensorycznych oraz w NMJ i 221-Gal460,61 dla wyrażenia specyficznego dla dendrytu.
  4. Hoduj muchy przy użyciu standardowych technik hodowli much55,56. Zaleca się, aby muchy były trzymane w wilgotnych inkubatorach w temperaturze 25 °C w celu uzyskania optymalnej ekspresji Gal4/UAS.
  5. Korzystając ze standardowych technik genetycznych much55,56, wykonaj krzyżówki, aby wygenerować muchy w celu ekspresji markera MT plus-end w pożądanych komórkach/tkankach.
    UWAGA: Dla każdej kombinacji sterownika Gal4 i transgenu projekt eksperymentalny powinien obejmować eksperymenty potwierdzające słuszność koncepcji i walidację w celu scharakteryzowania systemu i uniknięcia artefaktów wynikających z nadekspresji.

2. Konfiguracja sprzętu

  1. Ustaw stację roboczą, w tym muchy, odczynniki znieczulające, materiały do budowy szkiełek, mikroskop stereoskopowy i źródło światła, w pobliżu mikroskopu konfokalnego (tj. w tym samym pomieszczeniu), aby zminimalizować czas spędzony między przygotowaniem próbki a obrazowaniem, aby przedłużyć zdrowie i żywotność larw.
  2. Przygotuj środek znieczulający, mieszając 9% mieszaninę chloroformu (0,1 ml chloroformu i 1,0 ml oleju halowęglowego) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Aby uniknąć separacji, dobrze wymieszaj, odwracając probówkę przed przygotowaniem każdego nowego szkiełka.
  3. Przygotuj szkiełko podstawowe: Wytnij cztery paski taśmy dwustronnej (o szerokości ~15 mm). Ułóż dwa elementy na szklanym szkiełku, pozostawiając odstęp ~5 mm między paskami. Ułóż pozostałe dwa kawałki na pierwszych dwóch, aby podwoić grubość taśmy (Rysunek 1C).
  4. Dodać dużą kroplę (~100 μL) mieszaniny chloroformu i oleju na szkiełko w odstępie 5 mm między kawałkami taśmy (Rysunek 1C).

3. Przygotowanie próbek larwalnych do obrazowania

  1. Napełnij pojemnik (np. płytkę 6-dołkową) 1x PBS.
  2. Zbierz 3 larwy w stadium rozwojowym z fiolki muchowej za pomocą kleszczy lub podobnego instrumentu. Identyfikuj larwy we właściwym stadium na podstawie ich pełzania i obecności 9–12 wydatnych, ząbkowanych haczyków gębowych. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby pomóc w ocenie larw (Ryc. 1D).
  3. Umieść larwę w PBS i delikatnie nią poruszaj, aby zmyć wszelkie resztki jedzenia lub inne zanieczyszczenia. Delikatnie osusz larwę na delikatnej chusteczce.
  4. Znieczulić larwę, umieszczając ją w kropli chloroformu/oleju na szkiełku z sekcji 2 (Rysunek 1C).
    UWAGA: Orientacja grzbietowa/brzuszna larwy nie jest krytyczna, ponieważ zarówno neurony czuciowe, jak i ruchowe można wykryć przez półprzezroczysty naskórek, ustawiając stolik mikroskopu na odpowiednią płaszczyznę ogniskowej, niezależnie od orientacji preparatu.
  5. Umieść szkiełko nakrywkowe #1.5 na wierzchu. Przyklej szkiełko nakrywkowe do taśmy, delikatnie uciskając, unieruchamiając w ten sposób larwę bez jej uszkodzenia (Rysunek 1C).
  6. Uszczelnij komorę wazeliną lub lakierem do paznokci.

4. Poklatkowe obrazowanie konfokalne żywych próbek

  1. Przygotuj mikroskop konfokalny i soczewkę obiektywową 60x z zanurzeniem w olejku. Umieść próbkę na stole montażowym (Rysunek 1A,B).
  2. Użyj oprogramowania do akwizycji, aby skonfigurować experiments.
    UWAGA: W tym badaniu każda seria obrazowania została uzyskana w jednej płaszczyźnie ogniskowej, a nie w stosie z.
    1. Ustaw czas trwania filmu poklatkowego na 30 s w odstępie 2 s, co daje łącznie 16 klatek.
    2. Ustaw ekspozycję i intensywność lasera, aby zapewnić wystarczający sygnał, unikając nasycenia i fotowybielania.
    3. W przypadku obrazowania EB1-GFP laser 488 nm został ustawiony na czas naświetlania 100 ms i intensywność 30%. Wartości te mogą się różnić dla różnych zastosowań tego protokołu i powinny być modyfikowane empirycznie.
  3. Użyj okularów mikroskopu, aby znaleźć larwę w szerokim zielonym oświetleniu. Znajdź dendryty lub NMJ, powoli dostosowując stolik. Nie wystawiaj larw na działanie oświetlenia (szerokopolowego lub konfokalnego) dłużej niż to konieczne.
    1. Dendryty wyglądają jak cienkie, jasnozielone pajęczyny nerwów, które można łatwo odróżnić od grubych, długich wiązek aksonów (Ryc. 1E).
    2. NMJ pojawiają się jako grupy jasnozielonych pojedynczych butonów o średnicy około 5 μm, na końcach grubych, długich wiązek aksonów, które odchodzą od sznura nerwowego (Ryc. 1F).
  4. Korzystając z obrazu z kamery na żywo, szybko ustaw ostrość na interesujący Cię obszar za pomocą oświetlenia 488 nm. Natychmiast zatrzymaj oświetlenie po znalezieniu właściwej ostrości, aby uniknąć fototoksyczności.
  5. Zainicjuj akwizycję obrazu. Komety EB1 są rozpoznawalne jako jasne, ruchliwe punkty.
  6. Zapoznaj się z wcześniej opublikowanymi protokołami, aby uzyskać dodatkowe informacje i wytyczne dotyczące obrazowania fluorescencji na żywo57.

5. Przetwarzanie i analiza obrazu w oparciu o oprogramowanie

  1. Przeanalizuj każdy plik wideo z osobna. W oprogramowaniu (interfejs użytkownika pokazany w Rysunek 2), wybierz Plik | Import | Sekwencja obrazów i przeciągnij pliki TIF w wyświetlonym polu. Wyświetl podgląd wideo.
  2. W menu Parametry wykrywania dostosuj parametry oprogramowania, aby zapewnić wykrywanie tylko wyraźnie widocznych punktów i uniknąć wykrywania fałszywych obiektów. Na przykład zmniejszenie intensywności cząstek powoduje większą wrażliwość oprogramowania na punkty punktowe, ale zwiększa potencjalne wyniki fałszywie dodatnie. Dokładne wartości parametrów będą się różnić empirycznie. Opisy parametrów wykrywania i śledzenia są dostępne u autorów na żądanie.
  3. Zastosuj przepis Neuron Particle Tracking, aby przeanalizować obraz za pomocą przycisku Od początku (niebieska strzałka, Rysunek 2B). Oprogramowanie wyświetli wyniki dla parametrów śledzenia wymienionych w tabeli 1 do arkusza kalkulacyjnego wyników (zielone pole, Rysunek 2B). Aby ułatwić późniejszą analizę i interpretację, wyniki można przechowywać w arkuszu kalkulacyjnym za pomocą funkcji Eksportuj znajdującej się w sekcji Arkusz kalkulacyjny wyników.
  4. Przesuń kursor do puncta wykrytego w poprzednim kroku i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zaznaczyć lub odznaczyć. Wiele punktów punktowych można wybrać jednocześnie za pomocą Ctrl + lewy przycisk myszy.
    UWAGA: W zależności od celów projektu i zastosowań, do filtrowania znaków interpunkcyjnych mogą być stosowane dodatkowe heurystyki. Na przykład punkty szybkiego życia o czasie życia krótszym niż 8–10 s (4–5 klatek) mogą zostać pominięte, ponieważ nie zawierają wystarczających informacji o całym zdarzeniu wzrostu. Potrzeba takich heurystyk będzie się różnić empirycznie. Dodatkowe informacje na temat funkcjonalności oprogramowania są dostępne u autorów na życzenie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muchy zostały wyhodowane ze stabilnych stad, które konstytutywnie wyrażają transgen UAS-EB1-GFP albo panneuronalnie (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58,59 lub w neuronach czuciowych (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)60,61. EB1 został wybrany do tego badania, ponieważ specyficznie lokalizuje się na rosnących końcach i dysocjuje natychmiast po pauzie i skurczeniu14,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule omówiono protokół wykonywania nieinwazyjnego obrazowania przyżyciowego dynamiki MT w dendrytach i w NMJ podczas rozwoju. Wkład człowieka jest wymagany na etapach doświadczalnych, takich jak wybór zwierząt do obrazowania, i może wprowadzać stronniczość w procesie gromadzenia danych, której nie można racjonalnie usunąć. W związku z tym kluczowym celem protokołu jest zminimalizowanie stronniczości wszędzie tam, gdzie to możliwe, poprzez przeprowadzenie automatycznej analizy za pomocą nowego oprogramowania (sekcja...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy Hoyin Lai, Michael Jones, Hideki Sasaki, Luciano A.G. Lucas, Sam Alworth (dawniej) i James Shih-Jong Lee są pracownikami firmy DRVision Technologies LLC, która produkuje oprogramowanie używane w tym protokole.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy naszym kolegom z laboratorium Van Vactor i z DRVision oraz doktorom Maxowi Heimanowi, Pascalowi Kaeserowi, Davidowi Pellmanowi i Thomasowi Schwarzowi za pomocną dyskusję. Dziękujemy dr Melissie Rolls za hojne dostarczenie elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-DCR2 oraz 221-Gal4; Akcje UAS-EB1-GFP wykorzystane w tym badaniu. Dziękujemy dr Jennifer Waters i dr Annie Jost z Centrum Obrazowania Nikon na Harvardzie za ekspertyzę w zakresie mikroskopii świetlnej. Praca ta jest finansowana przez National Institutes of Health (F31 NS101756-03 do V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D do J.S.L.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlEppendorf21008-959Przygotowanie próbki
1000 &mikro; L Końcówki do pipet TipOneUSA Scientific1111-2721Przygotowanie próbki
200 &mikro; L Końcówki do pipet TipOneUSA Scientific1120-8710Przygotowanie próbki
221-Gal4 muchyBloomington Drosophila Stock Center (US)26259Genetyka Drosophila / krzyżówki Soczewka obiektywowa
60xNikonPlan Apo 60x OlejAkwizycja obrazu
Płytka 6-dołkowaBD Falcon353224Przygotowanie próbki
AgarMoorAgar41084Pokarm dla Drosophila
AiviaDRVision LLCZoptymalizowane w ramach tego badania
Chloroform (stabilizowany amylenami)Sigma-AldrichC2432Przygotowanie próbki
Dmuchawka CO2 (do selekcji much do krzyżówek)Genesee54-104Genetyka Drosophila / krzyżówki
Bełkot CO2 (do selekcji much do krzyżówek)Genesee59-180Genetyka Drosophila / krzyżówki
Chłodzona kamera CCDHamamatsuORCA-R2Akwizycja obrazu
Mąka kukurydzianaGenesee62-101Żywność Drosophila
destylowanaŻywność Drosophila
Taśma dwustronnaTaśma SzkockaPrzygotowanie próbki
Fiolki DrosophilaGenesee32-109Żywność Drosophila
Zatyczki Droso (korki piankowe do fiolek)Genesee59-200Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox KleszczeFine Science Tools11252-20Przygotowanie próbki
elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-DCR2 leciPrezent Melissy Rolls (Penn State University)Nie dotyczygenetyki Drosophila/krzyżówek
Etanol (95%)VWR75811-022Żywność Drosophila
Oświetlacz światłowodowy/źródło światła do mikroskopu stereoskopowegoNikonNI-150Przygotowanie próbki
Flypad (do wyboru much do krzyżówek)Genesee59-172Genetyka Drosophila / krzyżówki
Forma Komora/InkubatorŚrodowiskowy ThermoFisher3940Genetyka Drosophila / krzyżówki Olej
halowęglowy 700Sigma-AldrichH8898Przygotowanie próbki
Olejek immersyjnyNikonMXA22168Akwizycja obrazu
Kimwipe Delikatne chusteczkiFisher Scientific34120Przygotowanie próbki
Moduł scalania laserowegoSpectral Badania stosowaneLMM-5Akwizycja obrazu
Źródło światła do konfokalnegoLumentoraSOLA 54-10021Akwizycja obrazu
Mikroskopia MetaMorph Automatyzacja i Oprogramowanie do analizy obrazumolekularneAkwizycja obrazu
Mikro okulary ochronne, kwadratowe, nr 1 1/2 (#1.5)VWR48366-205Przygotowanie próbki
Zmotoryzowany mikroskop odwrócony z systemem Perfect FocusNikonTI-ND6-PFS-SAkwizycja obrazu
Zmotoryzowany stolik i żaluzjeWcześniejszyProscan IIIAkwizycja obrazu
Nożyczki wielofunkcyjneScotchMMM1428Przygotowanie próbki
Lakier do paznokciSally Hansen784179032016 074170382839Przygotowanie próbki
Filtr optycznyChromaET480/40mAkwizycja obrazu
P1000 PipetmanGilsonF123602Przygotowanie próbki
P200 PipetmanGilsonF123601Przygotowanie próbki
PBS (10X) ph 7,4ThermoFisher70011044Przygotowanie próbki
Kwas propionowyFisherA258-500Żywność Drosophila
Skaner konfokalny z wirującym dyskiemYokagawaCSU-X1Akwizycja obrazu
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ800NPrzygotowanie próbki
Cukier (sacharoza)Genesee62-112Drysophila food
Superfrost SlideVWR48311-600Przygotowanie próbki
TegoseptGenesee20-258Drosophila food
UAS-dtacc-RNAi leciWiedeń Drosophila Resource Center (Wiedeń, Austria)VDRC-101439Genetyka Drosophila / krzyżówki
Wazelina wazelinawazelina DVOCB311003Mason Przygotowanie próbki
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, rozmiar 0Zszywki5012000Genetyka Drosophila/krzyżówki
DrożdżeVWRTorula Drożdże IC90308580Drosophila food
Yokogawa dichroiczny beamsplitterSemrockDi01-T405/488/568/647-13x15x0.5Akwizycja obrazu
Woda Urządzenia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rolls, M. M. Neuronal polarity in Drosophila: Sorting out axons and dendrites. Developmental Neurobiology. 71 (6), 419-429 (2011).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: Mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11 (5), 316-328 (2010).
  3. Lewis, T. L., Courchet, J., Polleux, F. Cell biology in neuroscience: Cellular and molecular mechanisms underlying axon formation, growth, and branching. Journal of Cell Biology. 202 (6), 837-848 (2013).
  4. Kandel, E. R. The Molecular Biology of Memory Storage: A Dialogue Between Genes and Synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  5. Turney, S. G., Lichtman, J. W. Chapter 11: Imaging Fluorescent Mice In Vivo Using Confocal Microscopy. Methods in Cell Biology. 89 (8), 309-327 (2008).
  6. McCann, C. M., Lichtman, J. W. In vivo imaging of presynaptic terminals and postsynaptic sites in the mouse submandibular ganglion. Developmental Neurobiology. 68 (6), 760-770 (2008).
  7. Turney, S. G., Walsh, M. K., Lichtman, J. W. In vivo imaging of the developing neuromuscular junction in neonatal mice. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1166-1176 (2012).
  8. Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. Journal of Cell Biology. 128 (1-2), 139-155 (1995).
  9. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. Journal of Cell Biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  10. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  11. Tirnauer, J. S., Bierer, B. E. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability. Journal of Cell Biology. 149 (4), 761-766 (2000).
  12. Schwartz, K., Richards, K., Botstein, D. BIM1 encodes a microtubule-binding protein in yeast. Molecular Biology of the Cell. 8 (12), 2677-2691 (1997).
  13. Juwana, J. P., et al. EB/RP gene family encodes tubulin binding proteins. International Journal of Cancer. 81 (2), 275-284 (1999).
  14. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 309-322 (2008).
  15. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: Two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
  16. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic Instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  17. Van De Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Rebollo, E., Karkali, K., Mangione, F., Martín-Blanco, E. Live imaging in Drosophila: The optical and genetic toolkits. Methods. 68 (1), 48-59 (2014).
  19. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  20. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22 (4), 719-729 (1999).
  21. Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Current Biology. 15 (7), 684-689 (2005).
  22. Rao, K., et al. Spastin, atlastin, and ER relocalization are involved in axon but not dendrite regeneration. Molecular Biology of the Cell. 27 (21), 3245-3256 (2016).
  23. Hill, S. E., et al. Development of dendrite polarity in Drosophila neurons. Neural Development. 7, 34(2012).
  24. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  25. Mattie, F. J., et al. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Current Biology. 20 (24), 2169-2177 (2010).
  26. Stone, M. C., Roegiers, F., Rolls, M. M. Microtubules Have Opposite Orientation in Axons and Dendrites of Drosophila Neurons. Molecular Biology of the Cell. 19 (10), 4122-4129 (2008).
  27. Rolls, M. M., et al. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2, 7(2007).
  28. Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. Journal of Neuroscience. 28 (49), 13094-13105 (2008).
  29. Merriam, E. B., et al. Dynamic microtubules promote synaptic NMDA receptor-dependent spine enlargement. PLoS One. 6 (11), 27688(2011).
  30. Hu, X., et al. BDNF-induced increase of PSD-95 in dendritic spines requires dynamic microtubule invasions. Journal of Neuroscience. 31 (43), 15597-15603 (2011).
  31. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  32. Jaworski, J., et al. Dynamic Microtubules Regulate Dendritic Spine Morphology and Synaptic Plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  33. Dent, E. W. Of microtubules and memory: Implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  34. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 198-205 (2007).
  35. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. Journal of Neuroscience. 28 (44), 11111-11123 (2008).
  36. Ruiz-Cañada, C., Budnik, V. Synaptic cytoskeleton at the neuromuscular junction. International Review of Neurobiology. 75 (6), 217-236 (2006).
  37. Bodaleo, F. J., Gonzalez-Billault, C. The presynaptic microtubule cytoskeleton in physiological and pathological conditions: lessons from Drosophila Fragile X syndrome and hereditary spastic paraplegias. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 60(2016).
  38. Applegate, K. T., et al. PlusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  39. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  40. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and Cellular Biology. 33 (8), 1528-1545 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  42. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  43. Ma, Y., Wang, X., Liu, H., Wei, L., Xiao, L. Recent advances in optical microscopic methods for single-particle tracking in biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4445-4463 (2019).
  44. Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
  45. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  46. Weickert, J. Coherence-Enhancing Diffusion Filtering. International Journal of Computer Vision. 31 (2-3), 111-127 (1999).
  47. Peset, I., Vernos, I. The TACC proteins: TACC-ling microtubule dynamics and centrosome function. Trends in Cell Biology. 18 (8), 379-388 (2008).
  48. Hood, F. E., Royle, S. J. Pulling it together. Bioarchitecture. 1 (3), 105-109 (2011).
  49. Lucaj, C. M., et al. Xenopus TACC1 is a microtubule plus-end tracking protein that can regulate microtubule dynamics during embryonic development. Cytoskeleton. 72 (5), 225-234 (2015).
  50. Nwagbara, B. U., et al. TACC3 is a microtubule plus end-tracking protein that promotes axon elongation and also regulates microtubule plus end dynamics in multiple embryonic cell types. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3350-3362 (2014).
  51. Rutherford, E. L., et al. Xenopus TACC2 is a microtubule plus end-tracking protein that can promote microtubule polymerization during embryonic development. Molecular Biology of the Cell. 27 (20), 3013-3020 (2016).
  52. Chou, V. T., Johnson, S., Long, J., Vounatsos, M. dTACC restricts bouton addition and regulates microtubule organization at the Drosophila neuromuscular junction. Cytoskeleton. 77 (1-2), 4-15 (2019).
  53. Maiato, H., et al. Human CLASP1 Is an Outer Kinetochore Component that Regulates Spindle Microtubule Dynamics. Cell. 113 (7), 891-904 (2003).
  54. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs persistent growth in the cell interior , asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115, Pt 17 3527-3539 (2002).
  55. Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  56. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  57. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2007).
  58. Berger, C., Renner, S., Lüer, K., Technau, G. M. The commonly used marker ELAV is transiently expressed in neuroblasts and glial cells in the Drosophila embryonic CNS. Developmental Dynamics. 236 (12), 3562-3568 (2007).
  59. Robinow, S., White, K. Characterization and spatial distribution of the ELAV protein during Drosophila melanogaster development. Journal of Neurobiology. 22 (5), 443-461 (1991).
  60. Parrish, J. Z., Kim, M. D., Lily, Y. J., Yuh, N. J. Genome-wide analyses identify transcription factors required for proper morphogenesis of Drosophila sensory neuron dendrites. Genes and Development. 20 (7), 820-835 (2006).
  61. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  62. Zhang, T., et al. Microtubule plus-end binding protein EB1 is necessary for muscle cell differentiation, elongation and fusion. Journal of Cell Science. 122 (9), 1401-1409 (2009).
  63. Yang, C., et al. EB1 and EB3 regulate microtubule minus end organization and Golgi morphology. Journal of Cell Biology. 216 (10), 3179-3198 (2017).
  64. Allison, A., Nunn, J. Effect of general anaesthetics on microtubules. Lancet. 292 (7582), 1326-1329 (1968).
  65. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (67), e3780(2012).
  66. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998(2014).
  67. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible neurotechnique cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (5), 451-461 (1999).
  68. Resh, M. D. Fatty acylation of proteins: New insights into membrane targeting of myristoylated and palmitoylated proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1451 (1), 1-16 (1999).
  69. Edwards, K. A., Demsky, M., Montague, R. A., Weymouth, N., Kiehart, D. P. GFP-moesin illuminates actin cytoskeleton dynamics in living tissue and demonstrates cell shape changes during morphogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 191 (1), 103-117 (1997).
  70. Riedl, J., et al. Lifeact a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  71. Dent, E. W., Kalil, K. Axon Branching Requires Interactions between Dynamic Microtubules and Actin Filaments. Journal of Neuroscience. 21 (24), 9757-9769 (2001).
  72. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. Journal of Cell Biology. 158 (1), 139-152 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Particle TrackingSynaptic Microtubule DynamicsDrosophila Neuromuscular JunctionEB1 GFP Labeled MTsConfocal Image AnalysisdTACC KnockdownAutomated Particle DetectionMultiparametric AnalysisLive Time Lapse ImagingPresynaptic MT Dynamics
Video Coming Soon

Related Articles