Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

DOI:

10.3791/61160

⸱

29 maja 2020

 ,  ,  ,  , 
1Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Endocrinology, Beijing Hospital, National Center of Gerontology; Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Department of endocrinology, Guangzhou First People's Hospital, School of Medicine, South China University of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelujemy prosty multipleksowany test ECL, który łączy ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Test jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu innych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i autoimmunologicznego zespołu wielogruczołowego 1.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym (IAbs) są szeroko stosowane w diagnostyce i przewidywaniu cukrzycy typu 1 (T1D). Cztery główne IAb do insuliny (IAA), dekarboksylaza glutaminianu-65 (), antygen insulinomy-2 (IA-2A) i transporter-8 (ZnT8A) są równie ważne w przewidywaniu choroby. Obecnie u 40% pacjentów, u których zdiagnozowano cukrzycę typu 1, rozwijają się inne zaburzenia autoimmunologiczne. Niestety, obecne metody badań przesiewowych wykorzystujące pojedyncze autoprzeciwciało do pomiaru są pracochłonne i nieefektywne w przypadku badań przesiewowych na dużą skalę. Niedawno opracowaliśmy prosty test elektrochemiluminescencji multipleksowej (ECL), aby rozwiązać te aktualne problemy. Test łączy wszystkie 7 testów autoprzeciwciał w jednym dołku. Każda studzienka zawiera trzy IAb (IAA, i IA-2A), autoprzeciwciała przeciwko peroksydazie tarczycowej (TPOA) i globuliny tarczycy (ThGA) do wykrywania autoimmunologicznej choroby tarczycy, autoprzeciwciała przeciwko transglutaminazie tkankowej (TGA) w celiakii oraz autoprzeciwciała przeciwko interferonowi alfa (IFNαA) w autoimmunologicznym zespole wielogruczołowym-1 (APS-1); wszystkie z nich prowadzą badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i innych istotnych chorób autoimmunologicznych jednocześnie. Multipleksowy test ECL jest oparty na pojedynczej platformie testowej ECL, ale zamiast tego wykorzystuje płytkę multipleksową łączącą wiele testów autoprzeciwciał, do 10, w jednym dołku. Główna różnica w stosunku do pojedynczego testu ECL polega na tym, że każdy kompleks przeciwciało-antygen utworzony w fazie płynnej jest ograniczony w określonym miejscu na każdym dołku za pomocą systemu łącznikowego na płytce multipleksowej. Test 7-Plex ECL w niniejszym badaniu jest walidowany w porównaniu ze standardowymi testami wiązania promieniotwórczego (RBA) i pojedynczymi testami ECL, przy użyciu dużej kohorty nowo zdiagnozowanych pacjentów z cukrzycą typu 1 i zdrowych osób kontrolnych w tym samym wieku, co skutkuje doskonałą czułością i swoistością testu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cukrzyca typu 1 (T1D) jest poważną chorobą przewlekłą, która najczęściej występuje w dzieciństwie. Obecnie około 1,4 miliona osób w Stanach Zjednoczonych ma cukrzycę typu 1; Uderzające jest to, że częstość występowania cukrzycy typu 1 stale rośnie w tempie 3-5% każdego roku na całym świecie i podwoiła się w ciągu ostatnich dwóch dekad, zwłaszcza u małych dzieci1,2. Autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym (IAb) w krążeniu krwi są obecnie najbardziej wiarygodnym biomarkerem. IAb mogą pojawić się na wiele lat przed rozwojem klinicznej cukrzycy typu 13. Obecnie cztery główne IAb są szeroko stosowane w diagnostyce cukrzycy typu 1 i badaniach przesiewowych ryzyka, w tym autoprzeciwciała przeciwko insulinie (IAA), dekarboksylazie glutaminianu-65 (), antygenowi insulinoma-2 (IA-2A) i transporterowi-8 (ZnT8A). Te cztery IAb są równie ważne w przewidywaniu rozwoju cukrzycy typu 1. Klasyfikacja cukrzycy typu 1 została niedawno ponownie zdefiniowana jako obecność ≥2 dowolnych 4 IAb z prawidłowym metabolizmem glukozy jako stadium choroby 14.

W badaniu Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) ujawniono, że jedno na czworo dzieci zagrożonych T1D prawdopodobnie rozwinie się w stan autoimmunizacji wysp trzustkowych, celiakii, tarczycy lub reumatoidalnej, a co bardziej uderzające, około 40% pacjentów, u których zdiagnozowano cukrzycę typu 1, ostatecznie rozwija dodatkową chorobę autoimmunologiczną5,6,7. Identyfikacja autoprzeciwciał ma zasadnicze znaczenie dla przewidywania i diagnozowania tych chorób autoimmunologicznych i powinna zapewnić lepszą opiekę kliniczną pacjentom. Obecnie nie ma łatwego i niedrogiego sposobu na badania przesiewowe w kierunku tych wielu chorób autoimmunologicznych. Obecne metody badań przesiewowych wykorzystujące standardowy test wiązania promieniotwórczego (RBA), z pojedynczym pomiarem autoprzeciwciał, są pracochłonne i nieefektywne w przypadku badań przesiewowych na dużą skalę.

Tutaj będziemy opisywać nowo opracowany prosty multipleksowany test ECL, który uwierzytelniliśmy za pomocą pojedynczej platformy testowej ECL8,9,10,11. Multipleksowy test ECL łączy 7 testów autoprzeciwciał w jednym dołku, przy użyciu tylko 15 μl surowicy, i jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu istotnych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i APS-1. Test ZnT8A ECL nie został jeszcze opracowany w tym czasie i nie został włączony do testu multipleksowego. Multipleksowy test ECL stanowi doskonałe narzędzie do wysokowydajnych badań przesiewowych w populacji ogólnej w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół badawczy został zatwierdzony przez Colorado Multiple Institutional Review Board.

1. Przygotowanie bufora

  1. Przygotuj bufor do etykietowania (2x PBS, pH 7,9). Używając 400 ml destylowanej wody dejonizowanej (DD), dodaj 100 ml 10x PBS. Aby dostosować pH roztworu, dodawaj NaOH, aż osiągnie 7,9.
  2. Stworzyć 3 mM biotyny, rozpuszczając 1 mg biotyny w 588 μl wcześniej utworzonego buforu znakującego. Wykonać 3 mM Ru Sulfo-NHS, rozpuszczając 150 nmol Ru Sulfo-NHS w 50 μl buforu do znakowania.
  3. Przygotować bufor antygenowy (1% BSA), biorąc 500 ml 1x PBS i dodając 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do roztworu. Przygotować 0,5 M roztworu kwasu octowego. Przygotować 1 M bufor Tris-HCl za pomocą Trizma Base i dostosować pH do 9,0.
  4. Do buforu powlekającego (3% Bloker A) weź 500 ml 1x PBS i dodaj 15 g Blockera A. Przygotuj bufor do przemywania (0,05 % Tween 20, PBST), mieszając 5000 ml 1x PBS z 2,5 ml Tween 20. Utwórz bufor odczytu (2x bufor do odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym), dodając 500 ml wody DD i 500 ml 4 ml buforu odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym.
    UWAGA: Aby zachować spójność między testami, ważne jest, aby zarówno roztwory biotyny, jak i Ru Sulfo-NHS były tworzone tuż przed procedurą etykietowania i nie były tworzone i przechowywane do wykorzystania w przyszłości.

2. Znakowanie każdego białka antygenowego biotyną i Ru Sulfo-NHS osobno

UWAGA: Aby uzyskać bardziej efektywną reakcję znakowania, użyj stężenia białka antygenowego ≥0,5 mg/ml.

  1. Obliczyć liczbę molową każdego białka antygenowego oraz liczbę molową biotyny i Ru Sulfo-NHS. Dodać odpowiednią ilość biotyny lub Ru Sulfo-NHS do białka antygenowego w celu znakowania reakcji zgodnie ze stosunkiem molowym białka antygenu do biotyny lub Ru Sulfo-NHS.
    1. W przypadku antygenu o mniejszej masie cząsteczkowej (≤10 kDa), takiego jak białko proinsuliny, należy zastosować stosunek molowy 1:5 (antygen: biotyna i Ru Sulfo-NHS). W przypadku antygenu o większej masie cząsteczkowej (>50 kDa), takiego jak białko, należy użyć stosunku molowego 1:20. W przypadku antygenu o średniej masie cząsteczkowej (10-50 kDa) należy zastosować stosunek molowy dostosowany w zakresie 1:5-1:20.
  2. Zarówno w przypadku biotyny, jak i Ru Sulfo-NHS należy podzielić masę każdego antygenu przez odpowiadającą mu masę cząsteczkową, aby uzyskać liczbę molową antygenu dla każdego z nich. Podziel liczbę molową przez stężenie, aby uzyskać objętość biotyny. Powtórz to dla Ru Sulfo-NHS.
  3. Wymieszać białko antygenu z biotyną przy użyciu odpowiedniego stosunku molowego, określonego w kroku 2.2. Następnie zrób to samo dla Ru Sulfo-NHS.
    UWAGA: Aby zapewnić skuteczność reakcji znakowania, wszelkie redukujące chemikalia, takie jak Tris lub glicyna w systemie buforowym, muszą zostać zamienione na bufor 2x PBS o pH 7,9 przez kolumnę wirującą do zaklejania. Protokoły etykietowania biotyny i Ru Sulfo-NHS są identyczne.
  4. Przykryj probówki reakcyjne folią aluminiową i inkubuj je w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę. Powodem przykrywania probówek reakcyjnych folią jest to, że zarówno biotyna, jak i odczynniki Ru Sulfo-NHS są wrażliwe na światło.
  5. Zalać kolumnę wirową o pojemności 2 ml lub 5 ml podczas inkubacji probówek reakcyjnych (wielkość kolumny wirowej zależy od objętości wprowadzonej do kolumny). Napełnij kolumnę wirową buforem 2x PBS, a następnie odwiruj ją przy 1 000 x g przez 2 minuty za każdym razem, w sumie trzy razy.
  6. Przerwać reakcję znakowania po zakończeniu inkubacji probówek reakcyjnych. Aby zatrzymać reakcję, należy oczyścić znakowane białko antygenowe, przepuszczając je raz przez kolumnę wirową. Następnie odwirować kolumnę o sile 1 000 x g przez 2 minuty.
  7. Obliczyć całkowite stężenie znakowanego antygenu, dzieląc ilość obecnego białka antygenowego przez objętość końcową. Podwielokrotność 50 μl oczyszczonego, znakowanego białka antygenowego na probówkę i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C do długotrwałego stosowania.
    UWAGA: Ważne jest, aby mieć świadomość, że za każdym razem, gdy kolumna wirowa przechodzi przez białko antygenowe, nastąpi około 90-95% wskaźnik retencji.

3. Zdefiniuj najlepsze stężenie i proporcje dla dwóch znakowanych antygenów do testu (test szachownicy)

UWAGA: Ponieważ test ECL-IAA w tym teście 7-Plex wymaga kwasowego traktowania próbek surowicy, test szachownicy dla każdego antygenu musi przejść przez ten etap przed inkubacją z oznakowaną mieszaniną antygenów.

  1. Zastosuj test szachownicy dla każdego antygenu osobno przed uruchomieniem testu multipleksowego. W krokach 3.2-3.6 jako przykładu zostanie użyty GAD65.
  2. Obliczać Rozcieńczenie znakowanego białka GAD65. Zalecane stężenie docelowe pierwszego roztworu mieszaniny biotynylowanego GAD65 wynosi 2000 ng/ml, a Ru Sulfo-NHS oznaczonego GAD65 wynosi 1000 ng/ml. Jeśli stężenie zarówno biotynylowanego, jak i znakowanego Ru Sulfo-NHS GAD65 w roztworze podstawowym wynosi 1,0 μg/μL, objętość potrzebna do biotynylowania GAD65 w 560 μl roztworu roboczego wyniesie 1,12 μL, a objętość potrzebna do uzyskania GAD65 znakowanego Ru Sulfo-NHS w 700 μl roztworu roboczego wyniesie 0,7 μL.
  3. Wymieszaj 1,12 μl biotynylowanego białka GAD65 z 240 μl łącznika sprzężonego ze streptawidyną 1 w jednej probówce i 160 μl 1% BSA. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodać 160 μl roztworu zatrzymującego do probówki i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut.
  4. Wykonaj seryjne rozcieńczenie. Pobrać 280 μl mieszaniny do nowej probówki i dodać 280 μl roztworu zatrzymującego w celu uzyskania rozcieńczenia w stosunku 1:2. Przygotuj kilka nowych probówek. Powtórz ten krok, aby uruchomić poziome seryjne rozcieńczanie antygenu GAD65 znakowanego biotyną (patrz poprzednia publikacja12).
  5. Wymieszaj 0,7 μl białka GAD65 znakowanego Ru Sulfo-NHS (1 μg/μL) z 700 μl roztworu zatrzymującego. Następnie pobrać 350 μl mieszaniny do nowej probówki i dodać 350 μl roztworu zatrzymującego, aby uzyskać rozcieńczenie 1:2. Przygotuj kilka nowych probówek, powtórz ten krok, aby uruchomić pionowe seryjne rozcieńczanie antygenu GAD65 znakowanego Ru Sulfo-NHS.
  6. Przygotować dwie próbki surowicy, jedną próbkę wysoce dodatnią na obecność i jedną próbkę ujemną na obecność, każda o objętości 0,75 ml. Podwielokrotność 15 μl dodatniej surowicy do każdego dołka w lewej połowie 96-dołkowej płytki PCR. Podwielokrotność 15 μl ujemnej surowicy do każdego dołka w prawej połowie 96-dołkowej płytki PCR.
  7. Dodać 18 μl 0,5 M kwasu octowego do każdej studzienki i wymieszać. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować nową 96-dołkową płytkę do PCR. Dodać 17,5 μl antygenu znakowanego biotyną i 17,5 μl antygenu znakowanego Ru Sulfo-NHS do każdej studzienki zgodnie z seryjnymi rozcieńczeniami (patrz poprzednia publikacja12).
  8. Kontynuuj pozostałe etapy oznaczania opisane w krokach od 5.2 do 9.1.
  9. Określić stosunek sygnału z próbek o wysokim poziomie dodatnim do odpowiadających im ujemnych sygnałów próbki. Wybierz najlepsze stężenie dla antygenu znakowanego biotyną i antygenu znakowanego Ru Sulfo-NHS, identyfikując punkt, który ma najwyższy lub bliski najwyższego stosunek sygnału dodatniego do ujemnego. W tym obliczeniu współczynnika należy wziąć pod uwagę niski sygnał tła uzyskany z próbek ujemnych.
    UWAGA: Optymalne stężenia Ru Sulfo-NHS i białek antygenowych znakowanych biotyną z testów szachownicowych przedstawiono poniżej: 30 ng/ml i 200 ng/ml dla GAD65, 120 ng/ml i 120 ng/ml dla proinsuliny, 10 ng/ml i 42 ng/ml dla IA-2, 80 ng/ml i 80 ng/ml dla TG, 8 ng/ml i 16 ng/ml dla TPO, 31 ng/ml i 31 ng/ml dla ThG oraz 12 ng/ml i 12 ng/ml dla IFNα.

4. Utwórz mieszane rozwiązanie antygenowe sprzężone z łącznikiem

  1. Wybierz optymalne stężenie dla każdego antygenu na podstawie testu szachownicy. Rozcieńczyć biotynę i antygen znakowany Ru Sulfo-NHS do racjonalnego stężenia roboczego.
  2. Zwiąż różne łączniki z każdym z unikalnie biotynylowanych białek antygenowych. W jednym teście na płytce 96-dołkowej wymieszaj 4 μl biotynylowanego białka GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsuliny, IFN-α i IA-2 z 240 μl łącznika 1, 2, 3, 4, 8, 9 i 10 sprzężonego ze streptawidyną w oddzielnej probówce (Rysunek 1). Następnie dodać 156 μl PBS/1% BSA na probówkę. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  3. Do każdej probówki dodać 160 μl roztworu zatrzymującego i inkubować je w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut. Weź 400 μl antygenu sprzężonego z łącznikiem z każdej probówki i połącz ze sobą wszystkie 7 antygenów. Dodać 1,2 ml roztworu zatrzymującego, a następnie dodać 4 μl Ru Sulfo-NHS znakowanego GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsuliny, IFN-α i antygenu IA-2 do mieszaniny. Teraz roztwór antygenu jest gotowy do użycia w teście.

5. Inkubuj próbki surowicy z oznaczonym antygenem

UWAGA: Ponieważ test ECL-IAA w tym teście 7-Plex wymaga kwaśnego traktowania próbek surowicy, każda surowica wymaga etapu obróbki kwasem przed inkubacją z znakowaną mieszaniną antygenów dla tego testu 7-Plex.

  1. Podwielokrotność 15 μl surowicy na dołek na 96-dołkową płytkę PCR. Dodać 18 μl 0,5 M kwasu octowego do każdej studzienki i wymieszać. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować nową 96-dołkową płytkę do PCR i podać porcję 35 μl roztworu antygenu do każdej studzienki.
  2. Podczas gdy płytka jest nadal w inkubacji, dodaj 13 μl 1 M buforu Tris pH 9,0 do każdej studzienki na płytce antygenowej. Dodaj bufor z boku każdej studzienki, aby ograniczyć mieszanie buforu Tris i antygenu. Po zakończeniu inkubacji pobrać 25 μl surowicy poddanej działaniu kwasu i natychmiast odpipetować ją do każdego dołka na płytce antygenowej. Wymieszać roztwór i przykryć płytkę folią uszczelniającą PCR, aby uniknąć ekspozycji na światło.
  3. W temperaturze pokojowej umieścić płytkę na wytrząsarce ustawionej na niskich obrotach na 1 godzinę. Następnie przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C i pozostawić płytkę do inkubacji przez 18-24 godziny.

6. Przygotuj płytę multipleksową

  1. Wyjmij płytkę multipleksową z lodówki o temperaturze 4 °C i pozwól, aby płyta znalazła się w stanie RT. Gdy płytka multipleksu znajdzie się w temperaturze pokojowej, dodaj 150 μl 3% blokera A do każdej studzienki. Przykryj płytkę multipleksu folią uszczelniającą. Inkubować płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Dzień 1 testu obejmuje kroki od 4 do 6.

7. Surowica/antygen transferowy inkubuje się do płytki multipleksowej

  1. Następnego dnia połóż ręczniki papierowe na stole i wyjmij z lodówki płytkę do inkubacji multipleksu. Opróżnij cały bufor z płyty. Aby to zrobić, odwróć talerz do góry nogami i wklep go w przygotowane ręczniki papierowe, aż w żadnym z dołków nie będzie bufora.
  2. Umyj płytkę multipleksową, dodając 150 μl PBST do każdej studzienki. Odrzuć bufor, jak wspomniano w kroku 7.1, i powtórz ten krok trzy razy. Dodać 30 μl inkubacji surowicy/antygenu do każdego dołka na płytce multipleksowej. Przykryj płytkę folią, aby ograniczyć jej ekspozycję na światło. Umieść płytkę na wytrząsarce do talerzy, ustawionej na niską prędkość, przy temperaturze obrotowej na 1 godzinę.

8. Umyj płytkę i dodaj bufor do odczytu.

  1. Wyjąć inkubację surowicy/antygenu z płytki multipleksowej, przytrzymując płytkę do góry nogami i wytrząsając roztwór. Dodać 150 μl PBST do wszystkich studzienek i usunąć bufor z płytki, ponownie przytrzymując płytkę do góry nogami i wytrząsając roztwór. Powtórz ten krok trzy razy. Po zakończeniu trzeciego płukania dodaj 150 μl buforu odczytowego do każdej studzienki.
    UWAGA: Pęcherzyki powietrza zakłócają zdolność czytnika płyt do dokładnej analizy wyników płyt i należy ich unikać za wszelką cenę.

9. Przeczytaj tabliczkę i przeanalizuj dane

  1. Policz przygotowaną płytkę na czytniku płytek, odczytując wszystkie wartości w zliczeniach na sekundę (CPS).
  2. Obliczyć wskaźnik względny dla testu, używając poziomów przeciwciał uzyskanych z czytnika płytek, za pomocą następującego równania:
    Wartość indeksu = [CPS (próbka) - CPS (norma ujemna)] / [CPS (norma dodatnia) - CPS (norma ujemna)].
  3. Określ, które wyniki przeciwciał są ujemne lub dodatnie, korzystając z ustalonych punktów odcięcia.
    UWAGA: Dzień testu 2 obejmuje kroki od 7 do 9.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza wyników testów została pokazana w Tabeli 1, Tabeli 2 i Tabeli 3. Odczytane wartości pochodzą z danych z 10 miejsc w tej samej studzience. Wartości indeksów dla każdej próbki obliczono w odniesieniu do odpowiadających im wewnętrznych kontroli dodatnich i ujemnych, jak opisano w protokole testu. Przykłady nieprawidłowych duplikatów przedstawiono w tabeli 1 i spowodowały one końcowy błąd w obliczeniach indeksu w tabeli 3. Wszystkie surowe wartości zliczania muszą być sprawdzone, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych.

Test ECL z 7 multipleksami został zweryfikowany przy użyciu dużej kohorty próbek od 1026 nowo zdiagnozowanych pacjentów z T1D i 1022 zdrowych osób z grupy kontrolnej pod względem wieku i płci. Poziomy autoprzeciwciał z testu 7-Plex ECL dla 1026 pacjentów z T1D porównano z poziomami z każdego z naszych odpowiednich ustalonych pojedynczych testów ECL, jak pokazano na Rysunek 2 oraz z każdego odpowiadającego pojedynczego standardu RBA i ELISA, jak pokazano w Rysunek 3. Swoistości testu ustalono identycznie na poziomie 99. percentyla dla wszystkich testów autoprzeciwciał z wyjątkiem autoprzeciwciał tarczycy (gdzie zastosowano 95. percentyl), z 1022 zdrowych osób kontrolnych dla wszystkich trzech metod oznaczania (7-Plex ECL, pojedynczy ECL, RBA lub ELISA), jak wymieniono w tabeli 4. Międzytestowe CV, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA i IFNαA wynoszą odpowiednio 6,4%, 4,5%, 9,1%, 4,9%, 5,7%, 11,3% i 5,9%.

Niewielka liczba niezgodnych próbek dla każdej z 7 autoprzeciwciał została znaleziona na granicy granic odcięć dla każdego testu (Rysunek 2 i Rysunek 3). W jedenastu próbkach kontrolnych (11/1022, 1,1%) stwierdzono dodatnie wyniki wielu autoprzeciwciał tylko w teście 7-Plex i ujemne w każdym odpowiadającym im pojedynczym teście. Podobnie stało się w 9 próbkach pacjentów z cukrzycą typu 1 (9/1026, 0,9%). Ponadto 10 wysoce dodatnich TPOA i jeden ThGA w kohorcie pacjentów, które zaobserwowano zarówno w pojedynczym teście ECL, jak i RBA, zostało pominiętych w teście 7-Plex. Próbki te zostały przekształcone w pozytywny wynik w teście 7-Plex po dalszym rozcieńczeniu. Ogólnie rzecz biorąc, 100% dodatnich wyników w pojedynczym teście ECL lub RBA uwzględniono w teście ECL 7-Plex, z taką samą specyficznością testu, jak pokazano w tabeli 4.

figure-results-1
Rysunek 1: Ilustracja testu Mutiplex ECL.
Autoprzeciwciała w surowicy połączą antygen Ru Sulfo-NHSged z antygenem biotynylowanym. Jest to sprzężone ze specyficznym łącznikiem, tworząc kompleks antygen-przeciwciało-antygen-łącznik. Kompleksy są wychwytywane na płytce i są ograniczane do swoich określonych miejsc przez każdy konkretny łącznik. Zilustrowano specyficznie sprzężone liczby łączników dla 7 różnych białek antygenowych. Wykrywanie sygnałów przeciwciał odbywa się za pomocą antygenów znakowanych Ru Sulfo-NHS z elektrochemiluminescencją. Rysunek pochodzi z Gu, Y. et al.13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Porównanie 7 poziomów autoprzeciwciał u 1026 nowych pacjentów z cukrzycą typu 1 między pojedynczym testem ECL a testem ECL 7-Plex.
Panele a, b, c, d, e, f i g wyświetlają porównania poziomów autoprzeciwciał odpowiednio dla, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA i IFNαA. Linie przerywane reprezentują punkty odcięcia testu dla każdego testu autoprzeciwciał. Wartości odcięcia ustalono na 99. percentyl 1022 zdrowych kontrolnych w tym samym wieku dla każdego testu (z wyjątkiem TPOA i ThGA, które zostały ustawione na 95. percentyl), jak pokazano w tabeli 4, z 1022 zdrowych kontroli w tym samym wieku zarówno dla pojedynczych, jak i multipleksowych testów ECL. Czerwone zamknięte diamenty są oznaczone jako "fałszywie" dodatnie w teście ECL 7-Plex, <1% badanej kohorty, i zostały zweryfikowane jako ujemne zarówno w pojedynczym ECL, jak i RBA. Czerwone zamknięte kwadraty są oznaczone jako "fałszywie" ujemne wyniki w teście ECL 7-Plex spowodowane zjawiskiem "prozone", występującym głównie w teście TPOA u <1% badanej kohorty. Zarówno te wyniki fałszywie dodatnie, jak i fałszywie ujemne są omówione w sekcji dyskusji. Rysunek pochodzi z Gu, Y. et al.13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Porównanie 7 poziomów autoprzeciwciał u 1026 nowych pacjentów z cukrzycą typu 1 między RBA (ELISA dla IFNαA) a testem ECL 7-Plex.
Panele a, b, c, d, e, f i g przedstawiają porównania poziomów autoprzeciwciał odpowiednio dla, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA i IFNαA. Przerywane linie reprezentują punkty odcięcia testu dla każdego testu autoprzeciwciał, tę samą specyficzność ustaloną zarówno dla testu RBA, jak i testu ECL 7-Plex, jak pokazano w tabeli 4, z 1022 zdrowych grup kontrolnych w tym samym wieku. Czerwone zamknięte romby i kwadraty reprezentują "fałszywie" dodatnie i "fałszywie" ujemne pojawiające się w teście ECL 7-Plex, to samo pokazano w Rysunek 2. Rysunek pochodzi z Gu, Y. et al.13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oddziaływanie Rozdział Rozdział szt. TGL Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział szt. Rozdział Rozdział szt. Rozdział szt. szt. Rozdział Rozdział TGL SZT. Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział szt. TGL Rozdział Rozdział TGL szt. Pokój Rozdział Rozdział Rozdział TGL TGL TGLI Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział szt. TGL TGL Rozdział Rozdział Rozdział SZT. szt. szt. Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział TGL szt. szt. Rozdział Rozdział TGL SZT. szt. TGLI Rozdział TGLI Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział szt. TGL TGL Rozdział TGL szt. szt. SZT. szt. TGL TGL szt. Rozdział Rozdział Rozdział SZT. Rozdział Rozdział szt. TGL Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział szt. SZT. szt. Rozdział TGL Rozdział szt. Rozdział Rozdział Rozdział szt. szt. TGL Rozdział Rozdział TGL TGL Rozdział Rozdział TGLI Rozdział TGL Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział szt. TGL szt.
1cyfra arabska3456
ANumer katalogowy: 55805674105Rozdział 117125Rozdział 139Łącznik-1
100Rozdział 108Rozdział 102Rozdział 102Numer katalogowy: 39563745Łącznik-2
Rozdział 115124Rozdział 107Rozdział 116Rozdział 113124Łącznik-3
67Rozdział 64686165Rozdział 69Łącznik-4
Rozdział 89Rozdział 87Rozdział 98Rozdział 9290Rozdział 80Łącznik-5
Rozdział 8771 Rozdział 71Rozdział 89Rozdział 876172 Rozdział 72Łącznik-6
94 Rozdział 94Rozdział 8279Rozdział 8521542280Łącznik-7
75Rozdział 66Rok 1628Rok 1594Rozdział 81Rozdział 83Łącznik-8
Rozdział 98Rozdział 10371 Rozdział 71Rozdział 84Rozdział 69Rozdział 85Łącznik-9
Rozdział 102Rozdział 11893 Rozdział 93Rozdział 98Rozdział 11399Łącznik-10
BRozdział 324Okręg wyborczy 337Rozdział 147Rozdział 148Numer katalogowy: 54265366Łącznik-1
Rozdział 101Rozdział 10293 Rozdział 93Rozdział 88Rozdział 8674 Rozdział 74Łącznik-2
Rozdział 111Rozdział 119Rozdział 119123 Rozdział 123Rozdział 6672 Rozdział 72Łącznik-3
72 Rozdział 726559 Rozdział 596874 Rozdział 7467Łącznik-4
Rozdział 81Rozdział 98Rozdział 83Rozdział 927972 Rozdział 72Łącznik-5
90Rozdział 8493 Rozdział 93Rozdział 867076 Rozdział 76Łącznik-6
Rozdział 101105Rozdział 10197 Rozdział 97956Okręg wyborczy 944Łącznik-7
Rozdział 82Rozdział 83Rozdział 189Z numerem 20497 Rozdział 9790Łącznik-8
Rozdział 92Rozdział 8378 Rozdział 78Rozdział 64Rozdział 8278 Rozdział 78Łącznik-9
Rozdział 8379Rozdział 8893 Rozdział 93Numer katalogowy: 4722Numer katalogowy: 4965Łącznik-10
CRozdział 110Rozdział 110Rozdział 87Rozdział 8121142365Łącznik-1
5526Numer katalogowy: 5680Rozdział 8870Rozdział 8693 Rozdział 93Łącznik-2
114Rozdział 1326771 Rozdział 7133263284Łącznik-3
Rozdział 6462Rozdział 8874 Rozdział 74Rozdział 64Rozdział 80Łącznik-4
94 Rozdział 94Rozdział 82Rozdział 8675Rozdział 8976 Rozdział 76Łącznik-5
77Rozdział 8775Rozdział 6370Rozdział 86Łącznik-6
77Rozdział 8671 Rozdział 71Rozdział 84Rozdział 138Rozdział 121Łącznik-7
73 Rozdział 73Rozdział 86Rozdział 807959 Rozdział 5973 Rozdział 73Łącznik-8
Rozdział 8674 Rozdział 74Numer katalogowy: 5064Numer katalogowy: 4923Rozdział 88Rozdział 86Łącznik-9
105Rozdział 113Rozdział 85Rozdział 80124114Łącznik-10
DRozdział 98Rozdział 88Rozdział 92Rozdział 84136Rozdział 127Łącznik-1
Rozdział 288291Rozdział 86Rozdział 86Okręg wyborczy 558Okręg wyborczy 564Łącznik-2
Rozdział 109Rozdział 10174 Rozdział 7473 Rozdział 73Rozdział 141Rozdział 127Łącznik-3
78 Rozdział 78Rozdział 66Rozdział 665574 Rozdział 74Rozdział 66Łącznik-4
79Rozdział 8379Rozdział 8696 Rozdział 9691Łącznik-5
Rozdział 83Rozdział 8696 Rozdział 96Rozdział 89Rozdział 8673 Rozdział 73Łącznik-6
Rozdział 87Rozdział 8977Rozdział 87841855Łącznik-7
74 Rozdział 7472 Rozdział 726072 Rozdział 729095 Rozdział 95Łącznik-8
6875Okręg wyborczy 331Rozdział 32824602580Łącznik-9
Rozdział 86Rozdział 98Rozdział 8075123 Rozdział 123Rozdział 133Łącznik-10
ERozdział 101114Rozdział 101Rozdział 106Okręg wyborczy 532548Łącznik-1
Rozdział 10196 Rozdział 96Rozdział 110Rozdział 104682675Łącznik-2
Numer katalogowy 6015Numer katalogowy: 5988124126 Rozdział 126Rozdział 101Rozdział 98Łącznik-3
Rozdział 6671 Rozdział 71Rozdział 8271 Rozdział 71Rozdział 8062Łącznik-4
Rozdział 10297 Rozdział 9799Rozdział 80Rozdział 83Rozdział 110Łącznik-5
Rozdział 8267Rozdział 81Rozdział 8060Rozdział 85Łącznik-6
Rozdział 8595 Rozdział 95Rozdział 52Rozdział 84245221Łącznik-7
72 Rozdział 7278 Rozdział 78Rozdział 8274 Rozdział 74Okręg wyborczy 486Okręg wyborczy 503Łącznik-8
7797 Rozdział 9797 Rozdział 977756 Rozdział 56Rozdział 66Łącznik-9
114Rozdział 1045726Numer katalogowy: 5814259Rozdział 253Łącznik-10
FRozdział 119120Rozdział 133Rozdział 118Rozdział 11296 Rozdział 96Łącznik-1
Rozdział 1019110095 Rozdział 9596 Rozdział 96Rozdział 82Łącznik-2
Rejon 406Okręg wyborczy 395Rozdział 111123 Rozdział 1232127Rozdział 101Łącznik-3
72 Rozdział 7260Rozdział 8672 Rozdział 7279Rozdział 83Łącznik-4
76 Rozdział 76Rozdział 8596 Rozdział 9699Rozdział 89Rozdział 103Łącznik-5
Rozdział 8878 Rozdział 7891Rozdział 83Rozdział 8995 Rozdział 95Łącznik-6
Rozdział 10497 Rozdział 97Rozdział 87Rozdział 10256 Rozdział 56Rozdział 66Łącznik-7
76 Rozdział 76777993 Rozdział 93Rozdział 6975Łącznik-8
Rozdział 8571 Rozdział 7195 Rozdział 95100Rozdział 8371 Rozdział 71Łącznik-9
131 Rozdział 131131 Rozdział 131Okręg wyborczy 358364Rozdział 92Rozdział 86Łącznik-10
G9095 Rozdział 95Rozdział 85Rozdział 82105Rozdział 107Łącznik-1
99Rozdział 867776 Rozdział 7612501174Łącznik-2
Rozdział 119123 Rozdział 123120Rozdział 118Rozdział 112Rozdział 108Łącznik-3
76 Rozdział 76Rozdział 8377Rozdział 80Rozdział 8676 Rozdział 76Łącznik-4
Rozdział 88Rozdział 86Rozdział 8693 Rozdział 93Rozdział 107Rozdział 92Łącznik-5
73 Rozdział 7373 Rozdział 7371 Rozdział 71Rozdział 82Rozdział 8475Łącznik-6
Numer katalogowy: 5210Numer katalogowy 517372 Rozdział 72Rozdział 6976 Rozdział 76Rozdział 85Łącznik-7
Rozdział 80Rozdział 8179Rozdział 82100Rozdział 101Łącznik-8
96 Rozdział 9697 Rozdział 97Rozdział 89Rozdział 8365Rozdział 83Łącznik-9
Rozdział 98Rozdział 103Rozdział 86Rozdział 88Rok 1933Rok 1979Łącznik-10
H114124Rozdział 81Rozdział 86299295Łącznik-1
Rozdział 107Rozdział 92Rozdział 6972 Rozdział 72Numer katalogowy: 4256Numer katalogowy: 4388Łącznik-2
114123 Rozdział 123125129 Rozdział 129Okręg wyborczy 501Okręg wyborczy 536Łącznik-3
777067Rozdział 6474 Rozdział 7462Łącznik-4
Rozdział 92Rozdział 110Rozdział 81Rozdział 847771 Rozdział 71Łącznik-5
Rozdział 877972 Rozdział 7276 Rozdział 76Rozdział 83Rozdział 81Łącznik-6
Rozdział 328Okręg wyborczy 341Rozdział 84Rozdział 80Rozdział 8897 Rozdział 97Łącznik-7
75Rozdział 84759074 Rozdział 74Rozdział 83Łącznik-8
73 Rozdział 737978 Rozdział 7876 Rozdział 76Rozdział 8470Łącznik-9
Rozdział 113120Rozdział 8176 Rozdział 7623722350Łącznik-10

Tabela 1: Analiza testu ECL 7-plex: surowe zliczenia CPS (lewa połowa płytki). Surowe zliczenia CPS są pobierane z płytki testowej (lewa połowa płytki), a każda próbka jest wykonywana w dwóch egzemplarzach. Pod każdym rzędem tabliczki (AH) znajduje się 10 linii odczytu wartości reprezentujących dane z 10 miejsc w tej samej studni, odpowiadających każdemu numerowi łącznika, jak zaznaczono. Przykłady złych duplikatów są wyróżnione na szaro, jak widać w wierszu F-linker 3-kolumny 5 i 6.

szt. TGL szt. Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział szt. TGL szt. LIPCA SZT. Rozdział SZT. Rozdział szt. Rozdział Rozdział SZT. SZT. Rozdział SZT. SZT. szt. szt. Rozdział szt. szt. TGL Rozdział SZT. szt. TGL TGLI szt. TGL szt. szt. SZT. TGL Rozdział szt.
Rząd tabeli 1AKolumna tabeli 1AKonsolidator 1Łącznik 2Konsolidator 3Konsolidator 7Konsolidator 8Łącznik 9Łącznik 10
ZA1-2PCNumer katalogowy: 5627Rozdział 104120Rozdział 8871 Rozdział 71Rozdział 101Rozdział 110
W1-2Niski komputerOkręg wyborczy 331Rozdział 102Rozdział 115Rozdział 103Rozdział 83Rozdział 88Rozdział 81
Z1-2Komputer TPOARozdział 110Numer katalogowy: 5603123 Rozdział 123Rozdział 82Rozdział 80Rozdział 80Rozdział 109
D1-2TPOA Niski PC93 Rozdział 93290105Rozdział 8873 Rozdział 7372 Rozdział 72Rozdział 92
E1-2TGA PCRozdział 10899Numer katalogowy 60029075Rozdział 87Rozdział 109
Z1-2TG Niski komputer12096 Rozdział 96Rejon 401Rozdział 1017778 Rozdział 78131 Rozdział 131
Z1-2Komputer ThGA93 Rozdział 9393 Rozdział 93Rozdział 121Numer katalogowy: 5192Rozdział 8197 Rozdział 97Rozdział 101
H1-2Niski poziom komputera ThGARozdział 119100Rozdział 119Okręg wyborczy 335Rozdział 8076 Rozdział 76Rozdział 117
ZA3-4Komputer IAARozdział 111Rozdział 102Rozdział 112Rozdział 82Rok 161178 Rozdział 7896 Rozdział 96
W3-4Niski komputer IAARozdział 14891Rozdział 12199Rozdział 19771 Rozdział 7191
Z3-4Komputer IFNaARozdział 8479Rozdział 6978 Rozdział 78Rozdział 80Numer katalogowy: 4994Rozdział 83
D3-4IFNaA Niski komputerRozdział 88Rozdział 8674 Rozdział 74Rozdział 82Rozdział 6633078 Rozdział 78
E3-4Komputer IA-2ARozdział 104Rozdział 1071256878 Rozdział 78Rozdział 875770
Z3-4IA-2A Niski PC126 Rozdział 126Rozdział 98Rozdział 11795 Rozdział 95Rozdział 86Rozdział 98361
Z3-4NcRozdział 8477Rozdział 11971 Rozdział 71Rozdział 81Rozdział 86Rozdział 87
H3-4NcRozdział 8471 Rozdział 71Rozdział 127Rozdział 8278 Rozdział 787779
ZA5-6Próbka1Rozdział 1323851Rozdział 119Numer katalogowy: 2217Rozdział 8277Rozdział 106
W5-6próbka25396Rozdział 80Rozdział 6995094 Rozdział 94Rozdział 80Numer katalogowy: 4844
Z5-6Próbka32240903305130Rozdział 66Rozdział 87Rozdział 119
D5-6próbka4Rozdział 132Okręg wyborczy 56113484893 Rozdział 932520Rozdział 128
E5-6próbka5Okręg wyborczy 540679100Rozdział 233Okręg wyborczy 49561Rozdział 256
Z5-6próbka6Rozdział 104Rozdział 89Numer katalogowy 11146172 Rozdział 7277Rozdział 89
Z5-6próbka7Rozdział 1061212Rozdział 110Rozdział 81Rozdział 10174 Rozdział 74Rok 1957
H5-6próbka8Rozdział 297Numer katalogowy: 4322Lokal mieszkalny 51993 Rozdział 9379772361

Tabela 2: Analiza testu ECL 7-plex: układ danych z Tabeli 1, oznaczonych jako 7 linkerów. Dane z tabeli 1 zostały przearanżowane, z usuniętymi linkerami od 4 do 6 (nieużywanymi), a średnie wartości zostały obliczone z każdego zduplikowanego odczytu z tabeli 1. Wartości wzorca wewnętrznego wysokich i niskich kontroli dodatnich, odpowiadające każdemu testowi autoprzeciwciał, ograniczonego przez określony łącznik, są pogrubione ciemną czcionką. PC, kontrola pozytywna. NC, sterowanie normalne.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. jedynki pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt.
IndeksIndeks TPOAIndeks TGAIndeks ThGAIndeks IAAIndeks IFNaAIndeks IA-2A
PC1.0000,0050,0000,003-0,0060,0030,004
Niski komputer0,0450,005-0,0010,0060,0020,000-0,001
Komputer IAA0,0051.0000,0010,002-0,001-0,0010,004
Niski komputer IAA0,0020,039-0,0020,003-0,005-0,0030,001
Komputer IA-2A0,0040,0041.0000,004-0,0040,0000,004
IA-2A Niski PC0,0070,0040,0480,006-0,002-0,0020,008
TGA PC0,0020,0030,0001.0000,0000,0020,002
TG Niski komputer0,0060,0040,0000,052-0,001-0,0020,005
Komputer TPOA0,0050,005-0,0010,0021.000-0,0020,001
TPOA Niski PC0,0120,0030,0000,0060,076-0,0030,001
Komputer ThGA0,0000,000-0,0080,0010,0001.000-0,001
Niski poziom komputera ThGA0,0010,002-0,0080,002-0,0090,050-0,002
Komputer IFNaA0,0040,0060,0010,000-0,0020,0001.000
IFNaA Niski komputer0,0080,0040,0000,0050,0040,0020,048
Nc0,0000,0000,0000,0000,0000,0000,000
Nc0,000-0,0010,0010,002-0,002-0,002-0,001
Próbka10,0090,6830,0000,4190,001-0,0020,003
próbka20,9580,001-0,0080,1720,009-0,0010,837
Próbka30,3890,0020,5420,012-0,0090,0000,006
próbka40,0090,0880,0030,1520,0080,4960,007
próbka50,0820,109-0,0030,0320,271-0,0050,030
próbka60,0040,0020,169-0,002-0,006-0,0020,000
próbka70,0040,205-0,0020,0020,013-0,0020,329
próbka80,0390,7680,0680,004-0,001-0,0020,400

Tabela 3: Analiza testu ECL 7-plex: wyniki wartości indeksu. Wartości indeksów dla każdej próbki dla wszystkich 7 testów autoprzeciwciał zostały obliczone w odniesieniu do odpowiadających im wewnętrznych kontroli dodatnich i ujemnych, jak opisano w protokole testu. Każda wartość indeksu, która była większa niż wartość odcięcia, była definiowana jako wynik pozytywny, pokazany ciemną pogrubioną czcionką. Wartość indeksu TGA dla sample6 została podświetlona na szaro, ponieważ jest to błąd spowodowany przez złe duplikaty pokazane w wierszu F-linker 3-kolumny 5 i 6 w tabeli 1.

. . . .
IA-2AIAATGATPOAThGAIFNαA*
SensSpecSensSpecSensSpecSensSpecSensSpecSensSpecSensSpec
RBA (Urząd Nadzoru T73,4%98,5%75,2%99,0%47,7%99,1%12,9 proc99,0%23,9 proc95,2%19,3%94,7%1,0 %99,6%
Pojedynczy ECL71,6%99,1%73,6%99,3%48,3%99,7%16,0%98,9%26,3%94,9%20,6 proc95,1%0,8 %99,2%
7-Plex ECL71,2%98,9%77,3%98,9%49,5%98,9%16,5%98,7%26,1%94,7%21,1%94,7%1,7 proc99,1%

Tabela 4: Czułość i swoistość testu wśród 1026 pacjentów z cukrzycą typu 1 i 1022 osób z grupy kontrolnej, dopasowanych zarówno pod względem wieku, jak i płci, w teście ECL 7-plex, w porównaniu do odpowiadającego mu pojedynczego testu ECL i RBA lub ELISA*. Trzyróżne testy (RBA, pojedynczy ECL i 7-Plex ECL) dla każdego autoprzeciwciała ustawiono na podobną specyficzność przy użyciu zdrowych kontrolnych 1022 dopasowanych pod względem wieku i płci. Wynik swoistości z badanej kohorty kontrolnej ustalono na poziomie około 95% dla TPOA i ThGA oraz na poziomie 99% dla 5 pozostałych testów. *Gwiazdka oznacza test IFNαA dla testu ELISA, podczas gdy inne to RBA.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W licznych krajowych i międzynarodowych badaniach klinicznych dotyczących cukrzycy typu 1 skuteczność pojedynczego testu ECL do wykrywania autoprzeciwciał wysp trzustkowych i autoprzeciwciał przeciwko transglutaminazie (TGA) w celiakii została potwierdzona 8,9,10,11. Na wszystkich tych ścieżkach test ten zwiększył czułość i swoistość wykrywania autoantygenu w porównaniu z istniejącym "złotym" standardem RBA. Zwiększoną swoistość choroby można zaobserwować przy rozróżnianiu autoprzeciwciał wysp trzustkowych o wysokim powinowactwie i wysokim ryzyku od sygnałów o niskim ryzyku i niskim powinowactwie, między pojedynczym testem ECL a RBA 14,15,16,17. Opierając się na pojedynczym teście ECL, opracowujemy nowy, wysokoprzepustowy, multipleksowany test autoprzeciwciał ECL, który umożliwia nam badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, a także kilku możliwych do zastosowania chorób autoimmunologicznych w tym samym czasie.

Multipleksowy test ECL wykorzystuje płytkę multipleksową, która może połączyć do 10 testów autoprzeciwciał w jednym dołku. W niniejszym badaniu połączono ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Autoprzeciwciała składają się z 3 IAb (IAA, i IA-2A), 2 autoprzeciwciał autoimmunologicznych przeciwko chorobom tarczycy (TPOA i ThGA), autoprzeciwciał przeciwko celiakii (TGA) i autoprzeciwciał APS-1 przeciwko interferonowi alfa (IFNαA). Mechanizm oznaczania jest zasadniczo oparty na pojedynczym teście ECL, jak wcześniej opublikowano 9,10,12,18 z pewnymi modyfikacjami. Główna różnica między multipleksowym testem ECL a pojedynczym testem ECL polega na tym, że każdy kompleks przeciwciało-antygen utworzony w fazie płynnej jest ograniczony do określonego łącznika (ryc. 1). Antygen znakowany biotyną jest inkubowany ze sprzężoną streptawidyną, łącznikiem używanym do tworzenia specyficznego kompleksu antygen-łącznik. Kompleks immunologiczny przeciwciało-antygen tworzy się po inkubacji z surowicą pacjenta i jest wychwytywany w określonym miejscu przez specyficzny system łączników na każdej studzience płytki multipleksowej. Antygen znakowany Ru Sulfo-NHS wychwycony przez przeciwciała w tym samym czasie dostarcza sygnał z elektrochemiluminescencją. Czytnik płytek może wykryć do 10 różnych sygnałów ze źródeł punktowych znajdujących się w każdej studni. Aby zachować spójność testów autoprzeciwciał między płytkami i podczas prowadzenia długoterminowych badań, sugerujemy stosowanie tego samego łącznika.

Przed skonfigurowaniem multipleksowego testu ECL, pojedyncze testy ECL dla każdego autoprzeciwciała muszą zostać zoptymalizowane odpowiednio na płytce multipleksowej i zweryfikowane zarówno pod kątem RBA, jak i pojedynczych testów ECL na zwykłej płytce ECL. Aby ulepszyć test szachownicy, do powiązanego testu autoprzeciwciał na płytce multipleksowej, użyto pacjenta o wysokim dodatnim wyniku i ujemnej próbki pacjenta. Po przeprowadzeniu testu szachownicy obliczono najbardziej idealne stężenia dla Ru Sulfo-NHS i antygenu znakowanego biotyną dla każdego z 7 testów autoprzeciwciał. Następujące stężenia są następujące: 30 ng/ml i 200 ng/ml dla GAD65, 120 ng/ml i 120 ng/ml dla proinsuliny, 10 ng/ml i 42 ng/ml dla IA-2, 80 ng/ml i 80 ng/ml dla TG, 8 ng/ml i 16 ng/ml dla TPO, 31 ng/ml i 31 ng/ml dla ThG, oraz odpowiednio 12 ng/ml i 12 ng/ml dla IFNα13. Stężenia niektórych antygenów z testu szachownicy mogą wymagać dalszego dostosowania zgodnie z wynikami rzeczywistego testu multipleksowego po połączeniu wszystkich testów razem.

Ponieważ IAA jest uwzględniony w niniejszym multipleksowym teście ECL, obowiązkowa obróbka kwasem próbek surowicy przed inkubacją surowicy z antygenem, jak podano w poprzednim badaniu12. Ogólnie rzecz biorąc, gdy dodatkowe autoprzeciwciało jest dodawane do testu multipleksowego, wpływa to na tło testu, a bardzo wysoki sygnał z jednego miejsca, w studzience, może utrudniać wyniki pobliskich plam poprzez przesłuchy. W związku z tym maksymalna liczba CPS musi być ograniczona do 20 000 zliczeń dla każdego autoprzeciwciała lub niższa dla próbek o najwyższej liczbie dodatnich. Z naszej wiedzy wynika, że w celu zmniejszenia ilości przesłuchów, autoprzeciwciała, które mają niższe tło, powinny być oddzielane, podczas projektowania mapy punktowej, z dala od miejsc o większej częstotliwości zliczeń.

W każdym teście stosowano wewnętrznie wysokie wyniki dodatnie i ujemne w celu obliczenia dokładnego indeksu dla nieznanych badanych próbek. Aby dokładnie ocenić i monitorować czułość testu, zastosowano niskie kontrole dodatnie, ustawione w pobliżu górnej granicy testu. Te standardowe kontrole dodatnie i ujemne zostały utworzone luzem i podwielokrotnością do długotrwałego stosowania i przechowywane w temperaturze -20 °C lub niższej, w celu zachowania spójności między testami. W celu zapewnienia jakości próbki badano dwukrotnie w każdym teście, a każdy pozytywny wynik był ponownie badany i potwierdzany poprzez umieszczenie próbki w nowym teście ECL następnego dnia. W przypadku jakichkolwiek rozbieżności co do pierwszego i drugiego testu potwierdzającego, konieczne było przeprowadzenie trzeciego testu. Spośród trzech przeprowadzonych testów, wyniki dwóch testów, które są zgodne (np. +, + lub -,-), określiły ostateczny wynik (dodatni lub negatywny) próbki.

W ciągu ostatniej dekady wiele grup badawczych poszukuje wysokoprzepustowego testu wykorzystującego metodę multipleksową do łączenia wielu testów autoprzeciwciał w jednym dołku w celu przeprowadzenia badań przesiewowych dużych populacji. Istnieje kilka badań, które wykorzystują różne rodzaje technologii do przeprowadzania testów autoprzeciwciał multipleksowych 19,20,21,22, ale nie ma porównania dla żadnego z tych testów pod względem czułości i swoistości w porównaniu z obecnym "złotym" standardem RBA, podczas badania cukrzycy typu 1. Te różne typy stosowanych platform nie są walidowane podczas międzynarodowych warsztatów Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) ani poprzez testowanie dużych kohort w badaniach klinicznych. W niedawnym badaniu przesiewowym opartym na populacji ogólnej w Niemczech, wysokoprzepustowy test łączony, 3 Screen ICATM ELISA dystrybuowany przez firmę Kronus, jest używany jako narzędzie do badań przesiewowych pierwszego rzutu w celu wykrycia trzech IAb,, IA-2A i ZnT8A, w celu uzyskania wczesnej diagnozy dziecięcej cukrzycytypu 1 23. 3-ekranowy test ELISA mierzy 3 autoprzeciwciała w 3 oddzielnych studzienkach, zużywając dużą objętość surowicy, lub w jednym dołku z wymieszanymi wszystkimi 3 testami. Jeśli jeden dołek w 3-ekranowym teście ELISA jest pozytywny, nie jest w stanie odróżnić, które z trzech autoprzeciwciał są obecne. Największą wadą tego testu jest brak możliwości uwzględnienia pomiaru IAA. Wszystkie wyniki IAA przeprowadzone metodą ELISA, jak udowodniono podczas warsztatów IASP, nie mają akceptowalnej czułości i swoistości24. IAA jest zwykle pierwszym IAb, który się pojawia i ma wysoką częstość występowania wśród małych dzieci. Badania przesiewowe IAb, z IAA, są konieczne dla dzieci i nie uważa się za dopuszczalne przeprowadzanie tych badań przesiewowych bez IAA w celu oceny ryzyka cukrzycy typu 1 w społeczności. Ponadto nie ma opublikowanych badań ani danych, które wskazywałyby, że test Kronus IAb kit jest bardziej specyficzny dla choroby T1D i jest w stanie odróżnić IAb wysokiego ryzyka od IAb niskiego ryzyka. Test ECL 7-Plex w niniejszym badaniu został zwalidowany przy użyciu dużej kohorty nowo zdiagnozowanych pacjentów z cukrzycą typu13. W porównaniu z obecnym standardowym testem RBA i ugruntowanym pojedynczym testem ECL, test 7-Plex jest w stanie zachować 100% dodatni wynik przy tej samej swoistości testu (Tabela 4). Obecnie test 4-Plex ECL, równoległy do standardowego RBA, jest stosowany w trwającym dużym badaniu klinicznym: badaniu Autoimmunity Screening for Kids (ASK). Badanie to obejmuje badania przesiewowe dzieci z populacji ogólnej z obszaru metropolitalnego Denver pod kątem cukrzycy typu 1 i celiakii. W porównaniu ze standardowym RBA zastosowanym w badaniu ASK, multipleksowy test ECL wykazuje doskonałą czułość i wyższą swoistość choroby, identyczną z naszymi poprzednimi raportami z wykorzystaniem pojedynczego badania ECL25. Co więcej, nasz test ECL 4-Plex wykazał wyraźne zmniejszenie nakładu pracy, kosztów i objętości surowicy o 70% w porównaniu z odpowiadającymi im 4 pojedynczymi testami ECL i RBA. Korzystając z multipleksowanego testu ECL, możemy dostosować każdą studzienkę za pomocą różnych liczb, reprezentujących różne autoprzeciwciała (do 10), aby przetestować różne choroby autoimmunologiczne, które są specyficzne dla potrzeb określonej lokalizacji klinicznej.

W niniejszym badaniu zaobserwowano pewne ograniczenia dotyczące multipleksowanego testu ECL przy użyciu płytki multipleksowej. Końcowe rozcieńczenie surowicy, inkubowanej z antygenem, nie może być dostosowane w celu uzyskania najbardziej optymalnych warunków dla każdego pojedynczego testu autoprzeciwciał, który jest połączony w jednym dołku. W dziewięciu próbkach (9/1026) od pacjentów z cukrzycą typu 1 zaobserwowano, że wynik jest fałszywie ujemny dla określonych autoprzeciwciał. 7 wyników fałszywie ujemnych dotyczyło TPOA, a 2 ThGA, w teście ECL 7-Plex, ale wysokie wyniki dodatnie wykazano zarówno w teście pojedynczego ECL, jak i RBA (Figura 2 i 3). Po dalszym rozcieńczeniu wszystkich 9 próbek, na płytce multipleksowej uzyskały one wynik dodatni. Wynik ten jest spowodowany tym, co nazywamy zjawiskiem "prozone". Zjawisko to powoduje, że próbka wykazuje fałszywie ujemny wynik, ponieważ wysokie miana przeciwciał wpływają na tworzenie sieci antygen-przeciwciało. Podczas ustawiania testu multipleksowego zaleca się, aby próbki o bardzo wysokich mianach, dla każdego z połączonych autoprzeciwciał, przeprowadziły testy wstępne w celu zidentyfikowania opcjonalnego rozcieńczenia surowicy do inkubacji antygenu. Alternatywnie, testy autoprzeciwciał o podobnie zoptymalizowanych warunkach powinny być wybrane w celu utworzenia testu połączonego, z którego uzyskuje się najlepszą czułość i swoistość testu dla każdego autoprzeciwciała. W niniejszym badaniu 7 próbek (7/1022) od zdrowych, normalnych osób z grupy kontrolnej dało fałszywie dodatnie wyniki dla wielu autoprzeciwciał w teście 7-Plex, ale po przeprowadzeniu pojedynczego testu ECL i RBA (Figura 2 i 3) stwierdzono, że te autoprzeciwciała są ujemne w obu testach. Przyczyny tych fałszywie dodatnich wyników występujących na płytce multipleksowej dla tych małych podzbiorów próbek są obecnie nieznane. W przypadku obecnego zastosowania multipleksowego testu ECL wszystkie dodatnie próbki są powtarzane z odpowiadającym im pojedynczym testem ECL w celu potwierdzenia dodatniego wyniku, co usuwa ten fałszywie dodatni błąd z multipleksowego testu ECL.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez DK32083 grantów NIH, JDRF Grants 2--2015-51-Q-R i 2--2018-533-S-B.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4 & stopnie; C lodówka
– 80 stopni Celsjusza; C oraz -20 ° C zamrażarki
96-dołkowa Wytrząsarkado płyt Wallac - Delfi
96-dołkowa okrągła płyta dolnaFisher8408220
Roztwór kwasu octowegoFisher
Folia
Białka antygenowe
Ludzkie białko GAD65 pełnej długościDiamyd
Ludzkie białko ThG o pełnej długościBioMart
Ludzkie białko TPO o pełnej długościBioMart
IA-2 białko wewnątrzkomórkoweBioMart
IFN-α białkoAbcam
Białko proinsulinyAmideBio
tTG białkoDiaRect
BiotynaSigma
Butelka 500 ml, Jednostki filtrująceFisher0974064A lub B
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA-7906
Destylowana woda
) HClKostkarka
Sektor MSDPerkin-Elmer
Pipeta
NaOH
Wieża
PBS
pH-metr
Pipety-Aid
Pipety/końcówki
Ru Sulfo-NHSMSD (R91AN)
Trizma BaseFisherBP152-5
Tween 20SigmaP-1379
Zestaw rozwojowy UplexMSD
96-dołkowa płytka UPlexMSD
AMSDR93AA
Linker-StreptawidynaMSD
Bufor odczytuMSDR92TC
Stop Solution MSD
Vortex mixer
ZeBa ColumnPierce89892
aluminiowadejonizowana (DD do lodu Fisher Tacki na lód wielokanałowapapierowa Bloker

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study. Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).
  2. Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
  3. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  4. Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
  5. Barker, J. M., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
  6. Triolo, T. M., et al. Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
  7. de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).
  8. Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
  9. Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
  10. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
  11. Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Journal of Clinical & Cellular Immunology. 8 (6), (2017).
  12. Gu, Y., et al. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. Journal of Visualized Experiments. (133), e57227(2018).
  13. Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
  14. Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
  15. Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
  16. Fouts, A., et al. Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects. Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).
  17. Sosenko, J. M., et al. The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).
  18. Zhao, Z., et al. Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 5(2016).
  19. Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes. Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).
  20. Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP). American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).
  21. Yim, S. W., et al. Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays. Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).
  22. Bale, S. S., et al. A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes. Technology. 02 (03), 200-205 (2014).
  23. Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
  24. Schlosser, M., et al. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).
  25. Zhao, Z., et al. A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease. Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test elektrochemiluminescencyjnyprzesiewowe badanie autoprzeciwciamultipleksowy test ECLczytnik p yteksystem cznikowyinkubacja surowicyprzemywanie w PBS Tbufor odczytowy

Powiązane artykuły