Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61160

⸱

29 maja 2020

 ,  ,  ,  , 
1Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Endocrinology, Beijing Hospital, National Center of Gerontology; Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Department of endocrinology, Guangzhou First People's Hospital, School of Medicine, South China University of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Modelujemy prosty multipleksowany test ECL, który łączy ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Test jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu innych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i autoimmunologicznego zespołu wielogruczołowego 1.

Streszczenie

Autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym (IAbs) są szeroko stosowane w diagnostyce i przewidywaniu cukrzycy typu 1 (T1D). Cztery główne IAb do insuliny (IAA), dekarboksylaza glutaminianu-65 (), antygen insulinomy-2 (IA-2A) i transporter-8 (ZnT8A) są równie ważne w przewidywaniu choroby. Obecnie u 40% pacjentów, u których zdiagnozowano cukrzycę typu 1, rozwijają się inne zaburzenia autoimmunologiczne. Niestety, obecne metody badań przesiewowych wykorzystujące pojedyncze autoprzeciwciało do pomiaru są pracochłonne i nieefektywne w przypadku badań przesiewowych na dużą skalę. Niedawno opracowaliśmy prosty test elektrochemiluminescencji multipleksowej (ECL), aby rozwiązać te aktualne problemy. Test łączy wszystkie 7 testów autoprzeciwciał w jednym dołku. Każda studzienka zawiera trzy IAb (IAA, i IA-2A), autoprzeciwciała przeciwko peroksydazie tarczycowej (TPOA) i globuliny tarczycy (ThGA) do wykrywania autoimmunologicznej choroby tarczycy, autoprzeciwciała przeciwko transglutaminazie tkankowej (TGA) w celiakii oraz autoprzeciwciała przeciwko interferonowi alfa (IFNαA) w autoimmunologicznym zespole wielogruczołowym-1 (APS-1); wszystkie z nich prowadzą badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i innych istotnych chorób autoimmunologicznych jednocześnie. Multipleksowy test ECL jest oparty na pojedynczej platformie testowej ECL, ale zamiast tego wykorzystuje płytkę multipleksową łączącą wiele testów autoprzeciwciał, do 10, w jednym dołku. Główna różnica w stosunku do pojedynczego testu ECL polega na tym, że każdy kompleks przeciwciało-antygen utworzony w fazie płynnej jest ograniczony w określonym miejscu na każdym dołku za pomocą systemu łącznikowego na płytce multipleksowej. Test 7-Plex ECL w niniejszym badaniu jest walidowany w porównaniu ze standardowymi testami wiązania promieniotwórczego (RBA) i pojedynczymi testami ECL, przy użyciu dużej kohorty nowo zdiagnozowanych pacjentów z cukrzycą typu 1 i zdrowych osób kontrolnych w tym samym wieku, co skutkuje doskonałą czułością i swoistością testu.

Wprowadzenie

Cukrzyca typu 1 (T1D) jest poważną chorobą przewlekłą, która najczęściej występuje w dzieciństwie. Obecnie około 1,4 miliona osób w Stanach Zjednoczonych ma cukrzycę typu 1; Uderzające jest to, że częstość występowania cukrzycy typu 1 stale rośnie w tempie 3-5% każdego roku na całym świecie i podwoiła się w ciągu ostatnich dwóch dekad, zwłaszcza u małych dzieci1,2. Autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym (IAb) w krążeniu krwi są obecnie najbardziej wiarygodnym biomarkerem. IAb mogą pojawić się na wiele lat przed rozwojem klinicznej cukrzycy typu 13. Obecnie cztery główne IAb są szeroko stosowane w diagnostyce cukrzycy typu 1 i badaniach przesiewowych ryzyka, w tym autoprzeciwciała przeciwko insulinie (IAA), dekarboksylazie glutaminianu-65 (), antygenowi insulinoma-2 (IA-2A) i transporterowi-8 (ZnT8A). Te cztery IAb są równie ważne w przewidywaniu rozwoju cukrzycy typu 1. Klasyfikacja cukrzycy typu 1 została niedawno ponownie zdefiniowana jako obecność ≥2 dowolnych 4 IAb z prawidłowym metabolizmem glukozy jako stadium choroby 14.

W badaniu Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) ujawniono, że jedno na czworo dzieci zagrożonych T1D prawdopodobnie rozwinie się w stan autoimmunizacji wysp trzustkowych, celiakii, tarczycy lub reumatoidalnej, a co bardziej uderzające, około 40% pacjentów, u których zdiagnozowano cukrzycę typu 1, ostatecznie rozwija dodatkową chorobę autoimmunologiczną5,6,7. Identyfikacja autoprzeciwciał ma zasadnicze znaczenie dla przewidywania i diagnozowania tych chorób autoimmunologicznych i powinna zapewnić lepszą opiekę kliniczną pacjentom. Obecnie nie ma łatwego i niedrogiego sposobu na badania przesiewowe w kierunku tych wielu chorób autoimmunologicznych. Obecne metody badań przesiewowych wykorzystujące standardowy test wiązania promieniotwórczego (RBA), z pojedynczym pomiarem autoprzeciwciał, są pracochłonne i nieefektywne w przypadku badań przesiewowych na dużą skalę.

Tutaj będziemy opisywać nowo opracowany prosty multipleksowany test ECL, który uwierzytelniliśmy za pomocą pojedynczej platformy testowej ECL8,9,10,11. Multipleksowy test ECL łączy 7 testów autoprzeciwciał w jednym dołku, przy użyciu tylko 15 μl surowicy, i jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu istotnych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i APS-1. Test ZnT8A ECL nie został jeszcze opracowany w tym czasie i nie został włączony do testu multipleksowego. Multipleksowy test ECL stanowi doskonałe narzędzie do wysokowydajnych badań przesiewowych w populacji ogólnej w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych.

Protokół

Protokół badawczy został zatwierdzony przez Colorado Multiple Institutional Review Board.

1. Przygotowanie bufora

  1. Przygotuj bufor do etykietowania (2x PBS, pH 7,9). Używając 400 ml destylowanej wody dejonizowanej (DD), dodaj 100 ml 10x PBS. Aby dostosować pH roztworu, dodawaj NaOH, aż osiągnie 7,9.
  2. Stworzyć 3 mM biotyny, rozpuszczając 1 mg biotyny w 588 μl wcześniej utworzonego buforu znakującego. Wykonać 3 mM Ru Sulfo-NHS, rozpuszczając 150 nmol Ru Sulfo-NHS w 50 μl buforu do znakowania.
  3. Przygotować bufor antygenowy (1% BSA), biorąc 500 ml 1x PBS i dodając 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do roztworu. Przygotować 0,5 M roztworu kwasu octowego. Przygotować 1 M bufor Tris-HCl za pomocą Trizma Base i dostosować pH do 9,0.
  4. Do buforu powlekającego (3% Bloker A) weź 500 ml 1x PBS i dodaj 15 g Blockera A. Przygotuj bufor do przemywania (0,05 % Tween 20, PBST), mieszając 5000 ml 1x PBS z 2,5 ml Tween 20. Utwórz bufor odczytu (2x bufor do odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym), dodając 500 ml wody DD i 500 ml 4 ml buforu odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym.
    UWAGA: Aby zachować spójność między testami, ważne jest, aby zarówno roztwory biotyny, jak i Ru Sulfo-NHS były tworzone tuż przed procedurą etykietowania i nie były tworzone i przechowywane do wykorzystania w przyszłości.

2. Znakowanie każdego białka antygenowego biotyną i Ru Sulfo-NHS osobno

UWAGA: Aby uzyskać bardziej efektywną reakcję znakowania, użyj stężenia białka antygenowego ≥0,5 mg/ml.

  1. Obliczyć liczbę molową każdego białka antygenowego oraz liczbę molową biotyny i Ru Sulfo-NHS. Dodać odpowiednią ilość biotyny lub Ru Sulfo-NHS do białka antygenowego w celu znakowania reakcji zgodnie ze stosunkiem molowym białka antygenu do biotyny lub Ru Sulfo-NHS.
    1. W przypadku antygenu o mniejszej masie cząsteczkowej (≤10 kDa), takiego jak białko proinsuliny, należy zastosować stosunek molowy 1:5 (antygen: biotyna i Ru Sulfo-NHS). W przypadku antygenu o większej masie cząsteczkowej (>50 kDa), takiego jak białko, należy użyć stosunku molowego 1:20. W przypadku antygenu o średniej masie cząsteczkowej (10-50 kDa) należy zastosować stosunek molowy dostosowany w zakresie 1:5-1:20.
  2. Zarówno w przypadku biotyny, jak i Ru Sulfo-NHS należy podzielić masę każdego antygenu przez odpowiadającą mu masę cząsteczkową, aby uzyskać liczbę molową antygenu dla każdego z nich. Podziel liczbę molową przez stężenie, aby uzyskać objętość biotyny. Powtórz to dla Ru Sulfo-NHS.
  3. Wymieszać białko antygenu z biotyną przy użyciu odpowiedniego stosunku molowego, określonego w kroku 2.2. Następnie zrób to samo dla Ru Sulfo-NHS.
    UWAGA: Aby zapewnić skuteczność reakcji znakowania, wszelkie redukujące chemikalia, takie jak Tris lub glicyna w systemie buforowym, muszą zostać zamienione na bufor 2x PBS o pH 7,9 przez kolumnę wirującą do zaklejania. Protokoły etykietowania biotyny i Ru Sulfo-NHS są identyczne.
  4. Przykryj probówki reakcyjne folią aluminiową i inkubuj je w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę. Powodem przykrywania probówek reakcyjnych folią jest to, że zarówno biotyna, jak i odczynniki Ru Sulfo-NHS są wrażliwe na światło.
  5. Zalać kolumnę wirową o pojemności 2 ml lub 5 ml podczas inkubacji probówek reakcyjnych (wielkość kolumny wirowej zależy od objętości wprowadzonej do kolumny). Napełnij kolumnę wirową buforem 2x PBS, a następnie odwiruj ją przy 1 000 x g przez 2 minuty za każdym razem, w sumie trzy razy.
  6. Przerwać reakcję znakowania po zakończeniu inkubacji probówek reakcyjnych. Aby zatrzymać reakcję, należy oczyścić znakowane białko antygenowe, przepuszczając je raz przez kolumnę wirową. Następnie odwirować kolumnę o sile 1 000 x g przez 2 minuty.
  7. Obliczyć całkowite stężenie znakowanego antygenu, dzieląc ilość obecnego białka antygenowego przez objętość końcową. Podwielokrotność 50 μl oczyszczonego, znakowanego białka antygenowego na probówkę i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C do długotrwałego stosowania.
    UWAGA: Ważne jest, aby mieć świadomość, że za każdym razem, gdy kolumna wirowa przechodzi przez białko antygenowe, nastąpi około 90-95% wskaźnik retencji.

3. Zdefiniuj najlepsze stężenie i proporcje dla dwóch znakowanych antygenów do testu (test szachownicy)

UWAGA: Ponieważ test ECL-IAA w tym teście 7-Plex wymaga kwasowego traktowania próbek surowicy, test szachownicy dla każdego antygenu musi przejść przez ten etap przed inkubacją z oznakowaną mieszaniną antygenów.

  1. Zastosuj test szachownicy dla każdego antygenu osobno przed uruchomieniem testu multipleksowego. W krokach 3.2-3.6 jako przykładu zostanie użyty GAD65.
  2. Obliczać Rozcieńczenie znakowanego białka GAD65. Zalecane stężenie docelowe pierwszego roztworu mieszaniny biotynylowanego GAD65 wynosi 2000 ng/ml, a Ru Sulfo-NHS oznaczonego GAD65 wynosi 1000 ng/ml. Jeśli stężenie zarówno biotynylowanego, jak i znakowanego Ru Sulfo-NHS GAD65 w roztworze podstawowym wynosi 1,0 μg/μL, objętość potrzebna do biotynylowania GAD65 w 560 μl roztworu roboczego wyniesie 1,12 μL, a objętość potrzebna do uzyskania GAD65 znakowanego Ru Sulfo-NHS w 700 μl roztworu roboczego wyniesie 0,7 μL.
  3. Wymieszaj 1,12 μl biotynylowanego białka GAD65 z 240 μl łącznika sprzężonego ze streptawidyną 1 w jednej probówce i 160 μl 1% BSA. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodać 160 μl roztworu zatrzymującego do probówki i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut.
  4. Wykonaj seryjne rozcieńczenie. Pobrać 280 μl mieszaniny do nowej probówki i dodać 280 μl roztworu zatrzymującego w celu uzyskania rozcieńczenia w stosunku 1:2. Przygotuj kilka nowych probówek. Powtórz ten krok, aby uruchomić poziome seryjne rozcieńczanie antygenu GAD65 znakowanego biotyną (patrz poprzednia publikacja12).
  5. Wymieszaj 0,7 μl białka GAD65 znakowanego Ru Sulfo-NHS (1 μg/μL) z 700 μl roztworu zatrzymującego. Następnie pobrać 350 μl mieszaniny do nowej probówki i dodać 350 μl roztworu zatrzymującego, aby uzyskać rozcieńczenie 1:2. Przygotuj kilka nowych probówek, powtórz ten krok, aby uruchomić pionowe seryjne rozcieńczanie antygenu GAD65 znakowanego Ru Sulfo-NHS.
  6. Przygotować dwie próbki surowicy, jedną próbkę wysoce dodatnią na obecność i jedną próbkę ujemną na obecność, każda o objętości 0,75 ml. Podwielokrotność 15 μl dodatniej surowicy do każdego dołka w lewej połowie 96-dołkowej płytki PCR. Podwielokrotność 15 μl ujemnej surowicy do każdego dołka w prawej połowie 96-dołkowej płytki PCR.
  7. Dodać 18 μl 0,5 M kwasu octowego do każdej studzienki i wymieszać. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować nową 96-dołkową płytkę do PCR. Dodać 17,5 μl antygenu znakowanego biotyną i 17,5 μl antygenu znakowanego Ru Sulfo-NHS do każdej studzienki zgodnie z seryjnymi rozcieńczeniami (patrz poprzednia publikacja12).
  8. Kontynuuj pozostałe etapy oznaczania opisane w krokach od 5.2 do 9.1.
  9. Określić stosunek sygnału z próbek o wysokim poziomie dodatnim do odpowiadających im ujemnych sygnałów próbki. Wybierz najlepsze stężenie dla antygenu znakowanego biotyną i antygenu znakowanego Ru Sulfo-NHS, identyfikując punkt, który ma najwyższy lub bliski najwyższego stosunek sygnału dodatniego do ujemnego. W tym obliczeniu współczynnika należy wziąć pod uwagę niski sygnał tła uzyskany z próbek ujemnych.
    UWAGA: Optymalne stężenia Ru Sulfo-NHS i białek antygenowych znakowanych biotyną z testów szachownicowych przedstawiono poniżej: 30 ng/ml i 200 ng/ml dla GAD65, 120 ng/ml i 120 ng/ml dla proinsuliny, 10 ng/ml i 42 ng/ml dla IA-2, 80 ng/ml i 80 ng/ml dla TG, 8 ng/ml i 16 ng/ml dla TPO, 31 ng/ml i 31 ng/ml dla ThG oraz 12 ng/ml i 12 ng/ml dla IFNα.

4. Utwórz mieszane rozwiązanie antygenowe sprzężone z łącznikiem

  1. Wybierz optymalne stężenie dla każdego antygenu na podstawie testu szachownicy. Rozcieńczyć biotynę i antygen znakowany Ru Sulfo-NHS do racjonalnego stężenia roboczego.
  2. Zwiąż różne łączniki z każdym z unikalnie biotynylowanych białek antygenowych. W jednym teście na płytce 96-dołkowej wymieszaj 4 μl biotynylowanego białka GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsuliny, IFN-α i IA-2 z 240 μl łącznika 1, 2, 3, 4, 8, 9 i 10 sprzężonego ze streptawidyną w oddzielnej probówce (Rysunek 1). Następnie dodać 156 μl PBS/1% BSA na probówkę. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  3. Do każdej probówki dodać 160 μl roztworu zatrzymującego i inkubować je w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut. Weź 400 μl antygenu sprzężonego z łącznikiem z każdej probówki i połącz ze sobą wszystkie 7 antygenów. Dodać 1,2 ml roztworu zatrzymującego, a następnie dodać 4 μl Ru Sulfo-NHS znakowanego GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsuliny, IFN-α i antygenu IA-2 do mieszaniny. Teraz roztwór antygenu jest gotowy do użycia w teście.

5. Inkubuj próbki surowicy z oznaczonym antygenem

UWAGA: Ponieważ test ECL-IAA w tym teście 7-Plex wymaga kwaśnego traktowania próbek surowicy, każda surowica wymaga etapu obróbki kwasem przed inkubacją z znakowaną mieszaniną antygenów dla tego testu 7-Plex.

  1. Podwielokrotność 15 μl surowicy na dołek na 96-dołkową płytkę PCR. Dodać 18 μl 0,5 M kwasu octowego do każdej studzienki i wymieszać. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować nową 96-dołkową płytkę do PCR i podać porcję 35 μl roztworu antygenu do każdej studzienki.
  2. Podczas gdy płytka jest nadal w inkubacji, dodaj 13 μl 1 M buforu Tris pH 9,0 do każdej studzienki na płytce antygenowej. Dodaj bufor z boku każdej studzienki, aby ograniczyć mieszanie buforu Tris i antygenu. Po zakończeniu inkubacji pobrać 25 μl surowicy poddanej działaniu kwasu i natychmiast odpipetować ją do każdego dołka na płytce antygenowej. Wymieszać roztwór i przykryć płytkę folią uszczelniającą PCR, aby uniknąć ekspozycji na światło.
  3. W temperaturze pokojowej umieścić płytkę na wytrząsarce ustawionej na niskich obrotach na 1 godzinę. Następnie przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C i pozostawić płytkę do inkubacji przez 18-24 godziny.

6. Przygotuj płytę multipleksową

  1. Wyjmij płytkę multipleksową z lodówki o temperaturze 4 °C i pozwól, aby płyta znalazła się w stanie RT. Gdy płytka multipleksu znajdzie się w temperaturze pokojowej, dodaj 150 μl 3% blokera A do każdej studzienki. Przykryj płytkę multipleksu folią uszczelniającą. Inkubować płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Dzień 1 testu obejmuje kroki od 4 do 6.

7. Surowica/antygen transferowy inkubuje się do płytki multipleksowej

  1. Następnego dnia połóż ręczniki papierowe na stole i wyjmij z lodówki płytkę do inkubacji multipleksu. Opróżnij cały bufor z płyty. Aby to zrobić, odwróć talerz do góry nogami i wklep go w przygotowane ręczniki papierowe, aż w żadnym z dołków nie będzie bufora.
  2. Umyj płytkę multipleksową, dodając 150 μl PBST do każdej studzienki. Odrzuć bufor, jak wspomniano w kroku 7.1, i powtórz ten krok trzy razy. Dodać 30 μl inkubacji surowicy/antygenu do każdego dołka na płytce multipleksowej. Przykryj płytkę folią, aby ograniczyć jej ekspozycję na światło. Umieść płytkę na wytrząsarce do talerzy, ustawionej na niską prędkość, przy temperaturze obrotowej na 1 godzinę.

8. Umyj płytkę i dodaj bufor do odczytu.

  1. Wyjąć inkubację surowicy/antygenu z płytki multipleksowej, przytrzymując płytkę do góry nogami i wytrząsając roztwór. Dodać 150 μl PBST do wszystkich studzienek i usunąć bufor z płytki, ponownie przytrzymując płytkę do góry nogami i wytrząsając roztwór. Powtórz ten krok trzy razy. Po zakończeniu trzeciego płukania dodaj 150 μl buforu odczytowego do każdej studzienki.
    UWAGA: Pęcherzyki powietrza zakłócają zdolność czytnika płyt do dokładnej analizy wyników płyt i należy ich unikać za wszelką cenę.

9. Przeczytaj tabliczkę i przeanalizuj dane

  1. Policz przygotowaną płytkę na czytniku płytek, odczytując wszystkie wartości w zliczeniach na sekundę (CPS).
  2. Obliczyć wskaźnik względny dla testu, używając poziomów przeciwciał uzyskanych z czytnika płytek, za pomocą następującego równania:
    Wartość indeksu = [CPS (próbka) - CPS (norma ujemna)] / [CPS (norma dodatnia) - CPS (norma ujemna)].
  3. Określ, które wyniki przeciwciał są ujemne lub dodatnie, korzystając z ustalonych punktów odcięcia.
    UWAGA: Dzień testu 2 obejmuje kroki od 7 do 9.

Wyniki

Analiza wyników testu została przedstawiona w Tabeli 1, Tabeli 2 oraz Tabeli 3. Wartości odczytów pochodzą z danych z 10 punktów w obrębie tej samej studzienki. Wartości indeksu dla każdej próbki obliczono w odniesieniu do odpowiadających im wewnętrznych kontroli pozytywnych i negatywnych, zgodnie z opisem w protokole testu. Przykłady błędnych duplikatów przedstawiono w Tabeli 1, co spowodowało błąd obliczenia końcowego indeksu w Tabeli 3. Wszystkie surowe wartości zliczeń muszą zostać sprawdzone, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych.

Zwalidowano 7-multipleksowy test ECL, wykorzystując obszerną kohortę próbek pochodzących od 1026 nowo zdiagnozowanych pacjentów z T1D oraz 1022 zdrowych osób kontrolnych, dopasowanych pod względem wieku i płci. Poziomy autoprzeciwciał z 7-multipleksowego testu ECL dla 1026 pacjentów z T1D porównano z poziomami z każdego z odpowiadających im, uznanych pojedynczych testów ECL, jak pokazano na Rysunku 2, oraz z każdego odpowiadającego im pojedynczego standardowego testu RBA i ELISA, jak pokazano na Rysunku 3>. Specyficzność testów ustalono identycznie na poziomie 99th percentyla dla wszystkich testów autoprzeciwciał z wyjątkiem autoprzeciwciał przeciwko tarczycy (gdzie zastosowano 95. percentyl), dla 1022 zdrowych kontroli dla wszystkich trzech metod badawczych (7-multipleksowy ECL, pojedynczy ECL, RBA lub ELISA), zgodnie z wykazem w Tabeli 4. Międzytestowe współczynniki zmienności (CV) dla GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA i IFNαA wynoszą odpowiednio 6,4%, 4,5%, 9,1%, 4,9%, 5,7%, 11,3% i 5,9%.

W przypadku każdego z 7 autoprzeciwciał stwierdzono niewielką liczbę rozbieżnych próbek w pobliżu granicy odcięcia dla poszczególnych testów (Rysunek 2 oraz Rysunek 3). Jedenaście próbek kontrolnych (11/1022, 1,1%) wykazalo dodatni wynik dla wielu autoprzeciwciał wyłącznie w teście 7-Plex, natomiast wynik ujemny w każdym odpowiadającym mu pojedynczym teście. Podobnie stało się w przypadku 9 próbek pacjentów z T1D (9/1026, 0,9%). Ponadto, 10 silnie dodatnich próbek TPOA i jedna ThGA w kohorcie pacjentów, które były widoczne zarówno w pojedynczym teście ECL, jak i RBA, nie zostały wykryte w teście 7-Plex. Próbki te stały się dodatnie w teście 7-Plex po ich dalszym rozcieńczeniu. Ogólnie rzecz biorąc, 100% dodatnich wyników w pojedynczym teście ECL lub RBA zostało objętych testem 7-Plex ECL, przy zachowaniu tej samej swoistości testu, co przedstawiono w Tabeli 4.

figure-results-1
Rysunek 1: Ilustracja testu Multiplex ECL.
Autoprzeciwciała w surowicy tworzą mostek między antygenem znakowanym Ru Sulfo-NHS a antygenem biotynilowanym. Jest on łączony ze specyficznym linkerem w celu utworzenia kompleksu antygen-przeciwciało-antygen-linker. Kompleksy są wychwytywane na płytce i unieruchamiane w swoich specyficznych miejscach za pomocą odpowiednich linkerów. Przedstawiono numery specyficznie sprzężonych linkerów dla 7 różnych białek antygenowych. Detekcja sygnałów przeciwciał odbywa się przy użyciu antygenów znakowanych Ru Sulfo-NHS z wykorzystaniem elektrochemiluminescencji. Rysunek pochodzi z pracy Gu, Y. i wsp.13. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Porównanie poziomów 7 autoprzeciwciał u 1026 pacjentów z nowo zdiagnozowaną T1D pomiędzy pojedynczym testem ECL a testem 7-Plex ECL.
Panele a, b, c, d, e, f oraz g przedstawiają porównania poziomów autoprzeciwciał odpowiednio dla GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA oraz IFNαA. Linie przerywane reprezentują wartości odcięcia (cut-off) dla każdego testu autoprzeciwciał. Wartości odcięcia zostały ustalone na poziomie 99th percentyla dla 1022 zdrowych osób kontrolnych dobranych pod względem wieku dla każdego testu (z wyjątkiem TPOA i ThGA, dla których ustalono 95th percentyl), jak pokazano w Tabeli 4, dla 1022 zdrowych osób kontrolnych dobranych pod względem wieku zarówno dla pojedynczych, jak i multipleksowych testów ECL. Czerwone zamknięte romby są oznaczone jako wyniki fałszywie dodatnie w teście 7-Plex ECL, stanowiące <1% badanej kohorty, i zostały one zweryfikowane jako ujemne zarówno w pojedynczym ECL, jak i w RBA. Czerwone zamknięte kwadraty są oznaczone jako wyniki fałszywie ujemne w teście 7-Plex ECL spowodowane zjawiskiem „prozonalnym”, występującym głównie w teście TPOA u <1% badanej kohorty. Oba te wyniki, fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne, są omówione w sekcji dyskusji. Rysunek pochodzi z pracy Gu, Y. et al.13. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Porównanie poziomów 7 autoprzeciwciał u 1026 pacjentów z nowo zdiagnozowaną T1D pomiędzy metodą RBA (ELISA dla IFNαA) a testem 7-Plex ECL.
Panele a, b, c, d, e, f i g przedstawiają odpowiednio porównania poziomów autoprzeciwciał GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA oraz IFNαA. Linie przerywane reprezentują wartości odcięcia dla każdego testu autoprzeciwciał, przy tej samej swoistości ustalonej zarówno dla RBA, jak i testu 7-Plex ECL, co pokazano w Tabeli 4, na podstawie 1022 zdrowych kontroli dobranych pod względem wieku. Czerwone zamknięte romby i kwadraty reprezentują wyniki „fałszywie” dodatnie i „fałszywie” ujemne występujące w teście 7-Plex ECL, analogicznie jak pokazano na Rycini 2. Rycina pochodzi z pracy Gu, Y. et al.13. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

123456
A55805674105117125139 łącznik-1
10010810210239563745 łącznik-2
115124107116113124 łącznik-3
676468616569 łącznik-4
898798929080 łącznik-5
877189876172 łącznik-6
9482798521542280 łącznik-7
7566162815948183 łącznik-8
9810371846985 łącznik-9
102118939811399 łącznik-10
B32433714714854265366 łącznik-1
10110293888674 łącznik-2
1111191191236672 łącznik-3
726559687467 łącznik-4
819883927972 łącznik-5
908493867076 łącznik-6
10110510197956944 łącznik-7
82831892049790 łącznik-8
928378648278 łącznik-9
8379889347224965 łącznik-10
C110110878121142365 łącznik-1
5526568088708693 łącznik-2
114132677133263284 łącznik-3
646288746480 łącznik-4
948286758976 łącznik-5
778775637086 łącznik-6
77867184138121 łącznik-7
738680795973 łącznik-8
8674506449238886 łącznik-9
1051138580124114 łącznik-10
D98889284136127 łącznik-1
2882918686558564 łącznik-2
1091017473141127 łącznik-3
786666557466 łącznik-4
798379869691 łącznik-5
838696898673 łącznik-6
87897787841855 łącznik-7
747260729095 łącznik-8
687533132824602580 łącznik-9
86988075123133 łącznik-10
E101114101106532548 łącznik-1
10196110104682675 łącznik-2
6015598812412610198 łącznik-3
667182718062 łącznik-4
10297998083110 łącznik-5
826781806085 łącznik-6
85955284245221 łącznik-7
72788274486503 łącznik-8
779797775666 łącznik-9
11410457265814259253 łącznik-10
F11912013311811296 łącznik-1
10191100959682 łącznik-2
4063951111232127101 łącznik-3
726086727983 łącznik-4
7685969989103 łącznik-5
887891838995 łącznik-6
10497871025666 łącznik-7
767779936975 łącznik-8
8571951008371 łącznik-9
1311313583649286 łącznik-10
G90958582105107 łącznik-1
9986777612501174 łącznik-2
119123120118112108 łącznik-3
768377808676 łącznik-4
8886869310792 łącznik-5
737371828475 łącznik-6
5210517372697685 łącznik-7
80817982100101 łącznik-8
969789836583 łącznik-9
98103868819331979 łącznik-10
H1141248186299295 łącznik-1
10792697242564388 łącznik-2
114123125129501536 łącznik-3
777067647462 łącznik-4
9211081847771 łącznik-5
877972768381 łącznik-6
32834184808897 łącznik-7
758475907483 łącznik-8
737978768470 łącznik-9
113120817623722350 łącznik-10

Tabela 1: Analiza testu ECL 7-pleks: surowe zliczenia CPS (lewa połowa płytki). Surowe zliczenia CPS są pozyskiwane z płytki testowej (lewa połowa płytki), a każda próbka jest analizowana w duplikacie. Pod każdym rzędem płytki (A-H) znajduje się 10 linii wartości odczytów reprezentujących dane z 10 punktów w obrębie tej samej studzienki, odpowiadających poszczególnym numerom łączników zgodnie z oznaczeniem. Przykłady błędnych duplikatów są wyróżnione na szaro, jak widać w rzędzie F-łącznik 3-kolumny 5 i 6.

Wiersz tabeli 1AKolumna tabeli 1A łącznik 1 łącznik 2 łącznik 3 łącznik 7 łącznik 8 łącznik 9 łącznik 10
A1-2GADA PC56271041208871101110
B1-2GADA Low PC331102115103838881
C1-2TPOA PC1105603123828080109
D1-2TPOA Low PC9329010588737292
E1-2TGA PC108996002907587109
F1-2TG Low PC120964011017778131
G1-2ThGA PC939312151928197101
H1-2ThGA Low PC1191001193358076117
A3-4IAA PC1111021128216117896
B3-4IAA Low PC14891121991977191
C3-4IFNaA PC8479697880499483
D3-4IFNaA Low PC888674826633078
E3-4IA-2A PC1041071256878875770
F3-4IA-2A Low PC12698117958698361
G3-4NC847711971818687
H3-4NC847112782787779
A5-6próbka 1132385111922178277106
B5-6próbka 25396806995094804844
C5-6próbka 322409033051306687119
D5-6próbka 4132561134848932520128
E5-6próbka 554067910023349561256
F5-6próbka 610489111461727789
G5-6próbka 7106121211081101741957
H5-6próbka 829743225199379772361

Tabela 2: Analiza testu ECL 7-pleks: układ danych z Tabeli 1, oznaczonych jako 7 łączników. Dane z Tabeli 1 zostały przeorganizowane poprzez usunięcie łączników od 4 do 6 (niewykorzystanych), a wartości średnie obliczono z każdego powtórzonego pomiaru z Tabeli 1. Wartości wysokiej i niskiej kontroli pozytywnej standardu wewnętrznego, odpowiadające każdemu testowi autoprzeciwciał ograniczonemu przez konkretny łącznik, zostały zaznaczone pogrubioną czcionką. PC, kontrola pozytywna. NC, kontrola prawidłowa.

Indeks GADWskaźnik TPOAIndeks TGAIndeks ThGAIndeks IAAWskaźnik IFNaAIndeks IA-2A
GADA PC1.0000.0050.0000.003-0.0060.0030.004
Niskie stężenie GADA w surowicy/osoczu0.0450.005-0.0010.0060.0020.000-0.001
IAA PC0.0051.0000.0010.002-0.001-0.0010.004
Niski poziom IAA w PC0.0020.039-0.0020.003-0.005-0.0030.001
IA-2A PC0.0040.0041.0000.004-0.0040.0000.004
IA-2A Low PC0.0070.0040.0480.006-0.002-0.0020.008
TGA PC0.0020.0030.0001.0000.0000.0020.002
TG niska kontrola pozytywna0.0060.0040.0000.052-0.001-0.0020.005
TPOA PC0.0050.005-0.0010.0021.000-0.0020.001
Niski poziom PC TPOA0.0120.0030.0000.0060.076-0.0030.001
ThGA PC0.0000.000-0.0080.0010.0001.000-0.001
ThGA niska zawartość PC0.0010.002-0.0080.002-0.0090.050-0.002
IFNaA PC0.0040.0060.0010.000-0.0020.0001.000
Niski poziom PC IFN$\alpha$A0.0080.0040.0000.0050.0040.0020.048
NC0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000
NC0.000-0.0010.0010.002-0.002-0.002-0.001
Próbka 10.0090.6830.0000.4190.001-0.0020.003
próbka20.9580.001-0.0080.1720.009-0.0010.837
próbka 30.3890.0020.5420.012-0.0090.0000.006
Próbka 40.0090.0880.0030.1520.0080.4960.007
próbka50.0820.109-0.0030.0320.271-0.0050.030
Próbka 60.0040.0020.169-0.002-0.006-0.0020.000
próbka70.0040.205-0.0020.0020.013-0.0020.329
próbka 80.0390.7680.0680.004-0.001-0.0020.400

Tabela 3: Analiza testu ECL 7-pleks: wyniki wartości indeksu. Wartości indeksu dla każdej próbki dla wszystkich 7 testów przeciwciał autoprzeciwciał zostały obliczone w odniesieniu do odpowiadających im wewnętrznych kontroli pozytywnych i negatywnych, zgodnie z opisem w protokole testu. Każda wartość indeksu przekraczająca wartość odcięcia została zdefiniowana jako wynik dodatni, zaznaczony ciemną pogrubioną czcionką. Wartość indeksu TGA dla próbki 6 została wyróżniona kolorem szarym, ponieważ jest to błąd spowodowany wadliwymi powtórzeniami przedstawionymi w wierszu F-linker 3-kolumnach 5 i 6 w Tabeli 1.

GADAIA-2AIAATGATPOAThGAIFNαA*
CzułośćSwoistośćCzułośćSwoistośćCzułośćSwoistośćCzułośćSwoistośćCzułośćSwoistośćCzułośćSwoistośćCzułośćSwoistość
RBA73.4%98.5%75.2%99.0%47.7%99.1%12.9%99.0%23.9%95.2%19.3%94.7%1.0%99.6%
Pojedynczy ECL71.6%99.1%73.6%99.3%48.3%99.7%16.0%98.9%26.3%94.9%20.6%95.1%0.8%99.2%
7-Plex ECL71.2%98.9%77.3%98.9%49.5%98.9%16.5%98.7%26.1%94.7%21.1%94.7%1.7%99.1%

Tabela 4: Czułość i swoistość testu wśród 1026 pacjentów z T1D oraz 1022 osób z grupy kontrolnej, dopasowanych pod względem wieku i płci, w 7-pleksowym teście ECL w porównaniu do odpowiadającego mu pojedynczego testu ECL oraz RBA lub ELISA*. Trzy różne testy (RBA, pojedynczy ECL i 7-pleksowy ECL) dla każdego autoprzeciwciała zostały ustawione na podobne poziomy swoistości z wykorzystaniem 1022 zdrowych osób z grupy kontrolnej dopasowanych pod względem wieku i płci. Wynik swoistości w badanej kohorcie kontrolnej został ustalony na poziomie około 95% dla TPOA i ThGA oraz 99% dla 5 pozostałych testów. *Gwiazdka oznacza test IFNαA wykonany metodą ELISA, podczas gdy pozostałe wykonano metodą RBA.

Dyskusja

W licznych krajowych i międzynarodowych badaniach klinicznych dotyczących cukrzycy typu 1 skuteczność pojedynczego testu ECL do wykrywania autoprzeciwciał wysp trzustkowych i autoprzeciwciał przeciwko transglutaminazie (TGA) w celiakii została potwierdzona 8,9,10,11. Na wszystkich tych ścieżkach test ten zwiększył czułość i swoistość wykrywania autoantygenu w porównaniu z istniejącym "złotym" standardem RBA. Zwiększoną swoistość choroby można zaobserwować przy rozróżnianiu autoprzeciwciał wysp trzustkowych o wysokim powinowactwie i wysokim ryzyku od sygnałów o niskim ryzyku i niskim powinowactwie, między pojedynczym testem ECL a RBA 14,15,16,17. Opierając się na pojedynczym teście ECL, opracowujemy nowy, wysokoprzepustowy, multipleksowany test autoprzeciwciał ECL, który umożliwia nam badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, a także kilku możliwych do zastosowania chorób autoimmunologicznych w tym samym czasie.

Multipleksowy test ECL wykorzystuje płytkę multipleksową, która może połączyć do 10 testów autoprzeciwciał w jednym dołku. W niniejszym badaniu połączono ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Autoprzeciwciała składają się z 3 IAb (IAA, i IA-2A), 2 autoprzeciwciał autoimmunologicznych przeciwko chorobom tarczycy (TPOA i ThGA), autoprzeciwciał przeciwko celiakii (TGA) i autoprzeciwciał APS-1 przeciwko interferonowi alfa (IFNαA). Mechanizm oznaczania jest zasadniczo oparty na pojedynczym teście ECL, jak wcześniej opublikowano 9,10,12,18 z pewnymi modyfikacjami. Główna różnica między multipleksowym testem ECL a pojedynczym testem ECL polega na tym, że każdy kompleks przeciwciało-antygen utworzony w fazie płynnej jest ograniczony do określonego łącznika (ryc. 1). Antygen znakowany biotyną jest inkubowany ze sprzężoną streptawidyną, łącznikiem używanym do tworzenia specyficznego kompleksu antygen-łącznik. Kompleks immunologiczny przeciwciało-antygen tworzy się po inkubacji z surowicą pacjenta i jest wychwytywany w określonym miejscu przez specyficzny system łączników na każdej studzience płytki multipleksowej. Antygen znakowany Ru Sulfo-NHS wychwycony przez przeciwciała w tym samym czasie dostarcza sygnał z elektrochemiluminescencją. Czytnik płytek może wykryć do 10 różnych sygnałów ze źródeł punktowych znajdujących się w każdej studni. Aby zachować spójność testów autoprzeciwciał między płytkami i podczas prowadzenia długoterminowych badań, sugerujemy stosowanie tego samego łącznika.

Przed skonfigurowaniem multipleksowego testu ECL, pojedyncze testy ECL dla każdego autoprzeciwciała muszą zostać zoptymalizowane odpowiednio na płytce multipleksowej i zweryfikowane zarówno pod kątem RBA, jak i pojedynczych testów ECL na zwykłej płytce ECL. Aby ulepszyć test szachownicy, do powiązanego testu autoprzeciwciał na płytce multipleksowej, użyto pacjenta o wysokim dodatnim wyniku i ujemnej próbki pacjenta. Po przeprowadzeniu testu szachownicy obliczono najbardziej idealne stężenia dla Ru Sulfo-NHS i antygenu znakowanego biotyną dla każdego z 7 testów autoprzeciwciał. Następujące stężenia są następujące: 30 ng/ml i 200 ng/ml dla GAD65, 120 ng/ml i 120 ng/ml dla proinsuliny, 10 ng/ml i 42 ng/ml dla IA-2, 80 ng/ml i 80 ng/ml dla TG, 8 ng/ml i 16 ng/ml dla TPO, 31 ng/ml i 31 ng/ml dla ThG, oraz odpowiednio 12 ng/ml i 12 ng/ml dla IFNα13. Stężenia niektórych antygenów z testu szachownicy mogą wymagać dalszego dostosowania zgodnie z wynikami rzeczywistego testu multipleksowego po połączeniu wszystkich testów razem.

Ponieważ IAA jest uwzględniony w niniejszym multipleksowym teście ECL, obowiązkowa obróbka kwasem próbek surowicy przed inkubacją surowicy z antygenem, jak podano w poprzednim badaniu12. Ogólnie rzecz biorąc, gdy dodatkowe autoprzeciwciało jest dodawane do testu multipleksowego, wpływa to na tło testu, a bardzo wysoki sygnał z jednego miejsca, w studzience, może utrudniać wyniki pobliskich plam poprzez przesłuchy. W związku z tym maksymalna liczba CPS musi być ograniczona do 20 000 zliczeń dla każdego autoprzeciwciała lub niższa dla próbek o najwyższej liczbie dodatnich. Z naszej wiedzy wynika, że w celu zmniejszenia ilości przesłuchów, autoprzeciwciała, które mają niższe tło, powinny być oddzielane, podczas projektowania mapy punktowej, z dala od miejsc o większej częstotliwości zliczeń.

W każdym teście stosowano wewnętrznie wysokie wyniki dodatnie i ujemne w celu obliczenia dokładnego indeksu dla nieznanych badanych próbek. Aby dokładnie ocenić i monitorować czułość testu, zastosowano niskie kontrole dodatnie, ustawione w pobliżu górnej granicy testu. Te standardowe kontrole dodatnie i ujemne zostały utworzone luzem i podwielokrotnością do długotrwałego stosowania i przechowywane w temperaturze -20 °C lub niższej, w celu zachowania spójności między testami. W celu zapewnienia jakości próbki badano dwukrotnie w każdym teście, a każdy pozytywny wynik był ponownie badany i potwierdzany poprzez umieszczenie próbki w nowym teście ECL następnego dnia. W przypadku jakichkolwiek rozbieżności co do pierwszego i drugiego testu potwierdzającego, konieczne było przeprowadzenie trzeciego testu. Spośród trzech przeprowadzonych testów, wyniki dwóch testów, które są zgodne (np. +, + lub -,-), określiły ostateczny wynik (dodatni lub negatywny) próbki.

W ciągu ostatniej dekady wiele grup badawczych poszukuje wysokoprzepustowego testu wykorzystującego metodę multipleksową do łączenia wielu testów autoprzeciwciał w jednym dołku w celu przeprowadzenia badań przesiewowych dużych populacji. Istnieje kilka badań, które wykorzystują różne rodzaje technologii do przeprowadzania testów autoprzeciwciał multipleksowych 19,20,21,22, ale nie ma porównania dla żadnego z tych testów pod względem czułości i swoistości w porównaniu z obecnym "złotym" standardem RBA, podczas badania cukrzycy typu 1. Te różne typy stosowanych platform nie są walidowane podczas międzynarodowych warsztatów Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) ani poprzez testowanie dużych kohort w badaniach klinicznych. W niedawnym badaniu przesiewowym opartym na populacji ogólnej w Niemczech, wysokoprzepustowy test łączony, 3 Screen ICATM ELISA dystrybuowany przez firmę Kronus, jest używany jako narzędzie do badań przesiewowych pierwszego rzutu w celu wykrycia trzech IAb,, IA-2A i ZnT8A, w celu uzyskania wczesnej diagnozy dziecięcej cukrzycytypu 1 23. 3-ekranowy test ELISA mierzy 3 autoprzeciwciała w 3 oddzielnych studzienkach, zużywając dużą objętość surowicy, lub w jednym dołku z wymieszanymi wszystkimi 3 testami. Jeśli jeden dołek w 3-ekranowym teście ELISA jest pozytywny, nie jest w stanie odróżnić, które z trzech autoprzeciwciał są obecne. Największą wadą tego testu jest brak możliwości uwzględnienia pomiaru IAA. Wszystkie wyniki IAA przeprowadzone metodą ELISA, jak udowodniono podczas warsztatów IASP, nie mają akceptowalnej czułości i swoistości24. IAA jest zwykle pierwszym IAb, który się pojawia i ma wysoką częstość występowania wśród małych dzieci. Badania przesiewowe IAb, z IAA, są konieczne dla dzieci i nie uważa się za dopuszczalne przeprowadzanie tych badań przesiewowych bez IAA w celu oceny ryzyka cukrzycy typu 1 w społeczności. Ponadto nie ma opublikowanych badań ani danych, które wskazywałyby, że test Kronus IAb kit jest bardziej specyficzny dla choroby T1D i jest w stanie odróżnić IAb wysokiego ryzyka od IAb niskiego ryzyka. Test ECL 7-Plex w niniejszym badaniu został zwalidowany przy użyciu dużej kohorty nowo zdiagnozowanych pacjentów z cukrzycą typu13. W porównaniu z obecnym standardowym testem RBA i ugruntowanym pojedynczym testem ECL, test 7-Plex jest w stanie zachować 100% dodatni wynik przy tej samej swoistości testu (Tabela 4). Obecnie test 4-Plex ECL, równoległy do standardowego RBA, jest stosowany w trwającym dużym badaniu klinicznym: badaniu Autoimmunity Screening for Kids (ASK). Badanie to obejmuje badania przesiewowe dzieci z populacji ogólnej z obszaru metropolitalnego Denver pod kątem cukrzycy typu 1 i celiakii. W porównaniu ze standardowym RBA zastosowanym w badaniu ASK, multipleksowy test ECL wykazuje doskonałą czułość i wyższą swoistość choroby, identyczną z naszymi poprzednimi raportami z wykorzystaniem pojedynczego badania ECL25. Co więcej, nasz test ECL 4-Plex wykazał wyraźne zmniejszenie nakładu pracy, kosztów i objętości surowicy o 70% w porównaniu z odpowiadającymi im 4 pojedynczymi testami ECL i RBA. Korzystając z multipleksowanego testu ECL, możemy dostosować każdą studzienkę za pomocą różnych liczb, reprezentujących różne autoprzeciwciała (do 10), aby przetestować różne choroby autoimmunologiczne, które są specyficzne dla potrzeb określonej lokalizacji klinicznej.

W niniejszym badaniu zaobserwowano pewne ograniczenia dotyczące multipleksowanego testu ECL przy użyciu płytki multipleksowej. Końcowe rozcieńczenie surowicy, inkubowanej z antygenem, nie może być dostosowane w celu uzyskania najbardziej optymalnych warunków dla każdego pojedynczego testu autoprzeciwciał, który jest połączony w jednym dołku. W dziewięciu próbkach (9/1026) od pacjentów z cukrzycą typu 1 zaobserwowano, że wynik jest fałszywie ujemny dla określonych autoprzeciwciał. 7 wyników fałszywie ujemnych dotyczyło TPOA, a 2 ThGA, w teście ECL 7-Plex, ale wysokie wyniki dodatnie wykazano zarówno w teście pojedynczego ECL, jak i RBA (Figura 2 i 3). Po dalszym rozcieńczeniu wszystkich 9 próbek, na płytce multipleksowej uzyskały one wynik dodatni. Wynik ten jest spowodowany tym, co nazywamy zjawiskiem "prozone". Zjawisko to powoduje, że próbka wykazuje fałszywie ujemny wynik, ponieważ wysokie miana przeciwciał wpływają na tworzenie sieci antygen-przeciwciało. Podczas ustawiania testu multipleksowego zaleca się, aby próbki o bardzo wysokich mianach, dla każdego z połączonych autoprzeciwciał, przeprowadziły testy wstępne w celu zidentyfikowania opcjonalnego rozcieńczenia surowicy do inkubacji antygenu. Alternatywnie, testy autoprzeciwciał o podobnie zoptymalizowanych warunkach powinny być wybrane w celu utworzenia testu połączonego, z którego uzyskuje się najlepszą czułość i swoistość testu dla każdego autoprzeciwciała. W niniejszym badaniu 7 próbek (7/1022) od zdrowych, normalnych osób z grupy kontrolnej dało fałszywie dodatnie wyniki dla wielu autoprzeciwciał w teście 7-Plex, ale po przeprowadzeniu pojedynczego testu ECL i RBA (Figura 2 i 3) stwierdzono, że te autoprzeciwciała są ujemne w obu testach. Przyczyny tych fałszywie dodatnich wyników występujących na płytce multipleksowej dla tych małych podzbiorów próbek są obecnie nieznane. W przypadku obecnego zastosowania multipleksowego testu ECL wszystkie dodatnie próbki są powtarzane z odpowiadającym im pojedynczym testem ECL w celu potwierdzenia dodatniego wyniku, co usuwa ten fałszywie dodatni błąd z multipleksowego testu ECL.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez DK32083 grantów NIH, JDRF Grants 2--2015-51-Q-R i 2--2018-533-S-B.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4 & stopnie; C lodówka
– 80 stopni Celsjusza; C oraz -20 ° C zamrażarki
96-dołkowa Wytrząsarkado płyt Wallac - Delfi
96-dołkowa okrągła płyta dolnaFisher8408220
Roztwór kwasu octowegoFisher
Folia
Białka antygenowe
Ludzkie białko GAD65 pełnej długościDiamyd
Ludzkie białko ThG o pełnej długościBioMart
Ludzkie białko TPO o pełnej długościBioMart
IA-2 białko wewnątrzkomórkoweBioMart
IFN-α białkoAbcam
Białko proinsulinyAmideBio
tTG białkoDiaRect
BiotynaSigma
Butelka 500 ml, Jednostki filtrująceFisher0974064A lub B
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA-7906
Destylowana woda
) HClKostkarka
Sektor MSDPerkin-Elmer
Pipeta
NaOH
Wieża
PBS
pH-metr
Pipety-Aid
Pipety/końcówki
Ru Sulfo-NHSMSD (R91AN)
Trizma BaseFisherBP152-5
Tween 20SigmaP-1379
Zestaw rozwojowy UplexMSD
96-dołkowa płytka UPlexMSD
AMSDR93AA
Linker-StreptawidynaMSD
Bufor odczytuMSDR92TC
Stop Solution MSD
Vortex mixer
ZeBa ColumnPierce89892
aluminiowadejonizowana (DD do lodu Fisher Tacki na lód wielokanałowapapierowa Bloker

Bibliografia

  1. Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study. Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).
  2. Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
  3. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  4. Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
  5. Barker, J. M., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
  6. Triolo, T. M., et al. Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
  7. de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).
  8. Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
  9. Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
  10. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
  11. Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Journal of Clinical & Cellular Immunology. 8 (6), (2017).
  12. Gu, Y., et al. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. Journal of Visualized Experiments. (133), e57227(2018).
  13. Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
  14. Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
  15. Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
  16. Fouts, A., et al. Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects. Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).
  17. Sosenko, J. M., et al. The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).
  18. Zhao, Z., et al. Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 5(2016).
  19. Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes. Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).
  20. Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP). American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).
  21. Yim, S. W., et al. Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays. Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).
  22. Bale, S. S., et al. A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes. Technology. 02 (03), 200-205 (2014).
  23. Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
  24. Schlosser, M., et al. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).
  25. Zhao, Z., et al. A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease. Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test elektrochemiluminescencyjnyprzesiewowe badanie autoprzeciwciałmultipleksowy test ECLczytnik płyteksystem łącznikowyinkubacja surowicyprzemywanie w PBS-Tbufor odczytowy
Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.