Artykuł metodologiczny

Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

DOI:

10.3791/61166

⸱

19 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia dwa zoptymalizowane protokoły badania rezydentnych i obwodowo pochodzących komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym mózgu, rdzeniu kręgowym i oponach mózgowych. Każdy z tych protokołów pomaga ustalić funkcję i skład komórek zajmujących te przedziały w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) składa się z mózgu i rdzenia kręgowego i jest otoczony przez opony mózgowe, błoniaste warstwy służące jako bariera między obwodem a OUN. Ośrodkowy układ nerwowy jest miejscem wyspecjalizowanym immunologicznie, a w stanie stacjonarnym przywilej immunologiczny jest najbardziej widoczny w miąższu OUN. W przeciwieństwie do tego, opony mózgowe zawierają różnorodny szereg komórek rezydentnych, w tym wrodzone i nabyte komórki odpornościowe. Podczas stanów zapalnych wywołanych uszkodzeniem OUN, autoimmunizacją, infekcją, a nawet neurodegeneracją, komórki odpornościowe pochodzenia obwodowego mogą dostać się do miąższu i zamieszkać w oponach mózgowych. Uważa się, że komórki te wykonują zarówno korzystne, jak i szkodliwe działania podczas patogenezy choroby OUN. Pomimo tej wiedzy, opony mózgowe są często pomijane podczas analizy przedziału OUN, ponieważ konwencjonalne metody ekstrakcji tkanek OUN pomijają warstwy opon mózgowych. Protokół ten przedstawia dwie odrębne metody szybkiej izolacji mysich tkanek OUN (tj. mózgu, rdzenia kręgowego i opon mózgowych), które nadają się do dalszej analizy za pomocą technik jednokomórkowych, immunohistochemii i metod hybrydyzacji in situ. Opisane metody zapewniają kompleksową analizę tkanek OUN, idealną do oceny fenotypu, funkcji i lokalizacji komórek zajmujących przedział OUN w warunkach homeostazy i podczas patogenezy choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) jest immunologicznie wyspecjalizowanym miejscem. Miąższ OUN, z wyłączeniem przestrzeni płynu mózgowo-rdzeniowego, opon mózgowych i układu naczyniowego, jest klasycznie postrzegany jako miejsce uprzywilejowane immunologicznie1,2,3,4,5 i jest stosunkowo pozbawiona komórek odpornościowych w warunkach homeostazy2,6,7. Natomiast opony mózgowe, składające się z warstwy opony twardej, pajęczynówki i pia, są kluczowymi składnikami przedziału OUN, aktywnie uczestnicząc w homeostatycznym nadzorze immunologicznym i procesach zapalnych podczas patogenezy choroby3,6,7,8. W stanie stacjonarnym opony mózgowe wspierają liczne immunologiczne komórki wartownicze, w tym wrodzone komórki limfoidalne (ILC), makrofagi, komórki dendrytyczne (DC), komórki tuczne, limfocyty T i w mniejszym stopniu komórki B9,10,11.

Opony mózgowe są silnie unaczynionymi strukturami i zawierają naczynia limfatyczne, które zapewniają połączenie limfatyczne między OUN a jego obrzeżami8,12,13,14. W stanach zapalnych wywołanych uszkodzeniem OUN, infekcjami, autoimmunizacją, a nawet neurodegeneracją, komórki odpornościowe pochodzenia obwodowego infiltrują miąższ i zmieniają krajobraz immunologiczny w oponach mózgowych. Po infiltracji komórek opony mózgowe mogą stanowić funkcjonalną niszę dla komórek odpornościowych pochodzenia obwodowego, promując agregację komórek odpornościowych, lokalną aktywację komórek odpornościowych i długoterminowe przeżycie w przedziale OUN. Wyraźne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych obserwuje się w wielu chorobach wpływających na OUN, w tym w stwardnieniu rozsianym (SM)15,16,17,18,19, stroke20,21, sterylne uszkodzenie22,23 (tj. uraz rdzenia kręgowego i uraz mózgu), migreny24 oraz infekcja bakteryjna25,26,27,28,29. W związku z tym charakterystyka komórek rezydentnych i komórek odpornościowych pochodzenia obwodowego w przedziale oponowo-rdzeniowym jest niezbędna do zrozumienia roli tych komórek w warunkach stanu stacjonarnego i patogenezy choroby.

Ekstrakcja mózgu, rdzenia kręgowego i opon mózgowych z czaszki i trzonów kręgów jest technicznie trudna i czasochłonna. Obecnie nie ma dostępnych technik szybkiej ekstrakcji mózgu z nienaruszonymi wszystkimi trzema warstwami opon mózgowych. Chociaż laminektomia zapewnia doskonałą morfologię tkanki rdzenia kręgowego i zachowuje warstwy opon mózgowych, jest zarówno niezwykle czasochłonna, jak i skomplikowana30,31. I odwrotnie, bardziej konwencjonalne metody ekstrakcji, takie jak usunięcie mózgu z czaszki i hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego, ułatwiają szybką ekstrakcję tkanki OUN, ale zarówno opony pajęczynówkowe, jak i opony oponowe opony twardej są tracone dzięki tym technikom30,31. Pominięcie warstw opony twardej i pajęczynówki podczas konwencjonalnej izolacji tkanek mózgu i rdzenia kręgowego powoduje niepełną analizę komórek w obrębie przedziału OUN. W związku z tym identyfikacja nowych technik skoncentrowanych na szybkiej ekstrakcji tkanek OUN z nienaruszonymi oponami mózgowymi ma kluczowe znaczenie dla optymalnej analizy przedziału OUN.

Ten manuskrypt przedstawia dwie metody szybkiej ekstrakcji mózgu, rdzenia kręgowego i opon mózgowych od myszy, ułatwiając dalszą analizę komórek rezydentnych i komórek odpornościowych pochodzenia obwodowego w miąższu OUN i oponach mózgowych. Te zoptymalizowane protokoły koncentrują się na 1) izolowaniu zawiesin pojedynczych komórek do dalszej analizy oraz 2) przygotowaniu tkanki do przetwarzania histologicznego. Uzyskanie zawiesin jednokomórkowych z mózgu, tkanki rdzenia kręgowego oraz opon oponowych opon twardych i pajęczynówkowych32 pozwala na jednoczesną analizę komórek znajdujących się zarówno w przedziale miąższowym, jak i oponowym. Zawiesiny pojedynczych komórek mogą być używane w różnych zastosowaniach, w tym w testach hodowli komórkowych do przeprowadzania stymulacji in vitro33, immunospot sprzężony z enzymem (ELISpot)28,34,35, cytometria przepływowa36,33 i jednokomórkowa37 lub transkryptomika masowa. Dodatkowo, zoptymalizowany protokół odwapniania całych mózgów i rdzeni kręgowych z nienaruszonymi czaszkami lub kręgosłupami, odpowiednio, pozwala na delikatne odwapnienie otaczającej kości, pozostawiając opony mózgowe nienaruszone i zachowując morfologię tkanek. Metoda ta pozwala na selektywną identyfikację białek lub RNA za pomocą technik immunohistochemicznych (IHC) lub hybrydyzacji in situ (ISH) zarówno w obrębie miąższu, jak i opon mózgowo-rdzeniowych. Charakterystyka fenotypu, stanu aktywacji i lokalizacji komórek rezydentnych i komórek odpornościowych pochodzenia obwodowego w obrębie OUN może dostarczyć informacji niezbędnych do zrozumienia, w jaki sposób poszczególne typy komórek w przedziale OUN przyczyniają się do homeostazy i patogenezy choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prace ze zwierzętami wykorzystują protokoły sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Geisel School of Medicine w Dartmouth.

1. Przetwarzanie próbek mózgu i rdzenia kręgowego do odwapnienia

  1. Izolowanie próbek mózgu i rdzenia kręgowego
    1. Poddać mysz eutanazji poprzez wdychanie CO2 . Upewnij się, że natężenie przepływu CO2 przemieszcza się o 10%–30% objętości klatki na minutę.
    2. Za pomocą kleszczy podnieś wyrostek mieczykowaty i przetnij ścianę brzucha nożyczkami tuż pod klatką piersiową, podciągając do góry, aby uniknąć przecięcia leżących poniżej naczyń krwionośnych lub narządów. Przeciąć membranę bocznie.
    3. Przeciąć klatkę piersiową wzdłuż bocznych krawędzi równolegle do płuc aż do obojczyka. Za pomocą kleszczy podnieś mostek i zaciśnij mostek hemostatem. Umieść hemostat nad głową, aby podnieść klatkę piersiową i odsłonić serce.
    4. Za pomocą kleszczy chwyć serce w pobliżu jego wierzchołka i wykonaj nacięcie w prawym przedsionku serca, aby zapewnić ujście. Włóż igłę 25 G z dołączoną strzykawką 10 ml, aby powoli podać 10 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS) do lewej komory w celu przezsercowego perfuzji myszy.
      UWAGA: Perfuzja powinna nastąpić w ciągu 4-5 minut, aż wątroba zostanie oczyszczona z krwi. Do perfuzji zwykle wystarcza łącznie 10 ml 1x PBS, ale w razie potrzeby można użyć więcej. Czysta wątroba zwykle wskazuje na odpowiednie ukrwienie.
    5. Używając ostrych nożyczek, usuń głowę przez ścięcie głowy (Rysunek 1; 1). Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry (Rysunek 1; 2) i odwróć skórę na oczy, aby uwolnić czaszkę.
    6. Przeciąć kość nosową, aby uwolnić żuchwę od czaszki (Ryc. 1; 3). Usuń żuchwę, język i oczy. Przeciąć wzdłuż bocznych aspektów czaszki, aby uwolnić tkankę wzdłuż zewnętrznego przewodu słuchowego (Ryc. 1; 4). Przytnij, aby usunąć nadmiar skóry, mięśni i tkanek pokrywających czaszkę.
    7. Oddziel klatkę piersiową od kręgosłupa, przecinając równolegle do kręgosłupa ostrymi nożyczkami (Rysunek 1; 5 i 6). Wykonaj małe nacięcie w dolnej części odcinka lędźwiowego, aby odizolować kręgosłup (Ryc. 1; 7). Przytnij i usuń pozostały mięsień wzdłuż kręgosłupa, aby odsłonić kręgi (Rysunek 1; 8).
      UWAGA: Usunięcie nadmiaru tkanki z kręgosłupa i czaszki jest konieczne do uzyskania odpowiedniej penetracji utrwalającego buforu odwapniającego paraformaldehydu (PFA) i kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
  2. Po utrwaleniu, odwapnieniu i kriokonserwacji
    1. Za pomocą kleszczy umieść mózg z nienaruszoną czaszką lub kręgosłupem w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 4% PFA. Umieścić probówki w temperaturze 4 °C na co najmniej 48 godzin w celu odpowiedniego zamocowania.
      UWAGA: Aby uniknąć nadmiernego utrwalenia tkanki, nie należy przekraczać 72 godzin utrwalania. Czas utrwalenia jest wydłużony w przypadku próbek kości przed odwapnieniem. Odpowiednie utrwalenie ochroni tkankę przed skutkami odwapnienia i zapewni lepszą morfologię tkanek.
    2. Opłucz mózg lub rdzeń kręgowy, usuwając tkankę z 4% PFA za pomocą kleszczy i umieszczając tkankę w jednorazowej probówce o pojemności 14 ml z 10 ml 1x PBS na 5 minut. Przenieś mózg lub rdzeń kręgowy do stożkowej rurki o pojemności 50 ml z 10 ml 10% EDTA (pH = 7,2–7,4).
      UWAGA: Użycie większej probówki z 10 ml EDTA nadaje EDTA większą powierzchnię kontaktu z tkanką i przyspiesza proces odwapnienia.
    3. Sprawdzaj codziennie, czy kość jest miękka i giętka: usuń tkankę z roztworu EDTA za pomocą kleszczy, umieść ją na szalce Petriego i delikatnie sprawdź miękkość kości za pomocą igły 25 G. Jeśli igła z łatwością wbije się w kość, proces odwapniania jest zakończony.
    4. Usuń tkankę z roztworu EDTA i przenieś mózg lub rdzeń kręgowy do jednorazowej probówki o pojemności 14 ml zawierającej 10 ml 1x PBS i myj przez 10 minut. Powtórz pranie.
      UWAGA: Odwapnienie trwa zwykle 2-3 dni. Roztwór należy zmieniać co 2-3 dni, jeśli kość nie jest jeszcze odpowiednio odwapniona. Jednak przedłużona inkubacja w EDTA po odwapnieniu kości może uszkodzić morfologię tkanki.
    5. Przygotuj 10%, 20% i 30% roztwory sacharozy, dodając sacharozę do 1x PBS. Na przykład, aby uzyskać 10% sacharozy, dodaj 10 g sacharozy i doprowadź objętość do 100 ml za pomocą sterylnego 1x PBS. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
      UWAGA: Roztwory sacharozy są podatne na rozwój mikroorganizmów, dlatego próbki nie powinny być przechowywane w tych roztworach przez dłuższy czas.
    6. Usunąć tkankę z 1x PBS, umieścić ją w 10 ml 10% roztworu sacharozy i przechowywać w temperaturze 4 °C. Pozostaw chusteczkę na 24 godziny lub do momentu, gdy opadnie na dno tubki.
    7. Powtórz ten proces, przenosząc tkankę najpierw do 20% roztworu sacharozy, a na końcu do 30% roztworu sacharozy. Pozwól tkance zanurzyć się w 30% sacharozie (co najmniej 24 godziny) i przystąp do zatapiania tkanki.
  3. Osadzanie i zamrażanie tkanek
    1. Za pomocą kleszczy usuń tkankę z 30% sacharozy, umieść ją na szalce Petriego i przechyl naczynie, aby pozbyć się nadmiaru roztworu sacharozy z tkanki. Za pomocą skalpela pokrój tkankę na pożądane segmenty.
    2. Na dnie kriomoldu należy utworzyć cienką warstwę związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i umieścić fragment(y) tkanki w formie. Całkowicie przykryj tkankę związkiem OCT, upewniając się, że nie ma pęcherzyków.
    3. Błyskawicznie zamroź bloki, najeżdżając na ciekły azot38 lub ustawiając bloki na zawiesinie 100% izopropanolu/suchego lodu39, aż blok stanie się nieprzezroczysty. Zawiń krioformy w folię aluminiową i przechowuj bloki w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania. Przesunąć bloki do temperatury -20 °C przed cięciem.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas sekcji i wykonywania protokołów histologicznych na odwapnionych mózgach, ponieważ warstwy czaszki i opon mózgowych mogą zostać utracone, jeśli skrawki są traktowane nieostrożnie.

2. Przygotowanie tkanek opon mózgowych i OUN do barwienia metodą cytometrii przepływowej

  1. Ekstrakcja czaszki, czapki i mózgu
    1. Używając ostrych nożyczek, usuń głowę przez ścięcie głowy (Rysunek 2A; 1). Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry (Rysunek 2A; 2) i odwróć skórę na oczach, aby uwolnić czaszkę.
    2. Umieść nożyczki w otworze wielkim i zacznij ciąć czaszkę bocznie wzdłuż kory mózgowej w kierunku opuszki węchowej, utrzymując nacięcia powyżej zewnętrznego przewodu słuchowego i żuchwy (Ryc. 2A; 3). Wykonaj te same nacięcia po przeciwnej stronie, z nacięciami spotykającymi się przy opuszce węchowej, aby uwolnić pokrywę czaszki od mózgu (Rysunek 2A; 3).
    3. Za pomocą kleszczy odklej nasadkę czaszki i umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml zimnego podłoża RPMI uzupełnionego 25 mM HEPES. Trzymaj probówkę na lodzie.
    4. Używając zakrzywionych kleszczy, umieść kleszcze poniżej podstawy mózgu i podnieś, aby uwolnić mózg z czapeczki czaszki. Umieść mózg w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml zimnego RPMI uzupełnionego 25 mM HEPES. Trzymaj probówkę na lodzie do czasu przetworzenia.
  2. Ekstrakcja kręgosłupa i tkanki rdzenia kręgowego
    1. Za pomocą kleszczy i ostrych nożyczek oddziel klatkę piersiową od kręgosłupa, przecinając równolegle do kręgosłupa (Rysunek 2A; 4 i 5). Wykonaj małe nacięcie w dolnej części odcinka lędźwiowego, aby odizolować kręgosłup (Rysunek 2A; 6). Przytnij i usuń pozostały mięsień wzdłuż kręgosłupa, aby odsłonić kręgi (Rysunek 2A; 7).
    2. Umieść bardzo cienkie nożyczki chirurgiczne w kręgosłupie i przetnij wzdłuż bocznej krawędzi kolumny (Rysunek 2C). Całkowicie odetnij przeciwległą krawędź boczną, aby podzielić kręgosłup na część przednią i tylną.
      UWAGA: Rdzeń kręgowy pozostanie połączony z kręgosłupem.
    3. Za pomocą kleszczy powoli i ostrożnie oderwij rdzeń kręgowy od kręgosłupa i umieść tkankę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml zimnego RPMI z 25 mM HEPES. Przenieś przednią i tylną część kręgosłupa do stożkowej rurki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml zimnego RPMI z 25 mM HEPES.
  3. Usuwanie opon mózgowych w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych
    1. Za pomocą kleszczy zdejmij nasadkę czaszki z nośnika RPMI. Za pomocą ostrych kleszczy (#7 kleszczy; Tabela materiałów), naciąć wokół zewnętrznej krawędzi czapeczki czaszki (Rycina 2B) i oderwać opony mózgowe od krawędzi czapki czaszki, zeskrobując w celu usunięcia opon oponowych opon twardych i pajęczynówkowych. Ułóż opony mózgowe na szalce Petriego.
      UWAGA: Usunięcie opon mózgowych zarówno z mózgu, jak i rdzenia kręgowego wymaga praktyki. Jeśli użytkownik ma trudności z ekstrakcją opon mózgowych, użyj mikroskopu preparacyjnego, aby pomóc w usunięciu.
    2. Usuń kręgosłup z rurki. Za pomocą ostrych kleszczy naciąć krawędzie kręgosłupa, aby uwolnić opony mózgowe i oderwać opony mózgowe od krawędzi kręgu za pomocą zakrzywionych kleszczy. Ułóż opony mózgowe na szalce Petriego.
    3. Umieść sitko z nylonowej siatki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przenieś opony mózgowe do sitka i dodaj 3 ml RPMI uzupełnione 25 mM HEPES. Za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 5 ml zmielić tkankę i podłoże przez sitko.
    4. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml przemyj sitko dodatkowymi 2 do 3 ml pożywki RPMI/HEPES, aż cała widoczna tkanka przejdzie przez sitko.
      UWAGA: Aby uzyskać odpowiednią liczbę komórek do analizy cytometrii przepływowej, może być konieczne połączenie opon mózgowych wielu zwierząt. W tym eksperymencie (Ryc. 3 i Ryc. 4) mózg i opony rdzenia kręgowego od 4-5 myszy zostały połączone razem. Jeśli próbki zostaną połączone, potrzebne będą dodatkowe podłoża do zmielenia tkanki przez sitko z siatki nylonowej, aby zapobiec przegrzaniu tkanki.
    5. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml przenieś komórki i pożywkę do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml przemyć probówkę stożkową o pojemności 50 ml 5 ml pożywki w celu zebrania pozostałych komórek. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
    6. Za pomocą pipety Pasteura z podciśnieniem odessać supernatant, uważając, aby uniknąć osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości i buforze.
    7. Aby policzyć zawiesinę jednokomórkową, należy rozcieńczyć niewielką objętość komórek (tj. 5–10 μl) za pomocą barwnika wykluczającego błękit trypanowy (rozcieńczenie 1:10) i RPMI. Dodać 10 μl rozcieńczenia do hemocytometru.
    8. Policz komórki zgodnie z wcześniejszym opisem40,41, uzyskując co najmniej dwie siatki kwadratowe po 16 dla dokładności.
      UWAGA: W Rysunek 3, na przykład, połączone, granulowane komórki z opon mózgowych zostały ponownie zawieszone w 250 μL bufora do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (1x PBS z 1% FBS) w celu dalszego barwienia powierzchni. Komórki rozcieńczono w stosunku 1:10 w celu liczenia (5 μl komórek, 5 μl błękitu trypanowego, 40 μl RPMI). To rozcieńczenie dało od 50 do 100 komórek na 16 kwadratowych siatek, zapewniając dokładniejsze zliczanie komórek, ponieważ komórki nie są ani zbyt gęste i nakładające się na siebie, ani zbyt rzadkie. Liczba komórek jądrzastych z połączonych opon mózgowych i rdzenia kręgowego na mysz była następująca: dla opon mózgowych myszy leczonych pozorami = 100 000–150 000 komórek, a dla opon mózgowo-rdzeniowych z mysiego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego wywołanej chorobą demielinizacyjną Theilera myszy = 300 000–350 000 komórek. Liczba komórek będzie się różnić w zależności od precyzji pobierania, przetwarzania i tego, czy występuje zapalenie opon mózgowych.
    9. Przejdź do żądanej techniki jednokomórkowej, takiej jak powierzchnia FACS (Rysunek 3)14,36,42,43,44, wewnątrzkomórkowe protokoły barwienia33,45, stymulacja in vitro, testy hodowli komórkowych33,46,47, test ELISPOT28,34,35, oraz transkryptomika zbiorcza lub jednokomórkowa37,48.
      UWAGA: Trzymaj wszystkie probówki na lodzie między etapami przetwarzania.
  4. Przygotowanie jednokomórkowych zawiesin tkanki mózgu i rdzenia kręgowego
    1. Przenieść tkankę mózgu lub rdzenia kręgowego z pożywką na szczyt płytki Petriego o średnicy 100 mm, wylewając tkankę i pożywkę z probówki. Za pomocą kleszczy przesuń tkankę na dno szalki Petriego. Drobno zmiel mózg lub rdzeń kręgowy sterylną żyletką. Za pomocą żyletki przenieś zmieloną tkankę na dno płytki, zeskrobując, aby zebrać tkankę.
      UWAGA: W przypadku poniższego protokołu trawienia enzymatycznego można połączyć ze sobą do dwóch rdzeni kręgowych w celu przetworzenia. Mózgi powinny być przetwarzane indywidualnie.
    2. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodaj 3 ml RPMI uzupełnionego 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) na szalkę Petriego. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml pipetuj w górę i w dół, aby ponownie zawiesić tkankę w podłożu i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Jeśli dalsze zastosowanie to analiza sekwencjonowania pojedynczych komórek lub masowego RNA lub hodowla komórek, partie FCS powinny zostać przetestowane, aby upewnić się, że komórki nie są aktywowane przed analizą. Alternatywnie, komórki mogą być przetwarzane przy użyciu 1x PBS z 0,04% BSA zamiast RPMI z 10% FCS.
    3. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, umyć szalkę Petriego dodatkowymi 2 ml pożywki w celu zebrania wszelkich resztek tkanki i przeniesienia do stożkowej probówki o całkowitej objętości 5 ml. Utrzymuj probówki na lodzie między etapami przetwarzania.
    4. Za pomocą pipety ponownie zawiesić proszek kolagenazy I w pożywce Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), aby uzyskać pożądane stężenie (tj. 100 mg/ml). Dodać kolagenazę typu I do stożkowej probówki zawierającej próbkę tkanki mielonej, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe (tj. 50 μl dla 1 mg/ml).
      UWAGA: Wyższe stężenia kolagenazy zwiększą wydajność komórek, ale mogą rozszczepić markery powierzchni komórki. W związku z tym partie kolagenazy I należy miareczkować w celu określenia optymalnego stężenia potrzebnego do uzyskania jak największej liczby żywotnych komórek z nienaruszonymi wszystkimi wymaganymi markerami powierzchni komórek. Na przykład kolagenaza I została przetestowana w końcowych stężeniach 0,5 mg/ml, 1 mg/ml i 2 mg/ml na pojedynczych próbkach mózgu lub rdzenia kręgowego. Żywotność komórek określono za pomocą metody wykluczenia błękitu trypanowego, a markery powierzchniowe komórek CD45, CD19 i CD4 oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. Stężenie kolagenazy I wynoszące 1 mg/ml dało najwyższą liczbę żywych komórek przy zachowaniu wszystkich interesujących markerów powierzchniowych komórek. W związku z tym stężenie to wykorzystano do dalszych eksperymentów badających te typy komórek.
    5. Delikatnie zawiesić proszek DNazy I za pomocą 0,15 M chlorku sodu do żądanego stężenia podstawowego. Dodać zawieszoną DNazę I do stożkowej probówki zawierającej próbkę tkanki mielonej, aby uzyskać końcowe stężenie 20 U/mL.
      UWAGA: Partie DNazy I różnią się jednostkami aktywności na ml. Stężenie, które należy dodać do próbki tkanki, zmieni się w zależności od jednostek aktywności fiolki podstawowej na mililitr. Końcowe pożądane stężenie na próbkę wynosi 20 U/ml.
    6. Umieścić probówki w stojaku na probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 40 minut. Odwracać probówki co 15 minut, aby dokładnie wymieszać tkankę z enzymami. Po inkubacji dodać 500 μl 0,1 M EDTA (pH = 7,2) do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01 M EDTA i inkubować przez dodatkowe 5 minut w celu inaktywacji kolagenazy.
    7. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, dodaj 9 ml RPMI uzupełnionego 10% FCS do każdej probówki, aby uzyskać objętość każdej probówki do ~14,5 ml. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Używając pipety Pasteura z podciśnieniem, odessać supernatant, uważając, aby nie dotknąć osadu komórkowego.
    8. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodać 3 ml 100% roztworu gradientu gęstości izotonicznej do probówki zawierającej osad komórkowy. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodaj dodatkowe podłoże RPMI 10% FCS, aby doprowadzić końcową objętość do 10 ml i ponownie zawieś osad komórek, aby utworzyć 30% warstwę gradientu gęstości izotonicznej roztworu.
      UWAGA: Przygotować 100% podstawowe podłoże o gradientzie gęstości izotonicznej z wyprzedzeniem, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. Aby przygotować 100% podstawowy roztwór gradientu gęstości izotonicznej, należy rozcieńczyć pożywkę o gradiencie gęstości (tabela materiałów) buforem do rozcieńczania pożywki o gradiencie gęstości. Przygotować bufor do rozcieńczania pożywek o gradiencie gęstości (80,0 g/l NaCl, 3,0 g/l KCl; 0,73 g/L Na2HP04, 0,20 g/L KH2HP04; 20,0 g/l glukozy) i przefiltrować sterylizować za pomocą systemu filtrów próżniowych. Przygotuj 100% podstawowy roztwór gradientu gęstości izotonicznej, mieszając 1 część bufora rozcieńczającego gradient gęstości i 9 części pożywki o gradiencie gęstości. Dobrze wymieszaj.
    9. Odwróć i dobrze wymieszaj każdą probówkę przed dodaniem 70% podkładu z gradientem gęstości izotonicznej. Włożyć na dno probówki pipetę serologiczną o pojemności 1 ml zawierającą 1 ml 70% podstawowego roztworu gradientu gęstości izotonicznej. Powoli nałóż 1 ml roztworu, uważając, aby nie powstały bąbelki. Powoli wyjąć pipetę serologiczną z probówki, uważając, aby nie naruszyć gradientu.
      UWAGA: W przypadku 70% podkładu, 100% podstawowy roztwór gradientu gęstości izotonicznej należy rozcieńczyć do 70% przy użyciu pożywki RPMI (tj. 7 ml 100% roztworu gradientu gęstości izotonicznej i 3 ml pożywki RPMI dobrze wymieszanej). Dodatkowo, stworzenie czystego, niezakłóconego 70% podkładu jest niezbędne do usunięcia resztek mieliny i uzyskania czystych zawiesin jednokomórkowych na granicy gradientów po odwirowaniu.
    10. Wirować przy 800 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C bez hamulca. Odessać supernatant, w tym warstwę resztek mieliny, aż w probówce pozostaną 2–3 ml, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórkowej. Zbierz warstwę komórek między gradientem gęstości 30/70% za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przenieś do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    11. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, dodaj pożywkę RPMI 10% FCS, aby uzyskać ostateczną objętość do 15 ml. Wirować 450 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Na tym etapie warstwy komórek z dwóch probówek można w razie potrzeby połączyć. Nie łącz więcej niż dwóch probówek, w przeciwnym razie ogniwa nie będą się osadzać ze względu na stężenie mediów gradientowych o dużej gęstości.
    12. Ostrożnie odessać supernatant, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości/buforze, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru (np. ponownie zawiesić pojedynczy rdzeń kręgowy w 250 μl buforu FACS w celu dalszego barwienia powierzchni) (Rysunek 3).
    13. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś zawiesiny komórek na górną część górnej probówki filtra (tabela materiałów) i pozwól komórkom przefiltrować się na dno probówki, aby usunąć wszelkie pozostałe resztki mieliny.
    14. Używając barwnika wykluczającego błękit trypanowy, rozcieńczyć i policzyć komórki na hemocytometrze, uśredniając co najmniej dwie siatki kwadratowe po 16 w celu uzyskania dokładności40,41.
    15. Postępuj zgodnie z żądaną techniką analizy pojedynczej komórki.
      UWAGA: Używając różnych form kolagenazy (tj. D, typ I, typ II, typ IV), komórki odpornościowe, mikroglej (Rysunek 3), astrocyty, perycyty, komórki śródbłonka 49 i neurons50 mogą być skutecznie izolowane. Liczba komórek jądrzastych uzyskana dla wyników była następująca przy użyciu miareczkowanego enzymu kolagenazy I: Cały mózg traktowany pozorem = 500 000–600 000 komórek; Cały mózg TMEV-IDD = 800 000–1 000 000 komórek; Cały rdzeń kręgowy leczony pozorem = 150 000–200 000 komórek; Cały rdzeń kręgowy TMEV-IDD = 300 000–400 000. Liczba komórek będzie się różnić w zależności od precyzji pobierania, przetwarzania i tego, czy występuje zapalenie OUN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten reprezentatywny eksperyment miał na celu ilościowe określenie komórek B i T oraz opisanie lokalizacji komórek B i T w przedziałach oponowo-rdzeniowych i miąższowych OUN w warunkach homeostazy, jak również w mysim modelu postępującego MS (tj. TMEV-IDD). TMEV-IDD indukowano u 5-tygodniowych samic myszy SJL przez infekcję wewnątrzczaszkową 5 x 106 jednostek tworzących blaszkę (PFU) TMEV BeAn, jak opisano wcześniej29.

Niniejsze badanie oceniało limfocyty B i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody oceny składu komórkowego w przedziale OUN podczas homeostazy i choroby są niezbędne do zrozumienia fizjologicznych i patologicznych stanów OUN. Jednak pomimo tego, że służą jako ważna bariera w OUN i zawierają różnorodny szereg komórek odpornościowych, opony mózgowe są często pomijane w analizie, ponieważ wiele konwencjonalnych metod ekstrakcji tkanek mózgu i rdzenia kręgowego nie pozwala na pobranie tych błon. To pominięcie jest krytycznym ograniczeniem w postępie w naszym zrozumieniu składu komórkowego i funkcji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują personelowi Centrum Medycyny Porównawczej i Badań (CCMR) w Dartmouth za fachową opiekę nad myszami wykorzystywanymi do tych badań. Fundusz Badawczy Bornstein sfinansował te badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Folia aluminiowadowolnaN/A
Surowica bydlęca AlbuminaThermoFisher Scientific37002D
WirówkaBeckman CoulterAllegra X-12R Wirówka
Kolagenaza IWorthingtonLS004196
Probówka stożkowa, 15 mlVWR525-1069
Probówka stożkowa, 50 mlVWR89039-658
Szkło osłonoweHauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
Kleszcze zakrzywioneFine Science Tools11003-14
Jednorazowa tubka polistyrenowa, 14 mlFisher Scientific14-959-1B
Jednorazowy skalpelFisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
Suchy lódAirgasN/A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA sól disodowa dwuwodnaAmresco0105-500g
Etanol, 100%dowolnaN/A
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyklonSH30910.03
Górna rurka filtra, 5 mlVWR352235
Możliwa do naprawienia plama żywotności 780Becton Dickinson565388
Cytometr przepływowyBeckman CoulterGallios
GlukozaFisher ChemicalD16-500
Kozia anty-mysia IgG (488 sprzężona)Jackson immunoresearch115-546-146
Kozia anty-mysia IgG (594 koniugat)Jackson immunoresearch115-586-146
Kozia anty-królik 488Jackson immunoresearch111-545-144
Kozia anty-szczur 594Jackson immunoresearch112-585-167
Kozia anty-szczura 650Jackson immunoresearch112-605-167
Roztwór soli zbalcowanej Hanka (HBSS)Corning21-020-CV
HemacytometrAndwin Scientific02-671-51B
HemostatFine Science Tools13004-14
HEPES (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chemicalBP366-500
KH2PO4 (bezwodny)Sigma AldrichP5655-100G
Ciekły azotAirgasN/A
Mysz FC blok (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (bezwodny)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Igła, rozmiar 25 Becton Dickinson305122
Normalna surowica dla myszyThermoFisher Scientific31881
Sitko z siatki nylonowejVWR352350
OCTSakura4583
Paraformaldehyd, 20%Mikroskopia elektronowa Sciences15713-SRozcieńczony do 4% za pomocą 1 x pipeta Pasteura PBS
, 9 cali, odłączonyFisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE Szczur Anty-Myszy CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 Szczur Anti-Mouse CD19Becton Dickinson562329
Percoll gradient gęstościGE healthcare17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Szczur Anti-Mouse CD45Becton Dickinson550994
szalka Petriego, 100 mm353003
pH-metrFisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipeta 200 µ lKońcówkiFA10005M
, 1 mlUSA Scientific1111-2831
Końcówki do pipet, 200 i mikro; lPipeta USA Scientific1111-1816
, 1 mlGilsonFA10006M
Prolong Diamond mocowanie z DAPIThermoFisher ScientificP36962
Oczyszczony szczur Anti-Mouse CD16/CD32Becton Dickinson553141
Królik anty-mysz CD3 (klon SP7)Abcamab16669
Laminina przeciw myszom królikaAbcamab11575
przeciw myszom ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
Pipeta serologiczna, 1 mlVWR357521
Pipeta serologiczna, 10 mlVWR357551
Pipeta serologiczna, 5 mlVWR357543
Wodorotlenek soduFisher ScientificS318-100
SacharozaFisher chemicalS5-500
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14001-16
Nożyczki chirurgiczne, bardzo drobneRobozRS-5882
Strzykawka, 10 mlBecton Dickinson302995
, 5 mlBecton Dickinson309646
Trypan niebieskiGibco15250-061
System filtrów próżniowychMillipore20207749
Kolba próżniowaThomas Scientific5340-2L
Filtr próżniowy liniowyPall Corporation4402
Przewód próżniowyCole PalmerEW-06414-20
Łaźnia wodnaThermoFisher ScientificVersa kąpiel
Media VWR do pipet Gilson Szczurzy środek Strzykawka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492(2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, Pt 10 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, Pt 9 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1(2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714(2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226(2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44(2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266(2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229(2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198(2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987(2016).
  40. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019).
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752(2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752(2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046(2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45(2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092(2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952(2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja opon m zgowychekstrakcja tkanki m zgowejekstrakcja rdzenia kr gowegoanaliza pojedynczych kom rekmetody immunohistochemicznehybrydyzacja in situtraktowanie kolagenazwirowanie w gradiencie g sto cibramkowanie CD45

Powiązane artykuły