Artykuł metodologiczny

Blokowanie przepływu limfy poprzez zszywanie aferentnych naczyń limfatycznych u myszy

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61178

⸱

14 maja 2020

 ,  , 
1Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin Medical University, 2Inflammation Research Network, Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Snyder Institute for Chronic Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół blokowania przepływu limfy poprzez chirurgiczne zszywanie doprowadzających naczyń limfatycznych.

Streszczenie

Naczynia limfatyczne są kluczowe dla utrzymania równowagi płynów tkankowych i optymalizacji ochrony immunologicznej poprzez transport antygenów, cytokin i komórek do drenujących węzłów chłonnych (LN). Przerwanie przepływu limfy jest ważną metodą podczas badania funkcji naczyń limfatycznych. Doprowadzające naczynia limfatyczne od mysiej opuszki stopy do węzłów chłonnych podkolanowych (pLN) są dobrze zdefiniowane jako jedyne drogi drenażu limfy do pLN. Szycie tych aferentnych naczyń limfatycznych może selektywnie zapobiegać przepływowi limfy do pLN. Metoda ta pozwala na zakłócenie przepływu limfy przy minimalnym uszkodzeniu komórek śródbłonka limfatycznego w drenującym pLN, doprowadzających naczyniach limfatycznych, a także innych naczyń limfatycznych w okolicy. Metoda ta została wykorzystana do zbadania, w jaki sposób limfa wpływa na żyłki śródbłonkowe (HEV) i ekspresję chemokin w LN oraz jak limfa przepływa przez tkankę tłuszczową otaczającą LN przy braku funkcjonalnych naczyń limfatycznych. Wraz z rosnącym uznaniem znaczenia funkcji limfatycznej, metoda ta będzie miała szersze zastosowanie w celu dalszego odkrywania funkcji naczyń limfatycznych w regulacji mikrośrodowiska LN i odpowiedzi immunologicznej.

Wprowadzenie

Przestrzenna organizacja układu limfatycznego zapewnia strukturalne i funkcjonalne wsparcie dla skutecznego usuwania płynu pozakomórkowego oraz transportu antygenów i komórek prezentujących antygen (APC) do drenujących LN. Początkowe naczynia limfatyczne (zwane również naczyniami włosowatymi limfatycznymi) są wysoce przepuszczalne ze względu na ich nieciągłe połączenia międzykomórkowe, które ułatwiają skuteczne zbieranie płynów, komórek i innych materiałów z otaczających przestrzeni zewnątrzkomórkowych1. Początkowe naczynia limfatyczne łączą się w zbiorcze naczynia limfatyczne, które mają ścisłe połączenia międzykomórkowe, ciągłą błonę podstawną i pokrycie mięśni limfatycznych. Naczynia limfatyczne zbierające są odpowiedzialne za transport zebranej limfy do drenujących LN i ostatecznie powrót limfy do krążenia2,3. Naczynia limfatyczne zbierające, które napędzają limfę do drenującego LN, to doprowadzające naczynia limfatyczne4,5,6,7. Niedrożność doprowadzających naczyń limfatycznych może blokować przepływ limfy do LN, co jest przydatną techniką podczas badania funkcji przepływu limfy.

Poprzednie badania wykazały, że przepływ limfy odgrywa znaczącą rolę w transporcie antygenów i APC, a także w utrzymaniu homeostazy LN. Dobrze wiadomo, że APC pochodzenia tkankowego, zazwyczaj aktywowane migrujące komórki dendrytyczne (DC), przemieszczają się przez aferentne naczynia limfatyczne do LN, aby aktywować limfocyty T8. Pomysł, że wolne antygeny, takie jak drobnoustroje lub rozpuszczalne antygeny, pasywnie przepływają z limfą do LN, aby aktywować APC rezydujące w LN, zyskał akceptację w ciągu ostatniej dekady9,10,11,12. Wolne antygeny przemieszczające się z limfą potrzebują kilku minut po zakażeniu, aby przemieścić się do LN, a aktywacja komórek rezydujących w LN może nastąpić w ciągu 20 minut po stymulacji. Jest to znacznie szybsze niż aktywacja migrujących kontrolerów domeny, która zajmuje więcej niż 8 godzin, aby wprowadzić drenujący LN9. Oprócz transportu antygenów w celu zainicjowania ochrony immunologicznej, limfa przenosi również cytokiny i DC do LN, aby utrzymać jego mikrośrodowisko i wspierać homeostazę komórek odpornościowych13,14. Wcześniej blokowanie przepływu limfy poprzez zszywanie aferentnych naczyń limfatycznych wykazało, że limfa jest wymagana do utrzymania fenotypu HEV wymaganego do wspierania homeostatycznych limfocytów T i limfocytów B naprowadzających do LN15,16,17. CCL21 to krytyczna chemokina, która kieruje pozycjonowaniem komórek DC i T w klasie LN8,< klasa sup = "xref">18. Blokowanie przepływu limfy przerywa ekspresję CCL21 w LN i potencjalnie przerywa pozycjonowanie i/lub interakcję limfocytów DC i T w klasie LN19. Tak więc zablokowanie przepływu limfy może bezpośrednio lub pośrednio znieść dostęp antygenu/DC do drenującego LN poprzez zakłócenie mikrośrodowiska LN, które reguluje odpowiedzi immunologiczne w LN. Aby lepiej zbadać funkcję przepływu limfy, przedstawiono eksperymentalny protokół (Rysunek 1) blokujący przepływ limfy u myszy poprzez zszycie aferentnych naczyń limfatycznych od opuszki stopy do pLN. Metoda ta może być ważną techniką dla przyszłych badań nad funkcją limfy w zdrowych i chorych warunkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace ze zwierzętami muszą być zatwierdzone przez instytucjonalną i rządową komisję etyki i postępowania ze zwierzętami. To jest operacja niepozwalająca na przeżycie.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Przygotuj 100 ml 70% etanolu, mieszając 70 ml 100% etanolu z 30 ml sterylnej wody. Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed zabiegiem i przechowuj je w 70% etanolu przed i w trakcie operacji, aby utrzymać sterylizację.
  2. Przygotować aparat do wstrzykiwań.
    1. Wytnij ~30 cm rurki polietylenowej (średnica 0,28 mm). Podłącz końcówkę igły 30 G x 1/2 (igły A) do jednego końca rurki polietylenowej. Ostrożnie usuń kolejną igłę 30 G x 1/2 (igłę B) i podłącz złamaną stronę do drugiego końca rurki polietylenowej.
    2. Przymocować igłę A do strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml.
      UWAGA: W przypadku tej rurki polietylenowej 1,6 cm płynu w wężyku odpowiada 1 μL20.
  3. Przygotować mieszaninę ketaminy i ksylazyny w stosunku 10:1 (10 mg/ml ketaminy i 1 mg/ml ksylazyny) w soli fizjologicznej (bakteriostatyczny 0,9% [w/v] chlorek sodu). Przygotuj roztwór na świeżo przed użyciem.

2. Przygotowanie zwierzęcia do operacji

UWAGA: Używaj myszy w wieku 6−10 tygodni. Można używać zarówno samic, jak i samców myszy. W tym badaniu wykorzystano 6-10-tygodniowe samice myszy C57BL/6. Metodę tę można dostosować do innych szczepów myszy.

  1. Znieczulij mysz, wstrzykując dootrzewnowo 250 μl mieszaniny ketaminy i ksylazyny. Poczekaj, aż mysz całkowicie przejdzie w stan uśpienia. Upewnij się, że mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca, aby wykryć pełne znieczulenie.
  2. Ogol futro wokół nóg za pomocą maszynki do strzyżenia włosów.
  3. Nałóż krem do depilacji na nogę i odczekaj 5 minut. Zetrzyj resztki sierści i kremu do depilacji wilgotną chusteczką i umyj nogę sterylną wodą. Rozpyl 70% etanolu wokół nogi, aby wysterylizować obszar operacyjny. Etanol jest ograniczony do miejsca nacięcia.

3. Chirurgiczne szycie doprowadzających naczyń limfatycznych

UWAGA: Prawa noga jest zszyta, a lewa noga jest używana jako kontrola pozorowana. Protokół szwu limfatycznego (kroki 3.1−3.8) trwa 20−30 min.

  1. Trzymaj mysz w pozycji leżącej i przymocuj ją taśmą chirurgiczną, aby odsłonić obszar operacji na prawej nodze.
  2. Śródskórnie wstrzyknąć 5 μl 1% niebieskiego barwnika Evansa lub 9 cm płynu z rurki aparatu do wstrzykiwań do opuszki stopy. Delikatnie masuj opuszkę pod stopy, aby pomóc Evans blue dostać się do naczyń limfatycznych.
    UWAGA: Strzykawka insulinowa nie jest łatwa do kontrolowania w przypadku wstrzykiwań o małej objętości. Objętość można dokładniej kontrolować za pomocą aparatu iniekcyjnego. Naczynia limfatyczne są uwidocznione przez niebieski barwnik pod skórą. Przy intensywnym treningu oba aferentne naczynia limfatyczne można zobaczyć gołym okiem jako przezroczyste naczynia w tkance tłuszczowej, równoległe do tętnicy odpiszczelowej. Dzięki intensywnemu szkoleniu możliwe jest zszywanie naczyń bez wstrzykiwania barwnika Evans Blue w przypadkach, gdy istnieją obawy o potencjalne zakłócenia spowodowane przez barwnik.
  3. Pod mikroskopem preparacyjnym wybierz miejsce nacięcia 5 mm od dolnej krawędzi dołu podkolanowego. Wykonaj małe nacięcie (~ 5 mm) w skórze nożyczkami. Używając precyzyjnych kleszczyków operacyjnych, rozciągnij nacięcie i odsłoń naczynia limfatyczne zbierające (Rysunek 1A).
    UWAGA: W razie potrzeby można usunąć niewielki fragment skóry, aby odsłonić naczynia limfatyczne.
  4. Zidentyfikuj oba doprowadzające naczynia limfatyczne prowadzące do pLN pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 1B).
    UWAGA: Od opuszki stopy do pLN znajdują się dwa doprowadzające naczynia limfatyczne. Oba muszą być zszyte, aby całkowicie zablokować przepływ limfy.
  5. Za pomocą uchwytu na igłę ostrożnie wprowadzić igłę do szycia (0,7 metra lub mniej) między doprowadzające naczynie limfatyczne a tętnicę odpiszczelową i delikatnie wyciągnąć igłę wokół doprowadzającego naczynia limfatycznego. Delikatnie pociągnij sznurek do szycia i zostaw około 2 cm sznurka do szwów. Użyj uchwytu na igłę, aby mocno zawiązać sznurek, aby zszyć jedno naczynie limfatyczne węzłem chirurgicznym (Rysunek 1C).
    UWAGA: Tkanka pod nacięciem może wyschnąć przy długotrwałym wystawieniu na działanie powietrza. Wykonanie jak najmniejszego nacięcia i szybkie wykonanie szwu (tj. w ciągu 5 minut) zapobiegnie wysychaniu tkanki. Utrzymuj wilgotność tkanki, nakładając niewielką objętość soli fizjologicznej za pomocą bawełnianego wacika.
  6. Delikatnie masuj podkładkę, aby upewnić się, że barwnik Evans Blue nie przechodzi przez miejsce szwu, a następnie odetnij nadmiar sznurka nożyczkami.
  7. Wykonaj te same kroki szwu (tj. kroki 3.5 i 3.6) na drugim doprowadzającym naczyniu limfatycznym (Rysunek 1D). Zamknij nacięcie skóry tym samym szwem, który został użyty do zszycia naczyń w kroku 3.5 (Rysunek 1E).
  8. W celu pozorowanej kontroli wstrzyknij śródskórnie 5 μl 1% niebieskiego barwnika Evansa w lewą opuszkę stopy i masuj opuszkę stopy, aby uwidocznić naczynia limfatyczne. Otwórz skórę przez wycięcie, a następnie zamknij ranę bez zszywania naczynia (Rysunek 1F).
  9. Opcjonalnie monitoruj operowane myszy przez 2-4 godziny. Strona nogawki do szwu powinna wykazywać obrzęk z niebieskim Evansem rozprzestrzenionym na udo, podczas gdy noga kontrolna będzie wykazywać ograniczony niebieski barwnik Evansa w opuszkach stóp. Jeśli myszy się obudzą, zostanie wstrzyknięta dodatkowa mieszanka ketaminy i ksylazyny, aby utrzymać znieczulenie do czasu eutanazji.

4. Śledzenie przepływu limfy

  1. Bezpośrednio po zabiegu należy śródskórnie wstrzyknąć 10 μL 2% izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) w opuszkę stopy zarówno kontrolnej, jak i nogi zszytej limfatycznie.
  2. Poddaj myszy eutanazji 400 μl mieszaniny ketaminy i ksylazyny i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, gdy myszy są w pełni znieczulone.
  3. Pobrać pLN z dołu podkolanowego i ostrożnie usunąć okołowęzłową tkankę tłuszczową wokół pLN pod mikroskopem preparacyjnym po 2, 6 i 12 godzinach od wstrzyknięcia FITC.
  4. Osadź pLN z obszarem zatoki szpikowej skierowanym w stronę boku kriomoldu w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (Rysunek 1G, H).
  5. Przygotuj zamrożone skrawki o wielkości 20 μm za pomocą kriotomi.
  6. Zobrazuj kriosekcje pod mikroskopem konfokalnym, aby określić rozkład FITC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Szycie naczyń limfatycznych było stosowane w poprzednich badaniach15,16,17,19, gdzie służyło jako ważne narzędzie do badania funkcji przepływu limfy, zanim biologia molekularna naczyń limfatycznych została lepiej poznana. Zablokowanie przepływu limfy zaburza homeostazę LN, co prowadzi do utraty przez HEV krytycznej ekspresji genów niezbędnej do optymalnego homingu limfocytów do LN

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Blokowanie przepływu limfy będzie miało szerokie zastosowanie w manipulowaniu dostarczaniem antygenu do LN w warunkach zdrowych i chorych. Możliwe jest zastosowanie tej metody do kontrolowania czasu dostarczania antygenu w celu zbadania, w jaki sposób ciągły przepływ limfy reguluje odpowiedź immunologiczną w drenujących LN. Ta metoda przerywania przepływu limfy może być również wykorzystana do zbadania, w jaki sposób limfa wpływa na kompartkalizację komórek, aktywację komórek, migrację komórek i interakcje komórka-komórk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Avie Zardynezhad za korektę manuskryptu. Praca ta jest wspierana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem (CIHR, PJT-156035) i Kanadyjską Fundację Innowacji dla SL (32930) oraz przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin dla Yujia Lin (81901576).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% sól fizjologiczna chlorku soduBaxterJB1323
100% etanolGreenfield GlobalUniversity of Calgary usługi dystrybucyjne UN1170.
Krem do depilacjiNairNair Sensitive Formula Depilacja Crè me z olejem ze słodkich migdałów i oliwką dla dzieci, 200 ml. Lub podobny produkt.
Evans Blue dyeSigma Life ScienceE2129-10GNa 1 ml niebieskiego barwnika Evans dodaj 0,1 g niebieskiego barwnika Evans do 10 ml PBS. Roztwór Evens Blue zostanie przefiltrowany przez filtry 0,22 mm i utrzymany w sterylnej postaci w podwielokrotnościach o pojemności 1 ml.
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)Sigma Life ScienceF7250-1G
Kleszcze Dumont #3WPI500337
Kleszcze Dumont #5WPI500233
Aparat iniekcyjnePodłącz jeden koniec rurki polietylenowej do 30G i razy; ½ igła. Podłączyć do igły strzykawkę o pojemności 1 ml TB. Usuń wałek igły z innego 30G i razy; ½ igła. Włóż koniec 30G i razy; ½ wałek igły do drugiego końca rurki. Średnica wewnętrzna tej rurki wynosi 0,28 mm. Zatem 1,6 cm płynu w rurce to 1 μl.
Strzykawka insulinowaBecton Dickinson and Company (BD)329461
IRIS Kleszcz prostyWPI15914
Nożyczki IRISWPI14218-G
KetaminaNarketanDIN 02374994Dostawcy ketaminy i ksylazyny są zwykle objęci regulacjami instytucjonalnymi i rządowymi.
Needles (26Gx3/8)Becton Dickinson and Company (BD)305110
Needles (30Gx1/2)Becton Dickinson and Company (BD)305106
Paton Uchwyt na igłyROBOZRS6403prosty, bez blokady; Ząbkowana
buforowana fosforanem sól fizjologiczna (PBS)Sigma Life ScienceP4417-100TAB
rurka polietylenowaBecton Dickinson and Company (BD)427401
Taśma chirurgiczna (1,25cmx9,1m)Transpore1527-0
Taśma chirurgiczna (2,5cmx9,1m)Transpore1527-1
szewDavis i Geck CYANAMID Kanada11/040,7 monofilamentowa
strzykawka polipropylenowa 0,7 metryczna (1ml)Becton Dickinson and Company (BD)309659
VANNAS nożyczkiWorld Precision Instruments (WPI)14122-G
XylazineRompunDIN02169606Dostawcy ketaminy i ksylazyny są zwykle objęci regulacjami instytucjonalnymi i rządowymi.
Sprzęt
Mikroskop preparacyjnyOlympusOlympus S261 (522-STS OH141791) ze źródłem światła: Olympus Highlight 3100
Mikroskop konfokalnyLeicaSP8

Bibliografia

  1. Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
  2. Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
  3. Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
  4. Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
  5. Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
  6. Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
  7. Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
  8. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
  9. Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
  10. Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
  11. Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
  12. Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
  13. Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
  14. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
  15. Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
  16. Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
  17. Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
  18. Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
  19. Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
  20. Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6(2014).
  21. Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
  22. Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Blokada przep ywu limfyw z y ch onne podkolanowestopa myszytechnika szyciamikroskopia konfokalnadystrybucja FITCzatoki w z w ch onnychtkanka t uszczowa oko ow z owa

Powiązane artykuły