Artykuł metodologiczny

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

DOI:

10.3791/61190

⸱

2 czerwca 2020

 , 
1Wuhan Center for Disease Control and Prevention, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) jest potencjalnym narzędziem do wyjaśnienia kluczowych mechanizmów związanych z neurogenezą i potencjalnie pomocne w medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu opracowaliśmy skuteczną i tanią metodę różnicowania neuronów od mESC in vitro, wykorzystując strategię kombinatorycznych badań przesiewowych. W określonych tutaj warunkach, 2-dniowy protokół indukcji ciała zarodkowego + 6-dniowy kwas retinowy umożliwia szybkie i skuteczne różnicowanie się z mESC w neuronalne komórki prekursorowe (NPC), co widać po tworzeniu dobrze ułożonych i podobnych do neurytów A2lox i 129 pochodnych, które są Nestin dodatnie. Stan zdrowia ciał zarodkowych i punkt czasowy, w którym stosuje się kwas retinowy (RA), a także stężenia RZS, mają kluczowe znaczenie w tym procesie. W późniejszym różnicowaniu się z NPC w neurony, N2B27 medium II (uzupełnione przez podłoże neurobazalne) może lepiej wspierać długoterminowe utrzymanie i dojrzewanie komórek nerwowych. Prezentowana metoda charakteryzuje się wysoką wydajnością, niskimi kosztami i łatwością obsługi oraz może być potężnym narzędziem do badań z zakresu neurobiologii i biologii rozwoju.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embrionalne komórki macierzyste (ESC) są pluripotencjalne i mogą różnicować się w neuronalne komórki prekursorowe (NPC), a następnie w neurony w określonych warunkach1. Neurogeneza oparta na ESC stanowi najlepszą platformę do naśladowania neurogenezy, służąc w ten sposób jako użyteczne narzędzie do badań biologii rozwojowej i potencjalnie pomagając w medycynie regeneracyjnej2,3. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opisano wiele strategii indukowania neurogenezy embrionalnej, takich jak metoda transgeniczna4, przy użyciu małych cząsteczek5, przy użyciu mikrośrodowiska matrycy 3D6, oraz technika współhodowli7. Jednak większość z tych protokołów jest albo ograniczona pod względem warunków, albo trudna w obsłudze, dlatego nie nadają się do użytku w większości laboratoriów.

Aby znaleźć łatwą w obsłudze i tanią metodę skutecznego różnicowania neuronów od mESC, zastosowano tutaj kombinatoryczną strategię przesiewową. Jak opisano w Rysunek 1, cały proces neurogenezy embrionalnej został podzielony na 2 fazy. Faza I odnosi się do procesu różnicowania się od mESC do NPC, a faza II odnosi się do późniejszego różnicowania się od NPC do neuronów. Opierając się na zasadach łatwej obsługi, niskich kosztów, łatwo dostępnych materiałów i wysokiej wydajności różnicowania, wybrano siedem protokołów w Fazie I i trzy protokoły w Fazie II w oparciu o tradycyjny przylegający system hodowli jednowarstwowej lub system tworzenia ciał zarodkowych8,9. Efektywność różnicowania protokołów w obu fazach oceniano za pomocą obserwacji morfologii komórek i testu immunofluorescencji. Łącząc najbardziej efektywny protokół każdej fazy, opracowaliśmy zoptymalizowaną metodę różnicowania neuronów od mESC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy

  1. Przygotuj 0,1% pokryte żelatyną naczynia lub płytki do hodowli komórkowych.
    1. Dodaj 2 ml wysterylizowanej 0,1% żelatyny (0,1% w/v w wodzie) do naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm. Delikatnie kołysz, aby zapewnić równomierne pokrycie szalek z kultur komórkowych.
    2. Umieścić naczynia w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C i pozostawić do powlekania przez 1 godzinę.
    3. Usuń 0,1% roztwór żelatyny przed wysiewem komórek.
      UWAGA: Po wyjęciu żelatyny nie ma potrzeby suszenia ani mycia panierowanych naczyń.
  2. Hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy (A2lox i 129)
    1. Inkubować komórki mESC (A2lox i 129) na pokrytych 0,1% żelatyną 60-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych w pożywce wzrostowej mESC w temperaturze 37 °C odpowiednio w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Pożywka wzrostowa mESC składa się z 85% nokautującego DMEM/F12, 15% nokautującej surowicy zastępczej (KSR), 0,1 mM β-merkaptoetanolu (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% aminokwasu endogennego (NEAA), 1% penicyliny/streptomycyny (P/S), 1000 U/ml czynnika hamującego białaczkę (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inhibitor GSK-3) i 0,33 nM PD0325901 (inhibitor MEK).
      UWAGA: β-merkaptoetanol jest łatwopalny i ma toksyczność inhalacyjną. Trzymaj z dala od źródeł ognia i noś maskę, aby uniknąć wdychania podczas użytkowania.
    2. Codziennie zmieniaj pożywkę wzrostową mESC, aby uzyskać lepszy wzrost A2lox i 129.
    3. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, usuń pożywkę i dodaj 1 ml 0,1% trypsyny do naczynia. Delikatnie kołysz przez 30 sekund, aby zapewnić równomierne pokrycie trypsyny na wszystkich komórkach.
    4. Pozostaw komórki na około 1 minutę, aby wytrypsynasię poddała, a następnie usuń trypsynę za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    5. Dodać 2 ml pożywki wzrostowej mESC do naczynia, kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
    6. Policz gęstość komórek w zawiesinie tak dokładnie, jak to możliwe, za pomocą hemocytometru.
    7. Podziel komórki na 7 grup i wywołaj różnicowanie za pomocą różnych protokołów pokazanych w Tabeli 1.

2. Różnicowanie między mESC a NPC (Faza I)

  1. Przygotować 0,1% pokryte żelatyną płytki do hodowli komórkowych lub szkiełka nakrywkowe.
    1. Przed użyciem należy przygotować 0,1% pokryte żelatyną płytki 6-dołkowe lub szkiełka nakrywkowe, jak w kroku 1.1.
  2. Faza I różnicowania z zastosowaniem protokołu 1 (Tabela 1)
    1. Wysiewać około 2 x 104 mESC w 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego I na basenie w 0,1% pokrytych żelatyną płytkach 6-dołkowych. Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 6 godzin, aby umożliwić przyłączenie.
    3. Po przyłączeniu wyjąć komórki z inkubatora i dwukrotnie przemyć je 2 ml PBS.
    4. Dodać 2 ml pożywki do różnicowania podstawowego I (Tabela 1) do każdej studzienki i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze.
    5. Pozostaw komórki do różnicowania na 8 dni. Pożywkę różnicowania podstawowego I należy wymieniać co 2 dni.
  3. Faza I różnicowania z zastosowaniem protokołu 2 (Tabela 1)
    1. Dodać 1,5 x 106 mESC do nieprzywierającego naczynia bakteryjnego w 10 ml podstawowej pożywki różnicującej I, aby umożliwić tworzenie się ciała zarodka w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    2. Po 2 dniach przenieś agregaty komórek do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść grawitacyjnie.
    3. Usunąć supernatant i dodać 10 ml świeżej pożywki do różnicowania podstawowego I w celu ponownego zawieszenia ciał zarodków. Przesadź je ponownie do nowego nieprzywierającego naczynia bakteryjnego i pozwól im się różnicować przez kolejne 2 dni.
    4. Sprawdź formowanie się ciał embrionalnych pod mikroskopem (Ryc. 2A).
    5. Pobrać ciała zarodków zgodnie z opisem w krokach 2.3.2-2.3.3. Wysiewać około 50 ciał zarodkowych w 2 ml podstawowej pożywki różnicującej I na studzienkę na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną.
    6. Przygotuj 1 mM wywar all-trans RA (w DMSO) i przechowuj z dala od światła w zamrażarce o temperaturze -80 °C po zapakowaniu.
      UWAGA: RZS jest niestabilny i należy zwrócić uwagę na trzymanie go z dala od światła i zmniejszenie kontaktu powietrza podczas przygotowywania wywaru RA.
    7. W przypadku indukcji RA dodać 2 μl wywaru RA do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM.
    8. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C i różnicować przez kolejne 4 dni.
    9. Zmieniaj całe 2 ml pożywki do różnicowania podstawowego I (z 1 μM RA) co 2 dni.
  4. Faza I różnicowania przy użyciu protokołu 3 (Tabela 1)
    1. Posadzić 1,5 x 106 mESC w nieadhezyjnym naczyniu bakteryjnym w 10 ml podłoża do różnicowania podstawowego I. Pozostawić na 2 dni do utworzenia ciała zarodka w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    2. Sprawdź formowanie się ciał embrionalnych pod mikroskopem (Ryc. 2B).
    3. Przenieś agregaty komórek do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść grawitacyjnie.
    4. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i dodać 10 ml świeżej pożywki do różnicowania podstawowego I w celu ich ponownego zawieszenia.
    5. Wysiewać około 50 ciał zarodkowych do 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego I na basenie na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną.
    6. W przypadku indukcji RA dodać 2 μl wywaru RA do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM.
    7. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C i różnicować przez kolejne 6 dni. Zmieniaj całe podstawowe podłoże różnicujące I (z 1 μM RA) co 2 dni.
  5. Faza I różnicowanie przy użyciu protokołu 4 (Tabela 1)
    1. Wysiewać około 2 x 104 mESC w obrębie 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego I na studzienkę na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić załączenie przez 6 godzin.
    2. Po przyłączeniu umyj komórki dwukrotnie 2 ml PBS. Dodać 2 ml podstawowej pożywki różnicującej I do każdej studzienki i pozostawić do różnicowania przez 4 dni w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    3. W celu indukcji RA dodać 2 μl wywaru all-trans RA do każdego dołka (stężenie robocze wynosi 1 μM), aby wywołać różnicowanie przez kolejne 4 dni.
    4. W całym procesie wymieniaj całe podłoże co 2 dni.
  6. Faza I różnicowanie z zastosowaniem protokołu 5 (Tabela 1)
    1. Wysiewać około 2 x 104 mESC w obrębie 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego I na studzienkę na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić załączenie przez 6 godzin.
    2. Umyj komórki dwukrotnie 2 ml PBS. Dodać 2 ml podstawowej pożywki różnicującej I do każdej studzienki i pozostawić do różnicowania przez 2 dni w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    3. W celu późniejszej indukcji RA dodać 2 μl wywaru RA do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C w celu wywołania różnicowania przez kolejne 6 dni.
    4. W całym procesie wymieniaj całe podłoże co 2 dni.
  7. Różnicowanie fazy I przy użyciu protokołu 6 (Tabela 1)
    1. Posadź 1,5 x 106 mESC w nieadhezyjnym naczyniu bakteryjnym w 10 ml pożywki N2B27 II (Tabela 1), aby umożliwić tworzenie ciał zarodkowych.
    2. Drugiego dnia zebrać agregaty komórkowe zgodnie z opisem w krokach 2.3.2-2.3.3 i ponownie zawiesić ciała zarodków przy użyciu 10 ml świeżej pożywki N2B27 II.
    3. Przesadzić je do nowego nieprzywierającego naczynia bakteryjnego i pozwolić na różnicowanie przez kolejne 2 dni w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Sprawdzić formowanie się ciał zarodkowych pod mikroskopem.
    4. W 4 dniu zbierz ciała zarodków. Wysiewać około 50 ciał zarodkowych na studzienkę na 0,1% pokrytych żelatyną 6-dołkowych płytkach z 2 ml pożywki N2B27 II.
    5. Dodać 2 μl wywaru all-trans RA do każdej studzienki i wywołać różnicowanie przez kolejne 4 dni. Wymieniać całe podłoże (pożywkę N2B27 II na 1 μM RA) co dwa dni.
  8. Faza I różnicowania przy użyciu protokołu 7 (Tabela 1)
    1. Wysiewać około 2 x 104 mESC w obrębie 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego I na studzienkę na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić załączenie przez 6 godzin.
    2. Umyj komórki dwukrotnie PBS. Następnie dodać 2 ml pożywki N2B27 II do każdej studzienki i pozostawić do różnicowania przez 8 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    3. Wymieniaj całe podłoże N2B27 II co 2 dni.

3. Obserwacja morfologii komórek

  1. Codziennie sprawdzaj stan różnicowania wyżej wymienionych 7 grup pod mikroskopem światła z odwróconymi fazami kontrastu.
  2. Losowo wybierz co najmniej 12 pól i zrób zdjęcia, aby zarejestrować zmiany morfologiczne każdej grupy na D8.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Przygotowanie próbki: Wysiewa się mESC na 0,1% szkiełkach nakrywkowych pokrytych żelatyną i pozostawia do różnicowania przez 8 dni przy użyciu protokołów wymienionych w kroku 2.
  2. Płukanie: W 8 dniu wyjąć próbki z inkubatora i usunąć pożywkę różnicującą przez aspirację. Delikatnie płucz komórki raz 1 ml PBS przez 5 minut.
  3. Utrwalanie: Dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu do każdej próbki i utrwal komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Płukanie: Po utrwaleniu delikatnie przepłucz komórki 1 ml PBS 3 razy, przez 5 minut każda.
  5. Permeabilizacja: Dodaj 1 ml 0,2% TritonX-100 w PBS do każdej próbki i pozostaw na 8 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Płukanie: Po permeabilizacji delikatnie spłucz komórki 1 ml PBS 3 razy, po 5 minut każda.
  7. Blokowanie: Dodać 1 ml 10% koziej surowicy w PBS do każdej próbki i inkubować w RT przez 1 godzinę, aby zablokować wszelkie niespecyficzne interakcje.
  8. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
    1. Rozcieńczyć przeciwciało anty-Nestin w stosunku 1:100 przy użyciu 5% surowicy koziej w PBS.
    2. Nałożyć 500 μl rozcieńczonego przeciwciała na różne próbki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Płukanie: Usunąć przeciwciało i delikatnie przepłukać próbki 1 ml PBS 3 razy przez 8 minut każda.
  10. Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym
    1. Rozcieńczyć kozią anty-mysią IgG znakowaną Alexa Fluor 488 w stosunku 1:500, używając 5% koziej surowicy w PBS.
    2. Nałożyć 500 μl rozcieńczonego przeciwciała na różne próbki i inkubować w ciemności przez 2 godziny w temperaturze RT.
      UWAGA: Po zastosowaniu fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego wszystkie kolejne kroki należy wykonać w ciemności, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji.
  11. Płukanie: Usunąć przeciwciało drugorzędowe i delikatnie przepłukać próbki 1 ml PBS 3 razy przez 8 minut każda.
  12. Barwienie jądrowe i montaż
    1. Umieść jedną kroplę medium montażowego DAPI na czystym mikroszkiełku.
    2. Ostrożnie wyjmij próbki z płytek i umieść próbkę na podłożu montażowym DAPI z kuwetą skierowaną w dół. Pozostaw w ciemności na 5 minut w RT.
    3. Usuń nadmiar nośnika montażowego DAPI za pomocą papieru chłonnego.
  13. Obserwacja pod mikroskopem fluorescencyjnym
    1. Umieść próbki pod mikroskopią fluorescencyjną i wykryj sygnał dla DAPI i Alexa Fluor 488 za pomocą odpowiednich filtrów.
    2. Równomiernie i losowo wybierz 10-15 różnych pól wizualnych dla każdej próbki i nagraj obrazy za pomocą kamery CCD.

5. Różnicowanie od NPC do neuronów (Faza II)

  1. Przygotuj pochodne mESC w ramach różnicowania fazy I, korzystając z protokołu 3 (8 dni, tabela 1), jak opisano w kroku 2.4, który ma najwyższą skuteczność różnicowania (patrz Rysunek 3).
    UWAGA: Po różnicowaniu w fazie I należy przeprowadzić kontrolę jakości za pomocą obserwacji morfologii komórek i testu immunofluorescencyjnego, o których mowa powyżej, w celu zapewnienia zdrowych i wysokowydajnych NPC.
  2. Wysiewać około 5 x 10 pochodnych5 mESC w obrębie 2 ml podstawowej pożywki różnicującej I na studzienkę na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną. Losowo podziel pochodne mESC na 3 grupy, odpowiednio jako protokół 1 fazy II, protokół 2 i protokół 3.
  3. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić naczepianie na 6 godzin. Przemyć je dwukrotnie 2 ml PBS.
  4. Dodać 2 ml pożywki różnicującej I, pożywki N2B27 I i pożywki N2B27 II (Tabela 2) odpowiednio do każdej studzienki z powyższych grup.
  5. Umieść płytki w inkubatorze i pozostaw do rozróżnienia przez kolejne 10 dni. Zmieniaj odpowiednie podłoże co 2 dni.
  6. Sprawdź stan różnicowania i zapisz zmiany morfologiczne, jak wspomniano w kroku 3.
  7. W dniu 18 oceń generację neuronów (dodatni β-tubulina III) i określ skuteczność różnicowania 3 protokołów użytych w kroku 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2-dniowe tworzenie ciała embrionalnego + 6-dniowa indukcja RA działa najlepiej w kierowaniu różnicowaniem mESC w NPC (Faza I). Aby określić optymalny protokół, który najlepiej sprzyja różnicowaniu mESC w NPC (faza I), przetestowano 7 protokołów zarówno na A2lox, jak i 129 mESC (Tabela 1), a stan zróżnicowania każdej grupy monitorowano za pomocą mikroskopu świetlnego. Jak pokazano w Rysunek 3A, większość pochodnych A2lox i 129 poddanych leczeniu "2-dniowa formacja ciała zarodka + 6-dni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu opracowaliśmy prostą i skuteczną metodę różnicowania neuronów od mESC, przy niskich kosztach i łatwych do uzyskania materiałach. W tej metodzie 2 dni tworzenia ciała zarodka, a następnie 6 dni indukcji RZS mogą skutecznie promować różnicowanie mESC w NPC (protokół fazy I 3). W przypadku różnicowania fazy II, podłoże N2B27 II (Faza II-protokół 3) najskuteczniej indukuje różnicowanie się od NPC do neuronów. Aby zapewnić sukces, należy zwrócić większą uwagę na kilka kluczowych kroków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31501099) oraz Średniego i Młodego z Departamentu Edukacji prowincji Hubei w Chinach (nr Q20191104). Dziękujemy profesorowi Wenshengowi Dengowi z Uniwersytetu Nauki i Technologii w Wuhan za dostarczenie linii embrionalnych komórek macierzystych myszy A2lox.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-Nestin [Rat-401]AbcamAb11306przechowywane w temperaturze -80 & deg; C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
przeciwciała anty-&beta-tubuliny III wytwarzanego w królikuSigma AldrichT2200przechowywanym w temperaturze -80 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgGBeyotimeA0428przechowywany w temperaturze -20 stopni; C i chronić przed światłem
Suplement B-27 (50X), bez surowicy17504044 Gibcoprzechowywany w temperaturze -20 stopni; C i chronić przed światłem
CHIR-99021 (CT99021)SelleckS1263przechowywany w temperaturze -20 stopni; C
Szkiełka nakrywkoweNEST801007
Znakowana Cy3 kozia anty-królicza IgGBeyotimeA0516przechowywana w temperaturze -20 stopni; C i chronić przed światłem
DME/F-12 1:1 (1x)HyCloneSH30023.01Bprzechowywany w temperaturze 4 stopni C
Płodowa surowica bydlęcaHyCloneSH30084.03przechowywana w temperaturze -20 ° C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
Mikroskopia fluorescencyjnaOlympusCKX53
ŻelatynaGibcoCM0635Bprzechowywana w temperaturze pokojowej
Suplement GlutaMAXGibco35050061przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Barwienie immunologiczne Bufor do rozcieńczania przeciwciał pierwotnychBeyotimeP0103przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
KnockOut DMEM/F-12Gibco12660012przechowywany w temperaturze 4 stopni; C
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028przechowywany w temperaturze -20 stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
czynnika hamującego białaczkę ludzkiegoSigmaL5283przechowywanego w temperaturze -20 & stopni; C
Medium montażowe z DAPI - wodne, FluoroshieldAbcamab104139przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C i chronić przed światłem
MEM Roztwór aminokwasów endogennychGibco11140076przechowywany w temperaturze 4 stopni; C
N-2 Suplement (100X)Gibco17502048przechowywany w temperaturze -20 & deg; C i chronić przed światłem
Normalna surowica koziaJackson005-000-121przechowywana w temperaturze -20 & stopni; C
Neurobasal MediumGibco21103049przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Nieprzylepne naczynie bakteryjneCorning3262
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (1X)HyCloneSH30256.01Bprzechowywany w temperaturze 4 stopni; C
Roztwór penicyliny/streptomycynyHyklonSV30010przechowywany w temperaturze 4 stopni C
PD0325901(Mirdametinib)SelleckS1036przechowywany w temperaturze -20 & deg; C
Kwas retinowySigmaR2625przechowywany w temperaturze -80 & deg; C i chronić przed światłem
Szczep 129 Mysie embrionalne komórki macierzysteCyagenMUAES-01001Utrzymywany w systemie hodowli bez karmienia
Stem-Cellbanker (wolny od DMSO)ZENOAQstembankbanker DMSO wolny od DMSOprzechowywany w temperaturze -20 ° C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
Trypsyna 0,25% (1X) RoztwórHyCloneSH30042.01przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Triton X-100SigmaT8787
2-merkaptoetanolGibco21985023przechowywany w temperaturze 4 stopni; C i chronić przed światłem
4% paraformaldehyduBeyotimeP0098przechowywany w temperaturze -20 & deg; C
6 - płytka dołkowaCorning3516
Naczynie do hodowli komórkowych 60 mmCorning430166
Probówka wirówkowa 15 mlNUNC339650

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
  2. Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
  3. Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
  4. Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
  5. Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
  6. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
  7. Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
  8. Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
  9. Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823(2015).
  10. Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486(2020).
  11. Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
  12. Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57(2009).
  13. Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
  14. Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
  15. Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
  16. Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953(2017).
  17. Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
  18. Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
  19. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  20. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174(2011).
  21. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie cia embrionoidalnychindukcja kwasem retinowymkom rki prekursorowe neuron wpo ywka N2B27test immunofluorescencyjnykom rki Nestin dodatniebeta tubulina IIIp ytki powlekane elatyn

Powiązane artykuły