Pokazujemy testy toksyczności glonów dla trudnych substancji (np. substancji kolorowych lub nanomateriałów) za pomocą zestawu oświetlonego pionowo diodą LED.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zestaw na małą skalę do badania toksyczności glonów nanomateriałów i innych trudnych substancji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dane dotyczące ekotoksyczności są wymagane do rejestracji chemikaliów przed i po wprowadzeniu na rynek zgodnie z europejskimi i międzynarodowymi przepisami (np. REACH). Test toksyczności glonów jest często stosowany w regulacyjnej ocenie ryzyka chemikaliów. W celu osiągnięcia wysokiej niezawodności i powtarzalności niezbędne jest opracowanie znormalizowanych wytycznych. W przypadku badań toksyczności glonów wytyczne wymagają stabilnych i jednolitych warunków parametrów takich jak pH, temperatura, poziom dwutlenku węgla i natężenie światła. Nanomateriały i inne tak zwane trudne substancje mogą zakłócać działanie światła, powodując duże różnice w uzyskiwanych wynikach, co utrudnia ich akceptację regulacyjną. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy LEVITATT (Stół do pionowego oświetlenia LED do testów toksyczności glonów). Konfiguracja wykorzystuje oświetlenie LED od dołu, co pozwala na jednorodny rozkład światła i kontrolę temperatury, jednocześnie minimalizując zacienienie wewnątrz próbki. Konfiguracja optymalizuje objętość próbki w celu ilościowego określenia biomasy, a jednocześnie zapewnia wystarczający napływ CO2 , aby wspierać wykładniczy wzrost glonów. Dodatkowo materiał, z którego wykonane są pojemniki testowe, może być dostosowany w celu zminimalizowania adsorpcji i ulatniania się. Podczas badania barwionych substancji lub zawiesin cząstek, zastosowanie lamp LED pozwala również na zwiększenie natężenia światła bez dodatkowego wytwarzania ciepła. Kompaktowa konstrukcja i minimalne wymagania sprzętowe zwiększają możliwości wdrożenia LEVITATT w szerokim zakresie laboratoriów. Chociaż projekt LEVITATT jest zgodny ze znormalizowanymi wytycznymi ISO i OECD dotyczącymi badania toksyczności glonów, wykazał również mniejszą zmienność między próbkami dla dwóch substancji odniesienia (3,5-dicholofenolu iK2Cr2O7) i trzech nanomateriałów (ZnO, CeO2 iBaSO4) w porównaniu z kolbami Erlenmeyera i płytkami do mikromiareczkowania.
Wprowadzenie
Test toksyczności glonów jest jednym z trzech obowiązkowych testów używanych do generowania danych ekotoksyczności wymaganych do rejestracji chemikaliów przed i po wprowadzeniu na rynek przez europejskie i międzynarodowe przepisy (np. REACH1 i TSCA (USA)). W tym celu organizacje międzynarodowe (np. ISO i OECD) opracowały znormalizowane wytyczne dotyczące badań glonów. Te normy i wytyczne testowe określają idealne warunki testowe pod względem pH, temperatury, poziomu dwutlenku węgla i natężenia światła. Jednak utrzymanie stabilnych warunków testowych podczas badania glonów jest w praktyce trudne, a wyniki mają problemy z odtwarzalnością i wiarygodnością dla szeregu substancji chemicznych i nanomateriałów (często określanych jako "trudne substancje")2. Większość istniejących zestawów do badania toksyczności glonów działa ze stosunkowo dużymi objętościami (100–250 ml) umieszczonymi na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora. Taki układ ogranicza liczbę badanych stężeń i replikuje osiągalne i duże ilości hodowli glonów i badanego materiału. Ponadto konfiguracje te rzadko mają jednolite pole świetlne, a niezawodne warunki oświetleniowe są ponadto trudne do uzyskania w dużych kolbach, częściowo dlatego, że natężenie światła zmniejsza się wykładniczo wraz z odległością światła, a częściowo z powodu geometrii kolby. Alternatywne konfiguracje obejmują plastikowe płytki microtiter3 zawierające małe objętości próbek, które nie pozwalają na uzyskanie odpowiedniej objętości próbki do pomiaru pH, dodatkowe pomiary biomasy, ekstrakcję pigmentu lub inne analizy wymagające destrukcyjnego pobierania próbek. Jednym ze szczególnych wyzwań związanych z wykorzystaniem istniejących konfiguracji do badania toksyczności glonów nanomateriałów i substancji tworzących kolorowe zawiesiny jest interferencja lub blokowanie światła dostępnego dla komórek glonów, często określane jako "cieniowanie"4,5. Zacienienie może wystąpić w obrębie fiolek przez badany materiał i/lub interakcje między badanym materiałem a komórkami glonów, lub zacienienie może wystąpić między fiolkami, ze względu na ich położenie względem siebie i źródła światła.
Metoda opiera się na konfiguracji testów toksyczności glonów na małą skalę, wprowadzonej przez Arensberg et al.6, która pozwala na testowanie zgodnie z normami takimi jak OECD 2017, oraz ISO 86928. Metoda jest dodatkowo optymalizowana w celu rozwiązania powyższych ograniczeń poprzez: 1) wykorzystanie technologii światła LED w celu zapewnienia jednolitych warunków oświetleniowych przy minimalnym wytwarzaniu ciepła, 2) zapewnienie odpowiedniej objętości próbki do analizy chemicznej/biologicznej przy zachowaniu stałego pH, poziomów CO2 oraz 3) umożliwienie zastosowania wszechstronnego materiału pojemnika testowego do badania substancji lotnych lub substancji o wysokim potencjale sorpcyjnym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Opis układu LEVITATT
- Należy użyć 20 mL szklanych fiolek scyntylacyjnych (Rysunek 1, wstawka 1), które przepuszczają światło. Alternatywnie można zastosować przepuszczalne dla światła fiołki plastikowe. Natężenie światła należy zmierzyć za pomocą fotometru.
- Na początku testu należy użyć co najmniej 4 mL zawiesiny testowej, aby umożliwić oznaczanie biomasy oraz charakterystykę/ilościowe określenie nanomateriałów w trakcie i po inkubacji (Rysunek 1, wstawka 2).
- Fiolki scyntylacyjne 20 mL należy zamknąć zakrętką (Rysunek 1, wstawka 3), w której wywiercono mały otwór (o średnicy około 1 mm), aby umożliwić wymianę CO2 z atmosferą. Wymiana ta jest kluczowa dla zapewnienia stabilnego pH i poziomu CO2 podczas testów.
- W przypadku substancji lotnych należy użyć szczelnej zakrętki pokrytej teflonem, aby umożliwić wzbogacenie przestrzeni nad cieczą w CO2 za pomocą strzykawki9, lub całkowicie zamkniętych kolb bez fazy gazowej, w których CO2 jest utrzymywany w roztworze przez wzbogacony system buforowy wodorowęglanu sodu (NaHCO3)10.
- Fiolki należy przymocować zaciskami zamontowanymi na zewnętrznej obudowie (Rysunek 1, wstawka 4).
- Należy zastosować źródło światła LED znajdujące się poniżej fiolek testowych (Rysunek 1, wstawka 5), zapewniające jednorodne oświetlenie fluorescencyjne typu „chłodna biel” lub „światło dzienne” o natężeniu w zakresie 60–120 µE∙m-2∙s-1, mierzonym w zakresie długości fal efektywnych dla fotosyntezy od 400 nm do 700 nm. Układ wykorzystuje regulowane natężenie światła w zakresie 5–160 µE∙m-2∙s-1 poprzez zamontowanie ściemniacza do źródła światła. Pozwala to na przeprowadzanie testów przy wyższych i niższych natężeniach światła.
- Układ należy zamontować na wytrząsarce orbitalnej, aby mieszać próbki przez cały czas trwania testu. Pozwala to utrzymać komórki w wolnej zawiesinie i ułatwia transport masy CO2 z powietrza do wody (Rysunek 1, wstawka 6).
- Układ należy umieścić w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą lub w szafie termostatycznej, aby utrzymać stabilną temperaturę podczas całego testu (Rysunek 1, wstawka 7).
Rycina 1: Zdjęcie stołu z pionowym oświetleniem LED do testów toksyczności alg (LEVITATT). 1) szklane fiolki scyntylacyjne o pojemności 20 mL do inkubacji, 2) próbka 4 mL do analizy, 3) pokrywka z wywierconym otworem do wymiany CO2, 4) obudowa zapewniająca określone warunki oświetlenia, 5) źródło światła LED umieszczone w centrum obudowy, 6) inkubator orbitalny do mieszania podczas eksperymentu oraz 7) szafa termostatyczna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
2. Przygotowanie pożywki do hodowli alg
- Pożywka do wzrostu alg ISO 8692 składa się z czterech różnych roztworów zapasowych. Odważyć odpowiednią ilość soli i rozcieńczyć w wodzie ultrapure zgodnie z Tabelą 1.
| Roztwory zapasowe | Składnik odżywczy | Stężenie w roztworze stokowym | Stężenie w roztworze testowym |
| 1: Makroskładniki odżywcze | NH4Cl | 1,5 g/L | 15 mg/L (N: 3,9 mg/L) |
| MgCl₂2∙6 h2O | 1,2 g/L | 12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L) | |
| CaCl22∙2H2O | 1,8 g/L | 18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L) | |
| MgSO₄4∙7H2O | 1,5 g/L | 15 mg/L (S: 1,95 mg/L) | |
| KH2PO4 | 0,16 g/L | 1,6 mg/l (P: 0,36 mg/l) | |
| 2: Fe-EDTA | FeCl3∙6 h2O | 64 mg/L | 64 µg/L (Fe: 13 µg/L) |
| Na2EDTA∙2H₂O2O | 100 mg/L | 100 µg/L | |
| 3: Pierwiastki śladowe | H3BO3a | 185 mg/L | 185 µg/L (B: 32 µg/L) |
| MnCl22∙4h2O | 415 mg/L | 415 µg/L (Mn: 115 µg/L) | |
| ZnCl22 | 3 mg/L | 3 µg/L (Zn: 1.4 µg/L) | |
| CoCl22∙6h2O | 1,5 mg/L | 1.5 µg/L (Co: 0.37 µg/L) | |
| CuCl2∙2H2O | 0,01 mg/L | 0.01 µg/L (Cu: 3,7 ng/L) | |
| Na2MoO4∙2H2O | 7 mg/L | 7 µg/L (Mo: 2.8 µg/L) | |
| 4: NaHCO3 | NaHCO33 | 50 g/L | 50 mg/L (C: 7,14 mg/L) |
Tabela 1: Stężenia składników odżywczych w roztworach stokowych do pożywki dla alg
UWAGA: H3BO3 można rozpuścić poprzez dodanie 0,1 M NaOH. Podczas badania zawartości metali należy usunąć EDTA, aby uniknąć kompleksowania z jonami metali. Roztwory stokowe należy wysterylizować poprzez filtrację membranową (średnia średnica porów 0,2 µm) lub w autoklawie (120 °C, 15 min). Roztworów stokowych 2 i 4 nie należy autoklawować, lecz wysterylizować je poprzez filtrację membranową. Roztwory należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
- Aby przygotować 1 L pożywki do wzrostu alg, przenieś 500 mL wysterylizowanej wody ultrapure do sterylnej kolby miarowej o pojemności 1 L, a następnie dodaj 10 mL roztworu stokowego 1: Makroskładniki, 1 mL roztworu stokowego 2: Fe-EDTA, 1 mL roztworu stokowego 3: Mikroelementy oraz 1 mL roztworu stokowego 4: NaHCO3.
- Uzupełnij objętość do 1 L wysterylizowaną wodą ultrapure, zamknij kolbę korkiem i dokładnie wymieszaj w celu homogenizacji pożywki do wzrostu alg.
- Przed użyciem wyrównaj stan roztworu, pozostawiając go na noc w kontakcie z powietrzem lub przedmuchując sterylnym, filtrowanym powietrzem przez 30 min. Po wyrównaniu, w razie potrzeby, dostosuj pH do wartości pH 8,1 ± 0,2 za pomocą 1 M HCl lub 1 M NaOH.
3. Przygotowanie testu glonowego
UWAGA: Schemat blokowy procedury testu z algami przedstawiono na Rysunku 2.
Rycina 2: Schemat blokowy układu testowego dla alg.** Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Przygotować roztwór zapasowy związku testowego o pożądanej najwyższej stężeniu w pożywce do wzrostu alg przygotowanej zgodnie z krokiem 2. W przypadku przygotowania roztworów/zawiesin zapasowych należy postępować zgodnie z wytycznymi OECD 201 (dla związków rozpuszczalnych) lub OECD 318 (dla nanomateriałów).
- Zmierzyć pH roztworu zapasowego. Jeśli odbiega ono o więcej niż jedną jednostkę od pH pożywki do wzrostu alg, należy skorygować pH do wartości 8 za pomocą 1 M HCl lub 1 M NaOH.
- Obliczyć objętość inokulum potrzebną do uzyskania końcowego stężenia komórek 1 x 104 cells/mL w 25 mL roztworu testowego.
UWAGA: Inokulum powinno pochodzić z kultury niezanieczyszczonych, rosnących wykładniczo Raphidocelis subcapitata hodowanych przy użyciu układu LEVITATT. - Obliczyć ilość roztworu zapasowego, którą należy dodać do każdej kolby miarowej o pojemności 25 mL, aby uzyskać pożądane stężenia testowe. Współczynnik między kolejnymi stężeniami nie powinien przekraczać 3,2.
- Oznaczyć kolby miarowe o pojemności 25 mL dla każdego wybranego stężenia oraz dodatkową kolbę miarową 25 mL jako kontrolę.
- Do kolb miarowych o pojemności 25 mL dodać taką ilość roztworu zapasowego związku testowego, która jest niezbędna do osiągnięcia pożądanych stężeń. Do kontroli nie dodawać roztworu zapasowego.
- Dolać pożywkę do każdej kolby miarowej 25 mL, aby osiągnąć objętość około 20 mL.
- Do każdej kolby miarowej 25 mL dodać objętość inokulum obliczoną w kroku 3.3. Dopełnić każdą kolbę miarową 25 mL pożywką do końcowej objętości całkowitej 25 mL.
- Zamknąć kolby korkami i dokładnie wymieszać, obracając kolby dwukrotnie w pionie.
- Przenieść 0,4 mL z każdej kolby do oddzielnych fiolek z zakrętkami i dodać 1,6 mL acetonu (nasyconego MgCO3): jedną próbkę dla każdego stężenia testowego oraz dla kontroli. Szczelnie zamknąć zakrętki i przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej do czasu pomiarów fluorescencji (sekcja 4).
- Odpipetować 4 mL każdego roztworu testowego do fiolek scyntylacyjnych o pojemności 20 mL (3 powtórzenia na stężenie i 5 powtórzeń dla kontroli). Zakręcić fiolki scyntylacyjne. Należy pamiętać, że zakrętki muszą mieć wywiercony otwór (o średnicy około 1 mm), aby umożliwić wymianę CO2.
- Po 24 h, 48 h i 72 h odpipetować 0,4 mL z każdej fiolki do fiolek z zakrętkami i dodać 1,6 mL acetonu (nasyconego MgCO3). Szczelnie zamknąć zakrętki i przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej do czasu pomiarów fluorescencji (sekcja 4).
- Po pobraniu ostatniej próbki w 72 h, delikatnie połączyć trzy powtórzenia dla danego stężenia w jednej fiolce i zmierzyć pH. Powtórzyć czynność dla wszystkich stężeń i kontroli. pH nie powinno odbiegać o więcej niż 1,5 jednostki od początkowego pH dla żadnej z mierzonych próbek.
- Pozostałe ciecze zutylizować w pojemniku na odpady zgodnie z zasadami i przepisami obowiązującymi w danej instytucji.
4. Analiza testowych próbek alg
- Użyj spektrofluorometru do pomiaru biomasy glonów (wyrażonej tutaj jako chlorofil A). Maksimum emisji dla chlorofilu A wynosi 420 nm dla długości fali wzbudzenia i 671 nm dla długości fali emisji.
- Zmierz fluorescencję każdej próbki trzykrotnie i oblicz wartość średnią dla każdej z nich.
- Użyj równania 1 do obliczenia szybkości wzrostu. Zmierzoną fluorescencję (jednostki względne) można bezpośrednio wykorzystać jako parametr biomasy w równaniu 1.
Równanie 1: µ = (ln Nt – ln N0) / t
gdzie µ to szybkość wzrostu (d-1), N0 to biomasa początkowa, Nt to biomasa w czasie t, a t to czas trwania okresu testowego (d). Uwaga: N0 i Nt powinny być wyrażone w tej samej jednostce. - Użyj oprogramowania statystycznego do dopasowania krzywej regresji nieliniowej (np. funkcji log-logistycznej lub funkcji Weibulla) do danych o szybkości wzrostu, aby uzyskać wartości stężeń efektywnych dla 10%, 20% i 50% inhibicji. W informacjach uzupełniających podano przykład kodu do dopasowania w programie statystycznym R przy użyciu pakietu DRC11.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu określenia wrażliwości szczepu glonów przeprowadza się wstępny test z substancją referencyjną. Substancjami referencyjnymi regularnie stosowanymi dla R. subcapitata są dichromian potasu oraz 3,5-dichlorofenol7,8. Rysunek 3 oraz Tabela 2 przedstawiają reprezentatywny wynik testu glonów, obejmujący dopasowanie krzywej i wyniki statystyczne uzyskane po zastosowaniu pakietu DRC w programie R do analizy sz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Fitoplankton przekształca energię słoneczną i dwutlenek węgla w materię organiczną, a tym samym odgrywa kluczową rolę w ekosystemie wodnym. Z tego powodu badania zahamowania tempa wzrostu glonów są zaliczane do trzech obowiązkowych badań toksyczności dla środowiska wodnego wymaganych do regulacyjnej oceny ryzyka chemikaliów. Możliwość przeprowadzenia wiarygodnego i powtarzalnego badania toksyczności glonów ma w tym względzie kluczowe znaczenie. Konfiguracje testowe z użyciem kolb Erlenmeyera wprowadzają szereg zmienności...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez PATROLS - Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 w ramach programu badań i innowacji Horyzont 2020.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Aceton | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Chlorek amonu | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap butelki (1L) | & Holm A/S | ||
| Kwas borowy | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Chlorek wapnia dwuwodny | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Przezroczysty arkusz akrylowy (40x40 cm) | |||
| Sigma-Aldrich | 255599 | ||
| Chlorek miedzi(II) dwuwodny | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Spektrofotometr fluorescencyjny F-7000 | Hitachi | ||
| Kwas solny | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Sześciowodny chlorek żelaza(III) | LED Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K | |
| Chlorek magnezu sześciowodny | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Siarczan magnezu siedmiowodny | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Czterowodny chlorek manganu(II) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Wytrząsarka orbitalna | IKA | 2980200 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 szczep | |
| Fiolki scyntylacyjne (20 ml) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Molibdenian sodu | dwuwodny Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Zacisk sprężynowy | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Szafa termostatyczna | VWR | WTWA208450 | Alternatywa: pomieszczenie z kontrolowaną temperaturą |
| Rura wentylacyjna (Ø 125 mm) | Kolby miarowe Silvan | 22605630165 | |
| (25 ml) | DWK Nauki Przyrodnicze | 246781455 | |
| Chlorek | Sigma-Aldrich | 208086 |
Bibliografia
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021(2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
