Artykuł metodologiczny

Bezpośrednie badania przesiewowe w postaci płynnych kultur w celu oceny produkcji białek heterologicznych przy użyciu auksotroficznego mutanta Aspergillus oryzae

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61219

⸱

12 maja 2020

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowano metodę bezpośredniego badania przesiewowego płynnej kultury (DLC), która znacznie skraca czas potrzebny na transformację protoplastów grzyba nitkowatego, Aspergillus oryzae, za pośrednictwem glikolu polietylenowego (PEG), gdy jest stosowana do oceny produkcji wydzielniczej białek heterologicznych. Ta metoda znacznie zwiększa przepustowość protokołu oceny.

Streszczenie

Aspergillus oryzae, grzyb nitkowaty, jest jednym z najczęściej używanych gospodarzy do zastosowań przemysłowych, w tym do produkcji białek na dużą skalę. Metoda transformacji protoplastów za pośrednictwem glikolu polietylenowego (PEG) jest zwykle stosowana do wprowadzania heterologicznych genów do A. oryzae. Konwencjonalna metoda zazwyczaj wymaga trzech tygodni na przesiewanie korzystnych transformantów. W tym przypadku wprowadzono nową technikę, metodę bezpośredniego badania przesiewowego w postaci cieczy (DLC), która skraca czas badania przesiewowego do sześciu dni w formacie kolby 200 ml lub do 10 dni w formacie 24-dołkowej mikropłytki. Metoda przesiewowa DLC zapewnia pozyskiwanie dodatnich transformantów i ocenę produkcji wydzielniczej białek heterologicznych w jednym kroku, w przeciwieństwie do konwencjonalnej metody przesiewowej, w której do tego samego wymagane są dwa oddzielne etapy. Opisano protokół transformacji A. oryzae w protoplastach za pośrednictwem PEG, który składa się z pięciu etapów: przygotowanie świeżej zawiesiny zarodników, hodowla wstępna, przygotowanie protoplastów, wprowadzenie DNA i badanie przesiewowe DLC. Aby uzyskać pomyślne wyniki badań przesiewowych DLC, ważne jest, aby użyć pożywki bogatej w składniki odżywcze o zoptymalizowanym ciśnieniu osmotycznym. Protokół powinien jeszcze bardziej spopularyzować stosowanie A. oryzae jako gospodarza z wyboru w przemysłowej produkcji białek.

Wprowadzenie

Aspergillus oryzae to ważny mikroorganizm w japońskim przemyśle spożywczym, który był używany przez ponad 1000 lat do produkcji fermentowanej żywności, takiej jak sake (wino ryżowe), shoyu (sos sojowy) i miso (pasta sojowa)1,2. Ma zdolność wydzielania dużej ilości białek, takich jak proteazy i amylazy3. Dostępne są również informacje o sekwencji genomu A. oryzae4. Co więcej, dla tego grzyba opracowano potężne i praktycznie użyteczne techniki inżynierii genetycznej5,6,7,8,9,10. Korzystne transformanty zostały wykorzystane jako gospodarze do produkcji wydzielniczej białek heterologicznych11,12,13,14.

Elektroporacja, transformacja za pośrednictwem Agrobacterium i transformacja protoplastów za pośrednictwem glikolu polietylenowego (PEG) to techniki używane do wprowadzania heterologicznych genów do A. oryzae15,16,17. Metoda transformacji protoplastów za pośrednictwem PEG jest szeroko stosowana od czasu, gdy po raz pierwszy opisano ją dla Neurospora crassa w 1979 roku18. W tej metodzie protoplasty są przygotowywane i mieszane z PEG i genem heterologicznym, który ma zostać wprowadzony do komórek. Ściany protoplastów są upośledzone enzymatycznie, co sprawia, że komórki są podatne na stres fizyczny i zmiany ciśnienia osmotycznego19,20. Konwencjonalna metoda przesiewowa stosowana w wydzielniczej produkcji białek heterologicznych obejmuje trzy etapy: nabycie dodatnich transformantów (na miękkiej płytce agarowej), selekcję prawdziwych i fałszywych transformantów (na płytce agarowej) oraz ocenę produkcji wydzielniczej białek heterologicznych (w płynnej hodowli); każdy z tych kroków trwa siedem dni (Rysunek 1). Tak więc konwencjonalna metoda zwykle wymaga około trzech tygodni.

Czas potrzebny na badanie przesiewowe przekształconych komórek A. oryzae jest znacznie dłuższy niż ten wymagany dla innych mikroorganizmów powszechnie stosowanych w badaniach biotechnologicznych, co czyni proces bardziej uciążliwym. Na przykład, gdy używa się Escherichia coli jako gospodarza, potrzeba około dwóch dni od wprowadzenia DNA do potwierdzenia jego działania21.

Aby obejść ograniczenia związane z użyciem A. oryzae, jak wspomniano powyżej, wprowadzono nową metodę bezpośredniego badania przesiewowego za pomocą płynów (DLC), która umożliwia szybsze i prostsze badanie przesiewowe w celu oceny produkcji wydzielniczej białek heterologicznych (Rysunek 1). W metodzie DLC stosuje się mutanta auksotroficznego urydyny i płynną pożywkę bogatą w składniki odżywcze. Stosując tę metodę, etap badania przesiewowego można zakończyć w ciągu sześciu dni po wprowadzeniu DNA do protoplastów w formie kolby o pojemności 200 ml lub w ciągu 10 dni w formacie mikropłytki 24-dołkowej. Ponadto w tej metodzie nie jest potrzebne czasochłonne i pracochłonne przygotowanie podłoża z płytek agarowych. Stosowanie nowo opisanej metody ma ogromną zaletę, zwłaszcza biorąc pod uwagę fakt, że metoda konwencjonalna wymaga dwóch różnych pożywek: miękkiej płytki agarowej do pozyskiwania dodatnich transformantów, która wymaga starannego obchodzenia się i kontroli temperatury, oraz stałej płytki agarowej do wyboru prawdziwych transformantów.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat transformacji protoplastów grzyba nitkowatego Aspergillus oryzae za pośrednictwem glikolu polietylenowego (PEG).
(Górny panel) Konwencjonalna metoda przesiewowa. (Dolny panel) Metoda bezpośredniego badania przesiewowego z hodowlą płynów (DLC). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie świeżej zawiesiny zarodników

  1. Zaszczepić 20 μl podstawowej zawiesiny zarodników (1 x 107 zarodników/ml) w środku płytki hodowlanej zawierającej pożywkę Czapek-Dox (CD) z 20 mM urydyną (autoklawizowaną w temperaturze 121 °C przez 20 minut, Tabela 1).
  2. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 7 dni, aby pobudzić tworzenie się zarodników.
  3. Dodać 1,5 ml 0,01 % roztworu Tween 20 (sterylizowanego w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut) do płytki hodowlanej zawierającej zarodniki i zawiesić zarodniki przez zeskrobanie za pomocą rozsiewacza komórek.
  4. Zebrać zawiesinę zarodników do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.
  5. Zawiesinę przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Zawiesinę zarodników należy zużyć w poniższej procedurze w ciągu 2 tygodni. Aby przygotować wywar do długotrwałego przechowywania, dodać glicerol do zawiesiny zarodników do końcowego stężenia 15% i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przedkultura

  1. Dodać 100 ml pożywki z polipeptonem i dekstryną (PD) (Tabela 2) do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
  2. Po upewnieniu się, że temperatura pożywki jest obniżona, dodać roztwór urydyny, wysterylizowany przez przejście przez filtr o wielkości porów 0,22 μm, do końcowego stężenia 20 mM.
  3. Dodać 200 μl zawiesiny przetrwalników (1 x 107 zarodników/ml) przygotowanej w kroku 1.4 i inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 120 obr./min przez 36 godzin.

3. Przygotowanie protoplastów

  1. Biomasę grzybów przygotowaną w kroku 2.3 zebrać na szklanym filtrze o wielkości porów 30 μm (sterylizowanym w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut).
  2. Wlać 100 ml wody destylowanej (DW) (sterylizowanej w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut) na szklany filtr i kilkakrotnie wymieszać szpatułką (sterylizowaną w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut).
  3. Po umyciu DW wlać 100 ml buforu chlorku sodu (NaCl) (sterylizowanego w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut, Tabela 3) na szklany filtr i kilkakrotnie wymieszać szpatułką.
  4. Przenieść około 1-2 ml (objętość mokra) komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą szpatułki (autoklawowanej w temperaturze 121 °C przez 20 minut).
  5. Po dodaniu 15 ml roztworu enzymatycznego (wysterylizowanego przez przepuszczenie przez filtr o wielkości porów 0,22 μm, Tabela 4) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, dodać bufor NaCl, aż całkowita objętość osiągnie 30 ml.
  6. Zamknij pokrywę i uszczelnij folią parafinową. Inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 60 obr./min przez 2 godziny.
  7. Przepuść otrzymany roztwór przez sitko o wielkości 70 μm podłączone do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby usunąć nieprzereagowaną grzybnię.
  8. Odwirować roztwór protoplastu w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przy 2,150 x g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  9. Delikatnie wyrzucić sklarowany osad, aby zapobiec przemieszczaniu się osadu. Dodać 1 ml lodowato wysterylizowanego roztworu B (sterylizowanego w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut, tabela 5) i delikatnie zawiesić wytrącone protoplasty przez pipetowanie.
  10. Przenieść zawieszone protoplasty do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.
  11. Wirować przy 2,220 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Następnie dodać 1 ml lodowatego roztworu B i delikatnie zawiesić osad przez pipetowanie.
  12. Powtórz krok 3.9.
  13. Za pomocą hemocytometru zmierz liczbę protoplastów pod mikroskopem.
  14. Przygotować zawiesinę protoplastów (1−3 x 107 protoplastów/ml) w roztworze B i przechowywać na lodzie do czasu użycia.
    UWAGA: Zawiesinę protoplastów należy natychmiast zużyć w następującej procedurze.

4. Wprowadzenie DNA do produkcji wydzielniczej białka

  1. Używając plazmidu zawierającego kasetę DNA do wydzielniczej produkcji białka jako matrycy, amplifikuj fragment DNA wymagany do produkcji wydzielniczej metodą PCR.
  2. Przygotować próbkę DNA do wykorzystania do transformacji, przetwarzając produkt PCR przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR.
  3. Dodać 1 ml roztworu protoplastu, 200 μl roztworu C (autoklawowanego w temperaturze 121 °C przez 20 minut, tabela 6) i 50 μl próbki DNA (0,5−1 μg/μl) do sterylnej, wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i delikatnie wymieszać roztwór, pipetując.
    UWAGA: Roztwór C ma wysoką lepkość i może być trudny w obsłudze; Zapewnić dokładne wymieszanie przez pipetowanie.
  4. Inkubować probówkę na lodzie przez 30 minut.
  5. Dodać 1,5 ml roztworu C, delikatnie wymieszać pipetując, a następnie pozostawić roztwór w temperaturze pokojowej na 20-30 minut.

5. Bezpośrednie badanie przesiewowe hodowli płynów

UWAGA: Wybierz system hodowli za pomocą kolb Erlenmeyera (sekcja 5.1) lub mikropłytek (sekcja 5.2).

  1. System hodowli z wykorzystaniem kolby Erlenmeyera o pojemności 200 ml
    1. Dodać 50 ml pożywki PD zawierającej 0,8 M sorbitolu do kolby Erlenmeyera o pojemności 200 ml i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
    2. Po potwierdzeniu, że temperatura pożywki jest obniżona, dodać zawiesinę protoplastów przygotowaną w kroku 4.5 do końcowego stężenia 1 x 105 protoplastów/ml.
    3. Inkubować kulturę przez 6 dni w temperaturze 30 °C, wytrząsając przy 120 obr./min.
    4. Zebrać 1 ml pożywki i przechowywać w probówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze 4 °C. Przechowywać próbkę kultury w temperaturze -20 °C, jeśli nie zostanie natychmiast poddana analizie.
    5. Zmieszać 20 μl próbki hodowlanej i 20 μl buforu próbki dodecylosiarczanu sodu (SDS) (tabela 7) w probówce o pojemności 1,5 ml i gotować w temperaturze 95 ° C przez 5 minut.
    6. Po schłodzeniu na lodzie załadować 20 μl gotowanej próbki i 5 μl wstępnie wybarwionego wzorca białkowego na prefabrykowany żel i przeanalizować wytwarzanie wydzielniczej docelowego białka heterologicznego przez elektroforezę w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE)10.
  2. System hodowli z wykorzystaniem 24-dołkowej mikropłytki
    1. Dodać zawiesinę protoplastów przygotowaną w kroku 4.5 do wysterylizowanej pożywki PD zawierającej 0,8 M sorbitol do końcowego stężenia 1 x 10,5 protoplastów/ml i delikatnie wymieszać pipetując.
    2. Dodać 1 ml roztworu przygotowanego w kroku 5.2.1 do trzech dołków w 24-dołkowej mikropłytce.
    3. Przykryć pokrywką i inkubować w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 175 obr./min przez 10 dni.
    4. Zebrać 1 ml pożywki i przechowywać w probówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze 4 ° C. Próbkę kultury należy przechowywać w temperaturze -20 ° C, jeśli nie zostanie natychmiast poddana analizie.
    5. Wymieszać 20 μl próbki hodowlanej i 20 μl buforu próbki SDS w probówce o pojemności 1,5 ml i gotować w temperaturze 95 ° C przez 5 minut.
    6. Po schłodzeniu na lodzie załadować 20 μl gotowanej próbki i 5 μl wstępnie wybarwionego wzorca białkowego na prefabrykowany żel i przeanalizować produkcję wydzielniczą docelowego białka heterologicznego za pomocą SDS-PAGE10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki wprowadzenia kasety kodującej ekspresję DNA dla celulobiohydrolazy Talaromyces cellulolyticus (CBH: GenBank Accession Number E39854) do auksotrofu urydynowego szczepu A. oryzae HO422 oraz badania przesiewowego pod kątem produkcji wydzielniczej białka heterologicznego są opisane poniżej.

Przygotowanie świeżej zawiesiny zarodników

Ostateczny wynik zawiesiny zarodników z jednej płytki agarowej wynosił 1 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowaliśmy system, który pozwala na przesiewanie transformantów A. oryzae szybciej niż metodą konwencjonalną, poprzez prowadzenie płynnej hodowli protoplastów. Najbardziej krytycznym aspektem tej metody jest ciśnienie osmotyczne ciekłego medium. Ciśnienie osmotyczne odpowiednie dla hodowli płynnej zostało zoptymalizowane przy użyciu sorbitolu. Wzrost szczepu A. oryzae HO4 był najbardziej aktywny w obecności 0,8 M sorbitolu (ryc. 3A). W konwencjonalnej metodzie wykorzystu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Rinkei Okano za pomoc w eksperymentach. Autorzy dziękują profesorowi Katsuyi Gomi z Uniwersytetu Tohoku i profesorowi Masayuki Machida z Kanazawa Institute of Technology za cenne dyskusje. Praca ta została sfinansowana przez Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 M NaOHNACALAI TESQUE, INC.37421-05
1 M Tris-HCl (pH 7,5)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation318-90225
1 M Tris-HCl (pH 6,8)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation2106-100
1,5 ml Probówka do mikrowirówekAS ONE Corporation1-1600-03
15 ml Stożkowa probówka wirówkowaBecton, Dickinson and Company352196
2- merkaptoetanolBio-Rad Laboratories, Inc.
24-dołkowa płytka MicroplateAGC TECHNO GLASS CO., LTD.3820-024
50-mililitrowa stożkowa probówka wirówkowaBecton, Dickinson and Company352070
70-&mikro; m Sitko do komórekBecton, Dickinson and Company352350
AgarFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation010-15815
AutoklawTOMY SEIKO CO., LTD.LSX-700
Niebieski bromofenolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation021-02911
CaCl2FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation038-24985
Kwas kasaminowyFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation393-02145
Celulaza R-10Cosmo Bio Co., Ltd.16419
Hydrat dekstrynyFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation044-00585
D-SorbitolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation191-14735
e-PAGELATTO CORPORATIONE-T/R1020LUżywany do prefabrykatów żelowych w SDS-PAGE
Urządzenie do elektroforezyATTO CORPORATIONWSE-1150Używane do SDS-PAGE
FeSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation098-01085
Filtr szklany 17G3Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.
GlicerolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation070-04941
HemocytometrFunakoshi Co., Ltd.521-10
Wirówka szybkoobrotowa z chłodzeniemKUBOTA CORPORATION7780Służy do wirowania próbek w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml
InkubatorTAITEC CORPORATION.G· BR-200Służy do hodowli płynów w kolbach i otrzymywania protoplastów
InkubatorTAITEC CORPORATION.BR-43FLUżywany do hodowli płynów na mikropłytkach i kultur płytkowych
KClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-03545
KH2PO4NACALAI TESQUE, INC.28721-55
Enzym lizującySigma-AldrichL1412-10G
MgSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation131-00405
Wirówka z mikrochłodzeniemKUBOTA CORPORATION3740Służy do wirowania próbek w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml
MikroskopLeica MicrosystemsDMI6000 B
NaClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation190-13921
NaH2PO4· 2H2ONACALAI TESQUE, INC.31718-15
NaNO3FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation195-02545
Parafilm MBemis Company, IncPM-996
Zestaw do oczyszczania PCRQIAGENKK 28104
szalka PetriegoSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-11900Używany jako płytka hodowlana
Glikol polietylenowySigma-AldrichP3640-500G
Pepton polipeptonowyBecton, Dickinson and Company211910
Drabinki białkoweBio-Rad Laboratories, Inc.161-0377Stosowany jako marker masy cząsteczkowej w SDS-PAGE
Dodecylosiarczan soduBio-Rad Laboratories, Inc.
Sterylny filtrMerck KGaASLGP033RB
SacharozaNACALAI TESQUE, INC.30404-45
Tween 20Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0543
UrydynaSigma-AldrichU3750-25G
YatalaseTakara Bio Inc.Zobacz materiał T017
161071000000941471610301

Bibliografia

  1. Tsuboi, H., et al. Improvement of the Aspergillus oryzae enolase promoter (P-enoA) by the introduction of cis-element repeats. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 69, 206-208 (2005).
  2. Nemoto, T., Maruyama, J. -I., Kitamoto, K. Contribution ratios of amyA, amyB, amyC genes to high-level α-amylase expression in Aspergillus oryzae. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 76, 1477-1483 (2012).
  3. Shinkawa, S., Mitsuzawa, S. Feasibility study of on-site solid-state enzyme production by Aspergillus oryzae. Biotechnology for Biofuels. 13, 31(2020).
  4. Machida, M., et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae. Nature. 438 (7071), 1157-1161 (2005).
  5. Veenstra, A. E., van Solingen, P., Bovenberg, R. A. L., vander Voort, L. H. M. Strain improvement of Penicillium chrysogenum by recombinant DNA techniques. Journal of Biotechnology. 17 (1), 81-90 (1991).
  6. Takahashi, T., Masuda, T., Koyama, Y. Enhanced gene targeting frequency in ku70 and ku80 disruption mutants of Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae. Molecular Genetics and Genomics. 275 (5), 460-470 (2006).
  7. Mizutani, O., et al. A defect of LigD (human Lig4 homolog) for nonhomologous end joining significantly improves efficiency of gene-targeting in Aspergillus oryzae. Fungal Genetics and Biology. 45 (6), 878-889 (2008).
  8. Bergès, T., Barreau, C. Isolation of uridine auxotrophs from Trichoderma reesei and efficient transformation with the cloned ura3 and ura5 genes. Current Genetics. 19 (5), 359-365 (1991).
  9. Takeno, S., et al. Cloning and sequencing of the ura3 and ura5 genes, and isolation and characterization of uracil auxotrophs of the fungus Mortierella alpina 1S-4. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (2), 277-285 (2004).
  10. Ji, Y. W., et al. Application of membrane filtration method to isolate uninuclei conidium in Aspergillus oryzae transformation system based on the pyrG marker. Food Science and Biotechnology. 22 (1), 93-97 (2013).
  11. Mitsuzawa, S., Fukuura, M., Shinkawa, S., Kimura, K., Furuta, T. Alanine substitution in cellobiohydrolase provides new insights into substrate threading. Scientific Reports. 7 (1), 16320(2017).
  12. Fleissner, A., Dersch, P. Expression and export: recombinant protein production systems for Aspergillus. Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 1255-1270 (2010).
  13. Yoon, J., Maruyama, J. -I., Kitamoto, K. Disruption of ten protease genes in the filamentous fungus Aspergillus oryzae highly improves production of heterologous proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 89, 747-759 (2011).
  14. Lin, H., et al. Engineering Aspergillus oryzae A-4 through the chromosomal insertion of foreign cellulase expression cassette to improve conversion of cellulosic biomass into lipids. PLoS One. 9, 108442(2014).
  15. Chakraborty, B. N., Patterson, N. A., Kapoor, M. An electroporation-based system for high-efficiency transformation of germinated conidia of filamentous fungi. Canadian Journal of Microbiology. 37 (11), 858-863 (1991).
  16. Sun, Y., et al. A dual selection marker transformation system using Agrobacterium tumefaciens for the industrial Aspergillus oryzae 3.042. Journal of Microbiology and Biotechnology. 29 (2), 230-234 (2019).
  17. Gomi, K., Iimura, Y., Hara, S. Integrative transformation of Aspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argB Gene. Agricultural and Biological Chemistry. 51 (9), 2549-2555 (1987).
  18. Case, M. E., Schweizer, M., Kushner, S. R., Giles, N. H. Efficient transformation of Neurospora crassa by utilizing hybrid plasmid DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (10), 5259-5263 (1979).
  19. Lim, F. Y., Sanchez, J. F., Wang, C. C., Keller, N. P. Toward awakening cryptic secondary metabolite gene clusters in filamentous fungi. Methods in Enzymology. 517, 303-324 (2012).
  20. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (1), 168(2017).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (7), 2172-2175 (1989).
  22. Shinkawa, S., et al. Base sequence for protein expression and method for producing protein using same. U.S. Patent. , 15/745,030 Application No. 15/745,030. Minato-Ku, Tokyo, Japan (2018).
  23. Tamano, K., et al. The β-1, 3-exoglucanase gene exgA (exg1) of Aspergillus oryzae is required to catabolize extracellular glucan, and is induced in growth on a solid surface. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 71 (4), 926-934 (2007).
  24. Endo, Y., et al. Novel promoter sequence required for inductive expression of the Aspergillus nidulans endoglucanase gene eglA. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (2), 312-320 (2008).
  25. Kubodera, T., Yamashita, N., Nishimura, A. Pyrithiamine resistance gene (ptrA) of Aspergillus oryzae: cloning, characterization and application as a dominant selectable marker for transformation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (7), 1416-1421 (2000).
  26. Yamada, O., Lee, B. R., Gomi, K. Transformation system for Aspergillus oryzae with double auxotrophic mutations, niaD and sC. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 61 (8), 1367-1369 (1997).
  27. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS One. 10 (7), 0133085(2015).
  28. Shi, T. Q., et al. CRISPR/Cas9-based genome editing of the filamentous fungi: the state of the art. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (20), 7435-7443 (2017).
  29. Katayama, T., et al. Forced recycling of an AMA1-based genome-editing plasmid allows for efficient multiple gene deletion/integration in the industrial filamentous fungus Aspergillus oryzae. Applied Environmental Microbiology. 85 (3), 01896-01918 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transformacja protoplast w za pomoc PEGprodukcja bia ek heterologicznychprzygotowanie protoplast wzawiesina zarodnik wpo ywka bogata w sk adniki od ywczeoptymalizacja ci nienia osmotycznegoprzesiewanie transformant w
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły