Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar zbiegu iPSC za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61225

⸱

10 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genetics and Rare Diseases Research Division, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS, 2Department of Science, University Roma Tre, 3Department of Onco-hematology, Gene and Cell Therapy, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS

W tym artykule

Podsumowanie

Celem protokołu jest porównanie różnych warunków powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aby ocenić, jak różnicowa powłoka wpływa na tempo wzrostu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). W szczególności dążymy do stworzenia warunków do uzyskania optymalnego wzrostu kultur iPSC.

Streszczenie

To badanie skupia się na zrozumieniu, w jaki sposób hodowla iPSC na różnych podłożach ECM może wpływać na konfluencję komórek. Stworzono protokół oceny konfluencji iPSC w czasie rzeczywistym bez konieczności liczenia komórek w zawiesinie pojedynczej komórki, aby uniknąć zaburzeń wzrostu. System analizy obrazu o wysokiej zawartości został wykorzystany do oceny konfluencji iPCS na 4 różnych modułach ECM w czasie w sposób zautomatyzowany. Do oceny zbiegu komórek przylegających iPSC zastosowano różne ustawienia analizy i zaobserwowano tylko niewielką różnicę (po 24 i 48 godzinach w przypadku lamininy), niezależnie od tego, czy zastosowano maskę 60, 80 czy 100%. Pokazujemy również, że laminina prowadzi do najlepszej konfluencji w porównaniu z Matrigel, witronektyną i fibronektyną.

Wprowadzenie

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są uzyskiwane z komórek somatycznych i mogą być różnicowane na różne typy komórek. Są one często wykorzystywane jako system do modelowania patogenezy choroby lub wykonywania badań przesiewowych leków, a także oferują potencjał do wykorzystania w kontekście medycyny spersonalizowanej. Ponieważ iPSC mają ogromny potencjał, ważne jest, aby w pełni scharakteryzować je pod kątem wykorzystania jako niezawodny system modelowy. Wcześniej pokazaliśmy, jak ważne jest hodowanie iPSC w środowisku niedotlenionym, ponieważ komórki te opierają się na glikolizie, a środowisko tlenowe może powodować nierównowagę redoks1. iPSC są również podatne na inne warunki hodowli, zwłaszcza środowisko zewnątrzkomórkowe. Optymalizacja warunków hodowli jest kluczową kwestią, aby utrzymać je w zdrowiu i rozmnażaniu. Zdrowa hodowla iPSC doprowadzi do powstania zdrowych, zróżnicowanych komórek, które na ogół są punktem końcowym modelu używanego do zrozumienia molekularnych, komórkowych i funkcjonalnych cech określonych zaburzeń lub procesów komórkowych u ludzi.

W tym badaniu, prosty protokół został użyty do testowania konfluencji iPSC przy użyciu różnych warunków powlekania w oddzielnych studzienkach. iPSC wymagają warstwy zasilającej mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) w celu prawidłowego przyłączenia, ale współistnienie iPSC i MEF utrudnia przeprowadzenie analizy, takiej jak ekstrakcja RNA lub białka, ponieważ obecne są dwie populacje komórek. Aby uniknąć warstwy zasilającej, różne białka należące do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) zostały użyte do odtworzenia naturalnej niszy komórkowej i hodowli iPSC wolnej od karmienia. W szczególności Matrigel jest rozpuszczonym preparatem błony podstawnej ekstrahowanym z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), który jest wzbogacony w białka macierzy zewnątrzkomórkowej (tj. lamininę, kolagen IV, proteoglikany siarczanu heparanu, entaktynę/nidogen i czynniki wzrostu)2,3. Innymi stosowanymi warunkami powlekania są oczyszczone białka o znanym znaczeniu w budowie ECM: wiadomo, że laminina-521 jest wydzielana przez ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) w wewnętrznej masie komórkowej zarodka i jest jedną z najczęstszych laminin w organizmie po urodzeniu4,5,6,7,8,9,10,11; Witronektyna to wolna od ksenotypów matryca do hodowli komórkowych, o której wiadomo, że wspomaga wzrost i różnicowanie hPSC12,13,14,15,16; fibronektyna jest białkiem ECM ważnym dla rozwoju kręgowców oraz przyczepiania i utrzymania embrionalnych komórek macierzystych w stanie pluripotencjalnym17,18,19,20,21,22,23,24,25. Ze względu na to, że dostępne są różne warunki powlekania, porównujemy je pod względem ich wpływu na zbieganie się komórek iPSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Powlekanie płytek 96-dołkowych

UWAGA: Różne powłoki były testowane na tej samej płycie, ale w oddzielnych studzienkach (zobacz Plik uzupełniający).

  1. Rozcieńczyć Matrigel w stosunku 1:100 w DMEM. Dodać 100 μl na studzienkę do 96 płytek dołkowych i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń roztwór i dwukrotnie umyj studzienki 100 μl DMEM.
  2. Rozcieńczyć lamininę (20 μg/ml, LN-521) w PBS (z wapniem i magnezem). Dodać 100 μl do studzienki i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia wykonaj dwa płukania DMEM przed wysiewem komórek.
  3. Rozcieńczyć witronektynę (10 μg/ml) w buforze rozcieńczającym. Dodać 100 μl na studzienkę do płytki 96-dołkowej i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj studzienki PBS (bez wapnia i magnezu) przed posiewem komórek.
  4. Rozcieńczyć HU-Fibronektynę (30 μg/ml) w ddH2O. Dodać 100 μl do studzienek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Następnie umyj studzienki pożywką przed wysianiem komórek.

2. Utrzymanie iPSC w kulturze

UWAGA: iPSC zostały zakupione komercyjnie. Komórki iPS pochodziły ze zdrowych ludzkich fibroblastów i zostały przeprogramowane przy użyciu technologii episomalnej.

  1. Z zamrażarki o temperaturze -80 °C lub ciekłego azotu rozmrozić kriokonserwowane iPSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Oczyścić fiolkę zawierającą komórki 70% etanolem przed włożeniem jej do komory bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Dodać zawiesinę komórkową do 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych (np. mTeSR1) kropla po kropli za pomocą pipety 1000 μl w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować komórki przy 304 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml pożywki do hodowli komórkowych.
  5. Zawiesinę komórkową należy umieścić w dwóch dołkach z 6 dołków (105 iPSC na 6-dołkową szalkę do hodowli komórek), w których wcześniej posiano mysie fibroblasty embrionalne (MEF). Wysiewać MEF na dwa dni przed posiewem iPSC o gęstości 2,4 x 104/cm2 w DMEM (zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% L-glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny).
  6. Po wysianiu uzupełnij pożywkę komórkową 10 μM inhibitora ROCK Y-27632.
  7. Hoduj iPSC na MEF przez pierwsze 4-5 tygodni, a następnie w stanie wolnym od MEF (stan wolny od MEF), używając jednej z powłok będących przedmiotem zainteresowania (patrz krok 1 i tabela 1) w mTeSR1.
  8. Gdy iPSC są w 70-80% zlewne, pasaż 1:4 przy użyciu 0,5 mM EDTA przez 3-5 minut w RT. Dodaj 1 ml 0,5 mM EDTA na płytkę 6-dołkową (lub proporcjonalne ilości dla innych typów płytek). Przenieść do nowych dołków w warunkach bezzasilających i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 20%O2.
  9. Zmieniaj pożywkę na nowy mTeSR1 każdego dnia i dziel komórki co 2 dni.

3. Charakterystyka zbiegu komórek

  1. Do eksperymentów użyj 96-dołkowych płytek.
  2. Wysiewaj 10 000 komórek na studzienkę po co najmniej 1 miesiącu hodowli w stanie wolnym od karmnika, aby mieć pewność, że MEF nie zostały pasażowane. Użyj jednorazowych szkiełek do liczenia, aby policzyć komórki za pomocą mikroskopu optycznego.
  3. Wykonaj eksperymenty w trzech egzemplarzach. Dlatego przetestuj każdy warunek wysiewu w trzech dołkach.
  4. Wykonaj automatyczną akwizycję obrazu od 1 dnia po wysiewie za pomocą cytometru w trybie jasnego pola. Wykonuj automatyczną akwizycję obrazu co 24 godziny przez 5 dni. Szczegółowe informacje na temat parametrów eksperymentalnych można znaleźć w pliku uzupełniającym.
  5. Użyj automatycznego kontrastu i automatycznej ekspozycji, aby lepiej wizualizować komórki.
  6. Ustaw ustawienie analizy (patrz Plik uzupełniający) dla analizy konfluencji, aby zastosować maskę 60%, 80% i 100% na odwiert, aby ocenić zmiany ostrości spowodowane załamaniem światła na granicy studzienek. Użyj innego ustawienia analizy maski, o którym mowa powyżej, aby przeanalizować zbieg komórek w każdym punkcie czasowym.

4. Analizy statystyczne

  1. Proszę podać wyniki ilościowe jako średnią ± błędu standardowego średniej (SEM).
  2. Aby porównać ogólne różnice w różnych warunkach powlekania, należy uzyskać dane przy użyciu tych samych próbek i wykonać test t dla sparowanych prób Studenta. Wartości P mniejsze niż 0,05 są uważane za statystycznie istotne, a wszystkie podane wartości p są dwustronne.

5. Charakterystyka mikrowłókien cytoszkieletu

  1. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (4% PFA) w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwa przemycia w PBS (łącznie 10 minut).
  2. Dodać 100 μl roztworu blokującego (składającego się z 5% BSA, 0,1% Tritonu w PBS) do każdego dołka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć roztwór blokujący i przemyć próbki dwukrotnie PBS przez 10 minut.
  4. Dodać 100 μl roztworu roboczego sprzężonego z falloidyną na próbkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Umyć komórki dwukrotnie PBS (10 min w temperaturze pokojowej).
  6. Jądra barwić Hoechst 33342 rozcieńczonym w stosunku 1:10000 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Usunąć roztwór Hoechsta i przemyć komórki dwukrotnie PBS przez 10 minut za każdym razem.
  8. Umyć próbkę za pomocąH2Oi pozostawić do wyschnięcia pod kapturem chemicznym.
  9. Dodać 100 μl pożywki montażowej (tj. PBS:glicerol, 1:1) w celu pokrycia komórek i zachowania fluorescencji próbek.
  10. Obserwuj celę przy Ex/Em 493/517 nm na laserowo-skaningowym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w źródło światła białego (WLL) i laser diodowy 405 nm. Sekwencyjne obrazy konfokalne można uzyskać za pomocą obiektywu HC PLAPO 40x z olejkiem immersyjnym. Użyj tej samej mocy lasera, rozdzielaczy wiązki, ustawień filtrów, średnic otworków i trybu skanowania dla wszystkich badanych próbek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu zbadaliśmy stopień zrastania się (konfluencję) iPSCs hodowanych w różnych warunkach powlekania. Dzięki zastosowaniu cytometru byliśmy w stanie uzyskać miarodajne wyniki w trzech powtórzeniach w ciągu 5 dni. Ponieważ iPSCs słabo przywierają do naczyń plastikowych i niezbędna jest powłoka wspierająca ich proliferację, zdecydowaliśmy się monitorować konfluencję ludzkich iPSCs, ponieważ jest ona wskaźnikiem kondycji hodowli komórkowej i może odzwierciedlać ich potencjał różnicowania. Po ekspansji in vitr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykorzystanie iPSC do modelowania chorób i przyszłych badań przesiewowych leków wraz z ich możliwym zastosowaniem w medycynie precyzyjnej sprawia, że jest to technologia o ogromnym znaczeniu i z tego powodu uważamy, że konieczne jest jasne zrozumienie warunków hodowli in vitro, które lepiej przypominają sytuację fizjologiczną embrionalnych komórek macierzystych. W tym kontekście przetestowaliśmy różne powłoki ECM przy użyciu iPSC typu dzikiego, aby zrozumieć warunki, które pozwalają komórkom pozostać w stanie zdrowym i n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez granty z Fondazione Bambino Gesù i Ricerca Corrente (włoskie Ministerstwo Zdrowia) dla C.C. Chcielibyśmy podziękować Dr Enrico Bertini (Wydział Neurologii, Oddział Chorób Nerwowo-Mięśniowych i Neurodegeneracyjnych, Laboratorium Medycyny Molekularnej, Dziecięcy Szpital Badawczy Bambino Gesù), Dr Stefania Petrini (Główny Ośrodek Mikroskopii Konfokalnej, Laboratoria Badawcze, Dziecięcy Szpital Badawczy Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Oddział Hematologii Onkologicznej, Terapii Genowej i Komórkowej, Dziecięcy Szpital Badawczy Bambino Gesù) oraz Roberta Ferretti (Oddział Hematologii Onkologicznej, Terapii Genowej i Komórkowej, Dziecięcy Szpital Badawczy Bambino Gesù) w celu przeprowadzenia rozmów naukowych i pomocy technicznej. Maria Vinci jest stypendystką programu "Children with Cancer UK Fellowship".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 ml pipety serologiczne paskowane, polistyren, indywidualnie owinięte papierem/tworzywem sztucznym, sterylneCorning448815
ml stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu (PP) o wysokiej czystościFalcon352097Tool
1x PBS (z Ca2+; Mg2+)Thermofisher14040133Medium
1x PBS (bez Ca2+; Mg2+)EurocloneECB4004LMedium
5 ml Pipety serologiczne paskowane, polistyren, indywidualnie owinięte papierem/tworzywem sztucznym, sterylneCorning4487
Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96 WELL, PS, F-BottomGreiner Bio One655090Support
Płytka do hodowli komórkowych, 6-dołkowaCostar3516Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose)SigmaD5671Medium
EDTASigmaED4SS-500gOdczynnik
Epi Episomal iPSC Reprogramming KitOdczynnik InvitrogenA15960
FAST - READ 102BiosigmaBVS100Tool
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10270106Medium
FibronektynaMerck FC010Powłoka
GlicerolSigmaG5516Odczynnik
H2OMILLIQ
HoechstThermofisher33342Odczynnik
Laminin 521Stem Cell Technologies77003Powłoka
L-glutamina (200 mM)Odczynnik GibcoLS25030081
MatrigelCorning Matrigel z kwalifikacją hESC Matrix354277powłoka
Fibroblasty embrionalne myszy (MEF)Life TechnologiesA24903Powłoka
MTESR1 Średnietechnologie komórek macierzystych85851Średni
suplement MTESR1Technologie komórek macierzystych85852Średnia
penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)Odczynnik Gibco15140122Odczynnik
PhalloidinSigmaP1951
VitronectinStem Cell Technologies7180Powłoka
Y-27632SigmaY0503Odczynnik
narzędzie narzędzie

Bibliografia

  1. Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
  2. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
  3. Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
  4. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
  5. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  6. Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
  7. Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042(2018).
  8. Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
  9. Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
  10. Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
  11. Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
  12. Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
  13. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
  14. Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
  15. Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
  16. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  17. Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
  18. Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
  19. Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
  20. Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
  21. Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
  22. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
  23. Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
  24. Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
  25. Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
  26. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
  27. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  28. Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Konfluencja iPSCpod o a powlekane ECMwysokoprzepustowa analiza obrazuprotok hodowli kom rkowejpowlekanie lamininmacierz b ony podstawnejpowlekanie witronektynpowlekanie fibronektynmikroskopia konfokalna
Pomiar zbiegu iPSC za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.