Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Summary

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Abstract

Pomiar wewnątrzkomórkowego bilansu oksydacji/redukcji daje wgląd w fizjologiczny i/lub patofizjologiczny stan redoks organizmu. Tiole są szczególnie ważne dla oświetlenia statusu redoks komórek poprzez ich zredukowane proporcje ditiolu i utlenionego dwusiarczku. Zmodyfikowane białka fluorescencyjne zawierające cysteinę otwierają nową erę dla bioczujników czułych na redoks. Jedno z nich, białko zielonej fluorescencji wrażliwe na redoks (roGFP), może być łatwo wprowadzone do komórek z transdukcją adenowirusową, umożliwiając ocenę statusu redoks przedziałów subkomórkowych bez zakłócania procesów komórkowych. Zredukowane cysteiny i utlenione cystyny roGFP mają maksima wzbudzenia odpowiednio przy 488 nm i 405 nm przy emisji przy 525 nm. Ocena proporcji tych zredukowanych i utlenionych form pozwala na wygodne obliczenie równowagi redoks w komórce. W artykule dotyczącym tej metody unieśmiertelnione ludzkie potrójnie ujemne komórki raka piersi (MDA-MB-231) wykorzystano do oceny statusu redoks w żywej komórce. Kroki protokołu obejmują transdukcję linii komórkowej MDA-MB-231 z adenowirusem w celu ekspresji cytozolowego roGFP, leczenie_H2O2oraz ocenę stosunku cysteiny i cystyny zarówno za pomocą cytometrii przepływowej, jak i mikroskopii fluorescencyjnej.

Introduction

Stres oksydacyjny został zdefiniowany w 1985 roku przez Helmuta Siesa jako "zaburzenie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej na korzyść tego pierwszego"¹, a mnóstwo badań zostało przeprowadzonych w celu uzyskania specyficznego dla choroby, odżywiania i starzenia się statusu redoks organizmów1^,2,3. Od tego czasu zrozumienie stresu oksydacyjnego stało się szersze. Testowanie hipotez stosowania przeciwutleniaczy przeciwko chorobom i/lub starzeniu się wykazało, że stres oksydacyjny nie tylko powoduje szkody, ale także pełni inne role w komórkach. Ponadto naukowcy wykazali, że wolne rodniki odgrywają ważną rolę w transdukcji sygnału². Wszystkie te badania wzmacniają znaczenie określania zmian w stosunku redukcja-utlenianie (redoks) makrocząsteczek. Aktywność enzymów, przeciwutleniacze i/lub utleniacze oraz produkty utleniania można oceniać różnymi metodami. Wśród nich metody określające utlenianie tiolu są prawdopodobnie najczęściej stosowane, ponieważ informują o równowadze między przeciwutleniaczami i prooksydantami w komórkach, a także w organizmach⁴. W szczególności proporcje między glutationem (GSH)/dwusiarczkiem glutationu (GSSG) i/lub cysteiną (CyS)/cystyną (CySS) są wykorzystywane jako biomarkery do monitorowania statusu redoks organizmów².

Metody używane do sprawdzania równowagi między prooksydantami a przeciwutleniaczami opierają się głównie na poziomach zredukowanych/utlenionych białek lub małych cząsteczek w komórkach. Western blot i spektrometria mas są używane do szerokiej oceny proporcji zredukowanych/utlenionych makrocząsteczek (białka, lipidów itp.), a stosunki GSH/GSSG można ocenić za pomocą spektrofotometrii⁵. Wspólną cechą tych metod jest fizyczne zaburzenie systemu przez lizę komórek i/lub homogenizację tkanek. Analizy te stają się również wyzwaniem, gdy konieczne jest zmierzenie stopnia utlenienia różnych przedziałów komórkowych. Wszystkie te perturbacje powodują artefakty w środowisku testowym.

Białka fluorescencyjne wrażliwe na redoks otworzyły korzystną erę do oceny równowagi redoks bez powodowania zakłóceń w komórkach⁶. Mogą celować w różne przedziały wewnątrzkomórkowe, umożliwiając ilościowe określenie działań specyficznych dla przedziałów (np. oznaczanie stanu redoks mitochondriów i cytozolu) w celu zbadania przesłuchów między organellami komórkowymi. Żółte białka fluorescencyjne (YFP), zielone białka fluorescencyjne (GFP) i białka HyPeR zostały ocenione przez Meyera i współpracowników⁶. Wśród tych białek GFP wrażliwy na redoks (roGFP) jest wyjątkowy ze względu na różne fluorescencyjne odczyty jego reszt CyS (np. 488 nm/em. 525 nm) i CySS (np. 405 nm/525 nm), co pozwala na analizę ratiometryczną, w przeciwieństwie do innych białek wrażliwych na redoks, takich jak YFP^7,8. Dane wyjściowe ratiometryczne są cenne, ponieważ równoważą różnice między poziomami ekspresji, czułością wykrywania i fotowybielaniem⁸. Subkomórkowe przedziały komórek (cytozol, mitochondria, jądro) lub różne organizmy (bakterie, a także komórki ssaków) mogą być celem poprzez modyfikację roGFP^7,9,10.

roGFP testy są przeprowadzane przy użyciu technik obrazowania fluorescencyjnego, szczególnie do eksperymentów z wizualizacją w czasie rzeczywistym. Analizy cytometryczne roGFP są również możliwe w przypadku eksperymentów z wcześniej określonymi punktami czasowymi. Niniejszy artykuł opisuje zarówno zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej, jak i cytometrii przepływowej do przeprowadzenia ratiometrycznej oceny statusu redoks w komórkach ssaków z nadekspresją roGFP (ukierunkowaną na cytozol) poprzez transdukcję adenowirusową.

Protocol

UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany dla 70%–80% konfluentnych komórek MDA-MB-231. W przypadku innych linii komórkowych należy ponownie zoptymalizować liczbę komórek i mnogość infekcji (MOI).

1. Przygotowanie komórek (dzień 1)

1. Utrzymuj linię komórkową MDA-MB-231 w kolbach o długości 75^cm2 z 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w wilgotności 5% CO₂ w atmosferze wilgotnej < br /> UWAGA: DMEM uzupełniony 10% FBS, 37 °C i 5% CO₂ nawilżana atmosfera są używane do wszystkich inkubacji przyłączania i leczenia w całym protokole.
2. Przygotuj komórki MDA-MB-231 do eksperymentu.
   1. Odessać pożywkę w kolbie, odłączyć komórki z 2 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA na 2 minuty i dezaktywować aktywność trypsyny za pomocą 6 ml kompletnej pożywki (DMEM z 10% FBS). Odwirować komórki przy sile 150 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki.
   2. Wymieszaj zawiesinę komórek o równej objętości i 0,4% błękitu trypanowego. Weź 10 μl tej mieszaniny i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.
      UWAGA: Do zliczania komórek można również użyć licznika redlic lub hemocytometru.
   3. Zasiaj komórki na 6-dołkowej płytce do analiz cytometrii przepływowej i zamieść 150 000 komórek w 1 ml pożywki na dołek. Poczekaj 16 godzin na zamocowanie ogniwa.
   4. Zasiej komórki w 4-dołkowym szkiełku do obrazowania fluorescencyjnego i zamieść 25 000 komórek w 0,5 ml pożywki na studzienkę. Poczekaj 16 godzin na zamocowanie ogniwa.
      UWAGA: Studzienki kontrolne nasion oprócz studzienek zaprawiających. Użyj jednej z studzienek kontrolnych, aby określić liczbę komórek (opcjonalnie: jeśli okres przyłączenia komórek jest krótszy niż czas podwojenia, można założyć, że liczba komórek jest taka sama jak gęstość wysiewu), a drugą dla niezakażonej kontroli (0 MOI).

2. Transdukcja adenowirusowa roGFP (dzień 2 i 3)

UWAGA: Adenowirusy mogą powodować choroby. Podczas transdukcji komórek używaj końcówek z filtrem i odkażaj końcówki, pipety Pasteura i probówki do mikrowirówek z 10% wybielaczem.

UWAGA: Ten protokół został zademonstrowany z wykorzystaniem specyficznego dla cytozolu roGFP, ale inne kompartmenty komórkowe (np. mitochondria lub mitochondrialna przestrzeń międzybłonowa) mogą być celem tego samego protokołu.

1. Wygeneruj krzywą dawka-odpowiedź dla MOI, aby uzyskać najwyższą wydajność transdukcji, obliczając objętość adenowirusa (mL) wymaganą dla każdej wartości MOI dla linii komórkowej MDA-MB-231 (Tabela 1):
   
   UWAGA: Funkcjonalne miano każdej partii zapasów adenowirusowych, które jest wyrażone jako jednostka tworząca płytkę (PFU) na ml, jest dostarczane przez firmę. Optymalny MOI dla transdukcji różni się w zależności od typu komórki. Dla większości komórek ssaków optymalny zakres MOI wynosi od 10 do 300. W zależności od odpowiedzi komórkowej wartości MOI powinny zostać ponownie obliczone (np. zakres MOI powinien zostać zmniejszony, jeśli komórki mają odpowiedź cytotoksyczną, lub zakres powinien zostać zwiększony, jeśli komórki mają niską wydajność transdukcji).
2. Przygotować rozcieńczenie 6 x^{10 10} PFU/ml adenowirusowego roztworu roGFP w stosunku 1:100 z pożywką do hodowli komórkowych (DMEM z 10% FBS) w celu niezawodnego pipetowania.
3. Odpipetować i dodać 0,0125 ml (12,5 μl), 0,025 ml (25 μl), 0,05 ml (50 μl) rozcieńczenia adenowirusowego roGFP do każdego dołka płytki 6-dołkowej w celu transdukcji 150 000 komórek odpowiednio o 50, 100 i 200 MOI do analizy cytometrii przepływowej (Tabela 1).
4. Odpipetować i dodać 0,0042 ml (4,2 μl) adenowirusowego rozcieńczenia roGFP do 4-komorowych szkiełek szkiełkowych, aby przeprowadzić transdukcję 25 000 komórek o 100 MOI do obrazowania fluorescencyjnego (Tabela 1).
   UWAGA: W studzienkach należy użyć minimalnej ilości pożywki, aby zapewnić najwyższą interakcję między konstruktem adenowirusowego roGFP a komórkami. Zawartość surowicy w pożywce hodowlanej może wymagać zmniejszenia dla różnych linii komórkowych, ponieważ wysoki poziom surowicy może negatywnie wpłynąć na wydajność transdukcji w niektórych typach komórek.
5. Inkubować komórki przez 16–24 godziny w warunkach utrzymania komórek. Następnego dnia (dzień 3) zmień pożywkę na pożywkę do hodowli komórkowych (DMEM z 10% FBS), aby umożliwić regenerację komórek przez dodatkowe 24 godziny. Wizualizuj komórki pod mikroskopem, aby ocenić ich morfologię; komórki mogą wyrażać roGFP, nawet jeśli mają zmiany morfologiczne.
   UWAGA: W dniu 3 komórki powinny zacząć wyrażać roGFP; Dlatego wydajność transdukcji można monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (filtry z Ex. 488/EM. 525). Aby uzyskać spójne wyniki testu, należy pamiętać o zmianach morfologicznych i dokumentować je pod mikroskopem kontrastu fazowego oraz obserwować morfologię podczas oceny wydajności transdukcji.
6. Skonstruować krzywą dawka-odpowiedź, wykorzystując próbki 50, 100 i 200 MOI przygotowane w kroku 2.3 oraz wyniki ich skuteczności transdukcji uzyskane z analizy cytometrii przepływowej (kroki 3.1 i 4.1). Oceń optymalną wydajność transdukcji na podstawie dokumentacji zmian morfologicznych (krok 2.5) i krzywej dawka-odpowiedź MOI.
   UWAGA: Chociaż ponad 98% populacji komórek przy 100 MOI i 200 MOI wyraża roGFP (patrz reprezentatywne wyniki), grupa 200 MOI wykazała znaczne zmiany w morfologii komórek MDA-MB-231. W związku z tym określono najskuteczniejszy MOI dla komórek MDA-MB-231 na 100 MOI.
7. Po wybraniu optymalnego MOI (tutaj 100 MOI) dla linii komórkowej MDA-MB-231, przeprowadź eksperyment z materiałami testowymi (10 μM H₂O₂ i jego nośnikiem 0,1% wody dejonizowanej).
   1. Przygotuj i wysiewaj komórki zgodnie z sekcją 1. Używając objętości transdukcji adenowirusa dla 100 MOI obliczonej w kroku 2.1, powtórz kroki 2.2−2.4 dla 100 MOI transdukcji adenowirusowej komórek. Następnie inkubować płytkę i szkiełka komorowe zgodnie z krokiem 2.5.

3. Przejęcie salda CyS/CySS

1. Cytometria przepływowa (dzień 4)
   1. W dniu 4 inkubować komórki z kroku 2.7.1 z 10 μM H₂O₂ przez 1 h.
      UWAGA: 10 μM H₂O₂ użyto jako substancji badanej, a 0,1% wody dejonizowanej użyto jako uzdatnianie nośnika w tym protokole. Inne czynniki utleniające mogą być tutaj stosowane jako kontrole pozytywne.
   2. Odessać pożywkę z płytki 6-dołkowej, zastąpić 750 μl 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i odczekać 2 minuty, aż komórki się oderwą. Dezaktywuj trypsynę za pomocą 2 ml kompletnego podłoża (DMEM z 10% FBS) i zbierz objętość do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
   3. Odwirować probówki o sile 150 x g przez 5 minut w temperaturze 4ºC. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   4. Powtórz krok 3.1.3
   5. Przefiltrować zawiesiny komórek do probówek kompatybilnych z cytometrią przepływową za pomocą siatki 40 μm. Trzymaj probówki na lodzie i z dala od światła, a następnie postępuj zgodnie z krokiem 4.1 w celu analizy danych.
2. Obrazowanie mikroskopowe (dzień 4)
   1. W 4 dniu należy potraktować komórki 10 μM H₂O₂ , uzyskać obrazy natychmiast (punkt czasowy 0) i 1 godzinę po podaniu działaniu substancji i postępować zgodnie z krokiem 4.2 w celu analizy danych.

4. Analiza danych

1. Kwantyfikacja cytometrii przepływowej
   1. Ustaw metodę cytometrii przepływowej dla 3 różnych analiz za pomocą oprogramowania do pobierania próbek (patrz tabela materiałów): rozproszenie do przodu (FCS) na osi x i rozproszenie boczne (SSC) na osi y w celu oceny wielkości komórek i złożoności komórek (SSC może być używane do przybliżonej identyfikacji komórek martwych i żywych); np. filtr pasmowoprzepustowy 488 nm/em. 525 nm (izotiocyjanian fluoresceiny [FITC]) na osi x i SSC na osi y do oceny CyS-roGFP; np. 405 nm/em. 525 nm (fiolet brylantowy 510 [BV510]) filtr pasmowoprzepustowy na osi x i SSC na osi y do oceny CySS-roGFP.
   2. Uzyskaj kontrolę 0 MOI i wizualizuj komórki za pomocą oprogramowania do pobierania próbek. Powtórzyć ten krok dla pozostałych próbek (50, 100, 200 grup MOI, a następnie 10 μM_H2O₂ komórek i komórek poddanych działaniu nośnika). Zapisz pliki do analizy danych.
   3. Otwórz oprogramowanie do analizy danych (patrz tabela materiałów) i otwórz przykładowy plik 0 MOI. Oceń populację komórek będących przedmiotem zainteresowania (bramka 1). Ustaw następujące ustawienia, aby zminimalizować fluorescencję tła dla np. 488 nm/em. 525 nm (bramka 2) i np. 405 nm/em. Filtry pasmowo-przepustowe 525 nm (bramka 3) z niezainfekowanymi (0 MOI) komórkami kontrolnymi.
   4. Otwórz pliki próbek 50, 100 i 200 MOI w oprogramowaniu do analizy danych, aby ocenić krzywą dawka-odpowiedź. Analizuj średnie intensywności fluorescencji za pomocą bramek 2 i 3 dla każdej próbki. Powtórzyć ten krok dla badanych próbek (10 μM_H2O2 komórek poddanych działaniu środka i komórek poddanych działaniu nośnika).
   5. Obliczyć średni stosunek intensywności fluorescencji między utlenionymi a zredukowanymi formami roGFP za pomocą następującego równania.

2. Ocena obrazu
   1. Użyj mikroskopu, który zawiera filtry fluorescencyjne dla CyS-roGFP i CySS-roGFP (odpowiednio filtry 488 nm/em. 525 nm i np. 405 nm/em. 525 nm).
   2. W każdym dołku zjeżdżalni komory wybierz 4 losowe obszary, aby uzyskać obrazy, używając obiektywu 4x, aby zwizualizować większe obszary.
      UWAGA: Obiektyw 20x może być również używany do wyświetlania obrazów.
   3. Otwórz obraz za pomocą oprogramowania ImageJ¹¹. Stosowanie analizy | Zmierz polecenia dla każdego obrazu i użyj równania z kroku 4.1.5, aby określić ilościowo dane.
      UWAGA: Kwantyfikacja obrazów jest ratiometryczna; W związku z tym protokół nie obejmuje odejmowania tła. Jednak, aby można było porównywać obrazy, jasność, kontrast i nasycenie muszą być takie same dla każdego obrazu. Istotność statystyczną oceniano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) i testu post hoc Tukeya.

Results

Stan redoks CyS/CySS można łatwo ocenić za pomocą transdukowanych roGFP. Sonda fluorescencyjna określa ilościowo stosunek między formami zredukowanymi i utlenionymi (długości fal wzbudzenia odpowiednio 488 nm i 405 nm). Dane fluorescencyjne można uzyskać zarówno za pomocą cytometrii przepływowej, jak i mikroskopii.

Dużą liczbę komórek można konsekwentnie i wygodnie pozyskać za pomocą cytometrii przepływowej. Analiza składa się z 3 głównych kroków: 1) wybierz interesującą nas populację komórek ...

Discussion

Równowaga tiolowo-dwusiarczkowa w organizmie odzwierciedla stan redoks komórek. Żywe organizmy zawierają glutation, cysteinę, tiole białkowe i tiole o niskiej masie cząsteczkowej, z których wszystkie są pod wpływem poziomu utlenienia i odzwierciedlają status redoks komórek⁴. Zmodyfikowane roGFP umożliwiają niezakłócające oznaczanie ilościowe równowagi tiol/dwusiarczek za pomocą ich reszt CyS⁷. Właściwość ratiometryczna roGFP zapewnia wiarygodne pomiary redoks dla komórek ss...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% Trypsyna-EDTA	Gibco firmy Life Sciences	25200-056
Szkiełko 4-dołkowe	Thermo Scientific	154526	Materiał do wysiewu komórek do obrazowania fluorescencyjnego
Probówki 5 ml z nasadką sitka do komórek	Falcon	352235	Jednokomórkowa rurka zawiesinowa do analizy cytometrii przepływowej
Płytka 6-dołkowa	Corning	353046	Materiał do wysiewu komórek do analizy cytometrii przepływowej
Probówki stożkowe 15 ml	MidSci	C15B	Hodowla komórkowa
75 cm2 wentylowane kolby do hodowli tkankowych	Corning	4306414	Hodowla komórkowa
Adenowirusowy specyficzny dla cytozolu roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP roGFP	konstrukcja uprzejmie dostarczona przez Dr. Schumaker
Klasa II, Szafka	na kaptur bezpieczeństwa typu A2Thermo Scientific	1300 Series A2	Hodowla komórek
Countess Automatyczny licznik komórek	Invitrogen	C10227	Zliczanie komórek
Szkiełka komorowe licznika komórek Countess	Invitrogen	C10283	Liczenie komórek
DMEM	Gibco firmy Life Sciences	11995-065	Hodowla komórkowa
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Hodowla
komórkowaKońcówki do pipet z filtrem, sterylne, 20 i mikro; l	Fisherbrand	02-717-161	Hodowla komórkowa
Filtrowane końcówki do pipet, sterylne, 1000 i mikro;	l Fisherbrand	02-717-166	do hodowli komórkowych
	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrument wyposażony w filtry pasmowoprzepustowe FITC i BV510 do analiz cytometrii przepływowej
Mikroskop fluorescencyjny	Zaawansowana grupa mikroskopii (AMG)	Evos FL	Obrazowanie fluorescencyjne
Nadtlenek wodoru 30%	Fisher Scientific	H325-100	Kontrola
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Obrazowanie fluorescencyjne komórek wykazujących ekspresję roGFP (ex 405 nm)
Lekka kostka, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Obrazowanie fluorescencyjne komórek wykazujących ekspresję roGFP (ex 488 nm)
MDA-MB-231	Amerykańska kolekcja kultur tkankowych	HTB-26	Linia komórkowa ludzkiego nabłonkowego raka piersi
Probówki do mikrowirówek, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Hodowla komórkowa
PBS	Gibco firmy Life Sciences	10010-023	Kontrola pipet do hodowli komórkowych
	Drummond	Hood Mate Model 360	do hodowli komórkowych
1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	do hodowli komórkowych
5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Pipeta serologiczna do hodowli komórkowych
10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Inkubator do hodowli tkankowych do hodowli
komórkowych	Termo Scientific	HERACell 150i	Inkubator CO2 do hodowli komórkowych
Trypan niebieski barwnik 0,4%	Invitrogen	T10282	Liczenie komórek