Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Summary

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Abstract

Pomiar wewnątrzkomórkowego bilansu oksydacji/redukcji daje wgląd w fizjologiczny i/lub patofizjologiczny stan redoks organizmu. Tiole są szczególnie ważne dla oświetlenia statusu redoks komórek poprzez ich zredukowane proporcje ditiolu i utlenionego dwusiarczku. Zmodyfikowane białka fluorescencyjne zawierające cysteinę otwierają nową erę dla bioczujników czułych na redoks. Jedno z nich, białko zielonej fluorescencji wrażliwe na redoks (roGFP), może być łatwo wprowadzone do komórek z transdukcją adenowirusową, umożliwiając ocenę statusu redoks przedziałów subkomórkowych bez zakłócania procesów komórkowych. Zredukowane cysteiny i utlenione cystyny roGFP mają maksima wzbudzenia odpowiednio przy 488 nm i 405 nm przy emisji przy 525 nm. Ocena proporcji tych zredukowanych i utlenionych form pozwala na wygodne obliczenie równowagi redoks w komórce. W artykule dotyczącym tej metody unieśmiertelnione ludzkie potrójnie ujemne komórki raka piersi (MDA-MB-231) wykorzystano do oceny statusu redoks w żywej komórce. Kroki protokołu obejmują transdukcję linii komórkowej MDA-MB-231 z adenowirusem w celu ekspresji cytozolowego roGFP, leczenie_H2O2oraz ocenę stosunku cysteiny i cystyny zarówno za pomocą cytometrii przepływowej, jak i mikroskopii fluorescencyjnej.

Introduction

Stres oksydacyjny został zdefiniowany w 1985 roku przez Helmuta Siesa jako "zaburzenie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej na korzyść tego pierwszego"¹, a mnóstwo badań zostało przeprowadzonych w celu uzyskania specyficznego dla choroby, odżywiania i starzenia się statusu redoks organizmów1^,2,3. Od tego czasu zrozumienie stresu oksydacyjnego stało się szersze. Testowanie hipotez stosowania przeciwutleniaczy przeciwko chorobom i/lub starzeniu się wykazało, że stres oksydacyjny nie tylko powoduje szkody, ale także pełni inne role w komórkach. Ponad....

Protocol

UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany dla 70%–80% konfluentnych komórek MDA-MB-231. W przypadku innych linii komórkowych należy ponownie zoptymalizować liczbę komórek i mnogość infekcji (MOI).

1. Przygotowanie komórek (dzień 1)

1. Utrzymuj linię komórkową MDA-MB-231 w kolbach o długości 75^cm2 z 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w wilgotności 5% CO₂ w atmosferze wilgotnej < br /> UWAGA: DMEM uzupełniony 10% FBS, 37 °C i 5% CO₂ nawilżana atmosfera są używane do wszystkich inkubacji przyłączania i leczenia....

Results

Stan redoks CyS/CySS można łatwo ocenić za pomocą transdukowanych roGFP. Sonda fluorescencyjna określa ilościowo stosunek między formami zredukowanymi i utlenionymi (długości fal wzbudzenia odpowiednio 488 nm i 405 nm). Dane fluorescencyjne można uzyskać zarówno za pomocą cytometrii przepływowej, jak i mikroskopii.

Dużą liczbę komórek można konsekwentnie i wygodnie pozyskać za pomocą cytometrii przepływowej. Analiza składa się z 3 głównych kroków: 1) wybierz interesującą nas populację komórek .......

Discussion

Równowaga tiolowo-dwusiarczkowa w organizmie odzwierciedla stan redoks komórek. Żywe organizmy zawierają glutation, cysteinę, tiole białkowe i tiole o niskiej masie cząsteczkowej, z których wszystkie są pod wpływem poziomu utlenienia i odzwierciedlają status redoks komórek⁴. Zmodyfikowane roGFP umożliwiają niezakłócające oznaczanie ilościowe równowagi tiol/dwusiarczek za pomocą ich reszt CyS⁷. Właściwość ratiometryczna roGFP zapewnia wiarygodne pomiary redoks dla komórek ss.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% Trypsyna-EDTA	Gibco firmy Life Sciences	25200-056
Szkiełko 4-dołkowe	Thermo Scientific	154526	Materiał do wysiewu komórek do obrazowania fluorescencyjnego
Probówki 5 ml z nasadką sitka do komórek	Falcon	352235	Jednokomórkowa rurka zawiesinowa do analizy cytometrii przepływowej
Płytka 6-dołkowa	Corning	353046	Materiał do wysiewu komórek do analizy cytometrii przepływowej
Probówki stożkowe 15 ml	MidSci	C15B	Hodowla komórkowa
75 cm2 wentylowane kolby do hodowli tkankowych	Corning	4306414	Hodowla komórkowa
Adenowirusowy specyficzny dla cytozolu roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP roGFP	konstrukcja uprzejmie dostarczona przez Dr. Schumaker
Klasa II, Szafka	na kaptur bezpieczeństwa typu A2Thermo Scientific	1300 Series A2	Hodowla komórek
Countess Automatyczny licznik komórek	Invitrogen	C10227	Zliczanie komórek
Szkiełka komorowe licznika komórek Countess	Invitrogen	C10283	Liczenie komórek
DMEM	Gibco firmy Life Sciences	11995-065	Hodowla komórkowa
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Hodowla
komórkowaKońcówki do pipet z filtrem, sterylne, 20 i mikro; l	Fisherbrand	02-717-161	Hodowla komórkowa
Filtrowane końcówki do pipet, sterylne, 1000 i mikro;	l Fisherbrand	02-717-166	do hodowli komórkowych
	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrument wyposażony w filtry pasmowoprzepustowe FITC i BV510 do analiz cytometrii przepływowej
Mikroskop fluorescencyjny	Zaawansowana grupa mikroskopii (AMG)	Evos FL	Obrazowanie fluorescencyjne
Nadtlenek wodoru 30%	Fisher Scientific	H325-100	Kontrola
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Obrazowanie fluorescencyjne komórek wykazujących ekspresję roGFP (ex 405 nm)
Lekka kostka, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Obrazowanie fluorescencyjne komórek wykazujących ekspresję roGFP (ex 488 nm)
MDA-MB-231	Amerykańska kolekcja kultur tkankowych	HTB-26	Linia komórkowa ludzkiego nabłonkowego raka piersi
Probówki do mikrowirówek, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Hodowla komórkowa
PBS	Gibco firmy Life Sciences	10010-023	Kontrola pipet do hodowli komórkowych
	Drummond	Hood Mate Model 360	do hodowli komórkowych
1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	do hodowli komórkowych
5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Pipeta serologiczna do hodowli komórkowych
10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Inkubator do hodowli tkankowych do hodowli
komórkowych	Termo Scientific	HERACell 150i	Inkubator CO2 do hodowli komórkowych
Trypan niebieski barwnik 0,4%	Invitrogen	T10282	Liczenie komórek