Artykuł metodologiczny

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

DOI:

10.3791/61230

⸱

12 czerwca 2020

 , 
1Departments of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Departments of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Fleischer Institute of Diabetes and Metabolism

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta publikacja opisuje protokół izolacji jąder z dojrzałych adipocytów, oczyszczania przez sortowanie aktywowane fluorescencją oraz transkryptomiki na poziomie pojedynczej komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brązowy i beżowy tłuszcz to wyspecjalizowane tkanki tłuszczowe, które rozpraszają energię do termogenezy za pomocą zależnych i niezależnych od UCP1 (Uncoupling Protein-1) szlaków. Jeszcze do niedawna adipocyty termogeniczne były uważane za populację jednorodną. Jednak ostatnie badania wykazały, że istnieje wiele podtypów lub subpopulacji, które różnią się pochodzeniem rozwojowym, zastosowaniem substratu i transkryptomem. Pomimo postępów w genomice pojedynczych komórek, bezstronny rozkład tkanki tłuszczowej na podtypy komórkowe stanowi wyzwanie ze względu na delikatną naturę adipocytów wypełnionych lipidami. Przedstawiony protokół został opracowany w celu obejścia tych przeszkód poprzez skuteczną izolację pojedynczych jąder z tkanki tłuszczowej do dalszych zastosowań, w tym sekwencjonowania RNA. Heterogeniczność komórkowa może być następnie analizowana za pomocą sekwencjonowania RNA i analiz bioinformatycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania wykazały, że brunatna tkanka tłuszczowa (BAT) ma niezwykłą zdolność do rozpraszania energii. Zarówno u gryzoni, jak i u ludzi występują dwa rodzaje adipocytów termogenicznych o wyraźnych cechach rozwojowych: adipocyty beżowe i adipocyty klasyczne brązowe. Podczas gdy klasyczne brązowe adipocyty znajdują się głównie w międzyłopatkowych magazynach BAT, beżowe adipocyty sporadycznie pojawiają się w białej tkance tłuszczowej (WAT) w odpowiedzi na pewne sygnały fizjologiczne, takie jak przewlekła ekspozycja na zimno, proces określany jako "brązowienie" lub "beżowanie". Dzięki zastosowaniu zaawansowanego obrazowania jest teraz jasne, że dorośli ludzie mają znaczne zapasy UCP1+ BAT, zwłaszcza w okolicy nadobojczykowej1,2,3,4. Ilość BAT u dorosłego człowieka odwrotnie koreluje z otyłością i może być zwiększona przez sygnały zewnętrzne, takie jak przewlekła ekspozycja na zimno5,6 lub agonista receptora β3-adrenergicznego7. Wydatek energetyczny zależny od BAT może stanowić realne podejście do walki z otyłością.

Do niedawna termogeniczne adipocyty były uważane za jednorodną populację. Jednak badania wykazały istnienie wielu podtypów lub subpopulacji, które różnią się pochodzeniem rozwojowym, zastosowaniem substratu i transkryptomem8,9,10. Na przykład rodzaj beżowych adipocytów, który preferencyjnie wykorzystuje glukozę do termogenezy, adipocyt g-beżowy, został niedawno opisany 10. Niepełne poznanie typów komórek w brunatnej i beżowej tkance tłuszczowej oraz brak specyficznych markerów stanowią krytyczną barierę w badaniu ich funkcji biologicznych.

Tradycyjne metody izolowania subpopulacji komórek opierają się na ekspresji tylko kilku znanych genów markerowych. Najnowsze postępy w genomice pojedynczych komórek umożliwiają wykorzystanie globalnych danych dotyczących ekspresji genów w pojedynczych komórkach w celu zapewnienia bezstronnego oszacowania liczby subpopulacji w tkance. Ostatecznym celem tego protokołu jest określenie wszystkich podtypów tkanki tłuszczowej pod wpływem różnych bodźców termogenicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki. W przeciwieństwie do innych tkanek i typów komórek, określenie podtypów komórkowych tkanki tłuszczowej jest trudne ze względu na kruchość adipocytów wypełnionych lipidami. W artykule przedstawiono solidny protokół izolacji pojedynczych jąder z tkanki tłuszczowej w celu dalszego zastosowania do sekwencjonowania snRNA. Co ważne, najnowsza literatura porównująca dobrze dopasowane zestawy danych sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder (snRNA-seq) i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) ujawniła, że sekwencjonowanie snRNA jest porównywalne z sekwencjonowaniem scRNA w wykrywaniu typu komórki i lepsze pod względem pokrycia komórkowego dla złożonej tkanki, takiej jak brain11. Protokół ten łączy metodę wirowania w gradiencie gęstości zoptymalizowaną dla tkanek tłuszczowych przez Rosen et al.12 z etapem "oczyszczania" jąder za pomocą szybkiego sortera MoFlo XDP. Jak widać w reprezentatywnych wynikach, analiza 7500 pojedynczych jąder z brunatnej tkanki tłuszczowej myszy między łopatkami zidentyfikowała wiele typów komórek w pozornie jednorodnych brązowych adipocytach. Ogólnie rzecz biorąc, ten prosty i solidny protokół można zastosować do badania organizacji adipocytów i komórek rezydujących w tkance tłuszczowej, identyfikacji genów markerowych specyficznych dla podtypu oraz fenotypowania rozwoju selektywnych myszy z nokautem/transgenicznymi selektywnymi pod względem tkanki tłuszczowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Albert Einstein College of Medicine.

1. Przygotowanie do trawienia i lizy tkanek

  1. Przygotować bufor do trawienia tkankowego.
    1. Przygotuj ~1 ml buforu trawiennego na każdy gram tkanki tłuszczowej.
    2. Odważyć 1,5 j./ml kolagenazy D i 2,4 j./ml dypazy II i dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  2. Przygotować bufor do przygotowania jąder (NPB).
    1. Przygotuj 10 mM HEPES, 1,5 mM chlorku magnezu, 10 mM chlorku potasu, 250 mM sacharozy i 0,1% NP-40 w wodzie wolnej od nukleaz. Dobrze wymieszaj. Sacharoza może potrzebować więcej czasu na rozpuszczenie niż inne składniki.
  3. Przygotować 0,5% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
    1. Przygotować 0,5% BSA w PBS zawierającym EDTA. Zaleca się stosowanie sterylnie przefiltrowanych hodowli komórkowych klasy PBS (patrz Tabela materiałów).

2. Trawienie enzymatyczne tkanki tłuszczowej

  1. Sekcja myszy w celu ekstrakcji tkanki tłuszczowej zgodnie z Aune et al.13. Zebrać wyizolowaną tkankę w naczyniu zawierającym PBS. Przenieś chusteczkę na ręcznik papierowy, aby osuszyć. Następnie umieść chusteczkę w czystym naczyniu.
  2. Dodać chlorek wapnia do buforu wytrawiającego do końcowego stężenia 10 mM. Dodaj niewielką objętość buforu trawiącego do naczynia i dokładnie zmiel tkankę tłuszczową. Wymagana objętość buforu trawiennego będzie zależeć od ilości wyizolowanej tkanki. Zwykle stosuje się ~1 ml lub mniej.
  3. Dodaj około połowy ilości przygotowanego buforu do trawienia (np. ~10 ml dla pięciu myszy) do zmielonej tkanki. Za pomocą pipety serologicznej przenieść próbkę do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać pozostałą ilość buforu do umycia naczynia i przenieść do probówki o pojemności 50 ml zawierającej próbkę. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół. Następnie inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 200-210 obr./min w temperaturze 37 °C przez 12-15 min.

3. Izolacja adipocytów

  1. Po inkubacji dodać do próbki 0,5% BSA w stosunku 1:1. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu odwirowania frakcji zrębu naczyniowego (SVF). Frakcja adipocytów pozostanie w górnej warstwie próbki.
  2. Umieść filtr komórkowy 40 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i przefiltruj próbkę, zbierając górną warstwę i pozostawiając SVF na dnie probówki. Przenieś górną warstwę (frakcję adipocytów) do nowej probówki, odwracając filtr do góry nogami nad probówką i używając 0,5% BSA do odwrotnego mycia filtra i zbierania próbki do probówki.
  3. Doprowadzić całkowitą objętość 0,5% BSA do 10-15 ml w zależności od wielkości próbki i pipetować w górę iw dół za pomocą pipety serologicznej lub krótko wstrząsnąć w górę iw dół, aby wymieszać próbkę. Ponownie odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

4. Izolacja jąder

  1. Użyj końcówki pipety o szerokim otworze i ostrożnie przenieś górną warstwę próbki do filtra komórkowego o wielkości 100 μm umieszczonego na nowej, wstępnie schłodzonej probówce na lodzie, pozostawiając resztki SVF.
  2. Wypłucz/umyj filtr odpowiednią ilością NPB i wyrzuć filtr. Od tego kroku naprzód należy umieszczać próbkę na lodzie tak często, jak to możliwe i pracować szybko, aby uniknąć nieszczelnych i/lub niezdrowych jąder. Pomocne jest wstępne schładzanie probówek wirówkowych, które mają być użyte w przyszłych krokach na lodzie.
  3. Umieścić próbkę na lodzie na nie dłużej niż 2 minuty, z przerywanym, delikatnym odwracaniem probówki do mieszania. Czas inkubacji na lodzie powinien być zoptymalizowany pod kątem wielkości próbki i rodzaju adipocytów. Wirować przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml NPB. Przenieść próbkę do czystej probówki do mikrowirówki. Podczas przenoszenia unikaj dotykania ścianek rurki, które zawierają zanieczyszczenia i lipidy. Dodać 0,6 U/μL inhibitora RNazy do próbki i wymieszać. Ponownie odwirować przy 1.000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
    UWAGA: Na tym etapie należy zmniejszyć prędkość i czas wirowania w przypadku mniejszych próbek.
  5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml buforu do przemywania jąder (2% BSA/PBS + 0,6 U/μL inhibitora RNazy).
  6. Podwójny filtr w czystej rurce z filtrami 30 μm, które można układać jeden na drugim. Przemyć filtr niewielką objętością (~300 μL) buforu do płukania jąder. Alternatywnie, w przypadku mniejszych próbek, należy użyć filtra 30 μm, który mieści się w probówce mikrowirówkowej i przefiltrować bezpośrednio do niej.
  7. Potwierdź pomyślną izolację zdrowych jąder.
    1. Zabarwić małą porcję próbki trypanem i użyć automatycznego licznika komórek do oceny średniej martwej wielkości i procentu martwych komórek. Średnia martwa wielkość próbki zawierającej głównie jądra powinna wynosić od 7 do 10 μm. Wielkość jąder wynosi zwykle około 8 μm.
    2. Wybarwić małą porcję próbki za pomocą DAPI i zbadać pod mikroskopem z obiektywem 20x lub wyższym. Błona jądrowa powinna być nienaruszona, a jądra powinny być okrągłe.

5. Oczyszczanie FACS i etap koncentracji jąder

  1. Natychmiast przejdź do kroku FACS, aby oczyścić jądra i usunąć nadmiar zanieczyszczeń. Bufor kolekcji powinien zawierać bufor Nuclei Wash. Podczas FACS bufor jest rozcieńczany. Pomocne jest przygotowanie wyższego stężenia inhibitora BSA i RNazy w celu uwzględnienia rozcieńczenia podczas sortowania. Blok zbiorczy FACS powinien być w trybie chłodzenia.
  2. Po posortowaniu jąder odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zagęszczenia próbki. Rozpuścić w odpowiedniej objętości buforu do przemywania jąder do uzyskania stężenia 500-1 500 jąder/μl. Nie próbuj usuwać całego supernatantu. Spowoduje to utratę jąder.
  3. Użyj hemocytometru i podwielokrotności barwionej DAPI do końcowego zliczenia i wizualizacji jąder. Następnie natychmiast przystąp do sekwencjonowania snRNA zgodnie z protokołem producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niesortowane jądra adipocytów zawierają szczątki i dublety, które powodują szum i wysokie tło podczas sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Reprezentatywna strategia bramki FACS jest pokazana w Rysunek 1. Jądra zostały najpierw wybrane na podstawie rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC) (A), a następnie wybrano tylko pojedyncze punkty na podstawie kombinacji szerokości i wysokości SSC (B). Na koniec wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono prostą i solidną metodę izolowania pojedynczych jąder i badania niejednorodności tkanki tłuszczowej. W porównaniu z sekwencjonowaniem RNA całej tkanki, ten przepływ pracy oferuje bezstronny wgląd w heterogeniczność komórkową i markery specyficzne dla populacji. Jest to znaczące i innowacyjne dla postępu w biologii adipocytów, metabolizmie molekularnym i badaniach nad otyłością.

Protokół ten jest szczególnie zoptymalizowany pod kątem dalszego stosowania sekwencji snRNA. Etap "oczy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Davidowi Reynoldsowi z centrum Albert Einstein Genomics i Jinghangowi Zhangowi z rdzenia cytometrii przepływowej za wsparcie techniczne. Dziękujemy za wsparcie ze strony National Institutes of Health (NIH) (DK110426) oraz granty pilotażowe i granty na wykonalność z Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) i New York Obesity Research Center (DK026687) (wszystkie dla K.S.). Chcielibyśmy również podziękować Albert Einstein Cancer Center (CA013330) za podstawowe wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
autoMACS Roztwór płuczącyMiltenyi Biotec130-091-222PBS z EDTA; sterylnie filtrowany
BSASigma A1595
CaCl2Sigma21115
Filtr komórkowy 100 μ mCorning431752
Filtr komórkowy 40μ mCorning431750
CellTrics (30 μ m)Sysmex04-004-2326
Kolagenaza D Roche11088866001
Countess II FL Automatyczny licznik komórekInvitrogenAMQAF1000
DAPISigmaD9542
Dispase IIRoche4942078001
HEPESSigmaH4034
KClFisherP217-3
Inteligentne filtry siatkowe MACS (30 µ m)Miltenyi Biotec130-098-458Filtry do układania w stosy
MgCl2SigmaM1028
MoFloXDP Sortownik komórekBeckman CoulterML99030
NP-40Sigma74385
Protector Inhibitor RNazyRoche3335402001
SacharozaFisherS5-3

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  2. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  3. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  4. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
  5. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  6. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  7. Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
  8. Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
  9. Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
  10. Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
  11. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648(2018).
  12. Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  13. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049(2017).
  15. Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
  16. Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619(2018).
  17. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
  18. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  19. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja pojedynczych j derbufor do przygotowania j derfrakcja naczyniowo stromalnabufor do przemywania j derbarwienie b kitem trypanubarwienie j der DAPIsortowanie j der metod FACSsekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rekredukcja wymiarowo ci t SNE

Powiązane artykuły