Ta metoda zapewnia grawimetryczną kwantyfikację substancji humusowych (np. kwasów humusowych i fulwowych) na bazie bezpopiołowej, w suchych i płynnych materiałach z miękkich węgli (tj. utlenionych i nieutlenionych węgla brunatnego i subbitumicznego), rud humatów i łupków, torfów, kompostów i komercyjnych nawozów oraz dodatków do gleby.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie ilościowe kwasów humusowych i fulwowych w rudach humatów, DOC, materiałach humififikowanych i produktach handlowych zawierających substancje humusowe
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem tej metody jest zapewnienie dokładnego i precyzyjnego stężenia kwasów humusowych (HA) i/lub fulwowych (FA) w miękkich węglach, rudach humusowych i łupkach, torfach, kompostach i produktach handlowych zawierających substancje humusowe. Metoda opiera się na alkalicznej ekstrakcji badanych materiałów przy użyciu 0,1 N NaOH jako ekstrahentu i oddzieleniu rozpuszczalnych w alkaliach substancji humusowych (HS) od produktów nierozpuszczalnych przez odwirowanie. pH odwirowanego ekstraktu alkalicznego jest następnie dostosowywane do pH 1 ze stężeniem HCl, co powoduje wytrącenie się kwasu hialuronowego. Wytrącony kwas hialuronowy oddziela się od frakcji fulwowej (FF) (frakcji HS, która pozostaje w roztworze) przez odwirowanie. Kwas hialuronowy jest następnie poddawany procesowi suszenia w piecu lub liofilizacji i określana jest zawartość popiołu w wysuszonym kwasie hialuronie. Masę czystego (tj. bezpopiołowego) kwasu hialuronowego dzieli się następnie przez masę próbki i otrzymaną frakcję mnoży się przez 100 w celu oznaczenia % kwasu hialuronowego w próbce. Aby określić zawartość FA, FF jest ładowany na hydrofobową żywicę DAX-8, która adsorbuje frakcję FA zwaną również hydrofobowym kwasem fulwowym (HFA). Pozostała frakcja kwasu niefulwowego, zwana również hydrofilową frakcją fulwową (HyFF), jest następnie usuwana przez przemywanie żywicy dejonizowanymH2O, aż do całkowitego usunięcia całego niewchłoniętego materiału. FA jest następnie desorbowany za pomocą 0,1 N NaOH. Powstały Na-fulwat jest następnie protonowany przez przepuszczenie go przez silną żywicę H+-wymienną. Otrzymany FA jest suszony w piecu lub liofilizowany, a zawartość popiołu określana jest, a stężenie w próbce oblicza się w sposób opisany powyżej dla HA.
Wprowadzenie
Substancje humusowe (HS) to dynamiczne pozostałości, które powstają w wyniku mikrobiologicznego rozkładu i transformacji martwych tkanek roślinnych1,2,3 wzbogacone o mikrobiologiczne produkty uboczne i biomasę3,4,5 przez proces, który jest określany jako humification6. HS są obecne w glebach, wodach naturalnych, osadach jeziornych, torfowiskach, miękkich węglach i łupkach humusowych i stanowią około 25% całkowitego węgla organicznego na ziemi7. Substancje te są złożonymi mieszaninami tysięcy unikalnych cząsteczek, które są frakcjonowane na trzy główne frakcje w oparciu o ich różną rozpuszczalność w silnie zasadowych i kwaśnych roztworach wodnych. Frakcje te są kwasami humusowymi (HA), które zawierają frakcję rozpuszczalną w alkaliach, ale nierozpuszczalną w kwasach; kwasy fulwowe (FA), frakcja rozpuszczalna zarówno w zasadach, jak i kwasach; oraz frakcja huminowa, która jest nierozpuszczalna przy wszystkich wartościach pH6,8. Frakcja fulwowa (FF) jest dalej dzielona na frakcje hydrofobowe FA (HFA) i hydrofilowe (HyFA). Frakcje te definiuje się jako część FF, która wiąże się z hydrofobową żywicą DAX-8 (HFA) i część, która nie wiąże się z żywicą (HyFA).
HS są coraz częściej używane w rolnictwie, gdzie są szeroko stosowane jako biostymulatory upraw, w hodowli zwierząt, w szczególności jako dodatek do paszy dla zwierząt gospodarskich, w górnictwie w płuczkach wiertniczych i remediacji środowiska jako wahadłowce elektronowe. Wzrasta również liczba badań nad zastosowaniem HS w zastosowaniach medycznych u ludzi.
Istnieje wiele metod ilościowego oznaczania HA i FA. Jednak większość z tych metod nie jest ani dokładna, ani precyzyjna. Na przykład dwie najczęściej stosowane metody oznaczania kwasu hialuronowego w USA to metoda kolorymetryczna9 oraz metoda Kalifornijskiego Departamentu Żywności i Rolnictwa (CDFA), z których obie wykazały zawyżenie ilości kwasu hialuronowego w szeregu źródeł rud i ekstraktów z zachodnich Stanów Zjednoczonych i Kanady10. Metoda kolorymetryczna lub spektrofotometryczna jest niedokładna, ponieważ opiera się na absorbancji ekstraktów alkalicznych, które oprócz HA, FA i innych chromoforów absorbują się na użytej długości fali, a norma nie jest reprezentatywna dla badanych materiałów10. Metoda CDFA nie jest dokładna, ponieważ nie zapewnia stężeń kwasu hialuronowego w stanie bezpopiołowym. Ponieważ różne rudy mają różne ilości popiołu, z których część jest przenoszona podczas ekstrakcji, a sam proces ekstrakcji dodaje popiół, ta metoda nie zapewnia dokładnej wartości stężeń HA10. W odpowiedzi na zapotrzebowanie na dokładną i precyzyjną metodę, w 2014 r. opublikowano ustandaryzowaną procedurę grawimetryczną opartą na procedurze szczegółowo opisanej przez11, aby zająć się oznaczaniem ilościowym zarówno HA, jak i FA na zasadzie wolnej od popiołu12. Metoda ta została następnie zaadaptowana, z niewielkimi modyfikacjami, przez Międzynarodową Organizację Normalizacyjną (ISO) w 2018 r. w ramach Nawozy i kondycjonery gleby jako "Oznaczanie stężeń humusowych i hydrofobowych kwasów fulwowych w materiałach nawozowych"13.
Ten artykuł przedstawia protokół ekstrakcji i ilościowego oznaczania humusowych i hydrofobowych kwasów fulwowych oraz podaje szczegóły dotyczące dokładności i precyzji danych uzyskanych za pomocą tej metody.
Protokół
1. Przygotowanie próbki stałej
- Rozdrobnić około 5 g próbki przeznaczonej do analizy za pomocą moździerza i tłuczka, tak aby 100% rozdrobnionej próbki przeszło przez amerykańskie standardowe sito o rozmiarze oczek nr 200 (tj. 74 μm), upewniając się, że proszek jest dobrze wymieszany.
- Określić grawimetrycznie zawartość wilgoci w proszku.
- Zważyć aluminiową łódkę wagową i zapisać masę (Wwb).
- Przenieść około 2 g próbki proszkowej do łodzi wagowej i zanotować masę (Wws+wb).
- Umieścić łódkę wagową w suszarce na 24 godziny w temperaturze 102 °C (nie przekraczać 102 °C). Po upływie 24 godzin wyjąć łódkę ważącą z suszarki i umieścić w eksykatorze do ostygnięcia na co najmniej 1 godzinę.
- Zważyć i zanotować masę łodzi wagowej i wysuszonej próbki proszku (Wds+wb).
- Oznaczyć zawartość wilgoci za pomocą wzoru 1.1.
Wzór 1.1 Zawartość wilgoci w proszku próbki stałej
% wilgotności = (((Wws+wb- Wwb) – (Wds+wb - Wwb))/ (Wws+wb - Wwb)) * 100
2. Procedura ekstrakcji
- Próbki stałe
- Odważyć około 2,5 g przesianej próbki w proszku (Wsamp) do plastikowej lub aluminiowej łódki wagowej i zanotować masę z dokładnością do czterech miejsc po przecinku.
- Załadować próbkę do cylindra z podziałką o pojemności 1 l i napełnić cylinder do objętości 1 l 0,1 M NaOH (4 g NaOH x L-1).
- Dodać mieszadło magnetyczne (np. o długości 5 - 7 cm) i szybko mieszać (tj. 300 – 400 obr./min) na płytce mieszającej, aż próbka zostanie dokładnie wymieszana.
- Przenieść całą zawartość butli miarowej do kolby Erlenmeyera o pojemności 1 l, opróżnić przestrzeń nad kolbą za pomocą gazuN2 i przykryć otwór kolby hermetyczną pokrywą.
- Umieścić kolbę Erlenmeyera na talerzu mieszającym i mieszać z prędkością 300 - 400 obr./min przez 16 - 18 godzin.
- Próbki cieczy
- W przypadku materiałów płynnych należy dokładnie wymieszać próbkę przez potrząsanie, aby upewnić się, że badana ciecz jest jednorodnie wymieszana. Upewnij się, że wszelkie pozostałości, które mogły spaść na dno pojemnika, są dokładnie wymieszane.
- Dodać około 5 g badanej cieczy, zważonej z dokładnością do 4 miejsc po przecinku (WTL), do butli z podziałką o pojemności 1 l.
- Napełnić cylinder z podziałką 0,1 M NaOH do końcowej objętości 1 l.
- Dodać mieszadło magnetyczne (np. o długości 5 – 7 cm) i szybko mieszać (np. 300 - 400 obr./min) na płytce mieszającej, aż badana próbka zostanie całkowicie wymieszana.
- Przenieść mieszaninę do kolby Erlenmeyera o pojemności 1 l, opróżnić przestrzeń nad wodą za pomocą gazuN2 i przykryć otwór kolby hermetyczną pokrywą.
- Umieścić kolbę Erlenmeyera na płytce mieszającej i mieszać z prędkością 300 - 400 obr./min przez 1 godz.
UWAGA: Po tym momencie postępowanie z próbkami stałymi i ciekłymi jest takie samo.
3. Usuwanie nierozpuszczalnych substancji z ekstraktów alkalicznych
- Po zakończeniu mieszania wyjąć kolbę z płytki mieszającej, przenieść mieszaninę do odpowiednich probówek wirówkowych i odwirować całą objętość przy sile 4,921 x g przez 30 minut.
- Zebrać alkaliczny supernatant zawierający kwas hialuronowy i tłuszcz tłuszczowy do czystej kolby Erlenmeyera o pojemności 1 l zawierającej mieszadło magnetyczne. Wyrzuć nierozpuszczalny materiał. Filtracja przez watę szklaną lub jakościową bibułę filtracyjną o wielkości porów 2,5 μm jest zalecana, jeśli po odwirowaniu nie wytrącają się resztkowe cząstki.
4. Wytrącanie i oddzielanie HA od FF
- Mieszając ekstrakt alkaliczny z prędkością 300 - 400 obr./min na płytce mieszającej, włożyć sondę pH do środkowej części roztworu (pionowo) i dodawać kroplami HCl do ekstraktu alkalicznego, aż do osiągnięcia stabilnego pH 1,0 ± 0,1.
- Gdy pH pH 1 zostanie osiągnięte i pozostanie stabilne, wyjąć sondę pH z kolby, wyjąć mieszadło, przykryć kolbę hermetyczną pokrywą i pozostawić kolbę do momentu, aż wytrącony kwas hialuronowy osiądzie na dnie kolby.
UWAGA: Czas potrzebny do wytrącenia się kwasu hialuronowego i wypadnięcia z roztworu będzie się różnić w zależności od źródła i ilości kwasu hialuronowego w próbce. Zwykle potrzeba 1 -6 godzin, aby kwas hialuronowy całkowicie się wytrącił i wypadł z roztworu. - Odwirować ekstrakt i wytrącony kwas hialuronowy w temperaturze 4921 x g przez 1 godzinę. Po odwirowaniu odlać sklarowany osad FF do czystego 1 litra Erlenmeyera i przykryć hermetyczną pokrywą.
UWAGA: Może być konieczne wydłużenie czasu wirowania w celu wystarczająco mocnego upakowania kwasu hialuronowego, aby umożliwić dekantację kwasu gorącolistego bez włączania któregokolwiek z wytrąconego kwasu hialuronowego. - Umieścić probówki wirówkowe w suszarce o temperaturze 100 °C na 24 godziny.
- Po wysuszeniu wyjmij probówki z pieca do suszenia i umieść w eksykatorze do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Po schłodzeniu przenieść ilościowo pozostałość z probówki, zeskrobując ją z boków i dna probówki szpatułką, przenieść do wytarowanej łodzi wagowej i zanotować masę (WEHA). Tą pozostałością jest "wyekstrahowany kwas hialuronowy".
UWAGA: Jeśli do separacji HA i FF użyto probówek wirówkowych większych niż 50 ml, wygodnie jest przenieść wytrącony HA do odpornych na temperaturę probówek wirówkowych o pojemności 50 ml w celu przeprowadzenia procesu suszenia. Ponadto, jeśli dostępny jest liofilizator, wytrącony kwas hiaologiczny można suszyć w liofilizacji. Zbieranie kwasu hialuronowego w stanie liofilizowanym jest łatwiejsze, ponieważ kwas hialuronowy nie przykleja się do boku plastikowych tubek i nie musi być złomowany.
5. Oznaczanie zawartości popiołu
UWAGA: Procedura oznaczania zawartości popiołu w próbkach suszonego HA i FA jest taka sama. Pokazano procedurę wykorzystującą notację dla HA.
- Przenieść około 30 mg osuszonego kwasu hialuronowego (WHA) do czystego, uprzednio zważonego naczynia ceramicznego (WCD), które zostało uprzednio wysuszone w piecu suszącym w temperaturze 100 °C, a następnie schłodzone w eksykatorze do temperatury pokojowej. Po zarejestrowaniu łącznej masy zważonego kwasu hialuronowego i naczynia (WHA+CD), należy spalić kwas hialuronowy w piecu muflowym przez 2 godziny w temperaturze 600°C.
UWAGA: Dla każdej próbki kwasu hialuronowego należy przetworzyć trzy kontrpróby, a do obliczenia czystego kwasu hialuronowego należy wykorzystać średnią zawartość popiołu. - Po 2 godzinach wyjmij naczynie i zawartość z piekarnika muflowego i umieść w eksykatorze do ostygnięcia. Po ostygnięciu zważ naczynie z popiołem (WASH+CD) i oblicz stosunek popiołu (Ash rat) według wzoru 1.2:
Formuła 1.2 Popiół szczur = (WASH+CD - WCD) / (WHA+CD - WCD)
6. Określenie procentu oczyszczonego wyekstrahowanego HA
- Oznaczyć końcową masę czystego kwasu hialuronowego (WPHA), korygując zawartość popiołu według wzoru 1.3:
Wzór 1,3 WPHA = WEHA * (1-Szczur popiołowy)
7. Oznaczanie stężenia (%) czystego kwasu hialuronowego w oryginalnej próbce źródłowej
- Oznaczyć stężenie czystego kwasu hialuronowego za pomocą wzorów 1.4 i 1.5:
Wzór 1.4: % czystego kwasu hialuronowego w próbce stałej = (WPHA/Wsamp) * 100
Wzór 1,5: % czystego kwasu hialuronowego w próbce cieczy = (WPHA/WTL) * 100
8. Przygotowanie kolumny do oczyszczania HFA
- Przygotować niskociśnieniową kolumnę chromatograficzną wypełnioną żywicą z polimetakrylanu metylu DAX-8. Jeśli żywica nie była wcześniej używana, namocz żywicę w metanolu na 2 godziny, a następnie dokładnie spłucz dejonizowanymH2O, aż cały metanol zostanie usunięty.
- Usuń małe cząsteczki żywicy, które w tym czasie unoszą się na wodzie. Jeśli żywica była wcześniej używana, zregeneruj ją zgodnie z opisem w punkcie 10.
- Po dokładnym wypłukaniu wlać żywicę do szklanej kolumny chromatograficznej o wymiarach 5 x 25 cm, wyposażonej w końcówkę z frytą o grubości 10 μm jako podparcie złoża żywicy. Pozostaw 2,5 do 5 cm na górze kolumny dla roztworu bez żywicy, aby umożliwić wymieszanie FF przed wejściem do złoża żywicy. Dopasuj górną część do kolumny i przepompuj dejonizowany H2Oprzez górną część kolumny, aby wypełnić złoże żywicy DAX-8 za pomocą pompy perystaltycznej.
9. Izolacja HFA
- Po zapakowaniu złoża żywicy załaduj FF na kolumnę za pomocą pompy perystaltycznej, pod niskim ciśnieniem, przez górną część kolumny. Stosować natężenie przepływu 35 – 40 ml/min. Bardzo ważne jest, aby górna część żywicy w kolumnie pozostawała pokryta roztworem przez cały czas trwania procedury ładowania i płukania, aby zapobiec wysuszeniu żywicy i przeprowadzeniu ekstraktu przez złoże żywicy.
- Gdy frakcja fulwowa zostanie całkowicie załadowana na żywicę, należy przepłukać żywicę wodą dejonizowaną, aby usunąć niezaadsorbowaną "hydrofilową frakcję fulwową" (HyFF), przepompowując ją przez górną część kolumny za pomocą pompy perystaltycznej pod niskim ciśnieniem. Stosować natężenie przepływu 35 – 40 ml/min. Ścieki zawierające HyFF należy wyrzucić, chyba że zostaną one wykorzystane do analizy.
- Przemyć kolumnę dejonizowanymH2O, aż absorbancja ścieków z kolumny przy 350 nm będzie równa (np. w granicach 0,015 jednostki absorbancji) dejonizowanejH2Oużytej do przemywania kolumny. Użyj wody dejonizowanej do wyzerowania (tj. ślepej) spektrofotometru.
- Desorpcję HFA przez elucję wsteczną poprzez pompowanie 0,1 M NaOH przez dno kolumny za pomocą pompy perystaltycznej. Stosować natężenie przepływu 35 – 40 ml/min. Wychwycić ścieki z pompy (Na-fulwat w czystym pojemniku o odpowiedniej wielkości (np. 2 l Erlenmeyera).
UWAGA: Większość adsorbcji HFA znajduje się na samej górze łoża żywicy DAX-8. Desorpcja poprzez wprowadzenie 0,1 M NaOH z dna kolumny minimalizuje ilość 0,1 M NaOH potrzebną do pełnej desorpcji FA. - Cały HFA został zdesorbowany, gdy absorbancja ścieków z kolumny jest równa absorbancji 0,1 M NaOH wpływającego przy 350 nm. Użyj 0,1 M NaOH jako ślepej próby spektrofotometrycznej. Dodać ścieki pobrane w celu sprawdzenia absorbancji zdesorbowanego roztworu FA, aby upewnić się, że wszystkie FA zostały wychwycone.
10. Usuwanie popiołu HFA przez protonację
- Przepuścić roztwór Na-fulwatianu, wielokrotnie, przez grawitacyjne zasilanie, przez mocną żywicę kationową H+- wymienną (tabela materiałów) zawartą w kolumnie o średnicy 5 × 50 cm, ze frytą szklaną w celu zatrzymania żywicy, aż przewodność elektryczna ścieków osiągnie <120 μS/cm, mierzoną miernikiem przewodności elektrycznej. Przed każdym przejazdem żywica wymienna H+ wymaga renowacji zgodnie z opisem w rozdziale 11.
- Aby upewnić się, że cały FA zostanie usunięty z żywicy po ostatnim przejściu, należy przepłukać żywicę wodą dejonizowaną, aż absorpcja ścieków przy 350 nm będzie taka sama (np. w granicach 0,015 jednostki absorbancji) jak woda dejonizowana używana do mycia kolumny. Użyj dejonizowanegoH2Ojako ślepej próby spektrofotometrycznej. Dodać płukanie i wszelkie porcje ścieków pobrane w celu sprawdzenia absorbancji do oczyszczonego roztworu FA. Aby pomóc w usunięciu całego FA, żywicę można kilkakrotnie wymieszać (np. za pomocą długiego szklanego lub plastikowego pręta).
- Zagęścić FA do objętości około 15 ± 2 ml za pomocą wyparki obrotowej w temperaturze 55 °C.
- Całkowicie przenieść 15 ml koncentratu FA do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wysuszyć w temperaturze 60±3 °C do stałej suchości w piecu suszącym. Liofilizacja jest alternatywą dla suszenia w piekarniku. Po wysuszeniu przenieść probówkę do eksykatora w celu ostygnięcia.
- Usuń FA z tuby, zeskrobując boki i spód probówki szpatułką i zważyć zebrane FA na wstępnie wytarowanym papierze wagowym. Tym materiałem jest "Ekstrahowany FA" (WEFA).
- Określić stosunek popiołu (ASH rat) wyekstrahowanego FA zgodnie z opisem w kroku 6 dla HA i obliczyć stosunek popiołu przy użyciu wzoru 1.2. Oznaczyć masę wyekstrahowanego FA bez popiołu (WPFA) przy użyciu wzoru 1.3, zastępując WEFA masą WEHA. Na koniec oznaczyć % czystości FA w próbce, stosując wzór 1.4, podstawiając WPFA przez WPHA.
11. Regeneracja żywicy DAX-8
- Zregeneruj żywicę DAX-8, pompując 0,1 M HCl (8,33 ml stężonego HCl/1000 ml końcowej objętości dejonizowanegoH2O) przy natężeniu przepływu 35 – 40 ml/min przez dno kolumny, aż pH ścieku zrówna się z pH dopływu. Użyj pompy perystaltycznej, aby przepompować wszystkie odczynniki przez kolumnę DAX-8 podczas regeneracji.
- Przepłukać kolumnę wodą DI, pompując ją do górnej części kolumny, aż pH ścieków zrówna się z pH dopływu (tj. wody DI).
12. Regeneracja żywicy H+-kationowymiennej
- Żywicę kationowymienną H+ należy zregenerować w procesie wsadowym, przelewając żywicę do dużej zlewki (np. zlewki plastikowej o pojemności 4 l), kilkakrotnie spłukać, przykrywając żywicę DIH2O, mieszając, a następnie wylewając wodę.
- Przykryj żywicę 1 M HCl (83,3 ml stężonego HCl/1000 ml końcowej objętości wody DI). Odstawić na co najmniej 2 godziny, od czasu do czasu mieszając (np. raz na 30 minut).
- Usuń nadmiar kwasu z żywicy, wylewając kwas i przykrywając żywicę wodą DI. Mieszać energicznie mieszadłem przez 15 s, następnie pozwolić żywicy opaść na dno kolby, a następnie odlewać wodę. Powtarzaj proces, aż przewodność elektryczna wody do płukania ≤ wyniesie 0,7 μS/cm.
- Załaduj zregenerowaną żywicę z powrotem do kolumny. Przykryj dejonizowanymH2O, aby upewnić się, że żywica pozostaje mokra między użyciami.
Wyniki
Dane dotyczące wydajności metody znajdują się w tabelach 1 – 5. Precyzja metody ekstrakcji HA i FAH z ciekłych próbek handlowych o bardzo różnych stężeniach HA i FHA podano w tabeli 1.
Względne odchylenia standardowe (RSD) dla HA były niższe niż te dla HFA, ale średni RSD HFA dla trzech próbek cieczy wynosił 6,83%, co wskazuje na wysoki stopień precyzji. Współczynnik Horwitza (HorRat) jest znormalizowanym parametrem wydajności, który wskazuje na przydatność metod analizy pod względem precyzji laboratoryjnej. Tutaj został wykorzystany do precyzji wewnątrzlaboratoryjnej. Wartość < 0,5 może wskazywać na nieujawnione uśrednianie lub wysoki poziom doświadczenia w stosowaniu metody. Wartości > 2,0 wskazują na niejednorodność badanych próbek, konieczność optymalizacji metody lub szerszego szkolenia, działanie poniżej granicy wykrywalności lub niemożliwą do zastosowania metodę. W przypadku analizy próbek cieczy HorRat wynosił tylko > 2 dla jednej z analiz HFA (tabela 1).
Dane dotyczące precyzji ekstrakcji HA i HFA z trzech próbek rudy humusowej są podane w Tabeli 2. Ponownie, z wyjątkiem HFA wydobytego z Rudy 2 i HA z Rudy 3, wszystkie HorRaty były poniżej 2. Świadczy to o wysokim stopniu precyzji tej metody ekstrakcji HA i HFA dla próbek rud humusowych.
Producenci roślinnych biostymulatorów często tworzą produkty, które zawierają HS oprócz innych składników, takich jak wodorosty, nawozy nieorganiczne, węgiel czy melasa. Tabela 3 przedstawia wyniki analizy włączenia tych rodzajów dodatków w odniesieniu do precyzji metody. Żaden z dodatków nie wpłynął znacząco na odzysk kwasu hialuronowego lub HFA (tabela 3).
Tabela 4 i Tabela 5 informują o odzyskach HA i HFA, odpowiednio, z próbek cieczy, które symulowały produkty handlowe o bardzo niskich stężeniach. Wyzdrowienia były doskonałe i wahały się od 88% do 97% dla HA (Tabela 4) oraz od 92% do 104% dla HFA (Tabela 5). Średnie odzyski dla HA i HFA wynosiły odpowiednio 93% i 97%, a % RSD dla obu HS było mniejsze niż 5%. Chociaż precyzja jest doskonała, dane te wskazują na potrzebę przeprowadzenia replik laboratoryjnych. Granica wykrywalności metody (MDL) i granica oznaczalności metody wynosiły 4,62 i 1,47 mg/l dla HA oraz 4,8 i 1,53 mg/l dla HFA.
pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.| Substancje humusowe, % | |||||||
| materiał | L16 | L17 | L2 | ||||
| HFA (Język HFA) | Ha | HFA (Język HFA) | Ha | HFA (Język HFA) | Ha | ||
| Przedstawiciel 1 | Klasa 1,44 | 17 | Godzina 6,59 | 7,76 | 0,36 | 4.46 | |
| Przedstawiciel 2 | Pytanie 1,39 | Godzina 16.03 | Godzina 6,25 | Godzina 7,79 | 0,42 | 4.93 | |
| Przedstawiciel 3 | Klasa 1,34 | godz. 16.44 | 6.02 | Godzina 7,55 | 0,4 | 4.46 | |
| Przedstawiciel 4 | 1,54 | godz. 16.75 | 6.2 | Godzina 7,69 | 0,33 | 4.53 | |
| znaczyć | 1,43 | godz. 16.56 | Lokal 6,27 | 7,7 | 0,38 | 4.6 | |
| SD | 0.09 | 0.42 | 0 | 0.11 | 0.04 | 0.23 | |
| 24 | |||||||
| RSD, % | Lokal mieszkalny 6,29 | Godzina 2,53 | 3.8 | Pytanie 1,39 | Rozdział 10.4 | 4.91 | |
| Hor Szczur(r) | Wynik 1,58 | 0,72 | Wydanie orzeczenia 1,25 | 0,47 | Godzina 2,31 | 1.55 | |
| a Warunki ekstrakcjiwynosiły 1 g na 1 L 0,1 M NaOH. | |||||||
Tabela 1. Precyzja metody ekstrakcji i oznaczania ilościowego HA i HFA z ciekłych próbek handlowych. Warunki ekstrakcji wynosiły 1 g w 1 L 0,1 M NaOH.
pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt.| Substancje humusowe, % | ||||||
| Ruda 1 | Ruda 2 | Ruda 3 | ||||
| materiał | HFA (Język HFA) | Ha | HFA (Język HFA) | Ha | HFA (Język HFA) | Ha |
| Przedstawiciel 1 | Pytanie 1,75 | 67,4 | Godzina 1,31 | Godzina 27.01 | 1,55 | 8,95 |
| Przedstawiciel 2 | Rejon 1,69 | 67,63 | Wydanie orzeczenia 1,25 | Godzina 27.48 | Rozdział 1,41 | 7.2 |
| Przedstawiciel 3 | Pytanie 1,63 | 67,1 | Pytanie 1,27 | O godz. 27.34 | Pytanie 1,47 | Godzina 8,35 |
| Przedstawiciel 4 | 1,77 | 67,59 | 1,55 | Godzina 26,89 | 1,51 | 7,98 |
| znaczyć | 1,71 | Z dnia 67,53 | Godzina 1,35 | Godzina 27,18 | Rejon 1,49 | Klasa 8.12 |
| Sd | 0,06 | 0,94 | 0,14 | 0,28 | 0,06 | 0,73 |
| RSD, % | 3.7 | Pytanie 1,39 | Godzina 10.33 | Pytanie 1,02 | Norma 4.02 | Godzina 9.02 |
| HorRat(r) | 0,99 | 0,66 | Z drugiej strony, 71 | 0,42 | 1,07 | Pytanie 3,09 |
Tabela 2. Precyzja metody ekstrakcji i oznaczania ilościowego HA i HFA z rud humusowych. Warunki ekstrakcji wynosiły 1 g próbki w 1 l 0,1 M NaOH. (Dane zaczerpnięte z Lamar et al., 2014)
pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt.| symulować | Domieszka | HA, % | FA, % | Względny odzysk HA, % | Względny odzysk HFA, % |
| 1 | żaden | 81,61 | 12,86 | ||
| cyfra arabska | żaden | 80,16 | Godzina 12.78 | ||
| 1 | wodorost | 80,21 | godz. 12.85 | ||
| cyfra arabska | wodorost | 80,72 | Godzina 12,79 | 99,5 | Nr 99,6 |
| 1 | nawóz | 80,25 | Godzina 12,98 | ||
| cyfra arabska | nawóz | Nr kat. 79,57 | 123,77 | 98,8 | 101,6 |
| 1 | węgiel | 78,79 | 12,92 | ||
| cyfra arabska | węgiel | 81,27 | Godzina 12,84 | 98,9 | 101,8 |
| 1 | melasa | Nr kat. 79,38 | Godzina 12,99 | ||
| cyfra arabska | melasa | 81.02 | Godzina 12,72 | Nr 99,2 | 100,9 |
| znaczyć | Klasa 80,3 | godz. 12.85 | |||
| Sd | 0,885 | 0,09 | |||
| a Końcowe stężenie FA + HA 2,5 g/L dodane do 0,1 M NaOH. (dane zaczerpnięte z Lamar et al., 2015) | |||||
Tabela 3. Wpływ domieszek na oznaczanie ilościowe HA i HFA z leonardytu Gascoyne. (Dane zaczerpnięte z Lamar et al., 2015)
pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.| HA | |||
| Przykładowy identyfikator | Wydobyty, mg | Wyleczony, mg | Odzyskane, % |
| 1 | Rejon 24,6 | Dnia 23,7 | 96,3 |
| cyfra arabska | Rozdział 22,6 | Pytanie 19,9 | 88,1 |
| 3 | Dnia 25,2 | Norma 23,6 | 93,7 |
| 4 | 22,5 | 21,5 | 95,6 |
| 5 | 23,9 | 21,8 | 91,2 |
| 6 | Pytanie 23,2 | 20,8 | 89,7 |
| 7 | 24 | Pytanie 23,2 | Nr 96,7 |
| znaczyć | Dnia 23,7 | Rozdział 22.1 | 93 Rozdział 93 |
| Sd | Pytanie 1,01 | 1,52 | Klasa 3,43 |
| RSD, % | Godzina 4,35 | 6,88 | Rejon 3,67 |
| (dane zaczerpnięte z Lamar et al., 2014) | |||
Tabela 4. Odzyskiwanie kwasu hialuronowego z kolczastych półfabrykatów. (Dane zaczerpnięte z Lamar et al., 2014)
pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.| FA | |||
| Przykładowy identyfikator | Wydobyty, mg | Wyleczony, mg | Odzyskane, % |
| 1 | Pytanie 19,9 | Rozdział 19 | Nr 95,48 |
| cyfra arabska | Rozdział 23,1 | Norma 22,9 | Nr 99,13 |
| 3 | Pytanie 20,7 | Rozdział 19,4 | Nr 93,72 |
| 4 | 20,5 | Pytanie 19,8 | Nr 96,39 |
| 5 | 20,8 | 21,6 | 103,85 |
| 6 | 21,9 | 20,1 | 91,78 |
| 7 | 22,7 | Rozdział 22,3 | 98,24 |
| znaczyć | O godz. 21.37 | Godzina 20,73 | Nr 96,94 |
| Sd | Pytanie 1,21 | Pytanie 1,53 | 3,95 |
| RSD, % | Klasa 5,64 | Godzina 7,36 | Godzina 4.07 |
| (Dane zaczerpnięte z Lamar et al., 2014) | |||
Tabela 5. Odzysk HFA z kolczastych półfabrykatów. (Dane zaczerpnięte z Lamar et al., 2014)
Dyskusja
Początkowe etapy ekstrakcji i izolacji kwasu hialuronowego w tej metodzie są stosunkowo proste. Ponieważ izolacja HFA obejmuje chromatografię kolumnową, uzyskanie powtarzalnych wyników wiąże się ze ścisłym przestrzeganiem szczegółów każdego kroku i praktyki. W szczególności pierwszorzędne znaczenie ma prawidłowe przygotowanie żywic. Niezwykle ważne jest, aby żywica z polimetakrylanu metylu DAX-8 była odpowiednio przygotowana i zapakowana. Prawidłowe upakowanie żywicy wpływa zarówno na wydajność, jak i jakość HFA. Jeśli istnieje kanalizacja, to ani obróbka wstępna (tj. zakwaszenie), ani adsorpcja HFA nie będą kompletne, a separacja doprowadzi do niedokładnych wyników. Jeżeli przed załadowaniem próbki zaobserwuje się kanały lub przestrzenie w żywicy, kolumnę należy wyjąć i wstrząsnąć w celu ponownego rozprowadzenia kulek żywicy, pozwalając im osiąść bez kanałów, a następnie ponownie zapakować, pompując czysty DIH 2O przez żywicę. Ponadto, jak wspomniano w protokole, utrzymanie objętości cieczy nad żywicą podczas ładowania FF na żywicę pozwoli FF wymieszać się przed wejściem do żywicy i spowoduje bardziej efektywną adsorpcję. W przypadku mocnej żywicy kationowej H+-wymiennej (tabela materiałów) nie można przyspieszyć całkowitej regeneracji. Wymiana Na+/H+ wymaga czasu i dlatego najlepiej przeprowadzić ją w obróbce masowej, aby żywica mogła być mieszana podczas ponownego zakwaszania. Mieszanie żywicy podczas płukania z DI H2O pomaga usunąć nadmiar HCl. Podczas podnoszenia zakwaszonej żywicy w celu usunięcia nadmiaru kwasu, mieszanie żywicy pomaga usunąć HCl. Niezwykle ważne jest usunięcie kwasu do punktu, w którym zostanie osiągnięta przewodność elektryczna ≤ 0,7 μS/cm. Jeśli nie, HCl zostanie przeniesiony wraz z HFA.
Wreszcie, podczas desorpcji HFA z żywicy DAX-8, gdy absorbancja dopływu zrówna się z absorbancją ścieków, dobrą praktyką jest pozostawienie kolumny na kilka godzin, aby sprawdzić, czy zostanie uwolniony dodatkowy HFA. Jeśli tak, będzie to postrzegane jako żółknięcie cieczy nad żywicą. W takim przypadku dodatkowy HFA może zostać usunięty przez ciągłą desorpcję, aż do momentu, gdy absorbancja dopływu/ścieków ponownie zrówna się.
Jedną z wad izolacji HFA jest to, że cały proces jest czasochłonny. Całkowita desorpcja HFA z żywicy DAX-8 i całkowite usunięcie z żywicy wymiennej H+ skutkują znaczną objętością HFA, która musi zostać zmniejszona przez odparowanie obrotowe. Jest to zdecydowanie wąskie gardło w analizie. W celu skrócenia tego czasu zasugerowano desorpcję HFA z żywicy DAX-8 przy użyciu acetonu, a nie 0,1 M NaOH14. Autorzy stwierdzili, że stosując 50% acetonu jako desorbentu zamiast NaOH, uzyskano podobny wynik HFA, a DAX-8 został odpowiednio zregenerowany, a tym samym można było wyeliminować etap wymiany H+. Modyfikacja ta spowodowała znaczne skrócenie czasu analizy w wyniku zmniejszenia wytwarzanej objętości i szybszego obrotowego odparowania acetonu w porównaniu z wodą. Ta modyfikacja zasługuje na dalsze badania.
Metoda ta ogranicza się do analizy materii organicznej, która została poddana procesowi humifikacji, a w przypadku torfu i węgla miękkiego – dalszych procesów torfowania oraz odpowiednio torfowania i uwęglania. Humifikacja to proces, w którym martwy, głównie materiał roślinny, jest rozkładany przez sekwencję drobnoustrojów, które konsumują i modyfikują coraz bardziej oporne substraty. Procesy abiotyczne uczestniczą również w reakcjach rozkładu i resyntezy. Humifikacja ostatecznie prowadzi do produkcji stosunkowo opornych materiałów składających się z niejednorodnych mieszanin tysięcy cząsteczek, które tworzą zakres masy cząsteczkowej oraz zawartości węgla, tlenu i wodoru, które tworzą HS. HS są dalej modyfikowane przez torfowanie i uwęglenie. Dlatego ta metoda nie jest odpowiednia dla materiałów roślinnych, które zostały zmodyfikowane w procesach chemicznych. Na przykład lignosulfonian jest szeroko stosowany jako domieszka HFA. Lignosulfonian jest produktem ubocznym procesu roztwarzania siarczynów. Dlatego materiał ten nie został wyprodukowany w procesie humifikacji. Ponadto istnieje wiele substancji, które wiążą się z żywicą DAX-8. Na przykład żywica DAX-8 została użyta do adsorpcji pestycydów z roztworu15. Oczywiście, pestycydy nie są HS. W związku z tym powiązanie materiału z żywicą DAX-8 nie uzasadnia twierdzenia, że jest to HFA. Warunkiem wstępnym jest zarówno produkcja przez humifikację, jak i wiązanie z żywicą DAX-8.
W miarę jak dowiadujemy się więcej o udziale różnych składników HS w różnych zastosowaniach, korzystne może okazać się dalsze frakcjonowanie HS, a tym samym odpowiednia modyfikacja metody. W obecnej formie metoda ta nie określa ilościowo HYFA. Jednak frakcja ta może również wykazywać aktywność np. w biostymulacji roślin, gdzie w zabiegach rolniczych stosuje się na ogół cały FF, a nie oczyszczony HFA.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Stowarzyszeniu Handlu Produktami Humusowymi (HPTA) za wsparcie w finansowaniu prac, które doprowadziły do standaryzacji metod opisanych w tym artykule, a także Lawrence'owi Mayhew oraz doktorom Danowi Olkowi i Paulowi Bloomowi za wsparcie techniczne podczas prac standaryzacyjnych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Amberlite IR 120 H+-exchange żywica | Sigma-Aldrich | 10322 | H+ form |
| Waga analityczna | Ohaus | PA214 | ze szklaną osłoną przeciwwiatrową |
| Wirówka | Beckman Coulter | Allegra X-14 | minimum 4300 obr./min |
| Probówki wirówkowe | Beckman Coulter | Pasuje do wybranego wirnika | |
| Ceramika Tygle do spalania | Sigma | Z247103 | |
| Kolumna chromatograficzna do DAX-8 | Diba | Omnifit 006EZ-50-25-FF | |
| Kolumna chromatograficzna do IR 120 | Chemglass | CG-1187-21 2 cale na 24 in. | |
| Eksykator | Capitol Scientic | Kimax 21200-250 | Piec do |
| suszenia | Fisher Scientific | Isotemp | Precision± 3? C |
| Miernik przewodności elektrycznej | HM Digital | EC-3 | |
| Kolby Erlenmeyera | Amazon | 1L, 2L | |
| HCl skoncentrowane | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Magnetyczna płytka mieszająca | Barnstead-Thermolyne | 721 | |
| Mieszadła | je uzyskać w wielu punktach sprzedaży | ||
| Mufla Piec | Fisher scientific | Thermolyne Typ 47900 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Azot gazowy | Praxair | UNI1066 | czystości 99,99% |
| Pompa perystaltyczna | Cole Parmer | Masterflex 7518-00 | |
| Rurka perstaltyczna | Cole Parmer | Masterflex Pharmed 06508-17 | |
| pH-metr | Oakton Instrumenty | WD-35618--03 | |
| Parownik obrotowy | Buchi | R-210 / R-215 | |
| Spektrofotometr | Opieka zdrowotna SCiences | Ultrospec II | Podwójna wiązka 200 do 900 nm z dokładnością długości fali ± 1 nm i odtwarzalność ± 0,5 nm. |
Bibliografia
- DiDonato, N., Chen, H., Waggoner, D., Hatcher, P. G. Potential origin and formation for molecular components of humic acids in soils. Geochimica et Cosmochimica Acta. 178, 210-222 (2016).
- Waggoner, D. C., Chen, H., Willoughby, A. S., Hatcher, P. G. Formation of black carbon-like and alicyclic aliphatic compounds by hydroxyl radical initiated degradation of lignin. Organic Geochemistry. 82, 69-76 (2015).
- Baldock, J. A., Skjemstad, J. O. Role of the soil matrix and minerals in protecting natural organic materials against biological attack. Organic Geochemistry. 31 (7-8), 697-710 (2015).
- Kallenbach, C. M., Frey, S. D., Grandy, A. S. Direct evidence for microbial-derived soil organic matter formation and its ecophysiological controls. Nature Communications. 7, 13630(2016).
- Schaeffer, A., Nannipieri, P., Kastner, M., Schmidt, B., Botterweck, J. From humic substances to soil organic matter-microbial contributions. In honour of Konrad Haider and James P. Martin for their outstanding research contributionns to soil science. Journal of Soils Sediments. 15 (9), 1865-1881 (2015).
- Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2e. , Wiley. (1994).
- Weber, J., Chen, Y., Jamroz, E., Miano, T. Preface: humic substances in the environment. Journal of Soils and Sediments. 18, 2665-2667 (2018).
- Schnitzer, M. Organic matter characterization. Methods of soil analysis, part 2: Chemical and microbiological properties. Page, A. L., Miller, R. H., Keeny, D. R. , American Society of Agronomy. Madison, Wisc. 581-594 (1982).
- Mehlich, A. Photometric determination of humic matter in soils: A proposed method. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 15 (12), 1417-1422 (1984).
- Lamar, R. T., Talbot, K. H. Critical comparison of humid acid test methods. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 50 (15-16), 2309-2322 (2009).
- Swift, R. S. Organic matter characterization. Methods of soil analysis, part 3: Chemical methods. Sparks, D. L. , Soil Science Society of America. Madison, WI. 1011-1069 (1996).
- Lamar, R. T., Olk, D. C., Mayhew, L., Bloom, P. R. A new standardized method for quantitation of humic and fulvic acids in humic ores and commercial products. Journal of the AOAC International. 97 (3), 722-731 (2014).
- International Organization of Standards. Fertilizers and soil conditioners-Determination of humic and hydrophobic fulvic acids concentrations in fertilizer materials. International Organization of Standards. , ISO/DIS 19822 (1982).
- Liam, L. E., Serben, T., Cano, M. Gravimetric quantification of hydrophobic filmic acids in lignite material using acetone. Journal of the AOAC International. 102 (6), 1901-1907 (2019).
- House, W. A., Zhmud, B. V., Orr, D. R., Lloyd, G. K., Irons, G. P. Transportation of pesticides by colloids. Final Report. Institute of Freshwater Ecology. National Environment Research Council. , IFE Report No. RL/T11059N1/6 (1998).
Przedruki i uprawnienia
