Artykuł metodologiczny

Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka

DOI:

10.3791/61234

⸱

11 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Experimental Medical Science, Lund University, 2Lund University Diabetes Centre

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest ciągłe monitorowanie dynamiki procesu wszczepiania ludzkich wysp trzustkowych oraz komórek gospodarza i dawcy. Osiąga się to poprzez przeszczepienie ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka (ACE) NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mysz, a następnie wielokrotne obrazowanie 2-fotonowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie komórek beta jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia przeszczepu wysp trzustkowych. Chociaż opracowano i wykorzystano różne platformy obrazowania do rejestrowania biologii komórek beta i ich wykorzystania in vivo, są one ograniczone pod względem umożliwiania rozdzielczości pojedynczej komórki i ciągłych zapisów podłużnych. Ze względu na przezroczystość rogówki, przednia komora oka (ACE) u myszy dobrze nadaje się do badania biologii ludzkich i mysich komórek wysp trzustkowych. Poniżej znajduje się opis, w jaki sposób to podejście można wykorzystać do wykonywania ciągłych podłużnych zapisów szczepienia i rewaskularyzacji pojedynczych przeszczepów ludzkich wysp trzustkowych. Przeszczepy ludzkich wysp trzustkowych są wprowadzane do ACE za pomocą NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-myszy jako biorcy. Pozwala to na badanie ekspansji komórek biorcy w stosunku do komórek dawcy oraz udziału komórek biorcy w promowaniu enkapsulacji i unaczynienia przeszczepu. Ponadto przedstawiono krok po kroku podejście do analizy obrazu i kwantyfikacji objętości wysp trzustkowych lub segmentowanego układu krwionośnego i torebki wysp trzustkowych tworzących komórki biorcze.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cukrzyca opisuje grupę chorób metabolicznych charakteryzujących się podwyższonym poziomem glukozy we krwi, będącym wynikiem niedostatecznej produkcji insuliny spowodowanej utratą lub dysfunkcją komórek beta wysp trzustkowych, której często towarzyszy insulinooporność. Cukrzyca typu 1 (T1D) i typu 2 (T2D) są złożonymi chorobami, w których postępująca dysfunkcja komórek beta powoduje rozwój choroby. T1D jest wywoływana przez autoimmunologiczny atak na komórki beta, podczas gdy T2D jest uważana za napędzaną przez czynniki metaboliczne, aczkolwiek z coraz większą liczbą dowodów na ogólnoustrojowe zapalenie o niskim stopniu złośliwości1. Przeszczepianie ludzkich wysp trzustkowych od dawców, szczególnie u pacjentów z cukrzycą typu 1, daje możliwość zapewnienia fizjologicznej kontroli glikemii. Jednak niedobór dawców tkanek i słabe wszczepienie wysp trzustkowych sprawiły, że przeszczep wysp trzustkowych stał się główną opcją terapeutyczną. Znaczna część funkcjonalnego przeszczepu wysp trzustkowych zostaje utracona w bezpośrednim okresie po przeszczepieniu (24–48 godzin) z powodu niedotlenienia, stanu zapalnego, immunogennego środowiska gospodarza2,3. Aby ocenić skuteczność metod interwencyjnych w celu poprawy przeżywalności wysp trzustkowych, konieczne jest ciągłe monitorowanie takich przeszczepów.

Techniki in vivo do obrazowania i śledzenia losu przeszczepionych ludzkich wysp trzustkowych po przeszczepie nadal pozostają wyzwaniem dla badań nad cukrzycą4,5. Do tej pory nieinwazyjne techniki obrazowania, w tym pozytonowa tomografia emisyjna (PET), rezonans magnetyczny (MRI) lub ultrasonografia (US) wykazują potencjał w zakresie kwantyfikacji i oceny funkcjonalnej przeszczepionych wysp trzustkowych w warunkach eksperymentalnych5. Jednak ze względu na małe rozmiary wysepek pomiary ilościowe dokonywane za pomocą tych metod mają niewystarczającą rozdzielczość. Przednia komora oka (ACE) jako miejsce przeszczepienia do obserwacji jest obiecującym nieinwazyjnym rozwiązaniem do obrazowania, oferującym efektywnie wyższą rozdzielczość przestrzenną i częste monitorowanie przez długi czas6. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do badania biologii mysich wysp trzustkowych (recenzja w Yang et al.7), autoimmunologicznych odpowiedzi immunologicznych8, a także szczepienia ludzkich wysp trzustkowych9,10.

Tutaj metoda przeszczepu ACE jest połączona z podejściem do obrazowania 2-fotonowego w celu zbadania dynamiki procesu wszczepiania ludzkich wysp trzustkowych poprzez ciągłe i powtarzane zapisy na poszczególnych przeszczepach wysp trzustkowych przez okres do 10 miesięcy po przeszczepie. Właściwości obrazowania wielofotonowego zapewniające większą głębię obrazowania i zmniejszone ogólne fotowybielanie i uszkodzenia zdjęć przezwyciężają ograniczenia obrazowania mikroskopii konfokalnej11. Kwantyfikacja obrazowania fluorescencyjnego obejmuje kilka etapów, w tym przygotowanie próbki wysp trzustkowych, przeszczep wysp trzustkowych, akwizycję obrazu, filtrowanie obrazu w celu usunięcia szumu wysp trzustkowych lub tła, segmentację, kwantyfikację i analizę danych. Najtrudniejszym krokiem jest zwykle partycjonowanie lub segmentowanie obrazu na wiele części lub regionów. Może to obejmować oddzielenie sygnału od szumu tła lub grupowanie regionów wokseli na podstawie podobieństw w kolorze lub kształcie w celu wykrycia i oznaczenia wokseli objętości 3D, która reprezentuje na przykład unaczynienie wysp. Po podzieleniu na segmenty statystyki, takie jak rozmiary woluminów obiektów, są zazwyczaj łatwe do wyodrębnienia. Podano metodę kwantyfikacji i ekstrakcji danych obrazowych, takich jak segmentacja i wizualizacja danych. Szczególną uwagę zwrócono na usunięcie autofluorescencji w ludzkich wyspach trzustkowych oraz rozróżnienie między unaczynieniem wysp trzustkowych a torebką wysp trzustkowych tworzącą komórki biorcze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regionalna Komisja Etyki w Lund, Szwecja, zatwierdziła badanie zgodnie z Ustawą o Ocenie Etycznej Badań z Udziałem Ludzi. Eksperymenty na zwierzętach były przeprowadzane w ścisłej zgodności ze szwedzką etyką doświadczeń na zwierzętach i zatwierdzone przez komisje etyczne w Malmö i Lund. 6 do 8-tygodniowego NOD z niedoborem odporności. (Cg)-Gt(ROSA)26SorTM4-RAG2-/- (NOD.ROSA-pomidor. Myszy biorcy Rag2-/-) zostały wykorzystane jako biorcy do przeszczepu ludzkich wysepek10.

1. Przygotowanie wysp trzustkowych do przeszczepu

  1. Hodowla ludzkich wysp trzustkowych w CMRL 1066 uzupełniona 10 mM HEPES, 2 mM L-glutaminy, 50 μg/ml gentamycyny, 0,25 μg/ml fungizonu, 20 μg/ml cyproksykacyny, 10 mM nikotynamidu (NIC) i 10% inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i nawilżonym powietrzem do czasu przeszczepu, jak opisano wcześniej12.
    UWAGA: Wysepki powinny być wolne od tkanki zewnątrzwydzielniczej i nie stykać się ze sobą w hodowli. Tkanki zewnątrzwydzielnicze wydają się półprzezroczyste.
  2. W dniu przeszczepienia przenieś pożywkę hodowlaną zawierającą wyspy trzustkowe na nową szalkę Petriego za pomocą zespołu rurki aspiratora połączonej z ciągniętą szklaną kapilarną.
    UWAGA: Alternatywnie można użyć pipety o pojemności 200 μl. Kolorowanie tylnej części szalki Petriego sprawia, że wysepki są łatwiejsze do rozróżnienia pod mikroskopem stereoskopowym.
  3. Używając mikroskopu stereoskopowego, wybierz ~20-40 wysepek na przeszczep i przenieś do probówki o pojemności 1,5 ml. Napełnij probówkę do góry pożywką hodowlaną z inkubatora.
  4. Uszczelnij probówki folią parafinową i przechowuj na lodzie do czasu przeszczepu. Przygotuj odpowiednią ilość do liczby wykonywanych przeszczepów.
  5. Alternatywnie, upewnij się, że na sali operacyjnej dostępny jest inkubator CO2 do utrzymywania wysp trzustkowych w kulturze i pobieranie ich bezpośrednio przed każdym przeszczepem.

2. Przygotowanie sprzętu do transplantacji i stołu operacyjnego

UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być sterylizowane w autoklawie, a stół operacyjny i narzędzia dezynfekowane 70% alkoholem.

  1. Podłącz stereotaktyczny uchwyt głowy do znieczulenia za pomocą maski na nos i włącz poduszkę grzewczą.
  2. Podłącz gazoszczelną strzykawkę Hamilton do rurki polietylenowej i kaniuli z oczkiem.
    UWAGA: Zaleca się wypełnienie wszystkich części PBS przed montażem. Sprawdź, czy nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza i usuń, jeśli są obecne.
  3. Przymocuj strzykawkę Hamiltona mocno do stołu (Rysunek 1a) lub ruchomej podstawy (Rysunek 1e) i przymocuj rurkę do mikroskopu stereoskopowego, z kaniulą zwisającą w dół (tj. pozycja oczekująca).
    UWAGA: Użyj taśmy chirurgicznej, ponieważ można ją łatwo zdjąć i ponownie przymocować.
  4. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml połączoną z igłą 30 g wypełnioną roztworem buprenorfiny o stężeniu 0,1 mg/kg.
  5. Przygotować strzykawkę ze sterylnym PBS. Alternatywnie użyj pipety.
  6. Odłóż na bok czystą klatkę budzenia z lampą grzewczą.

3. Znieczulenie i umiejscowienie myszy biorców do operacji

UWAGA: Wszystkie zwierzęta były hodowane i utrzymywane w środowisku wolnym od patogenów w obiektach dla zwierząt na Uniwersytecie w Lund.

  1. Znieczulij mysz w komorze wypełnionej 40% O, 2/60%, N, 2/3% izofluranem i przenieś znieczuloną mysz na platformę uchwytu głowy na ciepłej poduszce grzewczej (Rysunek 1a). Sprawdź, czy nie ma odruchów pedałowania.
    UWAGA: Znieczulenie izofluranem jest preferowaną metodą znieczulenia w celu szybkiego powrotu do zdrowia po operacji. Pomieszczenie mikroskopu musi być odpowiednio wentylowane, aby można było stosować izofluran.
  2. Umieść pysk myszy w masce anestezjologicznej podłączonej do aparatu do znieczulenia izofluranem 40% O2/60% N2/0,9%–1,5%. Użyj kciuka i palca, aby lekko podnieść głowę do góry i zapnij ją za pomocą metalowych elementów po bokach. Upewnij się, że słuchawki mocują głowę bezpośrednio pod uszami. Wstrzyknąć 0,1 mg/kg roztworu buprenorfiny podskórnie w grzbiet myszy.
    UWAGA: Buprenorfina jest stosowana jako środek przeciwbólowy.
  3. Przechyl głowę tak, aby oko, które ma być operowane, było skierowane do góry i znajdowało się blisko badacza.
  4. Delikatnie cofnij powieki oka, które ma zostać przeszczepione, za pomocą kleszczy, wysuń oko i luźno przymocuj pęsetą. Upewnij się, że końcówki pęsety są pokryte rurką polietylenową przymocowaną do platformy uchwytu głowicy (Rysunek 1a, wstaw).
  5. Zawsze utrzymuj oba oczy mokre, nakładając kroplę sterylnego PBS na oko.
  6. Przenieś ludzkie wyspy trzustkowe z zamkniętej probówki o pojemności 1,5 ml (sekcja 1) na szalkę Petriego ze sterylnym PBS i upewnij się, że wysepki są blisko siebie, aby zminimalizować ilość przenoszonego podłoża do hodowli komórkowych (Rysunek 1c).
  7. Zbierz ~20–30 wysepek w kaniuli oka połączonej rurką polietylenową ze strzykawką Hamiltona.
    UWAGA: Weź jak najmniej płynu z wysepkami.
  8. Zawieś rurkę do góry nogami i przymocuj do mikroskopu stereoskopowego (Rysunek 1d). Ostrożnie przyklej rurkę, aby wysepki opadły na koniec rurki w kierunku kaniuli.

4. Procedura transplantacji

UWAGA: Ta metoda została już wcześniej opisana dla przeszczepu mysich wysp trzustkowych6. Nieco zmodyfikowana procedura jest przedstawiona tutaj.

  1. Ściśnij opuszki na tylnych nogach, aby upewnić się, że mysz śpi.
  2. Zaciśnij kleszcze krępujące oko, nie zakłócając przepływu krwi i nałóż kroplę sterylnego PBS na oko.
  3. Używając igły 25 G jako skalpela, skosować do góry, ostrożnie wbić tylko połowę końcówki w rogówce i wykonać pojedyncze boczne nacięcie. Zrób otwór pod kątem do góry; otwór łatwiej się uszczelni po przeszczepie (Rysunek 1f).
  4. Ostrożnie podnieś rogówkę z kaniulą wstępnie załadowaną wyspami trzustkowymi i powoli przyłóż wysepki do oka. Unikaj wkładania kaniuli do przedniej komory, aby zapobiec uszkodzeniu tęczówki, ale raczej ostrożnie dociśnij do otworu rogówki (Rysunek 1g). Powoli wycofaj kaniulę z ACE.
    UWAGA: Należy dążyć do uzyskania objętości wstrzyknięcia wynoszącej 3–8 μl. Jeśli objętość jest zbyt duża, narazi oko na niepotrzebnie wysokie ciśnienie wewnątrzgałkowe i może spowodować refluks ostrzykniętych wysp trzustkowych z komory przedniej.
  5. W przypadku trudności z wstawieniem wysepek z powodu zwiększonego ciśnienia w komorze oka, należy powiększyć miejsce nacięcia, wzmacniając boczne miejsce nacięcia i ponownie założyć wyspy trzustkowe.
    UWAGA: Czasami wprowadzone pęcherzyki powietrza mogą być używane jako uchwyty na przestrzeń.
  6. Nałóż żel pod oczy na oko, poluzuj kleszczyki krępujące oczy i pozostaw mysz na izofluranie w tej samej pozycji na 8-10 minut, aby wyspy trzustkowe się zastygły.
  7. Zdejmij kleszcze przytrzymujące powiekę i ustaw powiekę z powrotem w normalnej pozycji.
  8. Wyjmij mysz z uchwytu na głowę i przenieś ją do klatki budzenia.
  9. Gdy mysz jest obudzona i porusza się, przenieś ją z powrotem do oryginalnej klatki i trzymaj w pomieszczeniu dla zwierząt do czasu skanowania (zalecane jest co najmniej 5 dni).

5. Obrazowanie wszczepionych ludzkich wysp trzustkowych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej

UWAGA: Zaleca się wykonanie zdjęć przeglądowych oka za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego (Rysunek 2a–c) 4-5 dni po przeszczepie przed obrazowaniem 2-fotonowym w celu zlokalizowania interesujących wysp trzustkowych. Unikaj zbyt ścisłego krępowania oka tak wcześnie po przeszczepie. Stosuj obrazowanie 2-fotonowe 6–7 dni po przeszczepie.

  1. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu (patrz Spis materiałów). W menu "Laser" aktywuj laser Mai Tai (Power "ON"), a w menu "Light Path" ustaw długość fali na 900 nm i zastosuj minimalną moc lasera transmisyjnego, zaczynając od 5%–10% mocy lasera (użyj suwaków).
    UWAGA: Podczas skanowania dostosuj moc lasera zgodnie z potrzebami.
  2. Ustaw kanały zielony, pomarańczowy i czerwony. Zbieraj światło emisyjne jednocześnie na trzy detektory nieuszkodzone (NDD) za pomocą zwierciadła dichronicznego (LBF 760) i informacji o filtrze emisyjnym w następujący sposób: Red/Angiosense 680, 690–730 nm; Zielony/autofluorescencja, 500–550 nm; i Pomarańczowy/Pomidorowy, 565–610nm (Rysunek 2d).
  3. Umieść stolik uchwytu głowicy na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu i podłącz maskę gazową do rurki aparatu anestezjologicznego i rurki podłączonej do systemu wentylacji. Włącz poduszkę grzewczą.
  4. Znieczulić mysz biorcy, przenieść ją na platformę uchwytu głowy, przytrzymać oko do obrazowania i podać roztwór buprenorfiny zgodnie z powyższym opisem (kroki 3.1–3.5).
  5. W razie potrzeby dostosuj opary izofluranu. Częstość oddechów wynosząca ~55–65 oddechów na minutę (bpm) wskazuje na optymalne znieczulenie. Jeśli znieczulenie jest zbyt głębokie, szybkość wyniesie <50 uderzeń na minutę przy ciężkim oddechu lub sapaniu; Jeśli jest zbyt lekki, tempo wyniesie >70 uderzeń na minutę przy powierzchownym oddychaniu. Uważnie monitoruj myszy podczas znieczulenia poprzez oględziny co 15 minut.
    UWAGA: Znieczulenie różni się w zależności od myszy, szczepu myszy i w miarę postępu czasu pod narkozą13.
  6. Nałóż wystarczającą ilość żelu do oczu na oko w postaci płynu zanurzającego między rogówką a soczewką, pozwalając mu powoli się gromadzić (Rysunek 2f, wstaw). Unikaj pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Oświetlenie boczne za pomocą elastycznego metalowego węża lamp jest zalecane w celu regulacji ostrości i zlokalizowania przeszczepów wysp trzustkowych.
  7. Aby uwidocznić naczynia krwionośne, należy podać dożylnie 100 μl środka do obrazowania (np. Angiosense 680) do żyły ogonowej za pomocą jednorazowej strzykawki z insuliną 30 G.
  8. W "Trybie akwizycji" ustaw rozmiar klatki na 512 x 512 i prędkość skanowania.
    UWAGA: Wolniejsze skanowanie (tj. wydłużenie czasu przebywania) poprawi stosunek sygnału do szumu.
  9. W menu "Kanały" dostosuj wzmocnienie główne dla każdego PMT w woltach, aby wzmocnić sygnał, aż obraz pojawi się na ekranie w trybie skanowania na żywo. Im wyższa ta wartość, tym bardziej czuły staje się detektor na sygnały i szumy.
    UWAGA: Najlepiej utrzymywać wartości w zakresie 500–800 V.
  10. W menu "Z-stack" zdefiniuj początek i koniec z-stacka, ręcznie przesuwając fokus na górę przeszczepu wysepki. Zapisz pozycję, wybierając opcję "Ustaw najpierw". Przejdź do ostatniej dolnej płaszczyzny, która może być skupiona w przeszczepie wysepki i zapisz pozycję, wybierając opcję "Ustaw ostatnią". Użyj kroku Z o rozmiarze 2 μm.
  11. Zbierz ostateczny stos obrazów, klikając zakładkę "Rozpocznij eksperyment" i zapisz jako 8-bitowy plik CZI (tj. w formacie Carl Zeiss).

6. Obrazowanie wszczepionych ludzkich wysp trzustkowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Całkowita objętość, morfologia i plastyczność przeszczepionych wysp trzustkowych mogą być ocenione poprzez monitorowanie sygnału rozpraszania in vivo w oddzielnym skanowaniu (tj. oddzielnej ścieżce) poprzez detekcję laserowego światła rozpraszającego wstecznie10.

  1. Wyjmij rozdzielacz wiązki głównej (tj. filtr LBF) i w oknie dialogowym "Ścieżka światła" ustaw osobną ścieżkę do obrazowania konfokalnego. Wybierz laser argonowy o długości fali 633 nm i detekcji na tej samej długości fali co światło lasera. Stosy Z są rejestrowane z krokiem o wielkości 2–3 μm dla sygnału świetlnego rozpraszania wstecznego.
  2. Dostosuj ponownie ustawienia z-stack, aby upewnić się, że nagrywasz całą wysepkę (patrz krok 5.10).
  3. Pobierz stos obrazów i zapisz jako 8-bitowy plik CZI.

7. Analiza obrazu

UWAGA: Do tego kroku użyto komercyjnego oprogramowania (zobacz Tabelę materiałów).

  1. Usuwanie autofluorescencji wysepek (Rysunek 3b)
    1. W zakładce "Przetwarzanie obrazu" wybierz "Arytmetyka kanałów" i wpisz "ch1-ch2". Spowoduje to utworzenie nowego kanału 4 (kanał 4); zmień nazwę na "Vasculature".
      UWAGA: Kanał zielony/autofluorescencyjny jest odejmowany od kanału czerwonego/angiosense.
    2. Powtórz poprzedni krok i wpisz "ch3-ch2", aby utworzyć nowy kanał (kanał 5); zmień nazwę na "Tomato (all)".
      UWAGA: Kanał zielony/autofluorescencyjny jest odejmowany od kanału pomarańczowego/pomidorowego.
  2. Definiowanie maski wysepki za pomocą ręcznego rysowania (Rysunek 3c)
    1. Utwórz nową powierzchnię (niebieski symbol) i w kreatorze wybierz "Edytuj ręcznie". Przytrzymaj wskaźnik w trybie "Wybierz" i w widoku 3D odznacz "Głośność" (w obszarze Scena), aby wyświetlić sekcje.
    2. Aby ułatwić rozróżnianie granic wysepek, aktywuj wszystkie kanały, w tym ch 1–ch 3.
      UWAGA: Kanał Pomarańczowy/Pomidorowy jest przydatny do definiowania granic wysepek za pomocą sygnału kapsułki Tomato. Alternatywnie, zwiększ intensywność kanałów, aby wykorzystać wielokanałową autofluorescencję wysepek i sygnał tła detektora jako wskazówki.
    3. W zakładce "Rysunek" wybierz "Kontur" i kliknij "Rysuj", aby rozpocząć rysowanie konturów wokół granicy wysepki, zaczynając od pozycji przekroju 1.
    4. Przejście do nowej pozycji przekroju i powtórzenie rysowania konturów. Zakończ ostatnim przekrojem na górze wysepki i zakończ, klikając zakładkę "Utwórz powierzchnię". Zwykle wystarczy narysować kontury co 10plasterek.
  3. Segmentacja fluorescencji "Unaczynienie wysp trzustkowych" i "Pomidor wysp trzustkowych" za pomocą maski wysp trzustkowych (Rysunek 3d).
    1. Wybieramy zdefiniowany wcześniej obiekt "Maska wysepki", przechodzimy do zakładki edycji (symbol ołówka), a następnie klikamy zakładkę "Maskuj wszystko", co otwiera nowe okno.
    2. Wybierz poprzednio nazwany kanał "Vasculature" (rozdział 4) z menu rozwijanego wyboru kanału i aktywuj opcje "Zduplikuj kanał przed nałożeniem maski", "Stała wewnątrz/na zewnątrz" i ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na "0,000", co spowoduje utworzenie nowego kanału; zmień nazwę na "Unaczynienie wysp trzustkowych" (rozdział 6).
    3. Powtórz kroki 7.3.1 i 7.3.2 i wybierz poprzednio utworzony kanał "Pomidor (wszystkie)" (rozdział 5) z rozwijanego menu wyboru kanału, aby utworzyć nowy kanał; zmień nazwę na "Pomidor z wysepki" (rozdział 7).
  4. Renderowanie powierzchni naczyń krwionośnych wysp (Rysunek 3e)
    1. Utwórz nową powierzchnię w menu "Scena" i w kreatorze wybierz "Automatyczne tworzenie".
    2. Ustaw kanał źródłowy na wcześniej utworzone "Unaczynienie wysp trzustkowych" (kanał 6) i wybierz odejmowanie tła. W razie potrzeby można dostosować automatyczne szacowanie progu. Porównaj z odpowiadającym kanałem fluorescencji (np. wtapiając/usuwając nowo utworzoną zakładkę powierzchni). Postępuj w kreatorze.
    3. Opcjonalnie użyj filtrów. Na przykład wybierz "Objętość" i dostosuj filtr (żółty) w oknie, który może usunąć wybrane obiekty powierzchniowe. Zakończ pracę kreatora i nazwij nowy obiekt powierzchni "Naczynia wysp trzustkowych".
  5. Segmentacja sygnału fluorescencyjnego "Unaczynienie pomidora z wyspami trzustkowymi" (Rysunek 3f)
    1. W utworzonym wcześniej obiekcie powierzchni "Unaczynienie wysp trzustkowych" przejdź do zakładki edycji i kliknij zakładkę "Zamaskuj wszystko", co spowoduje otwarcie nowego okna.
    2. Wybierz poprzednio nazwany kanał "Islet tomato" (ch 7) z menu rozwijanego wyboru kanału i ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na "10.000", co spowoduje utworzenie nowego kanału; zmień nazwę na "Islet tomato vasculature" (ch 8).
  6. Segmentacja sygnału fluorescencyjnego "Kapsułka pomidorowa" (Rysunek 3g)
    1. Wybierz "Arytmetyka kanałów" w zakładce "Przetwarzanie obrazu" i wpisz "ch7-ch8", tworząc nowy kanał; zmień nazwę na "Kapsułka pomidorowa" (kanał 9).
      UWAGA: Sygnał fluorescencyjny "Unaczynienie pomidora z wyspami trzustkowymi" jest odejmowany od całkowitego sygnału fluorescencji "Pomidor z wysp trzustkowych".
  7. Renderowanie powierzchni "Unaczynienie pomidora wysepki" i "Kapsułka pomidorowa" (Rysunek 3h)
    1. Wykonaj czynności opisane w kroku 7.4 i w kreatorze wybierz kanały źródłowe "Islet toma, toma, vasculature" (8 o.p.m.) lub "Tomato capsule" (9 o.p.), aby odpowiednio utworzyć nowe obiekty powierzchniowe.
  8. Renderowanie powierzchni całkowitej powierzchni wysepek (Rysunek 3i)
    1. Otwórz plik rozproszenia wstecznego wysepki i utwórz nową powierzchnię.
    2. W kreatorze wybierz "Automatyczne tworzenie" i zdefiniuj "Obszar zainteresowania".
      UWAGA: "Obszar zainteresowania" służy do oddzielania sygnałów wielu wysepek i określania głębokości wysepki, która ma być analizowana (np. górne 75 μm).
    3. W polu "Intensywność bezwzględna" w razie potrzeby dostosuj próg. Obiekt powierzchni można kliknąć lub wyłączyć, aby sprawdzić go z odpowiednią intensywnością kanału. Zamknij kreatora.
  9. Kwantyfikacja (Rysunek 3j)
    1. Wybierz utworzony obiekt powierzchni w menu "Scena" i przejdź do zakładki "Statystyki".
    2. Aby pobrać szczegółowe dane o objętości w wybranym obiekcie powierzchni, wybierz zakładkę "Szczegółowe" i wybierz "Określone wartości" i "Objętość" z menu rozwijanego. Aby pobrać całkowitą wartość objętości wybranego obiektu powierzchniowego, przejdź do zakładki "Szczegółowe" i wybierz "Wartości średnie".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieoznaczone ludzkie wysepki zostały przeszczepione do ACE 8-tygodniowej samicy NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26SorTM4-RAG2-/-(NOD.ROSA-pomidor. Myszy biorcze Rag2−/−). Aby zapobiec odrzuceniu tkanek ludzkich, jako biorców wybrano myszy z nokautem Rag2 z niedoborem odporności. U tych transgenicznych myszy wszystkie komórki i tkanki wykazywały ekspresję białka fluorescencji pomidora (mT) ukierunkowanego na błonę, które umożliwia wyraźną identyfikację biorcy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono metodę badania procesu przeszczepiania ludzkich komórek wysp trzustkowych poprzez obserwację udziału tkanki biorcy i dawcy. Po minimalnie inwazyjnej operacji polegającej na wszczepieniu ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy z niedoborem odporności, mysz szybko wraca do zdrowia w ciągu kilku minut po operacji. Zabieg wykonywany jest na jednym oku. Ogólnie rzecz biorąc, od 5-7 dni po implantacji rogówka jest wystarczająco zagojona, aby można było wykonać obrazowanie przyżyciowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych, Obszar Badań Strategicznych Exodiab, Dnr 2009-1039, Szwedzką Fundację Badań Strategicznych Dnr IRC15-0067 do LUDC-IRC, Królewskie Towarzystwo Fizjograficzne w Lund, Diabetesförbundet i Barndiabetesförbundet.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aparat anestezjologiczny, np. Aparat anestezjologiczny U-400Agnthos8323001służy do znieczulenia izofluranem podczas operacji i
komory obrazowo-indukcyjnej 1,4 LAgnthos8329002podłączyć za pomocą rurki do
przełącznika trasy gazuAgnthos8433005podłączyć za pomocą rurki do U-400
AngioSense 680 EXPercin ElmerNEV10054EXŚrodek obrazujący do wstrzykiwań, stosowany do obrazowania naczyń krwionośnych w przeszczepach wysp trzustkowych u ludzi
Zespoły probówek aspiratoraSigmaA5177-5EAłączą się z ciągnionymi pipetami kapilarnymi do ręcznego pobierania wysepek
Buprenorfina (Temgesic) 0,3 mg / mlSchering-Plough Europé64022płyn do uśmierzania bólu
Pipety kapilarneVWR321242Cużywane razem z zespołami probówek aspiratora
Dextran-Texas Red (TR), 70kDaInvitrogenD1830środek do obrazowania do wstrzykiwań
Kaniula do oczu, koniec, 25 GBVI Visitec/BDBD585107wykonane na zamówienie z liniowca Tapered Hydrode [Blumenthal], wymiary: 0,5 x 22 mm (25 G x 7/8 cala) (45?), końcówka zwężająca się do 30 G ( 0,3 mm)
Żel do oczuNovartisViscotears, zawiera strzykawkę Carbomer 2 mg / g
Hamilton 0,5 ml, Model 1750 TPLTHamilton81242Gazoszczelna strzykawka typu tłokowego do wstrzykiwania wysp trzustkowych
Uchwyt na głowę
-Adapter do trzymania głowicyNarishigeSG-4N-Smontowany na metalowej
płycie-masce przeciwgazowejNarishigeGM-4-S-UST-2
Solidny przegub uniwersalnyNarishigeUST-2montowany na metalowej
płycie-wykonana na zamówienie metalowa płyta do montażu
głowy-Dumont #5, prostyAgnthos0207-5TI-PS lub 0208-5-PSprzymocowany do UST-2 (wykonane na zamówienie)
Poduszka grzewcza, wykonanaprzyklejona do platformy stereotaktycznej
Pożywka do hodowli ludzkich wysp trzustkowych
-CMRL 1066ICN Biomedicalspożywka do hodowli komórkowych wysp trzustkowych u
ludzi-HEPESGIBCO
GIBCO
GIBCO BRL-Fungizone
GIBCO BRL
-CiproxfloxacinBayer healthcare
Sigma
Oprogramowanie do analizy obrazuBitplaneImaris 9
Oprogramowanie do pozyskiwania obrazówZeissZEN 2010
Lampa na podczerwieńVWR1010364937służy do utrzymywania zwierząt w cieple w klatce budzenia
Isoflurane IsofloAbott Skandynawia/Apotekpłyn, do znieczulenia
Igła 25 G (0,5 x 16mm), pomarańczowaBD10442204używana jako skalpel
szalki Petriego, 90mmVWR391-0440
2-Photon/mikroskop konfokalny
-LSM7 MP Mikroskop pionowyZeiss-Ti
:Laser szafirowy TsunamiSpectra-Physics, Mai Tai-długodystansowy
obiektyw zanurzeniowy do zanurzania w wodzie 20x/NA1.0
/40m (Angiosense 680)Chroma
/65m-2p (TR)Chroma
/50 (GFP)
/75 (pomidor)Chroma-światło
drogowe rozdzielacz T680lpxxrChromaT680lpxxrLustro dichroiczne do transmisji 690 nm i powyżej oraz odbijania od 440 do 650 nm Rozmiar 25,5 x 36 x 1 mm
Rurka polietylenowa (0,38 mm ID, 1,09 mm OD)Smiths Medical Danmark800/100/120do połączenia ze strzykawką Hamilton i kaniulą oka
Mikroskop stereoskopowyNikonModel SMZ645, do wybierania wysepek
Mikroskop stereoskopowy (Flourescence)do obrazowania przeszczepów wysp
MultizoomNikonszerokokątny i długodystansowy-AZ
Plan Apo 1xNikon-AZ
Plan Apo 4x
Epifluorescencja z lampą C-LHGFI HGNikon-HG
Instrukcja obsługi Nowy IntensilightNikon
- Blok filtra Epi-FL TEXAS REDNIKONzawiera EX540-580, DM595 i BA600-660-Blok
filtra Epi-FL G-2ANikon(EX510-560, DM575 i BA590)
-Blok filtra Epi-FL B-2ANikon(EX450-490, DM505 i BA520)
-Kolorowy aparat cyfrowy DS-Fi1 (5MP)Strzykawka Nikon
1-ml, OmnitixBraun9161406Vdo wstrzykiwań buprenorfiny, stosowany z igłą 27 G
Taśma chirurgiczna3M
U-400 uchwytu na zamówienie BRL-L-glutamina BRL-Gentamycyna AG-Nikotynamid Zeiss-ET710 288003-ET645 NC528423-ET525Chroma-ET610 trzustkowych-AZ100 Nikon-AZ-FL

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
  2. Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035(2014).
  3. Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
  4. Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
  5. Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382(2017).
  6. Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  7. Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
  8. Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
  9. Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
  10. Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
  11. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).
  12. Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
  13. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).
  14. Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
  15. Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
  16. Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1(2015).
  17. Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
  18. Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
  19. Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
  20. Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
  21. Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
  22. Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
  23. Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
  24. Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
  25. Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeszczepianie ludzkich wysepek trzustkowychmikroskopia dwufotonowakwantyfikacja analizy obrazusegmentacja naczy krwiono nych wysepekodejmowanie autofluorescencjiwk ad kom rek biorcypod u ne monitorowanie przeszczepuywotno kom rek beta

Powiązane artykuły