Artykuł metodologiczny

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

DOI:

10.3791/61236

⸱

6 maja 2020

 ,  , 
1Department of Biology, Emmanuel College, 2Department of Chemistry and Physics, Emmanuel College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano wysoce równoległą metodę pomiaru specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół ten demonstruje technikę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej NdeI. Metodę można łatwo zmodyfikować w celu zbadania dowolnego procesu, który prowadzi do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specyficzne dla miejsca rozszczepienie DNA (SSDC) jest kluczowym krokiem w wielu procesach komórkowych i jest kluczowe dla edycji genów. W pracy opisano test kinetyczny zdolny do pomiaru SSDC w wielu pojedynczych cząsteczkach DNA jednocześnie. DNA substratu na uwięzi koralików, z których każdy zawiera pojedynczą kopię sekwencji docelowej, przygotowuje się w kanale przepływu mikroprzepływowego. Magnes zewnętrzny wywiera słabą siłę na kulki paramagnetyczne. Integralność do 1000 pojedynczych DNA może być monitorowana poprzez wizualizację mikrogranulek w obrazowaniu w ciemnym polu przy użyciu obiektywu o szerokim polu widzenia i małym powiększeniu. Wstrzyknięcie endonukleazy restrykcyjnej, NdeI, inicjuje reakcję rozszczepienia. Mikroskopia wideo służy do rejestrowania dokładnego momentu rozszczepienia DNA poprzez obserwację ramy, w której powiązany koralik porusza się w górę i poza płaszczyznę ogniskową obiektywu. Liczenie koralików klatka po klatce określa ilościowo reakcję, a dopasowanie wykładnicze określa szybkość reakcji. Metoda ta pozwala na zebranie ilościowych i statystycznie istotnych danych na temat reakcji SSDC pojedynczej cząsteczki w jednym eksperymencie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specyficzne dla miejsca rozszczepienie DNA (SSDC) jest kluczowym krokiem w wielu transakcjach genomowych. Na przykład systemy bacterial restriction-modification (RM)1 i CRISPR2 chronią komórki przed atakiem fagów i plazmidów, rozpoznając i rozszczepiając obce DNA w określonych sekwencjach. W typie II RM endonukleazy restrykcyjne (RE) rozpoznają krótkie sekwencje 4–8 par zasad (bp) poprzez interakcje białko-kwas nukleinowy3. Endonukleazy związane z CRISPR, takie jak Cas9, wiążą się z miejscami poprzez hybrydyzację miejsca docelowego z crRNA związanymi z endonukleazami4. Tworzenie specyficznych dla miejsca dwuniciowych pęknięć (DSB) jest również pierwszym krokiem w wielu zdarzeniach rekombinacji DNA5. Na przykład różnorodność regionów wiążących antygen utworzonych przez rekombinację V(D)J wymaga rozpoznania i rozszczepienia określonych miejsc docelowych6. Wiadomo, że niektóre transpozony celują również w określone sekwencje DNA7. Nic dziwnego, że wiele specyficznych dla miejsca nukleaz biorących udział w tych procesach, takich jak Cas9, jest kluczowym składnikiem technologii edycji genów8. Ponadto nowe endonukleazy specyficzne dla miejsca (tj. nukleazy palca cynkowego9 i TALENS10) zostały również zmodyfikowane do edycji genomów.

Wiele metod zostało wykorzystanych do pomiaru kinetyki specyficznego dla miejsca rozszczepienia kwasów nukleinowych. Należą do nich: analiza żelowa, fluorescence11,12 oraz metody oparte na sekwencjonowaniu13. Duży postęp osiągnięto dzięki wiązaniu mikrogranulek, które umożliwia wykrywanie DSB w pojedynczych cząsteczkach DNA przez ruch kulki po oddzieleniu nici. W tych metodach stosuje się różne rodzaje sił, aby zapewnić separację pasm i ruch stopki po rozszczepieniu. W jednym przypadku pułapki optyczne zostały użyte do pomiaru rozszczepienia DNA za pomocą EcoRV14. W tych eksperymentach celem badania jest wyszukiwanie docelowe, a warunki są zoptymalizowane tak, aby wiązanie specyficzne dla witryny było krokiem ograniczającym szybkość. Jedną z wad pułapek optycznych jest to, że w danym momencie można obserwować tylko jedno DNA. Ponadto należy przyłożyć okresową dużą siłę ciągnącą, aby sprawdzić separację pasm.

Inna technika wykorzystuje kombinację przepływu i słabych sił magnetycznych do ciągnięcia koralika w sposób ciągły15. W ten sposób mierzy się dyfuzyjną ograniczoną rozszczepialność przez NdeI. Zastosowana metoda pozwala na jednoczesny pomiar kilkuset DNA jednocześnie, co pozwala na uzyskanie istotności statystycznej w jednym eksperymencie. Przeprowadzono również eksperymenty oparte na pęsetach magnetycznych. W jednym z takich badań badano integrazę retrowirusową poprzez włączenie DSB do oligonukleotydu insercji16. Udana integracja doprowadziła do włączenia DSB do DNA na uwięzi i utraty dołączonego koralika. W podobnym badaniu endonukleazy restrykcyjnej typu III EcoPI zależnej od ATP, w jednym eksperymencie zaobserwowano dziesiątki DNA17. Pęseta magnetyczna ma tę zaletę, że napięcie, a także pętla DNA, mogą być kontrolowane i monitorowane podczas reakcji.

Prezentowana tutaj jest wysoce równoległa metoda pomiaru kinetyki SSDC, która wykorzystuje ostatnie ulepszenia w wiązaniu DNA na dużą skalę. Ta metoda jest ulepszeniem i rozszerzeniem poprzednich metod używanych do pomiaru replikacji DNA18, długości konturu DNA19 oraz rozszczepienia przez REs15. W tej technice liniowe DNA zawierające pojedynczą kopię sekwencji rozpoznawania są przygotowywane z biotyną na jednym końcu i digoksygeniną na drugim. Biotyna wiąże streptawidynę, która jest kowalencyjnie przyłączona do paramagnetycznej mikrokulki. Kompleksy DNA-kulki są wstrzykiwane do kanału mikroprzepływowego, który został sfunkcjonalizowany fragmentami FAB anty-digoksygeniny. DNA następnie wiąże się z punktami przyczepu do powierzchni poprzez wiązanie digoksygeniny z zaadsorbowanymi fragmentami FAB. Słabe siły magnetyczne przyłożone magnesem trwałym zapobiegają niespecyficznemu przywieraniu koralika do powierzchni. Próbki można szybko wstrzykiwać (<30 s) do kanału przepływowego w celu aktywacji reakcji rozszczepienia. Przepływ jest wyłączany podczas zbierania danych. Ponieważ każde DNA jest rozszczepiane, dokładny czas rozszczepienia można określić, rejestrując klatkę, w której koralik przesuwa się w górę i poza plan ogniskowy obiektywu, znikając w ten sposób z zapisu wideo. Liczenie pozostałych kulek klatka po klatce może być wykorzystane do ilościowego określenia postępu reakcji.

Poniżej znajduje się kompletny protokół, jak również przykładowe dane zebrane za pomocą NdeI. Przykładem tego, w jaki sposób można zastosować tę technikę, jest pomiar szybkości rozszczepienia dla różnych stężeń białek przy dwóch różnych stężeniach magnezu, niezbędnego kofaktora metalu. Chociaż to zastosowanie protokołu wykorzystuje NdeI, metodę można dostosować do użycia z dowolną nukleazą specyficzną dla danego miejsca poprzez zmianę projektu substratu DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie komórki przepływowej

  1. Mycie szkiełek nakrywkowych
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe w słoikach do barwienia i poddaj sonikacji etanolem (EtOH), a następnie 1 M KOH (po 30 minut każdy). Aby uniknąć wytrącania się KOH w EtOH, należy dokładnie spłukać ddH2O między praniami.
    2. Powtórz zarówno etapy mycia EtOH, jak i KOH 1x, co daje łączną liczbę czterech płukań (dwa EtOH i dwa KOH). Oczyszczone szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w ddH2O w słoikach do barwienia.
  2. Przetnij rurki załadowcze i wyjściowe (o długości 8 cm) za pomocą czystej brzytwy i włóż do otworów w czystym szklanym szkiełku. Użyj PE-20 do wlotu i PE-60 do wylotu. Żywica epoksydowa przez 5 minut, aby zabezpieczyć rurki i odciąć nadmiar rurek.
    UWAGA: Szkiełka szklane mają wymiary 2'' x 3'' x 1 mm. Otwory wierci się parami w odstępach 15 mm. Każda para tworzy jeden koniec pojedynczego kanału. Rurka o mniejszym ID jest używana do wlotu, ponieważ zmniejsza to objętość martwą przed wlotem, a tym samym wymagany czas mieszania (Rysunek 1).
  3. Wyrównaj i nałóż wstępnie przyciętą taśmę dwustronną z wzorem kanałów wyciętym nad otworami w szklanym szkiełku. Wygładź za pomocą plastikowych kleszczyków, aby uzyskać dobre uszczelnienie.
    UWAGA: Taśma dwustronna użyta w tym eksperymencie ma grubość 120 μm, a kanały mają 2 mm szerokości i 15 mm długości. Kanały wycinane są za pomocą drukarki nożowej (Tabela materiałów). Możliwe jest zamontowanie do czterech kanałów na jednym szkiełku nakrywkowym. Zobacz Rysunek 1 dla obrazu komórki przepływu.
  4. Po odklejeniu podłoża nałóż czyste szkiełko nakrywkowe (wysuszone sprężonym powietrzem) na taśmę i ponownie wygładź plastikowymi kleszkami, aby uzyskać dobre uszczelnienie.
  5. Epoksyduj krawędź szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić komórkę przepływową i pozwól jej się utwardzić.

2. Przygotowanie znakowanego DNA do wiązania

  1. W probówce do PCR przygotuj 50 μl mieszaniny reakcyjnej PCR zawierającej 0,02 U/μL polimerazy DNA o wysokiej wierności, 200 μM dNTP, 0,5 μM startera do przodu, 0,5 μM startera wstecznego i 250 ng wektora M13mp18 DNA.
    UWAGA: W tym przypadku starter do przodu (biotyna-CCAACTTAATCGCCTTGC) i starter odwrotny (digoksygenina-TGACCATTAGATACATTTCGC) zostały wybrane do amplifikacji regionu o długości około 1000 pz, obejmującego od pozycji 6338 do 107 w kolistym genomie DNA M13mp18. W środku amplifikowanego regionu znajduje się pojedyncze miejsce NdeI. Starter do przodu jest oznaczony 5ʹ digoksygeniną, która wiąże antydigoksygeninę na szkiełku nakrywkowym. Odwrócony starter to 5ʹ oznaczony biotyną, która wiąże kulki pokryte streptawidyną.
  2. Włóż probówkę do PCR do termocyklera i postępuj zgodnie z cyklem, jak pokazano w Tabeli 1.
  3. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Przy użyciu zestawu określonego w Tabeli Materiałów, typowa wydajność DNA wynosi ~2 μg.

3. Wiązanie DNA i koralików

  1. Przygotować 10 ml buforu A (1 M Tris-HCl [pH = 7,5], 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mg/ml β-kazeiny, 1 mg/ml Pluronic F-127). Odgazowuje w eksykatorze próżniowym przez co najmniej 1 godzinę.
  2. Aby funkcjonalizować komórkę przepływową, wstrzyknąć 25 μl fragmentów FAB anty-digoksygeniny (20 μg/ml) w PBS do kanału przepływowego. Użyj końcówek do ładowania żelu, aby dopasować je do rurki PE-60. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.
  3. Po inkubacji przepłukać kanał, przeciągając 0,5 ml buforu A przez kanał za pomocą strzykawki. Uważaj, aby nie wprowadzać powietrza do kanału.
  4. Po funkcjonalizacji zamontuj komórkę przepływową na odwróconym mikroskopie. Podłączyć rurkę wylotową do pompy strzykawkowej i umieścić rurkę wlotową w probówce mikrowirówki zawierającej bufor A.
  5. Ręcznie wyciągnij co najmniej 0.5 ml buforu A, aby przepłukać system i zalać pompę. Pozwól pompie pracować z prędkością 10 μl/min przez co najmniej 5 minut, aby zrównoważyć system.
  6. Aby przygotować kulki (tabela materiałów), należy zmieszać butelkę z kulkami i odpipetować 1,6 μl kulek podstawowych 10 mg/ml do 50 μl buforu A, a następnie odwirować.
  7. Za pomocą separatora magnetycznego odpipetować bufor i ponownie zawiesić w 50 μl buforu A, a następnie odwirować.
  8. Powtórz krok 3.7 2x, co daje w sumie trzy prania. Do ostatniego płukania ponownie zawiesić w 100 μl buforu A i odwirować, aby uzyskać końcowe stężenie 160 μg/ml.
  9. Aby skompleksować DNA i kulki, najpierw przygotuj 480 μl znakowanego substratu DNA o wartości 0,5 pM w buforze A. Następnie odpipetować pipetą 20 μl zawiesiny kulek o stężeniu 160 μg/ml, upewniając się, że kulki zostały swirowane przed pipetowaniem. Umieść na rotatorze na 3 min.
  10. Po 3 minutach natychmiast załadować do kanału z natężeniem przepływu 10 μl/min przez ~15 min lub do momentu, gdy zaobserwuje się wystarczające wiązanie koralików.
    UWAGA: Koraliki nie powinny być tak gęsto upakowane, aby oddziaływały ze sobą na powierzchni (patrz sekcja dyskusji).
  11. Aby umyć kanał ze wszystkich wolnych kulek, należy przełączyć rurkę doprowadzającą na nową rurkę z buforem A i przepływać z prędkością 50 μl/min przez co najmniej 10 minut lub do momentu, gdy nie zaobserwuje się luźnych kulek.

4. Gromadzenie i analiza danych

  1. Aby przygotować się do zbierania danych, umieść probówkę wlotową w probówce mikrowirówki zawierającej co najmniej 100 μl NdeI (0,25–4,00 U/ml) w buforze A. Opuść magnes trwały nad kanałem przepływowym i ustaw źródło światła poza osią do obrazowania w ciemnym polu.
    UWAGA: Dwa pierścieniowe magnesy ziem rzadkich, epoksydowane razem, są utrzymywane 8 mm nad powierzchnią czynną kanału przepływowego za pomocą wspornikowego słupka optycznego podczas zbierania danych. Lampa na gęsiej szyi służy do przebiegu światła poza osią.
  2. Użyj komercyjnego mikroskopu, kamery wideo i oprogramowania do zbierania danych (Spis materiałów). W oprogramowaniu kliknij zakładkę "Ekspozycja" i ustaw "Czas ekspozycji" na 10 ms. Kliknij zakładkę "Timelapse" i ustaw "Liczba obrazów" na 600, "Czas trwania" na 20 minut, a "Interwał" na 2 s. Kliknij "Uruchom", aby rozpocząć zbieranie danych.
  3. Na pompie strzykawkowej ustaw natężenie przepływu na 150 μl/min, a objętość wtrysku na 80 μl. Naciśnij "Uruchom" po 1 minutzie, aby rozpocząć zbieranie danych. Po wstrzyknięciu należy wyłączyć pompę i zamknąć zawór, aby zapobiec przepływowi podczas zbierania danych.
  4. Po zebraniu danych otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (Tabela materiałów). W zakładce "Plik" wybierz "Importuj" | "Sekwencja obrazów". Znajdź pliki obrazów w menu podręcznym i kliknij "Otwórz".
  5. Ustaw próg, wybierając opcję "Dostosuj uchwyt" w menu rozwijanym "Obraz". Użyj suwaka, aby ustawić wartość progową, aby zidentyfikować jasne punkty odpowiadające koralikom na obrazie.
  6. Policz jasne punkty w każdej klatce, klikając "Analizuj cząstki" w menu rozwijanym "Analizuj". Kliknij "OK", a następnie wybierz "Tak", aby przetworzyć wszystkie obrazy. Zapisz plik wyników.
    UWAGA: Spowoduje to zapisanie pliku danych, który zawiera liczbę koralików w każdej nagranej klatce wideo.
  7. Otwórz oprogramowanie do analizy danych (Tabela materiałów) i zaimportuj plik z wynikami, klikając "Importuj z pliku tekstowego" w menu rozwijanym "Plik". Wykreśl dane dotyczące liczby ściegów w funkcji czasu.
  8. Dopasuj liczbę koralików do czasu, klikając "Dopasuj krzywą" w menu rozwijanym "Analizuj". Wybierz równanie "Wykładnik naturalny" i kliknij "Wypróbuj dopasowanie" | "OK".
    UWAGA: Tylko dane zarejestrowane po wstrzyknięciu próbki powinny być zawarte w obszarze dopasowania. Parametrem dopasowania w wykładniku funkcji dopasowania będzie współczynnik rozszczepienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tej techniki, zmierzono wskaźniki SSDC NdeI dla różnych stężeń białka (0,25–4,00 U/ml) przy dwóch różnych stężeniach magnezu (2 mM i 4 mM). Każdy z tych warunków został zreplikowany co najmniej dwa razy, z kilkuset do 1000 DNA na uwięzi w każdym eksperymencie. Rysunek 2 opisuje projekt eksperymentalny. Rysunek 3 pokazuje przykłady zbierania danych i szczegółów ich analizy. Rysunek 4 ilustruje, jak szybkość zależy od st...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół może być wykorzystany do pomiaru kinetyki dowolnego systemu SSDC, pod warunkiem, że podczas eksperymentu zaobserwowano separację nici. Na wykrycie rozszczepienia ma wpływ obserwacja oderwania się koralika na uwięzi, a zatem oznacza moment oddzielenia pasma. Wszystkie poprzednie kroki zachodzą przed wykryciem rozszczepienia; W ten sposób rejestrowany jest tylko całkowity czas tranzytu.

Szkiełko nakrywkowe z komórek przepływowych jest funkcjonalizowane poprzez niespecyficzną adsorpcję b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant National Science Foundation MCB-1715317.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
fragmenty antydigoksygeniny
kamera i oprogramowanieJenoptikOprogramowanie do analizy danych GRYPHAX SUBRA
Dwustronna taśmaGrace BiolabsSA-S-1L
Dulbeccos Sól fizjologiczna buforowana fosforanemCorning21-031-CV
95%VWR89370-082
podkład do przodu: digoksygenina-CCAACTTAATCGCCTTGCZintegrowane technologie DNAbrak
oprogramowania do analizy obrazuInstitutes of HealthImageJ
nożowa
M13mp18 DNANew England BiolabsN4040S
Koraliki streptawidyny MyOneEnzym Thermo Fisher Scientific65601
Enzym NdeINew England BiolabsR0111S
Qiagen28104
pluronic F-127AnatraceP305
rurka polietylenowa PE-20BD Intramedic427406
rurka polietylenowa PE-60BD Intramedic427416
Q5 MastermixNew England BiolabsM0492S magnes ziem rzadkich
0,5 "OD 0,25" IDImport krajowyNSN0814
ziem rzadkich 0,75 "OD 0,5" IDImport krajowyNSN0615
odwrócony starter: biotyna-TGACCATTAGATACATTTCGCZintegrowane technologie DNA bez
z mleka bydlęcegoSigma-AldrichC6905
5-minutowe Epoxy Devcon 14250 Roche Diagnostics 11214667001 Vernier Inc. LP etanol National Mikroskop odwrócony Drukarka Nikon TE2000 Sylwetka Zestaw do czyszczenia PCR magnes pompy strzykawkowej Kent Scientific Genie Plusβ-Kazeina

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tock, M. R., Dryden, D. T. The biology of restriction and anti-restriction. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  3. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).
  4. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  5. Sadowski, P. D. Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops. The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).
  6. Schatz, D. G. Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase. Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).
  7. Craig, N. L. Tn7: a target site-specific transposon. Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).
  8. Gori, J. L., et al. Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).
  9. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  10. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  11. Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease. Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).
  12. Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease. Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).
  13. Becker, W. R., et al. High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2. Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).
  14. vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. How DNA coiling enhances target localization by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).
  15. Gambino, S., et al. A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage. Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).
  16. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409(2016).
  17. van Aelst, K., et al. Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).
  18. Williams, K., et al. A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates. American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).
  19. Song, D., et al. Tethered particle motion with single DNA molecules. American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).
  20. Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis. Biophys Journal. 106 (2), 22(2014).
  21. Piatt, S., Price, A. C. Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments. PLoS One. 14 (1), 0197726(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

DNA przytwierdzone do kulekmikrofluidyczny kana przep ywowyobrazowanie w ciemnym polumikroskopia wideorestrykcyjna endonukleaza NdeIanaliza dopasowania wyk adniczegoprzytwierdzanie do kulek magnetycznychprzygotowanie komory przep ywowej

Powiązane artykuły