Method Article

Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

DOI:

10.3791/61237

⸱

May 22nd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Colorado Denver School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białek na interfejsach komórkowych dyktują wiele wyników biologicznych, począwszy od rozwoju tkanek i progresji raka, a skończywszy na tworzeniu i utrzymywaniu synaps. Wiele z tych podstawowych interakcji zachodzi w trans i są zwykle indukowane przez heterofilne lub homofilne interakcje między komórkami wyrażającymi pary wiążące zakotwiczone w błonie. Wyjaśnienie, w jaki sposób mutacje związane z chorobą zakłócają te podstawowe interakcje białek, może dostarczyć informacji na temat niezliczonych dziedzin biologii komórki. Wiele testów interakcji białko-białko zazwyczaj nie rozróżnia interakcji cis i trans, co potencjalnie prowadzi do przeszacowania zakresu wiązania zachodzącego in vivo i wymaga pracochłonnego oczyszczania białka i/lub specjalistycznego sprzętu monitorującego. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany prosty protokół, który pozwala na obserwację i kwantyfikację tylko interakcji trans bez konieczności długotrwałego oczyszczania białek lub specjalistycznego sprzętu. Test agregacji komórek HEK polega na zmieszaniu dwóch niezależnych populacji komórek HEK, z których każda wykazuje ekspresję pokrewnych ligandów związanych z błoną. Po krótkim okresie inkubacji próbki są obrazowane, a otrzymane agregaty są oznaczane ilościowo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje synaptyczne ułatwione przez cząsteczki adhezyjne synaps są podstawą rozwoju, organizacji, specyfikacji, utrzymania i funkcjonowania synaps oraz generowania sieci neuronowych. Identyfikacja tych transsynaptycznych cząsteczek adhezyjnych komórek szybko rośnie; Dlatego niezwykle ważne jest zidentyfikowanie partnerów wiążących i zrozumienie, w jaki sposób te nowe cząsteczki adhezyjne oddziałują ze sobą. Ponadto sekwencjonowanie genomu zidentyfikowało mutacje w wielu z tych cząsteczek adhezyjnych, które są powszechnie powiązane z wieloma zaburzeniami neurorozwojowymi, neuropsychiatrycznymi i uzależnieniami1. Mutacje w genach kodujących cząsteczki adhezyjne komórek synaptycznych mogą niekorzystnie zmieniać interakcje trans i mogą przyczyniać się do patofizjologicznych zmian w tworzeniu i/lub utrzymaniu synaps.

Istnieje wiele testów do ilościowej oceny interakcji białko-białko, takich jak kalorymetria izotermiczna, dichroizm kołowy, powierzchniowy rezonans plazmonowy2 i chociaż mają charakter ilościowy, mają kilka ograniczeń. Po pierwsze, wymagają rekombinowanego białka, co czasami wymaga długich i żmudnych etapów oczyszczania. Po drugie, wymagają wyrafinowanego specjalistycznego sprzętu i wiedzy technicznej. Po trzecie, mogą przeceniać zakres wiązania, ponieważ pozwalają na interakcje zarówno cis, jak i trans między białkami, które są naturalnie przywiązane do błony in vivo. Tutaj proponujemy prosty i stosunkowo szybki test, który testuje wyłącznie interakcje trans.

Aby obejść wiele komplikacji związanych z testami na oczyszczone białka, zoptymalizowaliśmy test interakcji białek na bazie komórek, który podsumowuje interakcje trans w zredukowanym heterologicznym systemie komórkowym. Ten test był wcześniej używany w różnych formach do badania interakcji międzykomórkowych. W tym podejściu cząsteczki adhezyjne komórek kandydujących są transfekowane do komórek HEK293T. W warunkach fizjologicznych komórki HEK293T nie wykazują samoagregacji, co czyni je wzorcowymi modelami dla tego testu. Jednak gdy poszczególne populacje komórek HEK eksprymujących receptor i ligand są połączone, wiązanie receptora i liganda wymusza agregację komórek HEK. Ta agregacja jest zapośredniczona wyłącznie przez interakcje trans i jest zwykle obserwowana w ciągu dziesiątek minut. W tej metodzie nie są wymagane żadne etapy oczyszczania białek, a skuteczność metody opiera się na paradygmacie, w którym populacje komórek HEK wyrażających pokrewne cząsteczki adhezyjne są łączone, a następnie obrazowane dopiero kilkadziesiąt minut później. Ponadto metoda ta jest stosunkowo niedroga, ponieważ nie są wymagane ani przeciwciała, ani kosztowny sprzęt. Jedynym sprzętem wymaganym do pozyskiwania danych jest standardowy mikroskop fluorescencyjny. Dodatkową zaletą tego testu opartego na komórkach jest możliwość szybkiego badania przesiewowego wpływu mutacji punktowych istotnych dla choroby na interakcje trans. Można to osiągnąć poprzez transfekcję komórek HEK z cDNA zmutowanych wariantów białka będącego przedmiotem zainteresowania.

W tym protokole prezentujemy przykład, w którym badamy, czy mutacja missense w Neurexin3α (Neurexin3αA687T), zidentyfikowana u pacjenta, u którego zdiagnozowano głęboką niepełnosprawność intelektualną i epilepsję, zmienia interakcje w trans z bogatym w leucynę powtarzalnym białkiem transbłonowym 2 (LRRTM2). Neurexin3α należy do ewolucyjnie konserwatywnej rodziny presynaptycznych cząsteczek adhezyjnych komórek i chociaż ostatnie prace zidentyfikowały wiele ról w synapse3,4,5,6,7, nasze synaptyczne zrozumienie tej cząsteczki i wszystkich członków rodziny neureksyny pozostaje niepełne. LRRTM2 jest pobudzającym białkiem adhezyjnym komórek postsynaptycznych, które uczestniczy w tworzeniu i utrzymywaniu synaps8,9,10. Co ważne, LRRTM2 oddziałuje wyłącznie z izoformami neureksyny, które nie mają alternatywnego eksonu 4 miejsca splicingu (SS4-), ale nie z izoformami neureksyny zawierającymi alternatywny ekson miejsca splicingu 4 (SS4+). Ludzka mutacja typu missense (A687T) zidentyfikowana w Neurexin3α znajduje się w niezbadanym regionie zewnątrzkomórkowym, który jest ewolucyjnie konserwatywny i jest konserwatywny między wszystkimi alfa neureksinami7. Po ustaleniu interakcji między tymi dwiema cząsteczkami8,9,11, zadaliśmy pytanie: czy zdolność wiązania Neurexin3α SS4- z LRRTM2 jest zmieniona przez mutację punktową A687T? Test ten ujawnił, że mutacja punktowa A687T nieoczekiwanie zwiększyła agregację Neurexin3α do LRRTM2, co sugeruje, że region zewnątrzkomórkowy, w którym znajduje się mutacja punktowa, odgrywa rolę w pośredniczeniu w interakcjach transsynaptycznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

  1. Przygotuj pożywkę komórkową HEK z DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) uzupełnioną o 4,5 g/L glukozy, L-glutaminę i pirogronian sodu oraz 10% FBS. Sterylny filtr.
  2. Z góry określ odpowiednie ligandy i receptory do testu agregacji.
    UWAGA: W tym badaniu użyto Neurexin3α SS4+/- i jednego z jego znanych ligandów, LRRTM2. Ligandy i receptory będące przedmiotem zainteresowania ulegały ekspresji z cDNA w pcDNA3.1. Zestaw Gibsona został użyty do wstawienia Neurexin3α do pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTCTCTCCACTC/
    GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
  3. Przygotuj HEK293T komórek.
    1. Wyhoduj HEK293T komórek do zbiegu w jednej kolbie T-75.
    2. Po zlaniu użyj 2 ml trypsyny i umieść w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 minuty. Dodaj 6 ml pożywki HEK do kolby w celu ponownego zawieszenia komórek i przenieś wszystkie 8 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Osad w dawce 500 x g przez 5 minut i ponownie zawieś w pożywce komórkowej HEK, w sumie 8 ml.
    4. Policz komórki i dodaj 735 000 komórek do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Dostosuj końcową objętość do 2 ml dla każdej studzienki za pomocą pożywki komórkowej HEK.
    5. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C i pozwolić komórkom rosnąć przez noc lub do momentu, gdy osiągną 50-60% zlewności.
  4. Transfekcja komórek HEK293T metodą fosforanu wapnia13.
    1. Transfekcja well-1 z 3 μg białka będącego przedmiotem zainteresowania i kotransfekcja z 1 μg białka fluorescencyjnego (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- i 1 μg mCherry).
    2. Transfekcja well-2 jak w kroku 1.4.1, ale ze zmutowanym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
    3. Transfekcja well-3 z 3 μg ligandu będącego przedmiotem zainteresowania i kotransfekcja z 1 μg innego białka fluorescencyjnego (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 i 1 μg GFP).
    4. Przepuszczalne basenie 4 i 5 służące jako kontrole negatywne: basenik 4 z 1 μg GFP i basenik 5 z 1 μg mCherry.
    5. Przygotuj kolejną płytkę (jak w kroku 1.4.1-1.4.4), jeśli wymaga to dodatkowych warunków lub kontroli (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
      UWAGA: Skuteczność transfekcji jest analizowana 24 godziny po transfekcji pod mikroskopem epifluorescencyjnym i określana ilościowo jako liczba komórek wyrażających białko fluorescencyjne, którym zostały transfekowane. Bardziej uproszczone podejście obejmowałoby transfekcję komórek HEK z wektorem bicystronicznym kodującym białko fluorescencyjne i ligand będący przedmiotem zainteresowania i jest wysoce zalecane przed kotransfekcją. W przypadku tego badania alfa neureksyny mają ~4,3 kb i zaobserwowano niską intensywność fluorescencji przy użyciu systemu bicystronicznego wymagającego kotransfekcji.
  5. 48 godzin po transfekcji zbierz komórki do agregacji.
    1. Umyj każdą studzienkę dwukrotnie za pomocą PBS.
    2. Dodać 1 ml 10 mM EDTA w PBS do każdej studzienki, aby delikatnie dysocjować interakcje międzykomórkowe i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 min.
      UWAGA: Trypsyna nie jest zalecana w kroku 1.5.2 ze względu na potencjalne proteolityczne rozszczepienie cząsteczek adhezyjnych w badaniu. Dodatkowo, po dodaniu EDTA, protokół może nie zostać zatrzymany do czasu zakończenia, ponieważ komórki będą teraz wystawione na działanie warunków otoczenia.
    3. Delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki, i zbierz każdą studzienkę do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
    4. Odwirować stożkowe probówki o sile 500 x g i temperaturze pokojowej przez 5 min.
  6. Podczas granulowania komórek przygotuj 6 probówek inkubacyjnych, oznaczając górną część każdej probówki mikrowirówki każdym warunkiem.
    UWAGA: Każda permutacja warunków GFP i mCherry powinna być stosowana w celu uwzględnienia wszystkich warunków eksperymentalnych i właściwych kontroli. Na przykład: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Wykonaj dodatkowe rurki, aby dostosować się do dalszych warunków i kontroli.
  7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl pożywki HEK z 10 mM CaCl2 i 10 mM MgCl2 ogrzanymi do 37 °C.
    UWAGA: Dodanie CaCl2 i MgCl2 umożliwia cząsteczkom adhezyjnym ponowne nawiązanie wiązania i jest wymagane tylko wtedy, gdy partnerzy interakcji transkomórkowej, o których mowa, wymagają kationów dwuwartościowych do adhezji.
  8. Za pomocą hemocytometru policzyć komórki w każdej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i podzielić 200 000 komórek każdego stanu do odpowiedniej probówki z kroku 1.6.1, aby uzyskać mieszaninę 1:1 w całkowitej objętości 500 μl.
    UWAGA: Liczenie i rozdzielanie ilości powinno zająć tylko 5 minut na warunek.
  9. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej w powolnym rotatorze probówkowym.

2. Akwizycja obrazu

  1. Zoptymalizuj parametry akwizycji mikroskopu dla określonych próbek. W tym przykładzie obrazy zostały wykonane pod mikroskopem szerokokątnym. Użyj obiektywu powietrznego 5x (NA: 0.15; WD: 20000 μm), aby uzyskać wystarczająco duże pole do analizy.
  2. Oceń agregację wyjściową natychmiast po zmieszaniu dwóch warunków komórek HEK w kroku 1.8. To są teraz obrazy "czasu zero".
    1. Pobrać pipetę 40 μl każdej mieszaniny próbki na naładowane szkiełko mikroskopowe i obrazować pod wpływem fluorescencji w kanałach 488 i 561.
    2. Uzyskaj trzy różne pola widzenia na jednej płaszczyźnie ostrości na kroplę próbki.
  3. Uzyskaj końcowe obrazy po 60 minutach jako obraz "czas 60".
    1. Aby uzyskać obraz mieszaniny w czasie 60 po 60 minutach inkubacji, należy pobrać kolejną próbkę o objętości 40 μl z każdego stanu z obracających się probówek i pipetować każdą próbkę na naładowane szkiełko. Obraz jak w kroku 2.2.2.
      UWAGA: Agregacja komórek powinna być sprawdzana co 15 minut, aż do momentu nasycenia. Czas agregacji będzie zależał od badanych białek.

3. Analiza ImageJ/Fidżi

  1. Aby określić ilościowo zakres agregacji przy użyciu Fiji/ImageJ, zapisz pliki analizy.
    1. Zapisz dostarczone dodatkowe pliki kodowania w folderze makr imageJ na komputerze.
    2. Zainstaluj dostarczone makro agregacji (Wtyczki, Makra, Zainstaluj i wybierz plik "AggregationAssay.txt").
  2. Określ progi.
    1. Załaduj plik .tif "czasu zero" do imageJ i podziel kanały (Obraz | Kolor | Podziel kanały).
      UWAGA: Obraz "czasu zero" służy do określenia progu i najmniejszego rozmiaru puncta dla całego eksperymentu.
    2. Maskowanie każdego kanału (Wtyczki | Makra | AggregationAssay_MakeMask). Pojawi się okno Utwórz maskę z obrazu. Zaznacz pola wyboru Określ próg dla obrazu i Określ parametry klastra na podstawie histogramu, a następnie kliknij przycisk OK.
    3. Określ próg obrazu za pomocą suwaka, zapisz liczbę po prawej stronie suwaka i kliknij OK.
    4. Pojawi się histogram rozmiaru klastra. Wybierz z histogramu rozmiar klastra, który pasuje do eksperymentu, wpisz tę liczbę w polu Minimalny rozmiar klastra: i kliknij przycisk OK. Klastry poniżej tego rozmiaru nie będą analizowane.
  3. Uruchom analizę.
    1. Otwórz obraz "czasu 60" warunku 1 w obrazie J i podziel kanały jak w kroku 3.2.1.
    2. Zamaskuj każdy kanał (wtyczki, makra AggregationAssay_MakeMask). Użyj tego samego progu i rozmiaru, które zostały określone w krokach 3.2.3 i 3.2.4. Usuń zaznaczenie pól wyboru Określ próg dla obrazu i Określ parametry klastra na podstawie histogramu, a następnie ręcznie wpisz rozmiar i progi w odpowiednich polach, a następnie kliknij przycisk OK.
    3. Obliczanie indeksu agregacji (Wtyczki | Makra | AggregationAssay_CalculateOverlap). Wybierz zamaskowane kanały do porównania i katalog, w którym zostaną zapisane wynikowe pliki.
    4. Powtórz kroki 3.3.1–3.3.3 dla każdego obrazu "czas 60" w każdym stanie.
      UWAGA: Indeks agregacji definiuje się jako całkowity obszar nakładania się podzielony przez sumę dwóch obszarów kanału pomniejszoną o obszar nakładania pomnożony przez 100 (Wskaźnik agregacji = obszar nakładania się/[obszar kanału 1 + obszar kanału 2 – obszar nakładania się] x 100). Ta normalizacja jest operacją "LUB" między dwoma zamaskowanymi kanałami reprezentującymi łączną liczbę pikseli w każdej masce.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutacja A687T zwiększa wiązanie Neurexin3α SS4- z LRRTM27
Aby zbadać, w jaki sposób na interakcje międzykomórkowe dwóch znanych białek synaptycznych wpływa wprowadzenie mutacji punktowej znalezionej u pacjenta z niepełnosprawnością intelektualną i padaczką, użyliśmy powyższego testu agregacji komórek HEK (ryc. 1). Komórki transfekowano zgodnie z sekcją 1 i przygotowywano do obrazowania zgodnie z sekcjami 1 i 2 protokołu. Komórki zobrazowano na początku badania...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza interakcji białko-białko, które zachodzą w trans podczas adhezji komórek, może prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw podstawowych procesów komórkowych, w tym powstawania, funkcjonowania i utrzymywania synaps podczas dojrzewania i przebudowy. Implikacje interakcji międzykomórkowych wykraczają poza neurobiologię i odgrywają szerszą rolę w transdukcji sygnału, migracji komórek i rozwoju tkanek14. Aberracje w adhezji komórek mogą zakłócać procesy komórk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Mental Health (R00MH103531 i R01MH116901 do J.A.), grant na szkolenie przeddoktoranckie z National Institute of General Medicine (T32GM007635 do S.R.) oraz Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 do S.R.). Dziękujemy dr Kevinowi Woolfreyowi za pomoc przy mikroskopie, dr K. Ulrichowi Bayerowi za użycie mikroskopu epifluorescencyjnego oraz Thomasowi Südhofowi (Uniwersytet Stanforda) za plazmid LRRTM2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Jednorazowe mikroprobówki 1,5 ml z zatrzaskamiVWR89000-028Inkubacja mieszanej populacji komórek HEK
1000 ml Rapid— Filtr przepływowy, membrana 0,2 um aPESThermo Fisher567-0020Sterylizacja pożywek HEK
15 mL probówek wirówkowych SpectraTubeWard' s Science470224-998Zbieranie komórek HEK
6-dołkowe sterylne płytki do hodowli tkanekVWR100062-892hodowla komórek HEK
Chlorek wapniaSigma223506-500GTransfekcja fosforanu wapnia, ponowne zawieszenie komórek HEK
Wirówka - Sorvall Legend RTKendro Produkty laboratoryjne75004377Zbieranie komórek HEK
Inkubatorkomórek CO2Thermo ScientificHERACELL 150iInkubacja komórek HEK podczas wzrostu
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) z 4,5 g/L glukozy, L-glutaminą i pirogronianem soduCorning10-013-CVUtrzymanie komórek HEK
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami PBS (1X)Gibco14190-144Pasażowanie/zbieranie komórek HEK
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigmaED-500GZbieranie komórek HEK
Falcon Wentylowane kolby hodowlane, obszar wzrostu 75cm2Corning9381M26Hodowla komórek HEK
Płodowa surowica bydlęcaSigma17L184Utrzymanie
HEK293T komórekmodelowyATCC
ImageJNIHV: 2.0.0-rc-69/1.52pAnaliza obrazu
Chlorek magnezu sześciowodnySigmaM9272-500GZawiesina komórek HEK
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyFisher BioReagentsBP332-500Transfekcja fosforanu wapnia
Trypsyna 0,25% (1X) RoztwórGE Healthcare Life NaukiSH30042.01Pasażowanie komórek HEK
RotatorInkubacja mieszanej populacji komórek HEK
Szkiełka mikroskopowe UltraClear. Biały matowy, dodatnio naładowanyDenville Scientific Inc.M1021Akwizycja obrazu
Mikroskop szerokokątnyZeissAxio Vert 200MAkwizycja obrazu
komórek HEK System rurkowy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
  2. Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
  3. Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
  4. Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
  5. Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
  6. Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
  7. Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
  8. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
  9. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
  10. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
  11. Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
  12. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  13. Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
  14. Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
  15. Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
  16. Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
  17. Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).
  18. Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
  19. Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcellular InteractionsProtein AggregationHEK Cell AggregationTrans Adhesion AssayFluorescence ImagingCell CountingEDTA TreatmentCentrifugation ProtocolGFP mCherry LabelingAdhesion Molecule Screening

Related Articles