Artykuł metodologiczny

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61239

⸱

20 maja 2020

 ,  ,  , 
1Center for Veterinary Medicine, U.S. Food and Drug Administration

W tym artykule

Podsumowanie

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to test izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych (iNAAT), który wzbudził szerokie zainteresowanie w dziedzinie wykrywania patogenów. W tym miejscu przedstawiamy zatwierdzony przez wiele laboratoriów protokół Salmonella LAMP jako szybką, niezawodną i solidną metodę badań przesiewowych Salmonelli w żywności zwierzęcej i potwierdzania przypuszczalnej obecności Salmonelli w izolacji hodowli.

Streszczenie

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) stała się potężnym testem amplifikacji kwasu nukleinowego do szybkiego wykrywania licznych czynników bakteryjnych, grzybiczych, pasożytniczych i wirusowych. Salmonella jest patogenem bakteryjnym budzącym obawy dotyczące bezpieczeństwa żywności na całym świecie, w tym żywności dla zwierząt. Przedstawiono tutaj zatwierdzony przez wiele laboratoriów protokół Salmonella LAMP, który może być wykorzystany do szybkiego badania żywności dla zwierząt pod kątem obecności zanieczyszczenia Salmonellą, a także może być wykorzystany do potwierdzenia przypuszczalnych izolatów Salmonelli odzyskanych ze wszystkich kategorii żywności. Test LAMP jest ukierunkowany konkretnie na gen inwazji Salmonelli (invA) i jest szybki, czuły i wysoce specyficzny. Matrycowe DNA są przygotowywane z bulionów wzbogacających karmę zwierzęcą lub czystych kultur przypuszczalnych izolatów Salmonelli. Mieszaninę odczynników LAMP przygotowuje się przez połączenie izotermicznej mieszanki wzorcowej, starterów, matrycy DNA i wody. Test LAMP przebiega w stałej temperaturze 65 °C przez 30 minut. Pozytywne wyniki są monitorowane za pomocą fluorescencji w czasie rzeczywistym i można je wykryć już po 5 minutach. Test LAMP wykazuje wysoką tolerancję na inhibitory w karmie zwierzęcej lub pożywce hodowlanej, służąc jako szybka, niezawodna, solidna, opłacalna i przyjazna dla użytkownika metoda badań przesiewowych i potwierdzania Salmonelli. Metoda LAMP została niedawno włączona do Bakteriologicznego Podręcznika Analitycznego (BAM) Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration's Bacteriological Analytical Manual, BAM) Chapter 5.

Wprowadzenie

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to nowatorski test izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych (iNAAT) wynaleziony w 2000 roku przez grupę japońskich naukowców1. Poprzez tworzenie specyficznej dla celu struktury DNA pętli macierzystej podczas początkowych etapów, LAMP wykorzystuje polimerazę DNA wypierającą nić, aby skutecznie amplifikować ten materiał wyjściowy quasi-wykładniczo, co skutkuje 109 kopiami celu w czasie krótszym niż 1 h1. W porównaniu z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR), szeroko stosowaną metodą NAAT, LAMP ma kilka zalet. Po pierwsze, reakcje LAMP przeprowadza się w warunkach izotermicznych. Eliminuje to potrzebę stosowania wyrafinowanego przyrządu do cykli termicznych. Po drugie, LAMP jest wysoce tolerancyjny na podłoża hodowlane i substancje biologiczne2 z odpornością wykazaną zarówno w zastosowaniach klinicznych, jak i spożywczych3,4. Upraszcza to przygotowanie próbki i minimalizuje liczbę wyników fałszywie ujemnych5. Po trzecie, LAMP jest podatny na wiele platform detekcji, takich jak zmętnienie, kolorymetria, bioluminescencja, fluorescencja i mikrofluidyka6. Po czwarte, LAMP jest bardzo specyficzny, ponieważ używa od czterech do sześciu specjalnie zaprojektowanych starterów do kierowania na sześć do ośmiu określonych regionów1,7. Po piąte, LAMP jest ultraczuły, a liczne badania wykazały jego wyższą czułość na PCR lub real-time PCR8. Wreszcie, LAMP jest szybszy, ponieważ wiele testów przyjmuje teraz standardowy czas trwania 30 minut, podczas gdy testy typu PCR zwykle trwają 1−2 h8.

Te atrakcyjne cechy przyczyniły się do zastosowania LAMP w szerokich obszarach wykrywania patogenów, w tym w diagnostyce in vitro9, Animal disease diagnostics10, oraz Food and Environmental testing11. Warto zauważyć, że WHO zaleciła LAMPĘ DO GRUŹLICY (LAMP do Mycobacterium tuberculosis) jako ważny test zastępczy do mikroskopii rozmazowej plwociny w diagnostyce gruźlicy płuc w warunkach peryferyjnych12. Aplikacja LAMP wykracza również poza identyfikację mikrobiologiczną i obejmuje wykrywanie alergenów, gatunków zwierząt, oporności na leki, organizmów modyfikowanych genetycznie i pestycydów13.

Nietyfusowa Salmonella jest odzwierzęcym patogenem o dużym znaczeniu dla bezpieczeństwa żywności i zdrowia publicznego na całym świecie14. Został również zidentyfikowany jako ważne zagrożenie mikrobiologiczne w żywności dla zwierząt (tj. żywności dla zwierząt)15,16. Aby zapobiec chorobom/epidemiom Salmonelli spowodowanym skażoną żywnością dla ludzi i zwierząt, konieczne jest posiadanie szybkich, niezawodnych i solidnych metod testowania Salmonelli w różnych matrycach. W ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne wysiłki na arenie międzynarodowej w zakresie rozwoju i zastosowania testów Salmonella LAMP w szerokiej gamie matryc żywnościowych, co niedawno podsumowano w obszernym przeglądzie8. Kilka testów LAMP na obecność Salmonelli, w tym ten przedstawiony tutaj, pomyślnie przeszło walidację w wielu laboratoriach zgodnie z dobrze znanymi międzynarodowymi wytycznymi17,18,19,20.

Nasz test Salmonella LAMP jest ukierunkowany na gen inwazji Salmonelli invA (numer dostępu GenBank M90846)21 i jest szybki, niezawodny i wytrzymały w wielu matrycach żywności4,22,23,24,25,26. Metoda została zwalidowana na sześciu matrycach pokarmów zwierzęcych w badaniu przedzespołowym26 oraz na suchej karmie dla psów w wielolaboratoryjnym badaniu zespołowym19. W rezultacie, przedstawiona tutaj metoda Salmonella LAMP została niedawno włączona do Bakteriologicznego Podręcznika Analitycznego (BAM) Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) Rozdział 5 Salmonella27, aby służyć dwóm celom, po pierwsze jako szybka metoda przesiewowa na obecność Salmonelli w żywności zwierzęcej, a po drugie jako wiarygodna metoda potwierdzania przypuszczalnej Salmonelli wyizolowanej ze wszystkich pokarmów.

Protokół

UWAGA: Mieszanina reakcyjna LAMP zawiera polimerazę DNA, bufor, MgSO4, dNTP, primery, matrycę DNA oraz wodę. Pierwsze cztery odczynniki znajdują się w izotermicznym master mixie (Tabela materiałów). Primery są przygotowywane wewnątrz laboratorium jako mieszanina primerów (10x). Matryce DNA mogą być przygotowywane z bulionów wzbogacających próbki żywności pochodzenia zwierzęcego do celów przesiewowych lub z kultur domniemanych izolatów Salmonella do celów potwierdzających. Dodatkowo, w każdym przebiegu LAMP uwzględnia się kontrolę pozytywną (DNA wyekstrahowane z dowolnych szczepów referencyjnych Salmonella, np. Salmonella enterica serowaru Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) oraz kontrolę bez matrycy (NTC; sterylna woda klasy molekularnej).

1. Przygotowanie matryc DNA

  1. Aby przygotować matryce DNA z wzbogaceń pożywek dla zwierząt, należy wykonać następujące kroki.
    1.  Aseptycznie odważ 25 g próbki karmy dla zwierząt (np. suchej karmy dla kotów, suchej karmy dla psów, paszy dla bydła, paszy dla koni, paszy dla drobiu oraz paszy dla świń) do sterylnej torebki filtrującej (Tabela materiałów), lub odpowiednik. Umieścić worek w dużym pojemniku lub statywie w celu zapewnienia stabilności podczas inkubacji.
    2. Dodać 25 ml sterylnej buforowanej wody peptonowej (BPW). Dobrze wymieszać poprzez wirowanie i krótkie ugniatanie ręczne. Pozostawić w temperaturze pokojowej przez 60 ± 5 min.
    3. Wymieszać dokładnie przez delikatne obracanie naczynia i określić wartość pH za pomocą papierka wskaźnikowego. W razie potrzeby skorygować pH do wartości 6,8 ± 0,2, używając sterylnego 1 N NaOH lub 1 N HCl. Inkubować w temperaturze 35 ± 2 °C przez 24 ± 2 h.
    4. Wymieszać dokładnie, delikatnie obracając worek zawierający buliony do wzbogacania pożywienia dla zwierząt. Przenieść 1 µl z przefiltrowanej strony worka do probówki do mikrocentryfugi. Krótko wymieszać wstrząsarce wortexowej.
    5. Izolacja DNA przy użyciu odczynnika do przygotowania próbki (Tabela materiałów) w następujący sposób.
      1. Wiruj przy 90 x g przez 1 min, aby usunąć duże cząstki, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrocentryfugi.
      2. Wirować przy 16 0 x g przez 2 min, a następnie odrzucić supernatant.
      3. Resuspenduj osad w 100 µL odczynnika do przygotowania próbek i podgrzewać w temperaturze 10 ± 1 °C przez 10 min w suchym bloku grzewczym.
      4. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać ekstrakty DNA próbek w temperaturze -20 °C.
  2. Aby przygotować matryce DNA z materiału domniemanego Salmonella kultury, należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Uzyskać domniemany Salmonella izolaty z hodowli wyizolowane ze wszystkich produktów spożywczych zgodnie z rozdziałem 5 BAM FDA Salmonella Sekcja D: Izolacja Salmonella27.
    2. Zaszczepić próbkę domniemaną Salmonella izolaty na nie wybiórczej płytce agarowej (np. agarze krwi, agarze pożywkowym i agarze sojowo-kazeinowym) i inkubować w temperaturze 35 ± 2 °C przez 24 ± 2 h.
    3. Przenieść kilka pojedynczych kolonii do 5 ml bulionu sojowo-kazeinowego (TSB) lub bulionu BHI (brain heart infusion) i inkubować w temperaturze 35 ± 2 °C przez 16 ± 2 h.
      UWAGA: Ten krok może być opcjonalny, jeśli domniemany Salmonella kultura jest czysta. W takim przypadku matryce DNA można przygotować, zawieszając kilka pojedynczych kolonii w 5 ml TSB i poddając je działaniu ciepła 500 μL zawiesiny przy 10 ± 1 °C przez 10 min w suchym bloku grzewczym. Należy przejść do kroku 5 poniżej.
    4. Transfer 500 µL hodowli nocnej do probówki do mikrocentryfugi i podgrzać w temperaturze 10 ± 1 °C przez 10 min w suchym bloku grzewczym.
    5. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać wyekstrahowany izolowany DNA w temperaturze -20 °C.
  3. Aby przygotować DNA kontroli pozytywnej, należy postępować analogicznie jak powyżej w przypadku przygotowywania matryc DNA z próbek domniemanych. Salmonella kultury z jednym dodatkowym stopniem rozcieńczenia.
    1. Zaszczepić S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) lub jakikolwiek Salmonella szczepy referencyjne na nieoselekcyjnej płytce agarowej (np. agar krwisty, agar pożywkowy oraz agar sojowo-kazeinowy) i inkubować w temperaturze 35 ± 2 °C przez 24 ± 2 h.
    2. Przenieś kilka pojedynczych kolonii do 5 ml bulionu TSB lub BHI i inkubuj w temperaturze 35 ± 2 °C przez 16 ± 2 h do osiągnięcia poziomu ~109 JCF/ml
    3. Wykonaj rozcieńczenia seryjne kultury nocnej w 0,1% wodzie peptonowej, aby uzyskać ok. 107 CFU/ml
    4. Transfer 500 µL tej rozcieńczonej próbki do probówki do mikrocentryfugi i podgrzać w temperaturze 10 ± 1 °C przez 10 min w suchym bloku grzewczym.
    5. Schłodzić do temperatury pokojowej, a DNA kontroli pozytywnej przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie mieszaniny starterów (10x)

  1. Należy pozyskać komercyjnie syntetyzowane startery LAMP (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF oraz Sal4-LB) poddane standardowej puryfikacji poprzez odsalanie (Tabela 1).
Nazwa starteraOpisSekwencja (5´-3´)Długość (bp)
Sal4-F3Zewnętrzny starter prawyGAACGTGTCGCGGAAGTC18
Sal4-B3Zewnętrzny starter lewyCGGCAATAGCGTCACCTT18
Sal4-FIPWewnętrzny starter prawyGCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG38
Sal4-BIPWewnętrzny starter lewyGCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC38
Sal4-LFStarter pętli prawyTCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG25
Sal4-LBStarter pętli lewyAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG21

Tabela 1: Primery LAMP do przesiewowego wykrywania Salmonella w paszach dla zwierząt oraz potwierdzania obecności Salmonella w izolacji z hodowli. Primery zostały zaprojektowane na podstawie sekwencji genu Salmonella invA (numer akcesyjny GenBank M90846).

  1. Przygotować roztwory stokowe każdego startera (10 µM), rehydratując starter odpowiednią ilością sterylnej wody klasy molekularnej. Dobrze wymieszać w wirówce typu vortex przez 10 s i przechowywać w temperaturze -20 °C (-80 °C w przypadku przechowywania długoterminowego).
  2. Przygotować mieszaninę starterów (10x) zgodnie z arkuszem roboczym (Tabela 2). Dodać odpowiednie objętości roztworów stokowych starterów oraz sterylną wodę klasy molekularnej do probówki do mikrocentryfugi. Wszystkie odczynniki dobrze wymieszać w wirówce typu vortex przez 10 s.
KomponentStężenie zapasu (µM)stężenie mieszaniny starterów (µM)Wolumen (µL)
starter Sal4-F3100110
starter Sal4-B3100110
starter Sal4-FIP10018180
starter Sal4-BIP10018180
starter Sal4-LF10010100
starter Sal4-LB10010100
Woda klasy molekularnejN/DBrak danych420
SumaNie dotyczyNie dotyczy1000

Tabela 2: Arkusz przygotowania mieszaniny starterów LAMP (10x). Startery wymieniono w Tabeli 1.

  1. Rozdziel mieszaninę starterów 10x w aliquotach po 500 µL do probówek do mikrowirówki i przechowuj w temperaturze -20 °C.

3. Przygotowanie reakcji LAMP

UWAGA: Aby zapobiec kontaminacji krzyżowej, zdecydowanie zaleca się fizyczne oddzielenie obszarów wykorzystywanych do przygotowywania mieszaniny master mix LAMP oraz dodawania matryc DNA. Rysunek 1 przedstawia schemat metody LAMP.

Schemat procedury LAMP: Przygotowanie master mixu, rozdzielenie do dołków, dodanie matryc DNA, załadowanie, amplifikacja wyników.
Rysunek 1: Schemat przedstawiający Salmonella Procedura LAMP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotowanie i konfiguracja przebiegu
    1. Oczyścić blat izopropanolem oraz roztworem degradującym DNA i DNaza (Tabela Materiałów). Oczyścić pipety i uchwyty do pasków probówek (Tabela Materiałów) roztworem degradującym DNA i DNaza.
    2. Rozmrozić w temperaturze pokojowej izotermiczny master mix, mieszaninę starterów (10x), wodę klasy molekularnej, DNA kontroli pozytywnej oraz matryce DNA.
    3. Włączyć urządzenie LAMP (Tabela Materiałów) i dotknąć ekranu startowego, aby przejść do ekranu głównego. Wykonać poniższe kroki w celu utworzenia przebiegu.
      UWAGA: Jeden model urządzenia LAMP posiada 2 bloki (A i B) z 8 próbkami w każdym bloku, a inny model posiada pojedynczy blok mieszczący 8 próbek (Tabela Materiałów).
      1. Dotknąć LAMP+Anneal i wybrać Edit, aby wprowadzić informacje o próbkach.
        UWAGA: Domyślny profil przebiegu LAMP składa się z amplifikacji w 65 °C przez 30 min oraz fazy hybrydyzacji od 98 °C do 80 °C ze spadkiem temperatury o 0,05 °C na sekundę.
      2. Dotknąć każdego wiersza próbki, aby aktywować kursor i wprowadzić odpowiednie informacje o próbce, używając ikony AB block do przełączania się między dwoma blokami urządzenia LAMP.
      3. Dotknąć ikony Check po wprowadzeniu wszystkich informacji o próbkach.
        UWAGA: Opcjonalnie można zapisać konfigurację przebiegu (nazwaną „Profile”, która zawiera informacje o próbkach wraz z domyślnym profilem przebiegu LAMP) do późniejszego użycia. Dotknąć ikony Save i nadać profilowi unikalną nazwę. Przy kolejnym testowaniu tego samego zestawu próbek nowy przebieg można zainicjować za pomocą zapisanego profilu. Dotknąć ikony Folder w lewym dolnym rogu ekranu głównego i wybrać Profile, aby wczytać zapisane profile.
  2. Przygotowanie reakcji LAMP
    UWAGA: Przy użyciu obu bloków urządzenia LAMP (A i B, łącznie 16 próbek) należy przygotować master mix LAMP dla 18 próbek. W przypadku użycia tylko jednego bloku urządzenia LAMP (łącznie 8 próbek) należy przygotować master mix LAMP dla 10 próbek. Dla innych liczb próbek odpowiednio dostosować objętość, aby uwzględnić straty podczas pipetowania. W każdym przebiegu LAMP zawsze należy uwzględnić kontrolę pozytywną oraz NTC. Zaleca się powtórne badanie każdej próbki w niezależnych przebiegach LAMP.
    1. Przygotować master mix LAMP zgodnie z arkuszem roboczym (Tabela 3). Dodać odpowiednie objętości izotermicznego master mixu, mieszaniny starterów oraz wody klasy molekularnej do probówki do mikrocentryfugi i delikatnie wymieszać na wortexie przez 3 s. Krótko odwirować.
    2. Umieścić pasek probówek w uchwycie i rozdzielić 23 µL master mixu LAMP do każdej studni.
    3. Wymieszać wszystkie matryce DNA na wortexie i krótko odwirować. Dodać 2 µL matrycy DNA do odpowiedniej studni i szczelnie zamknąć.
    4. Wyjąć pasek probówek z uchwytu i potrząsnąć nadgarstkiem, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki zebrały się na dnie probówki.
    5. Włożyć pasek probówek do bloku(ów) urządzenia LAMP, upewniając się, że zakrętki są zabezpieczone przed zamknięciem pokrywy.
KomponentStężenie roboczeKońcowe stężenie w reakcjiObjętość na próbkę (µL)Objętość dla 18 próbek (µL)Objętość dla 10 próbek (µL)
izotermiczna mieszanina master mix ISO-011,67x1x15270150
Mieszanina starterów10x1x2.54525
Woda klasy molekularnejN/ATekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o wprowadzenie treści do tłumaczenia.5.59955
Suma składników master mixuNie dotyczyBrak danych23414230
matryca DNAPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski.Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia.2Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia.Brak danych

Tabela 3: Arkusz przygotowania mieszaniny reakcyjnej LAMP. Mieszanina starterów (10x) jest przygotowywana zgodnie z Tabelą 2 przy użyciu roztworów stokowych starterów wymienionych w Tabeli 1.

4. Przebieg LAMP

UWAGA: Podczas przebiegu reakcji LAMP odczyty fluorescencji są pozyskiwane przy użyciu kanału FAM. Wartości czasu do osiągnięcia szczytu (Tmax; min) są wyznaczane automatycznie przez instrument dla punktu czasowego, w którym stosunek fluorescencji osiąga maksymalną wartość krzywej szybkości amplifikacji. Tm (°C) to temperatura topnienia/odpalań końcowego produktu amplifikacji.

  1. Kliknij ikonę Run w prawym górnym rogu ekranu i wybierz blok(i) zawierające paski probówek, aby rozpocząć przebieg LAMP.
  2. Opcjonalnie, podczas trwania reakcji, dotknij kart Temperature, Amplification oraz Anneal, aby obserwować dynamiczne zmiany poszczególnych parametrów w trakcie przebiegu LAMP.
  3. Po zakończeniu przebiegu dotknij kart Amplification i Anneal, aby zobaczyć pełne krzywe amplifikacji i hybrydyzacji, a następnie dotknij karty Results, aby wyświetlić wyniki.
  4. Opcjonalnie, w celu prowadzenia dokumentacji, zapisz numer przebiegu znajdujący się w lewym górnym rogu ekranu, stosując format „numer seryjny instrumentu_numer przebiegu”, np. „GEN2-209_030”.

5. Interpretacja wyników LAMP

UWAGA: Wyniki LAMP można przeglądać bezpośrednio na panelu instrumentu LAMP i/lub za pomocą oprogramowania LAMP (Tabela materiałów).

  1. Aby zinterpretować wyniki LAMP na panelu instrumentu, należy wykonać następujące kroki.
    1. Stuknij ikonę Folder w lewym dolnym rogu ekranu głównego i wybierz Log, aby przejść do lokalizacji pliku i wczytać interesujący przebieg reakcji LAMP.
      UWAGA: Przebiegi LAMP są uporządkowane według daty, zaczynając od roku.
    2. Zapoznaj się z pięcioma zakładkami przypisanymi do każdego przebiegu: Profile, Temperature, Amplification, Anneal oraz Results.
      UWAGA: Zakładki Profile oraz Temperature pokazują odpowiednio temperaturę zaprogramowaną i rzeczywistą w dołkach z próbkami w miarę postępu reakcji LAMP. Zakładki Amplification i Anneal pokazują odpowiednio odczyty fluorescencji oraz zmiany fluorescencji podczas faz amplifikacji i hybrydyzacji. Zakładka Results przedstawia wyniki LAMP w widoku tabelarycznym.
    3. Stuknij zakładkę Results, aby zapoznać się z wynikami LAMP dla każdego dołka.
      UWAGA: Dostępne są trzy kolumny (Well, Amplification i Anneal). Kolumna „Amplification” pokazuje wartości czasu do osiągnięcia piku (Tmax; min:sek) dla każdej próbki („Well”), a kolumna „Anneal” pokazuje temperatury topnienia/hybrydyzacji (Tm; °C) dla każdego amplifikowanego produktu w danym dołku.
    4. Zinterpretuj wyniki LAMP i zaraportuj końcowe wyniki LAMP w następujący sposób.
      1. W pierwszej kolejności sprawdź dołki kontrolne. Dołek NTC powinien mieć pustą wartość Tmax, natomiast Tm może być pusty (w obu modelach instrumentów LAMP) lub < 83 °C (tylko w modelu instrumentu LAMP z dwoma blokami). Dołek kontroli pozytywnej powinien mieć Tmax między 5 a 10 min oraz Tm około 90 °C.
      2. Sprawdź dołki z próbkami. Wszystkie próbki z prawidłowym Tm (około 90 °C) i Tmax (między 5−30 min) są uznawane za pozytywne pod kątem Salmonella.
      3. Z raportuj końcowe wyniki LAMP na podstawie wyników z powtórzonych przebiegów. Jeśli powtórzone przebiegi dają spójne wyniki, można zaraportować końcowe wyniki LAMP. Jeśli wyniki powtórzeń są niespójne, należy niezależnie powtórzyć oba przebiegi. Jeśli wyniki nadal pozostają niespójne, próbkę należy uznać za prawdopodobnie pozytywną pod kątem Salmonella, co będzie wymagało potwierdzenia metodą hodowlaną.
  2. Aby zinterpretować wyniki LAMP za pomocą oprogramowania, należy wykonać następujące kroki.
    1. Kliknij ikonę Computer na lewym panelu i przejdź do lokalizacji pliku, aby wczytać interesujący przebieg reakcji LAMP.
      UWAGA: Komputer z zainstalowanym oprogramowaniem nie musi być połączony z instrumentem LAMP, aby analizować wyniki LAMP, t. j. dostępny jest dostęp zdalny. Przebiegi LAMP są uporządkowane według daty.
    2. Zapoznaj się z siedmioma zakładkami przypisanymi do każdego przebiegu: Profile, Temperature, Amplification, Amplification Rate, Anneal, Anneal Derivative oraz Result.
      UWAGA: Podobnie jak w widoku panelu instrumentu, zakładki Profile i Temperature pokazują odpowiednio temperaturę zaprogramowaną i rzeczywistą w dołkach z próbkami w miarę postępu reakcji LAMP. Zakładki Amplification/Amplification Rate oraz Anneal/Anneal Derivative pokazują odpowiednio odczyty fluorescencji lub zmiany fluorescencji podczas faz amplifikacji i hybrydyzacji. Zakładka Results przedstawia wyniki LAMP w widoku tabelarycznym, który nieznacznie różni się od widoku na panelu instrumentu.
    3. Stuknij zakładkę Amplification Rate, aby wyświetlić graficzną prezentację stosunków fluorescencji w czasie. Kliknij ikonę Setting w prawym górnym rogu ekranu i dostosuj „Peak Detection Threshold Ratio” z 0,020 na 0,010.
      UWAGA: Ta korekta jest niezbędna, aby zapewnić identyfikację wszystkich prawidłowych pików i dopasowanie wyników uzyskanych za pomocą oprogramowania do tych wyświetlanych na panelu instrumentu.
    4. Stuknij zakładkę Result, aby zapoznać się z wynikami LAMP dla każdego dołka.
      UWAGA: Dostępne są cztery kolumny (Graph Name, Well Number, Well Name oraz Peak Value). Górna część kolumny „Peak Value” pokazuje „Amp Time” (Tmax; min:sek) dla każdej próbki („Well Name”), natomiast dolna część pokazuje „Anneal Derivative” (Tm; °C) dla każdego amplifikowanego produktu w danym dołku.
    5. Zinterpretuj wyniki LAMP i zaraportuj końcowe wyniki LAMP, postępując analogicznie jak w przypadku korzystania z panelu instrumentu, z jednym wyjątkiem: dołek NTC oraz inne próbki negatywne powinny mieć pustą wartość Tm, ponieważ ustawienia oprogramowania LAMP eliminują wyniki Tm < 83 °C. Podobnie wszystkie próbki z prawidłowym Tm (około 90 °C) i Tmax (między 5−30 min) są uznawane za pozytywne pod kątem Salmonella.

Wyniki

Rysunek 2 oraz Rysunek 3 przedstawiają reprezentatywne wykresy/tabele LAMP wyświetlane na obu platformach. W tym przebiegu LAMP próbki S1 do S6 stanowią 10-krotne rozcieńczenia seryjne S. enterica serowar Infantis ATCC 51741 w zakresie od 1,1 x 106 CFU do 1 CFU na reakcję. Kontrolą pozytywną jest S. enterica serowar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) w stężeniu 1,7 x 104 CFU na reakcję, a NTC to woda klasy molekularnej.

Jak pokazano na Rysunku 2E oraz Rysunku 3G, zarówno studzienki NTC, jak i PC stanowią poprawne kontrole. W studzience NTC wartość Tmax jest pusta, natomiast Tm wynosi < 83 °C na panelu instrumentu LAMP i jest pusta w oprogramowaniu LAMP, co wskazuje na wynik negatywny. Studzienka PC wykazuje Tmax wynoszący 7 min 45 sec oraz Tm ok. 90 °C na obu platformach, co wskazuje na wynik pozytywny. Próbki od S1 do S6 mają Tmax w przedziale od 6 min 30 sec do 12 min 15 sec, co oznacza, że wszystkie są pozytywne pod kątem obecności Salmonella.

Po wykonaniu powtórnych analiz tego samego zestawu próbek, raportowane są końcowe wyniki LAMP dla tych próbek. Ten reprezentatywny przebieg reakcji LAMP pokazuje, że metoda ta skutecznie wykrywa Salmonella w szerokim zakresie stężeń w próbkach.

Analiza PCR z użyciem urządzenia Genie II; wykresy wyników eksperymentu wyświetlone na ekranie w pięciu etapach.
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki LAMP wyświetlone na panelu urządzenia LAMP. (A) The Profil Tabela przedstawia zaprogramowany profil temperatury. (B) The Temperatura tabela przedstawia rzeczywiste temperatury w dołkach z próbkami w miarę przebiegu reakcji LAMP.C) The Amplifikacja Tabela przedstawia odczyty fluorescencji podczas amplifikacji LAMP.D) The Wyżarzanie tabela przedstawia zmiany fluorescencji (pochodną) podczas fazy wyżarzania.E) The Wyniki karta przedstawia tabelaryczny widok wyników LAMP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza danych spektroskopowych; wykresy i wyniki badań emisji oraz absorpcji; konfiguracja spektrometru.
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki LAMP wyświetlone w oprogramowaniu LAMP. (A) The Profil tabela przedstawia zaprogramowany profil temperatury. (B) The Temperatura tabela przedstawia rzeczywiste temperatury w dołkach z próbkami w miarę postępu reakcji LAMP. (C) The Amplifikacja tabela przedstawia odczyty fluorescencji podczas amplifikacji LAMP.D) The Szybkość amplifikacji tabela przedstawia zmiany fluorescencji (stosunek fluorescencji) podczas amplifikacji metodą LAMP.E) The Wyżarzanie Tabela przedstawia odczyty fluorescencji podczas fazy przyłączania. (F) The Hybrydyzacja pochodnej tabela przedstawia zmiany fluorescencji (pochodna) podczas fazy hybrydyzacji. (G) The Wynik zakładka przedstawia wyniki metody LAMP w formie tabeli. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przedstawiliśmy tutaj prostą, szybką, specyficzną i czułą metodę LAMP do badania przesiewowego i potwierdzania Salmonelli odpowiednio w żywności zwierzęcej i czystej kulturze. Dzięki wygodzie izotermicznej mieszanki wzorcowej, która zawiera cztery kluczowe odczynniki, oraz gotowej do użycia, przygotowanej przez siebie mieszanki starterów, przygotowanie reakcji LAMP wymaga tylko kilku etapów pipetowania (ilustracja 1). Całkowity czas pracy wraz z fazami amplifikacji i wyżarzania wynosi mniej niż 38 minut (Rysunek 2A,B i Rysunek 3A,B). Pozytywne wyniki są monitorowane za pomocą fluorescencji w czasie rzeczywistym (Rysunek 2C i Rysunek 3C,D) i można je wykryć już po 5 minutach26. Faza wyżarzania służy jako dodatkowe potwierdzenie specyficzności LAMP, ponieważ tylko próbki o prawidłowym Tm (około 90 °C) są zgłaszane jako dodatnie (rysunek 2D,E i rysunek 3E−G). Wrażliwość 1 komórki Salmonelli w czystej kulturze i < 1 jtk/25 g w karmie zwierzęcej była zgłaszana wcześniej26.

Ponieważ LAMP jest dość skuteczny i generuje dużą ilość DNA1, bardzo ważne jest, aby stosować najlepsze praktyki laboratoryjne w celu zapobiegania zanieczyszczeniu krzyżowemu, które może obejmować fizyczne oddzielenie obszarów do przygotowania mieszanki wzorcowej LAMP i dodanie matryc DNA, unikanie wytwarzania aerozoli, używanie końcówek do pipet filtrujących, częstą zmianę rękawiczek i powstrzymanie się od otwierania probówek reakcyjnych LAMP po amplifikacji.

Swoistość tej metody Salmonella LAMP została wcześniej przetestowana przy użyciu 300 szczepów bakteryjnych (247 Salmonelli ze 185 serowarów i 53 nie-Salmonella) i wykazano, że jest w 100% swoista26. W szczególności zaobserwowano znaczące różnice w Tmax między dwoma gatunkami Salmonelli, S. enterica i Salmonella bongori, oraz między podgatunkami S. enterica, zwłaszcza subsp. arizonae (IIIa)26. Niemniej jednak były to nadal ważne pozytywne wyniki zgodnie z zasadami interpretacji wyników LAMP. W naszym wielolaboratoryjnym badaniu dotyczącym suchej karmy dla psów, w którym uczestniczyło 14analityków19, sporadycznie obserwowano próbki o niespójnych wynikach w zduplikowanych seriach LAMP. Zazwyczaj były to próbki z opóźnionymi wynikami dodatnimi (Tmax > 15 min). Powtórzenie obu przebiegów niezależnie zwykle rozwiązywało problem. Rzadziej obserwowaliśmy próbki z prawidłowymi wartościami Tm, ale bez lub nieregularnymi wartościami Tmax (< 5 min). Było to zwykle spowodowane pęcherzykami powietrza w rurce reakcyjnej.

Przez cały cykl życia opracowywania metody LAMP, oceny, badań przedzespołowych i walidacji w wielu laboratoriach zaobserwowaliśmy wysoką tolerancję LAMP na inhibitory w różnych karmach zwierzęcych lub matrycach żywnościowych i pożywkach hodowlanych 4,19,22,23,24, podkreślając solidność metody i współpracując z wieloma innymi badaniami na skalę globalną 8. Jest to lepsze rozwiązanie w porównaniu z PCR lub PCR w czasie rzeczywistym, które zwykle wymaga wewnętrznej kontroli amplifikacji, aby upewnić się, że negatywne wyniki nie są spowodowane hamowaniem macierzy28. Co więcej, LAMP wykazał podobną (lub wyższą) swoistość i czułość w porównaniu z PCR lub PCR w czasie rzeczywistym w zdecydowanej większości badań8. Koszt odczynników LAMP wynosi około 1 USD za reakcję. Instrumenty LAMP używane w tym protokole są małe, łatwe w utrzymaniu i przenośne. Mogą poradzić sobie z każdą metodą amplifikacji izotermicznej, która wykorzystuje wykrywanie celu za pomocą pomiaru fluorescencji, w tym LAMP. Za pomocą oprogramowania LAMP można generować kompleksowe raporty w wielu formatach (pdf, tekst i obraz).

Walidacja metody jest krytycznym krokiem, zanim nowa metoda będzie mogła zostać przyjęta do rutynowego użytku. Warto zauważyć, że zgłoszony tutaj protokół LAMP pomyślnie przeszedł walidację w wielu laboratoriach19. Oczekuje się, że wraz z niedawnym włączeniem tego protokołu LAMP do amerykańskiego raportu FDA BAM Chapter 5 Salmonella27, metoda ta zyska znacznie szersze zastosowanie, zarówno jako szybka metoda przesiewowa w żywności zwierzęcej, jak i jako wiarygodna metoda potwierdzania przypuszczalnych izolatów Salmonelli ze wszystkich kategorii żywności.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Poglądy wyrażone w tym manuskrypcie są poglądami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają oficjalną politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) lub rządu Stanów Zjednoczonych. Odniesienie do jakichkolwiek materiałów komercyjnych, sprzętu lub procesu w żaden sposób nie stanowi aprobaty, poparcia ani rekomendacji Agencji ds. Żywności i Leków.

Podziękowania

Autorzy dziękują członkom Podkomitetu ds. Walidacji Metod Mikrobiologicznych FDA (MMVS) oraz Rady Podręcznika Analizy Bakteriologicznej (BAM) za krytyczny przegląd badań walidacyjnych metody Salmonella LAMP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bulion do infuzji serca (BHI)BD Diagnostic Systems, Sparks, MD299070Płynna pożywka wzrostowa stosowana w uprawie Salmonelli.
Buforowana woda peptonowa (BPW)BD Systemy diagnostyczne, iskry, MD218105Pożywka do wstępnego wzbogacania do odzyskiwania Salmonelli z próbek żywności zwierzęcej.
DNA AWAYThermo Fisher Scientific, Waltham, MA7010Eliminuje niechciane DNA i DNazę z laboratoryjnego stołu, szkła i plastiku bez wpływu na kolejne próbki DNA.
Oprogramowanie Genie ExplorerOptiGene Ltd., West Sussex, Wielka BrytaniaWersja 2.0.6.3Obsługuje zdalną obsługę instrumentów Genie, w tym uruchamianie LAMP i analizę danych.
Genie II lub Genie III (instrument LAMP)OptiGene Ltd., West Sussex, Wielka BrytaniaGEN2-02 lub GEN3-02Mały instrument zdolny do kontroli temperatury do 100 stopni Celsjusza; C z ± 0,1 &stopni; Dokładność C i jednoczesna detekcja fluorescencji poprzez kanał FAM. Genie II składa się z 2 bloków (A i B) z 8 próbkami w każdym bloku. Genie III ma pojedynczy blok, który mieści 8 próbek.
Genie stripOptiGene Ltd., West Sussex, Wielka BrytaniaOP-00088-dołkowe paski do mikroprobówek ze zintegrowanymi nasadkami blokującymi i objętością roboczą od 10 do 150 μl.
Uchwyt pasków GenieOptiGene Ltd., West Sussex, Wielka BrytaniaGBLOCKUżywany do przytrzymywania pasków Genie podczas ustawiania reakcji LAMP, aluminiowy uchwyt może być również używany jako fajny blok.
Roztwór kwasu solnego (HCl), 1 NThermo Fisher Scientific, Waltham, MASA48-500Dostosowuje pH próbek pokarmu zwierzęcego po dodaniu BPW i przed wzbogacaniem przez noc.
Blok grzewczyThermo Fisher Scientific, Waltham, MA88-860-022Podgrzewa próbki w temperaturze 100 ± 1 oC w celu ekstrakcji DNA.
InkubatorThermo Fisher Scientific, Waltham, MA3960Standardowy inkubator laboratoryjny.
ISO-001 izotermiczna mieszanka głównaOptiGene Ltd., West Sussex, Wielka BrytaniaISO-001Zoptymalizowana mieszanka główna upraszczająca montaż reakcji LAMP, zawierająca duży fragment polimerazy DNA GspSSD z Geobacillus spp., termostabilną nieorganiczną pirofosfatazę, bufor reakcyjny, MgSO4, dNTP i dwuniciowy barwnik wiążący DNA (kanał wykrywania FAM).
IsopropanolThermo Fisher Scientific, Waltham, MAA416Dezynfekuje powierzchnie robocze.
Startery LAMPIntegrated DNA Technologies Inc., Coralville, IANiestandardowestartery LAMP ze szczegółowymi informacjami w Tabeli 1.
MikrowirówkaEppendorf North America, Hauppauge, NY22620207MiniSpin plus osobista mikrowirówka.
Probówki do mikrowirówekThermo Fisher Scientific, Waltham, MA05-408-129Standardowe probówki do mikrowirówek.
Woda klasy molekularnejThermo Fisher Scientific, Waltham, MAAM9938Stosowana do wytwarzania podkładów, mieszanin starterów i mieszanin reakcyjnych LAMP.
Roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), 1 NThermo Fisher Scientific, Waltham, MASS266-1Dostosowuje pH próbek pokarmu zwierzęcego po dodaniu BPW i przed wzbogaceniem przez noc.
Nieselektywny agar (np. agar z krwią, agar odżywczy i agar sojowy z tryptykazą)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAR01202Stałe podłoże wzrostowe stosowane w uprawie Salmonelli.
Woda peptonowaBD Diagnostic Systems, Sparks, MD218071Rozcieńcza przez noc kultury Salmonelli w celu wytworzenia pozytywnego DNA kontrolnego.
Pipety i końcówkiMettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CAPipet Lite LTSStandardowe pipety i końcówki laboratoryjne.
Odczynnik do przygotowania próbek PrepMan UltraThermo Fisher Scientific, Waltham, MA4318930Prosty zestaw służący do szybkiego przygotowania matryc DNA do użycia w reakcji LAMP.
Szczep referencyjny Salmonella LT2ATCC, Manassas, VA700720Szczep referencyjny Salmonella stosowany jako kontrola pozytywna.
Rosół sojowy z tryptykazy (TSB)BD Diagnostic Systems, Sparks, MD211768Płynne podłoże wzrostowe stosowane w uprawie Salmonelli.
Mieszalnik wirowyScientific Industries, Inc., Bohemia, NYSI-0236Standardowy laboratoryjny mieszalnik wirowy.
Worek filtracyjny Whirl-pakNasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WIB01318Worki filtracyjne do przechowywania próbek karmy dla zwierząt w celu wstępnego wzbogacenia.

Bibliografia

  1. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).
  2. Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).
  3. Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
  4. Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications. Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).
  5. Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).
  6. Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).
  7. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  8. Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions. Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).
  9. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage. Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).
  10. Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry. Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).
  11. Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).
  12. WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en (2016).
  13. Kundapur, R. R., Nema, V. Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification. Cogent Biology. 2, 1137110(2016).
  14. WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en (2018).
  15. FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf (2015).
  16. FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf (2013).
  17. Bird, P., et al. Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01. Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).
  18. D'Agostino, M., et al. Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica. Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).
  19. Ge, B., et al. Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food. Frontiers in Microbiology. 10, 562(2019).
  20. D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella. Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).
  21. Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family. Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).
  22. Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).
  23. Yang, Q., Chen, S., Ge, B. Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).
  24. Yang, Q., et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce. Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).
  25. Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiology. 16 (1), 112(2016).
  26. Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food. International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).
  27. Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2020).
  28. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

LAMP dla Salmonellabadanie przesiewowe ywno ci dla zwierz tpotwierdzenie obecno ci Salmonellacel genowy invAprzygotowanie matrycy DNAdetekcja fluorescencyjna w czasie rzeczywistymizotermiczny master mixanaliza w paskach prob wekFDA Bacteriological Analytical Manual
Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.