Method Article

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli

DOI:

10.3791/61239

⸱

May 20th, 2020

 ,  ,  , 
1Center for Veterinary Medicine, U.S. Food and Drug Administration

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to test izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych (iNAAT), który wzbudził szerokie zainteresowanie w dziedzinie wykrywania patogenów. W tym miejscu przedstawiamy zatwierdzony przez wiele laboratoriów protokół Salmonella LAMP jako szybką, niezawodną i solidną metodę badań przesiewowych Salmonelli w żywności zwierzęcej i potwierdzania przypuszczalnej obecności Salmonelli w izolacji hodowli.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) stała się potężnym testem amplifikacji kwasu nukleinowego do szybkiego wykrywania licznych czynników bakteryjnych, grzybiczych, pasożytniczych i wirusowych. Salmonella jest patogenem bakteryjnym budzącym obawy dotyczące bezpieczeństwa żywności na całym świecie, w tym żywności dla zwierząt. Przedstawiono tutaj zatwierdzony przez wiele laboratoriów protokół Salmonella LAMP, który może być wykorzystany do szybkiego badania żywności dla zwierząt pod kątem obecności zanieczyszczenia Salmonellą, a także może być wykorzystany do potwierdzenia przypuszczalnych izolatów Salmonelli odzyskanych ze wszystkich kategorii żywności. Test LAMP jest ukierunkowany konkretnie na gen inwazji Salmonelli (invA) i jest szybki, czuły i wysoce specyficzny. Matrycowe DNA są przygotowywane z bulionów wzbogacających karmę zwierzęcą lub czystych kultur przypuszczalnych izolatów Salmonelli. Mieszaninę odczynników LAMP przygotowuje się przez połączenie izotermicznej mieszanki wzorcowej, starterów, matrycy DNA i wody. Test LAMP przebiega w stałej temperaturze 65 °C przez 30 minut. Pozytywne wyniki są monitorowane za pomocą fluorescencji w czasie rzeczywistym i można je wykryć już po 5 minutach. Test LAMP wykazuje wysoką tolerancję na inhibitory w karmie zwierzęcej lub pożywce hodowlanej, służąc jako szybka, niezawodna, solidna, opłacalna i przyjazna dla użytkownika metoda badań przesiewowych i potwierdzania Salmonelli. Metoda LAMP została niedawno włączona do Bakteriologicznego Podręcznika Analitycznego (BAM) Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration's Bacteriological Analytical Manual, BAM) Chapter 5.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to nowatorski test izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych (iNAAT) wynaleziony w 2000 roku przez grupę japońskich naukowców1. Poprzez tworzenie specyficznej dla celu struktury DNA pętli macierzystej podczas początkowych etapów, LAMP wykorzystuje polimerazę DNA wypierającą nić, aby skutecznie amplifikować ten materiał wyjściowy quasi-wykładniczo, co skutkuje 109 kopiami celu w czasie krótszym niż 1 h1. W porównaniu z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR), szeroko stosowaną metodą NAAT, LAMP ma kilka zalet. Po pierwsze, reakcje LAMP przeprowadza się w warunkach izotermicznych. Eliminuje to potrzebę stosowania wyrafinowanego przyrządu do cykli termicznych. Po drugie, LAMP jest wysoce tolerancyjny na podłoża hodowlane i substancje biologiczne2 z odpornością wykazaną zarówno w zastosowaniach klinicznych, jak i spożywczych3,4. Upraszcza to przygotowanie próbki i minimalizuje liczbę wyników fałszywie ujemnych5. Po trzecie, LAMP jest podatny na wiele platform detekcji, takich jak zmętnienie, kolorymetria, bioluminescencja, fluorescencja i mikrofluidyka6. Po czwarte, LAMP jest bardzo specyficzny, ponieważ używa od czterech do sześciu specjalnie zaprojektowanych starterów do kierowania na sześć do ośmiu określonych regionów1,7. Po piąte, LAMP jest ultraczuły, a liczne badania wykazały jego wyższą czułość na PCR lub real-time PCR8. Wreszcie, LAMP jest szybszy, ponieważ wiele testów przyjmuje teraz standardowy czas trwania 30 minut, podczas gdy testy typu PCR zwykle trwają 1−2 h8.

Te atrakcyjne cechy przyczyniły się do zastosowania LAMP w szerokich obszarach wykrywania patogenów, w tym w diagnostyce in vitro9, Animal disease diagnostics10, oraz Food and Environmental testing11. Warto zauważyć, że WHO zaleciła LAMPĘ DO GRUŹLICY (LAMP do Mycobacterium tuberculosis) jako ważny test zastępczy do mikroskopii rozmazowej plwociny w diagnostyce gruźlicy płuc w warunkach peryferyjnych12. Aplikacja LAMP wykracza również poza identyfikację mikrobiologiczną i obejmuje wykrywanie alergenów, gatunków zwierząt, oporności na leki, organizmów modyfikowanych genetycznie i pestycydów13.

Nietyfusowa Salmonella jest odzwierzęcym patogenem o dużym znaczeniu dla bezpieczeństwa żywności i zdrowia publicznego na całym świecie14. Został również zidentyfikowany jako ważne zagrożenie mikrobiologiczne w żywności dla zwierząt (tj. żywności dla zwierząt)15,16. Aby zapobiec chorobom/epidemiom Salmonelli spowodowanym skażoną żywnością dla ludzi i zwierząt, konieczne jest posiadanie szybkich, niezawodnych i solidnych metod testowania Salmonelli w różnych matrycach. W ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne wysiłki na arenie międzynarodowej w zakresie rozwoju i zastosowania testów Salmonella LAMP w szerokiej gamie matryc żywnościowych, co niedawno podsumowano w obszernym przeglądzie8. Kilka testów LAMP na obecność Salmonelli, w tym ten przedstawiony tutaj, pomyślnie przeszło walidację w wielu laboratoriach zgodnie z dobrze znanymi międzynarodowymi wytycznymi17,18,19,20.

Nasz test Salmonella LAMP jest ukierunkowany na gen inwazji Salmonelli invA (numer dostępu GenBank M90846)21 i jest szybki, niezawodny i wytrzymały w wielu matrycach żywności4,22,23,24,25,26. Metoda została zwalidowana na sześciu matrycach pokarmów zwierzęcych w badaniu przedzespołowym26 oraz na suchej karmie dla psów w wielolaboratoryjnym badaniu zespołowym19. W rezultacie, przedstawiona tutaj metoda Salmonella LAMP została niedawno włączona do Bakteriologicznego Podręcznika Analitycznego (BAM) Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) Rozdział 5 Salmonella27, aby służyć dwóm celom, po pierwsze jako szybka metoda przesiewowa na obecność Salmonelli w żywności zwierzęcej, a po drugie jako wiarygodna metoda potwierdzania przypuszczalnej Salmonelli wyizolowanej ze wszystkich pokarmów.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Mieszanka reakcyjna LAMP zawiera polimerazę DNA, bufor,MgSO4, dNTP, startery, matrycę DNA i wodę. Pierwsze cztery odczynniki są zawarte w izotermicznej mieszance wzorcowej (tabela materiałów). Podkłady są wstępnie mieszane we własnym zakresie, aby stały się mieszanką podkładów (10x). Matryce DNA można przygotować z bulionów wzbogacających próbki pokarmu zwierzęcego do celów przesiewowych lub z kultur przypuszczalnych izolatów Salmonelli w celu potwierdzenia. Ponadto w każdej serii LAMP włącza się kontrolę pozytywną (DNA wyekstrahowane z dowolnych szczepów referencyjnych Salmonelli, np. Salmonella enterica serowar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) oraz kontrolę bez matrycy (NTC; sterylna woda molekularna).

1. Przygotowanie matryc DNA

  1. Aby przygotować matryce DNA ze wzbogaconych pokarmów dla zwierząt, wykonaj następujące kroki.
    1. Odważyć w asepcie 25 g próbki karmy zwierzęcej (np. suchej karmy dla kotów, suchej karmy dla psów, paszy dla bydła, paszy dla koni, paszy dla drobiu i paszy dla świń) do sterylnego worka filtrującego (tabela materiałów) lub równoważnego. Umieść worek w dużym pojemniku lub stojaku, aby uzyskać wsparcie podczas inkubacji.
    2. Dodać 225 ml sterylnej buforowanej wody peptonowej (BPW). Dobrze wymieszaj, wirując i wykonując krótki masaż dłoni. Odstawić w temperaturze pokojowej na 60 ± 5 min.
    3. Dobrze wymieszaj, mieszając i określ pH za pomocą bibułki testowej. W razie potrzeby dostosować pH do 6,8 ± 0,2 za pomocą sterylnego 1 N NaOH lub 1 N HCl. Inkubować w temperaturze 35 ± 2 °C przez 24 ± 2 godziny.
    4. Dobrze wymieszaj, obracając torebkę zawierającą buliony wzbogacające karmę dla zwierząt. Przenieść 1 ml z przefiltrowanej strony worka do probówki mikrowirówkowej. Wiruj krótko.
    5. Ekstrahować DNA za pomocą odczynnika do przygotowania próbki (tabela materiałów) w następujący sposób.
      1. Wirować przy 900 x g przez 1 minutę w celu usunięcia dużych cząstek i przeniesienia supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki.
      2. Wirować przy 16 000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.
      3. Zawiesić osad w 100 μl odczynnika do przygotowania próbki i ogrzewać w temperaturze 100 ± 1 °C przez 10 minut w suchym bloku grzewczym.
      4. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać próbki ekstraktów DNA w temperaturze -20 °C.
  2. Aby przygotować matryce DNA z przypuszczalnych kultur Salmonelli, wykonaj następujące kroki.
    1. Uzyskać przypuszczalne izolaty Salmonelli z izolacji kultur we wszystkich produktach spożywczych zgodnie z FDA BAM Rozdział 5 Salmonella sekcja D: Izolacja Salmonelli27.
    2. Zaszczepić przypuszczalne izolaty Salmonelli na nieselektywnej płytce agarowej (np. agarze z krwią, agarze z pożywką i agarze sojowym z tryptykazą) i inkubować w temperaturze 35 ± 2 °C przez 24 ± 2 godziny.
    3. Przenieść kilka pojedynczych kolonii do 5 ml bulionu sojowego z tryptykazą (TSB) lub bulionu z naparem z serca (BHI) i inkubować w temperaturze 35 ± 2 °C przez 16 ± 2 godz.
      UWAGA: Ten krok może być opcjonalny, jeśli przypuszczalna hodowla Salmonelli jest czysta. W takim przypadku matryce DNA można przygotować, zawieszając kilka pojedynczych kolonii w 5 ml TSB i podgrzewając 500 μl zawiesiny w temperaturze 100 ± 1 °C przez 10 minut w suchym bloku grzewczym. Kontynuuj krok 5 poniżej.
    4. Przenieść 500 μl kultury przez noc do probówki mikrowirówki i ogrzewać w temperaturze 100 ± 1 °C przez 10 minut w suchym bloku grzewczym.
    5. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać wyizolowane ekstrakty DNA w temperaturze -20 °C.
  3. Aby przygotować DNA do kontroli pozytywnej, należy postępować zgodnie z podobnymi krokami, jak powyżej, aby przygotować matryce DNA z przypuszczalnych kultur Salmonelli z jednym dodatkowym etapem rozcieńczania.
    1. Zaszczepić S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) lub dowolne szczepy referencyjne Salmonelli na nieselektywnej płytce agarowej (np. agar z krwią, agar odżywczy i agar sojowy z tryptykazą) i inkubować w temperaturze 35 ± 2 °C przez 24 ± 2 godziny.
    2. Przenieść kilka pojedynczych kolonii do 5 ml bulionu TSB lub BHI i inkubować w temperaturze 35 ± 2 °C przez 16 ± 2 godziny, aby osiągnąć ~109 CFU/ml.
    3. Seryjnie rozcieńczyć kulturę przez noc w 0,1% wodzie peptonowej, aby uzyskać ~107 CFU/ml.
    4. Przenieść 500 μl tego rozcieńczenia do probówki mikrowirówki i ogrzewać w temperaturze 100 ± 1 °C przez 10 minut w suchym bloku grzewczym.
    5. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać DNA kontroli dodatniej w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie mieszanki podkładowej (10x)

  1. Otrzymać komercyjnie zsyntetyzowane startery LAMP (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF i Sal4-LB) ze standardowym oczyszczaniem odsalającym (Tabela 1).
powiedział: powiedział:
Nazwa podkładuopisSekwencja (5'-3')Długość (bp)
Sal4-F3Przednie zaskrywki zewnętrzneGAACGTGTCGCGGAAGTCRozdział 18
Sal4-B3Podkład zewnętrzny do tyłuCGGCAATAGCGTCACCTTRozdział 18
Sal4-FIPWstępny podkład wewnętrznyGCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG38 Rozdział 38
Sal4-BIPWsteczny podkład wewnętrznyGCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC38 Rozdział 38
Sal4-LFPodkład do przodu pętliTCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG25
Sal4-LBPodkład wsteczny w pętliAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG powiedział:21

Tabela 1: Startery LAMP do badania przesiewowego Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania izolacji Salmonelli z hodowli. Startery zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencję Salmonella invA (numer dostępu GenBank M90846).

  1. Przygotować roztwory podstawowe każdego startera (100 μM) poprzez ponowne uwodnienie startera odpowiednią ilością sterylnej wody molekularnej. Dobrze wymieszać przez wirowanie przez 10 s i przechowywać w temperaturze -20 °C (-80 °C przy długotrwałym przechowywaniu).
  2. Przygotuj mieszankę podkładową (10x) zgodnie z arkuszem roboczym (Tabela 2). Dodaj odpowiednie objętości roztworów podstawowych startera i sterylnej wody molekularnej do probówki mikrowirówkowej. Dobrze wymieszaj wszystkie odczynniki, wirując przez 10 sekund.
szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt.
składnikStężenie w magazynie (μM)Stężenie mieszanki gruntującej (μM)Objętość (μL)
Podkład Sal4-F3100110
Podkład Sal4-B3100110
Podkład Sal4-FIP100Rozdział 18180
Podkład Sal4-BIP100Rozdział 18180
Podkład Sal4-LF10010100
Podkład Sal4-LB10010100
Woda klasy molekularnejN/aN/a420
łącznyN/aN/a1000

Tabela 2: Arkusz roboczy do przygotowania mieszanki podkładów LAMP (10x). Startery wymieniono w Tabeli 1.

  1. Porcję 10 porcji startera wymieszać do 500 μl na probówkę mikrowirówki i przechowywać w temperaturze -20 °C.

3. Montaż reakcji LAMP

UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, zaleca się fizyczne oddzielenie obszarów używanych do przygotowania mieszanki głównej LAMP i dodania matryc DNA. Rysunek 1 to diagram LAMP.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczny schemat przebiegu pracy w przypadku Salmonella LAMP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przygotowanie i konfiguracja uruchamiania
    1. Czysta ławka z izopropanolem i roztworem rozkładającym DNA i DNazę (tabela materiałów). Wyczyść pipety i uchwyty pasków probówek (tabela materiałów) roztworem rozkładającym DNA i DNazy.
    2. Rozmrozić izotermiczną mieszankę główną, mieszankę starterów (10x), wodę klasy cząsteczkowej, DNA kontroli pozytywnej i matryce DNA w temperaturze pokojowej.
    3. Włącz instrument LAMP (Tabela materiałów) i dotknij ekranu początkowego, aby uzyskać dostęp do ekranu głównego. Wykonaj następujące kroki, aby utworzyć plik run.
      UWAGA: Jeden model przyrządu LAMP ma 2 bloki (A i B) z 8 próbkami w każdym bloku, a inny model ma pojedynczy blok, który mieści 8 próbek (Tabela materiałów).
      1. Dotknij opcji LAMP+Anneal i wybierz opcję Edytuj, aby wprowadzić informacje o próbce.
        UWAGA: Domyślny profil pracy LAMP składa się ze wzmocnienia w temperaturze 65 °C przez 30 minut i fazy wyżarzania od 98 °C do 80 °C ze spadkiem o 0,05 °C na sekundę.
      2. Dotknij każdego wiersza próbki, aby aktywować kursor i wprowadzić odpowiednie informacje o próbce, używając ikony bloku AB, aby przełączać się między dwoma blokami instrumentów LAMP.
      3. Stuknij ikonę Sprawdź po wprowadzeniu wszystkich przykładowych informacji.
        UWAGA: Opcjonalnie można zapisać konfigurację przebiegu (nazywaną "Profilem", która zawiera przykładowe informacje wraz z domyślnym profilem uruchamiania LAMP) do późniejszego wykorzystania. Stuknij ikonę Zapisz i nadaj profilowi unikalną nazwę. Podczas testowania tego samego zestawu próbek następnym razem można zainicjować nowy przebieg przy użyciu zapisanego profilu. Stuknij ikonę folderu w lewym dolnym rogu ekranu głównego i wybierz Profil, aby załadować zapisane profile.
  2. Zespół reakcyjny LAMP
    UWAGA: W przypadku korzystania z obu bloków instrumentów LAMP (A i B, w sumie 16 próbek), przygotuj miks główny LAMP na 18 próbek. W przypadku korzystania tylko z jednego bloku przyrządów LAMP (łącznie 8 próbek), należy przygotować mieszankę wzorcową LAMP na 10 próbek. W przypadku innych numerów próbek należy odpowiednio dostosować objętość, aby zniwelować straty związane z pipetowaniem. Zawsze uwzględniaj kontrolę dodatnią i NTC w każdym uruchomieniu lampy. Zaleca się powtórne badanie każdej próbki w niezależnych seriach LAMP.
    1. Przygotuj główną mieszankę LAMP zgodnie z arkuszem roboczym (Tabela 3). Dodaj odpowiednie objętości izotermicznej mieszanki wzorcowej, mieszanki starterów i wody molekularnej do probówki mikrowirówki i delikatnie wiruj przez 3 s. Krótko odwirować.
    2. Umieścić pasek probówki w uchwycie paska i rozprowadzić 23 μl mieszanki wzorcowej LAMP do każdego dołka.
    3. Zwiruj wszystkie matryce DNA i krótko odwiruj. Dodaj 2 μl matrycy DNA do odpowiedniego dołka i szczelnie zakryj.
    4. Wyjmij pasek probówki z uchwytu i przesuń nadgarstek, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki zebrały się na dnie probówki.
    5. Załaduj pasek rurkowy do bloku (bloków) przyrządów LAMP, upewniając się, że zaślepki są dobrze zaślepione przed zamknięciem pokrywy.
szt. szt. Rozdział Rozdział szt.
składnikKonfiguracja roboczaKońcowa reakcja conc.Objętość na próbkę (μl)Objętość dla 18 próbek (μl)Objętość na 10 próbek (μL)
ISO-001 izotermiczna mieszanka główna1,67xa1x15270150
Mieszanka podkładowa10x1xRozdział 2.5Rozdział 4525
Woda klasy molekularnejN/aN/aRozdział 5.59955
Suma częściowa miksu głównegoN/aN/a23Z numerem 414230
Matryca DNAN/aN/acyfra arabskaN/aN/a

Tabela 3: Arkusz roboczy do przygotowania mieszanki reakcyjnej LAMP. Mieszaninę podkładów (10x) przygotowuje się zgodnie z tabelą 2 przy użyciu roztworów podstawowych starterów wymienionych w tabeli 1.

4. Bieg LAMP

UWAGA: Podczas pracy LAMP, odczyty fluorescencji są rejestrowane za pomocą kanału FAM. Wartości czasu do osiągnięcia wartości szczytowych (Tmax; min) są wyznaczane automatycznie przez przyrząd dla punktu czasowego, w którym współczynnik fluorescencji osiąga maksymalną wartość krzywej szybkości wzmocnienia. Tm (°C) jest temperaturą topnienia/wyżarzania końcowego wzmocnionego produktu.

  1. Kliknij ikonę Uruchom w prawym górnym rogu ekranu i wybierz blok (bloki) zawierający paski rurowe, aby rozpocząć uruchamianie LAMP.
  2. Opcjonalnie, gdy reakcja jest w toku, dotknij kart Temperatura, Wzmocnienie i Wyżarzanie, aby zobaczyć dynamiczne zmiany różnych parametrów podczas pracy LAMP.
  3. Po zakończeniu przebiegu dotknij kart Amplifikacja i Wyżarzanie, aby zobaczyć pełne krzywe wzmocnienia i wyżarzania, a następnie dotknij karty Wyniki, aby wyświetlić wyniki.
  4. Opcjonalnie, w celu prowadzenia dokumentacji, zapisz numer serii znajdujący się w lewym górnym rogu ekranu, używając formatu "numer seryjny number_run przyrządu", np. "GEN2-2209_0030".

5. Interpretacja wyników LAMP

UWAGA: Wyniki LAMP można przeglądać bezpośrednio na tablicy wskaźników LAMP i/lub za pomocą oprogramowania LAMP (Tabela Materiałów).

  1. Aby zinterpretować wyniki LAMP na tablicy wskaźników, wykonaj następujące czynności.
    1. Stuknij ikonę Folder w lewym dolnym rogu ekranu głównego i wybierz Dziennik, aby przejść do lokalizacji pliku i załadować interesujący Cię przebieg LAMP.
      UWAGA: Biegi LAMP są uporządkowane według daty, zaczynając od roku.
    2. Obserwuj pięć zakładek skojarzonych z każdym przebiegiem: Profil, Temperatura, Wzmocnienie, Wyżarzanie i Wyniki.
      UWAGA: Zakładki Profil i Temperatura pokazują odpowiednio zaprogramowaną i rzeczywistą temperaturę w studzienkach na próbki w miarę postępu reakcji LAMP. Zakładki Amplifikacja i Wyżarzanie pokazują odczyty fluorescencji i zmiany fluorescencji odpowiednio podczas fazy amplifikacji i wyżarzania. Na karcie Wyniki wyświetlany jest tabelaryczny widok wyników LAMP.
    3. Stuknij kartę Wyniki, aby obserwować wyniki LAMP dla każdej studni.
      UWAGA: Istnieją trzy kolumny (Well, Amplifikacja i Wyżarzanie). Kolumna "Amplifikacja" pokazuje wartości czasu do osiągnięcia wartości szczytowych (Tmax; min: s) dla każdej próbki ("Well"), a kolumna "Anneal" pokazuje temperatury topnienia/wyżarzania (Tm; °C) dla każdego amplifikowanego produktu w tej studni.
    4. Zinterpretuj wyniki LAMP i podaj końcowe wyniki LAMP w następujący sposób.
      1. Najpierw sprawdź studzienki kontrolne. Studzienka NTC powinna mieć ślepą wartość Tmax, podczas gdy Tm może być ślepa (oba modele przyrządów LAMP) lub < 83 °C (tylko dla modelu przyrządu LAMP z dwoma blokami). Studzienka kontroli dodatniej powinna mieć T max między 5 a 10 min i Tm około 90 °C.
      2. Zbadaj studzienki na próbki. Wszystkie próbki o prawidłowym T m (około 90 °C) i Tmax (między 5-30 min) uważa się za dodatnie na obecność Salmonelli.
      3. Raportowanie ostatecznych wyników LAMP na podstawie wyników z duplikatów. Jeśli zduplikowane przebiegi mają spójne wyniki, można podać końcowe wyniki LAMP. Jeśli zduplikowane przebiegi są niespójne, powtórz oba przebiegi niezależnie. Jeśli wyniki są nadal niespójne, próbkę należy uznać za przypuszczalnie dodatnią na obecność Salmonelli i będzie musiała przejść potwierdzenie posiewu.
  2. Aby zinterpretować wyniki LAMP za pomocą oprogramowania, wykonaj następujące kroki.
    1. Kliknij ikonę Komputer w lewym panelu i przejdź do lokalizacji pliku, aby załadować interesujący Cię przebieg LAMP.
      UWAGA: Komputer z zainstalowanym oprogramowaniem nie musi być podłączony do przyrządu LAMP w celu analizy wyników LAMP, tj. dostępny jest zdalny dostęp. Biegi LAMP są uporządkowane według dat.
    2. Zwróć uwagę na siedem zakładek skojarzonych z każdym przebiegiem: Profil, Temperatura, Wzmocnienie, Szybkość wzmocnienia, Wyżarzanie, Pochodna wyżarzania i Wynik.
      UWAGA: Podobnie jak w widoku na tablicy rozdzielczej, zakładki Profil i Temperatura pokazują odpowiednio zaprogramowaną i rzeczywistą temperaturę w studzienkach na próbki w miarę postępu reakcji LAMP. Zakładki Amplifikacja/Szybkość amplifikacji i Pochodna wyżarzania/wyżarzania pokazują odczyty fluorescencji lub zmiany fluorescencji odpowiednio podczas fazy amplifikacji i wyżarzania. Na karcie Results (Wyniki) wyświetlane są tabelaryczne wyniki lamp, które nieznacznie różnią się od wyników na tablicy rozdzielczej.
    3. Stuknij kartę Amplification Rate (Szybkość wzmocnienia), aby wyświetlić graficzne zestawienie współczynników fluorescencji według czasu. Kliknij ikonę Ustawienia w prawym górnym rogu ekranu i dostosuj "Współczynnik progu wykrywania szczytu" od 0,020 do 0,010,
      UWAGA: Regulacja jest konieczna, aby upewnić się, że wszystkie prawidłowe wartości szczytowe są identyfikowane, a wyniki uzyskane za pomocą oprogramowania są zgodne z wynikami wyświetlanymi na tablicy wskaźników.
    4. Stuknij kartę Wynik, aby obserwować wyniki LAMP dla każdej studzienki.
      UWAGA: Istnieją cztery kolumny (Nazwa wykresu, Numer studni, Nazwa studni i Wartość szczytowa). Górna część kolumny "Wartość szczytowa" pokazuje "Amp Time" (Tmax; min:s) dla każdej próbki ("Nazwa studni"), podczas gdy dolna część pokazuje "Pochodną wyżarzania" (Tm; °C) dla dowolnego amplifikowanego produktu w tym dołku.
    5. Zinterpretować wyniki LAMP i podać końcowe wyniki LAMP, wykonując podobne kroki, jak w przypadku korzystania z tablicy rozdzielczej, z jednym wyjątkiem, że studzienka NTC i inne próbki ujemne powinny mieć ślepą Tm, ponieważ ustawienia oprogramowania LAMP eliminują te wyniki T m < 83 °C. Podobnie, wszystkie próbki o prawidłowym Tm (około 90 °C) i Tmax (między 5-30 min) uważa się za dodatnie na obecność Salmonelli.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 i Rysunek 3 pokazuje reprezentatywne wykresy/tabele LAMP wyświetlane na obu platformach. W tym przebiegu LAMP próbki od S1 do S6 są 10-krotnymi seryjnymi rozcieńczeniami S. enterica serowar Infantis ATCC 51741 w zakresie od 1,1 x 106 CFU do 11 CFU na reakcję. Kontrolą pozytywną jest S. enterica serowar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) w stężeniu 1,7 x 104 CFU na reakcję, a NTC to woda o czystości cząsteczkowej.

Jak pokazano w Rysunek 2E i Rysunek 3G, zarówno studzienki NTC, jak i PC są prawidłowymi kontrolkami. Studzienka NTC ma ślepą wartość Tmax, podczas gdy Tm wynosi < 83 °C na tablicy przyrządów LAMP i pustą w oprogramowaniu LAMP, co sugeruje wynik negatywny. Studnia PC ma Tmax 7 min 45 s i Tm ~ 90 °C na obu platformach, co sugeruje pozytywny wynik. Próbki od S1 do S6 mają Tmax od 6 min 30 s do 12 min 15 s, przy czym wszystkie są dodatnie na obecność Salmonelli.

Po zduplikowanych przebiegach tego samego zestawu próbek, dla tych próbek podawane są końcowe wyniki LAMP. Ta reprezentatywna seria LAMP pokazuje, że LAMP z powodzeniem wykrywa Salmonellę w szerokim zakresie stężeń w próbkach.

figure-results-1
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki LAMP wyświetlane na tablicy wskaźników LAMP. (A) Zakładka Profil przedstawia zaprogramowany profil temperatury. (B) Zakładka Temperatura pokazuje rzeczywiste temperatury w studzienkach na próbki w miarę postępu reakcji LAMP. (C) Zakładka Amplifikacja pokazuje odczyty fluorescencji podczas LAMP amplifikacja. (D) Zakładka Wyżarzanie pokazuje zmiany fluorescencji (pochodnej) podczas fazy wyżarzania. (E) Zakładka Wyniki przedstawia tabelaryczne wyniki LAMP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki LAMP wyświetlane w oprogramowaniu LAMP. (A) Zakładka Profil przedstawia zaprogramowany profil temperatury. (B) Zakładka Temperatura pokazuje rzeczywiste temperatury w studzienkach na próbki w miarę postępu reakcji LAMP. (C) Zakładka Amplifikacja pokazuje odczyty fluorescencji podczas LAMP amplifikacja. (D) Zakładka Amplification Rate pokazuje zmiany fluorescencji (współczynnika fluorescencji) podczas LAMP amplifikacja. (E) Zakładka Wyżarzanie pokazuje odczyty fluorescencji podczas fazy wyżarzania. (F) Zakładka Pochodna wyżarzania pokazuje zmiany fluorescencji (pochodnej) podczas fazy wyżarzania. (G) Zakładka Wynik pokazuje tabelaryczne przedstawienie wyników LAMP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy tutaj prostą, szybką, specyficzną i czułą metodę LAMP do badania przesiewowego i potwierdzania Salmonelli odpowiednio w żywności zwierzęcej i czystej kulturze. Dzięki wygodzie izotermicznej mieszanki wzorcowej, która zawiera cztery kluczowe odczynniki, oraz gotowej do użycia, przygotowanej przez siebie mieszanki starterów, przygotowanie reakcji LAMP wymaga tylko kilku etapów pipetowania (ilustracja 1). Całkowity czas pracy wraz z fazami amplifikacji i wyżarzania wynosi mniej niż 38 minut (Rysunek 2A,B i Rysunek 3A,B). Pozytywne wyniki są monitorowane za pomocą fluorescencji w czasie rzeczywistym (Rysunek 2C i Rysunek 3C,D) i można je wykryć już po 5 minutach26. Faza wyżarzania służy jako dodatkowe potwierdzenie specyficzności LAMP, ponieważ tylko próbki o prawidłowym Tm (około 90 °C) są zgłaszane jako dodatnie (rysunek 2D,E i rysunek 3E−G). Wrażliwość 1 komórki Salmonelli w czystej kulturze i < 1 jtk/25 g w karmie zwierzęcej była zgłaszana wcześniej26.

Ponieważ LAMP jest dość skuteczny i generuje dużą ilość DNA1, bardzo ważne jest, aby stosować najlepsze praktyki laboratoryjne w celu zapobiegania zanieczyszczeniu krzyżowemu, które może obejmować fizyczne oddzielenie obszarów do przygotowania mieszanki wzorcowej LAMP i dodanie matryc DNA, unikanie wytwarzania aerozoli, używanie końcówek do pipet filtrujących, częstą zmianę rękawiczek i powstrzymanie się od otwierania probówek reakcyjnych LAMP po amplifikacji.

Swoistość tej metody Salmonella LAMP została wcześniej przetestowana przy użyciu 300 szczepów bakteryjnych (247 Salmonelli ze 185 serowarów i 53 nie-Salmonella) i wykazano, że jest w 100% swoista26. W szczególności zaobserwowano znaczące różnice w Tmax między dwoma gatunkami Salmonelli, S. enterica i Salmonella bongori, oraz między podgatunkami S. enterica, zwłaszcza subsp. arizonae (IIIa)26. Niemniej jednak były to nadal ważne pozytywne wyniki zgodnie z zasadami interpretacji wyników LAMP. W naszym wielolaboratoryjnym badaniu dotyczącym suchej karmy dla psów, w którym uczestniczyło 14analityków19, sporadycznie obserwowano próbki o niespójnych wynikach w zduplikowanych seriach LAMP. Zazwyczaj były to próbki z opóźnionymi wynikami dodatnimi (Tmax > 15 min). Powtórzenie obu przebiegów niezależnie zwykle rozwiązywało problem. Rzadziej obserwowaliśmy próbki z prawidłowymi wartościami Tm, ale bez lub nieregularnymi wartościami Tmax (< 5 min). Było to zwykle spowodowane pęcherzykami powietrza w rurce reakcyjnej.

Przez cały cykl życia opracowywania metody LAMP, oceny, badań przedzespołowych i walidacji w wielu laboratoriach zaobserwowaliśmy wysoką tolerancję LAMP na inhibitory w różnych karmach zwierzęcych lub matrycach żywnościowych i pożywkach hodowlanych 4,19,22,23,24, podkreślając solidność metody i współpracując z wieloma innymi badaniami na skalę globalną 8. Jest to lepsze rozwiązanie w porównaniu z PCR lub PCR w czasie rzeczywistym, które zwykle wymaga wewnętrznej kontroli amplifikacji, aby upewnić się, że negatywne wyniki nie są spowodowane hamowaniem macierzy28. Co więcej, LAMP wykazał podobną (lub wyższą) swoistość i czułość w porównaniu z PCR lub PCR w czasie rzeczywistym w zdecydowanej większości badań8. Koszt odczynników LAMP wynosi około 1 USD za reakcję. Instrumenty LAMP używane w tym protokole są małe, łatwe w utrzymaniu i przenośne. Mogą poradzić sobie z każdą metodą amplifikacji izotermicznej, która wykorzystuje wykrywanie celu za pomocą pomiaru fluorescencji, w tym LAMP. Za pomocą oprogramowania LAMP można generować kompleksowe raporty w wielu formatach (pdf, tekst i obraz).

Walidacja metody jest krytycznym krokiem, zanim nowa metoda będzie mogła zostać przyjęta do rutynowego użytku. Warto zauważyć, że zgłoszony tutaj protokół LAMP pomyślnie przeszedł walidację w wielu laboratoriach19. Oczekuje się, że wraz z niedawnym włączeniem tego protokołu LAMP do amerykańskiego raportu FDA BAM Chapter 5 Salmonella27, metoda ta zyska znacznie szersze zastosowanie, zarówno jako szybka metoda przesiewowa w żywności zwierzęcej, jak i jako wiarygodna metoda potwierdzania przypuszczalnych izolatów Salmonelli ze wszystkich kategorii żywności.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Poglądy wyrażone w tym manuskrypcie są poglądami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają oficjalną politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) lub rządu Stanów Zjednoczonych. Odniesienie do jakichkolwiek materiałów komercyjnych, sprzętu lub procesu w żaden sposób nie stanowi aprobaty, poparcia ani rekomendacji Agencji ds. Żywności i Leków.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują członkom Podkomitetu ds. Walidacji Metod Mikrobiologicznych FDA (MMVS) oraz Rady Podręcznika Analizy Bakteriologicznej (BAM) za krytyczny przegląd badań walidacyjnych metody Salmonella LAMP.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bulion do infuzji serca (BHI)BD Diagnostic Systems, Sparks, MD299070Płynna pożywka wzrostowa stosowana w uprawie Salmonelli.
Buforowana woda peptonowa (BPW)BD Systemy diagnostyczne, iskry, MD218105Pożywka do wstępnego wzbogacania do odzyskiwania Salmonelli z próbek żywności zwierzęcej.
DNA AWAYThermo Fisher Scientific, Waltham, MA7010Eliminuje niechciane DNA i DNazę z laboratoryjnego stołu, szkła i plastiku bez wpływu na kolejne próbki DNA.
Oprogramowanie Genie ExplorerOptiGene Ltd., West Sussex, Wielka BrytaniaWersja 2.0.6.3Obsługuje zdalną obsługę instrumentów Genie, w tym uruchamianie LAMP i analizę danych.
Genie II lub Genie III (instrument LAMP)OptiGene Ltd., West Sussex, Wielka BrytaniaGEN2-02 lub GEN3-02Mały instrument zdolny do kontroli temperatury do 100 stopni Celsjusza; C z ± 0,1 &stopni; Dokładność C i jednoczesna detekcja fluorescencji poprzez kanał FAM. Genie II składa się z 2 bloków (A i B) z 8 próbkami w każdym bloku. Genie III ma pojedynczy blok, który mieści 8 próbek.
Genie stripOptiGene Ltd., West Sussex, Wielka BrytaniaOP-00088-dołkowe paski do mikroprobówek ze zintegrowanymi nasadkami blokującymi i objętością roboczą od 10 do 150 μl.
Uchwyt pasków GenieOptiGene Ltd., West Sussex, Wielka BrytaniaGBLOCKUżywany do przytrzymywania pasków Genie podczas ustawiania reakcji LAMP, aluminiowy uchwyt może być również używany jako fajny blok.
Roztwór kwasu solnego (HCl), 1 NThermo Fisher Scientific, Waltham, MASA48-500Dostosowuje pH próbek pokarmu zwierzęcego po dodaniu BPW i przed wzbogacaniem przez noc.
Blok grzewczyThermo Fisher Scientific, Waltham, MA88-860-022Podgrzewa próbki w temperaturze 100 ± 1 oC w celu ekstrakcji DNA.
InkubatorThermo Fisher Scientific, Waltham, MA3960Standardowy inkubator laboratoryjny.
ISO-001 izotermiczna mieszanka głównaOptiGene Ltd., West Sussex, Wielka BrytaniaISO-001Zoptymalizowana mieszanka główna upraszczająca montaż reakcji LAMP, zawierająca duży fragment polimerazy DNA GspSSD z Geobacillus spp., termostabilną nieorganiczną pirofosfatazę, bufor reakcyjny, MgSO4, dNTP i dwuniciowy barwnik wiążący DNA (kanał wykrywania FAM).
IsopropanolThermo Fisher Scientific, Waltham, MAA416Dezynfekuje powierzchnie robocze.
Startery LAMPIntegrated DNA Technologies Inc., Coralville, IANiestandardowestartery LAMP ze szczegółowymi informacjami w Tabeli 1.
MikrowirówkaEppendorf North America, Hauppauge, NY22620207MiniSpin plus osobista mikrowirówka.
Probówki do mikrowirówekThermo Fisher Scientific, Waltham, MA05-408-129Standardowe probówki do mikrowirówek.
Woda klasy molekularnejThermo Fisher Scientific, Waltham, MAAM9938Stosowana do wytwarzania podkładów, mieszanin starterów i mieszanin reakcyjnych LAMP.
Roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), 1 NThermo Fisher Scientific, Waltham, MASS266-1Dostosowuje pH próbek pokarmu zwierzęcego po dodaniu BPW i przed wzbogaceniem przez noc.
Nieselektywny agar (np. agar z krwią, agar odżywczy i agar sojowy z tryptykazą)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAR01202Stałe podłoże wzrostowe stosowane w uprawie Salmonelli.
Woda peptonowaBD Diagnostic Systems, Sparks, MD218071Rozcieńcza przez noc kultury Salmonelli w celu wytworzenia pozytywnego DNA kontrolnego.
Pipety i końcówkiMettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CAPipet Lite LTSStandardowe pipety i końcówki laboratoryjne.
Odczynnik do przygotowania próbek PrepMan UltraThermo Fisher Scientific, Waltham, MA4318930Prosty zestaw służący do szybkiego przygotowania matryc DNA do użycia w reakcji LAMP.
Szczep referencyjny Salmonella LT2ATCC, Manassas, VA700720Szczep referencyjny Salmonella stosowany jako kontrola pozytywna.
Rosół sojowy z tryptykazy (TSB)BD Diagnostic Systems, Sparks, MD211768Płynne podłoże wzrostowe stosowane w uprawie Salmonelli.
Mieszalnik wirowyScientific Industries, Inc., Bohemia, NYSI-0236Standardowy laboratoryjny mieszalnik wirowy.
Worek filtracyjny Whirl-pakNasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WIB01318Worki filtracyjne do przechowywania próbek karmy dla zwierząt w celu wstępnego wzbogacenia.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).">Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).
  2. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).">Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).
  3. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).">Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
  4. Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications. Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).">Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications. Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).
  5. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).">Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).
  6. Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).">Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).
  7. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).">Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  8. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions. Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).">Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions. Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).
  9. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage. Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).">Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage. Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).
  10. Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry. Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).">Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry. Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).
  11. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).">Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).
  12. http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en (2016).">WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en (2016).
  13. Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification. Cogent Biology. 2, 1137110(2016).">Kundapur, R. R., Nema, V. Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification. Cogent Biology. 2, 1137110(2016).
  14. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en (2018).">WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en (2018).
  15. http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf (2015).">FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf (2015).
  16. https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf (2013).">FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf (2013).
  17. Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01. Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).">Bird, P., et al. Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01. Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).
  18. Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica. Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).">D'Agostino, M., et al. Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica. Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).
  19. Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food. Frontiers in Microbiology. 10, 562(2019).">Ge, B., et al. Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food. Frontiers in Microbiology. 10, 562(2019).
  20. A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella. Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).">D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella. Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).
  21. Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family. Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).">Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family. Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).
  22. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).">Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).
  23. Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).">Yang, Q., Chen, S., Ge, B. Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).
  24. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce. Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).">Yang, Q., et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce. Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).
  25. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiology. 16 (1), 112(2016).">Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiology. 16 (1), 112(2016).
  26. Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food. International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).">Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food. International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).
  27. http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2020).">Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2020).
  28. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).">Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Salmonella LAMPLoop Mediated Isothermal AmplificationAnimal Food ScreeningSalmonella ConfirmationinvA Gene TargetDNA Template PreparationReal Time Fluorescence DetectionIsothermal Master MixTube Strip AssayFDA Bacteriological Analytical Manual

Related Articles