Ta metoda opisuje protokół wysokoprzepustowego przygotowania ekstraktu białkowego z próbek Caenorhabditis elegans i późniejszej koimmunoprecypitacji.
Artykuł metodologiczny
Preparat ekstraktu białkowego i koimmunoprecypitacja z Caenorhabditis elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metody koimmunoprecypitacji są często używane do badania interakcji białko-białko. Potwierdzenie hipotetycznych oddziaływań białko-białko lub identyfikacja nowych może dostarczyć bezcennych informacji na temat funkcji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Niektóre z tradycyjnych metod przygotowania ekstraktu często wymagają pracochłonnych i czasochłonnych technik. W tym przypadku zmodyfikowany protokół przygotowania ekstraktu przy użyciu homogenizatora młyna perełkowego i kulek metalowych jest opisywany jako szybka alternatywa dla tradycyjnych metod przygotowania białka. Ta metoda przygotowania ekstraktu jest zgodna z dalszymi badaniami koimmunoprecypitacji. Na przykład metodę wykorzystano do udanej koimmunoprecypitacji mikroRNA Argonaute ALG-1 C. elegans i dwóch znanych interaktorów ALG-1: AIN-1 i HRPK-1. Protokół ten zawiera opisy pobierania próbek zwierzęcych, przygotowania ekstraktu, klarowania ekstraktu i immunoprecypitacji białek. Opisany protokół można dostosować do testowania interakcji między dowolnymi dwoma lub więcej endogennymi, endogennie znakowanymi lub nadmiernie eksprymowanymi białkami C. elegans w różnych tłach genetycznych.
Wprowadzenie
Identyfikacja makromolekularnych oddziaływań interesującego białka może być kluczem do lepszego poznania jego funkcji. Eksperymenty z immunoprecypitacją i koimmunoprecypitacją mogą być wykorzystane do identyfikacji całego interaktomu białka za pomocą podejść proteomicznych na dużą skalę1 lub do specyficznego testowania zdolności białka do korecipitacji z hipotetycznym interaktorem. U C. elegans obie metody zostały z powodzeniem zastosowane, aby dowiedzieć się więcej o aktywności różnych białek, w tym tych, które ściśle współpracują z mikroRNA w celu regulacji ekspresji genów2,3,4. Eksperymenty z koimmunoprecypitacją mają tę zaletę, że testują interakcje białko-białko w ich natywnym środowisku komórkowym, ale przygotowanie ekstraktu może być trudne i czasochłonne. Konieczna jest skuteczna liza próbki, ale należy zachować ostrożność, aby zminimalizować zakłócenia interakcji białko-białko. Metody takie jak douncing5, sonication6, Balch homogenization7 i zirconia beads-homogenization8,9 zostały wykorzystane do skutecznego przygotowania ekstraktów białkowych C. elegans. Metody te, z wyjątkiem homogenizacji kulek cyrkonu, mają ograniczenia pod względem liczby próbek, które mogą być przetwarzane jednocześnie. Przedstawiono alternatywną metodę, którą można łatwo skalować, aby umożliwić szybkie przygotowanie ekstraktu białkowego o wysokiej przepustowości z próbek C. elegans, a następnie koimmunoprecypitację. W szczególności metoda ta pozwala na przygotowanie do 24 próbek jednocześnie, co znacznie skraca czas potrzebny na przygotowanie ekstraktu. W przeciwieństwie do tego, na przykład, douncing zazwyczaj pozwala na przygotowanie tylko jednej próbki na raz. Ta metoda ekstrakcji może być stosowana do przygotowywania ekstraktów z dowolnego etapu rozwojowego C. elegans.
Opisana jest procedura krok po kroku pobierania próbek zwierzęcych, przygotowania ekstraktu, immunoprecypitacji i prezentacji danych Western blot, aby potwierdzić udane ściąganie białka i wykrycie interesującego białka koimmunoprecypitującego. Aby zademonstrować skuteczność protokołu, przeprowadzono dwa eksperymenty z koimmunoprecypitacją między 1) mikroRNA Argonaute ALG-1 i AIN-1, homologiem GW182; oraz 2) ALG-1 i HRPK-1, nowo zidentyfikowany interaktor ALG-12. ALG-1 i AIN-1 to białka rdzeniowe, które składają się na kompleks wyciszający indukowany mikroRNA (miRISC), a interakcja między tymi dwoma białkami jest dobrze znana10,11. Protokół przygotowania ekstraktu okazał się skuteczny w eksperymencie z koimmunoprecypitacją ALG-1-AIN-1. Protokół ten z powodzeniem potwierdził również interakcję między ALG-1 a jego nowo zidentyfikowanym interaktorem, HRPK-12.
Podsumowując, manuskrypt opisuje protokół przygotowania ekstraktu z C. elegans, który może być skalowany do jednoczesnego przetwarzania 24 próbek wraz z protokołem koimmunoprecypitacji, który może być użyty do identyfikacji nowych lub potwierdzenia hipotetycznych interakcji między białkami. Protokół przygotowania ekstraktu jest zgodny z wieloma dalszymi eksperymentami, w tym immunoprecypitacją białek2 i microRNA pulldowns12. Co więcej, protokół immunoprecypitacji można dostosować do testowania interakcji między dowolnymi dwoma lub więcej endogennymi, endogennie znakowanymi lub nadmiernie eksprymowanymi białkami C. elegans w różnych tłach genetycznych.
Protokół
1. Pobieranie próbek robaków
- Wysiewaj etap mieszany lub zsynchronizowany13 robaków na solidnych płytkach NGM w wymaganej temperaturze i pozwól robakom rosnąć do pożądanego etapu. Aby zapoznać się z podstawowymi informacjami na temat wzrostu i utrzymania C. elegans, zobacz Stiernagle et al. i Porta-de-la-Riva et al.14,13.
- Zebrać robaki w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, myjąc płytki ślimakowe buforem M9. Robaki osadzać
- przez odwirowanie w temperaturze 400 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 minuty i wyrzucić supernatant.
UWAGA: Wielkość granulki robaka do przygotowania ekstraktu wynosi od 100 μL do 500 μL. Granulka o pojemności 300 μl upakowanych robaków jest zalecana do dalszych eksperymentów immunoprecypitacyjnych i zwykle daje ~ 4,5 mg białka całkowitego, podczas gdy granulka o pojemności 500 μl daje ~ 7,5 mg białka całkowitego. - Wykonać dodatkowe 3–5 płukań buforem M9 (patrz Tabela 1) lub do momentu, gdy supernatant przestanie być mętny.
- Wykonać ostatnie płukanie za pomocą ddH2O.
- Przenieś luźny granulat robaka do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wiruj w dół przy 400 x g przy temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Odrzuć pozostały supernatant, aby uzyskać upakowany osad robaka i przystąp do przygotowania ekstrakcji.
UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Granulki robaków mogą być natychmiast zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie. Należy pamiętać, że granulki robaków można rozmrozić tylko raz i nie można ich ponownie zamrozić.
2. Przygotowanie ekstraktu z granulatu robaka
UWAGA: Przygotowanie ekstraktu powinno odbywać się na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
- W przypadku zamrożenia rozmrozić granulki robaków na lodzie.
UWAGA: Jeśli podczas pobierania próbki nie uzyskano pożądanego rozmiaru zapakowanych granulek robaków wynoszącego 300 μL, można połączyć wiele mniejszych granulek, aż będzie wystarczająca ilość materiału do dalszej ekstrakcji. - Dodaj równą objętość lodowatego 2x buforu do lizy (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM chlorku potasu, 0,1% Triton X, 4 mM chlorku magnezu, 10% glicerolu, 2 mM DTT z inhibitorem RNazy, inhibitorem proteazy i inhibitorami fosfatazy; patrz Tabela 1) i wirować lub pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Zakręć probówką (probówkami) w dół, aby zebrać mieszaninę na dnie probówki.
- Przenieść mieszaninę do 1,5 ml probówki wolnej od RNaz zawierającej metalowe kulki (patrz Tabela Materiałów) i umieścić próbkę w homogenizatorze młynka perełkowego (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że nakrętki probówek są dokręcone, a próbki są zrównoważone wewnątrz homogenizatora.
- Homogenizować próbkę z najwyższą prędkością (ustawienie 12) przez 4 minuty.
- Usuń próbkę z kulek i umieść ją w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Alternatywnie, magnes dostarczony z homogenizatorem może być użyty do usunięcia kulek z próbki.
- Odwirowywać ekstrakt w temperaturze 19 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby sklarować ekstrakt białkowy.
- Przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie, unikając przenoszenia białego, mętnego osadu, który tworzy się na wierzchu próbki. Supernatantem jest teraz sklarowany ekstrakt.
UWAGA: Zachowaj 10 μl sklarowanego ekstraktu, aby określić całkowite stężenie białka. - Ekstrakt należy natychmiast wykorzystać do następujących eksperymentów lub błyskawicznie zamrozić ekstrakt w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Ekstrakty mogą być przechowywane w bardzo niskiej temperaturze (-80 °C zamrażarka lub ciekły azot przez ~6 miesięcy). Zamrożone ekstrakty mogą być rozmrożone jednorazowo i nie mogą być ponownie rozmrożone. - Oznaczyć całkowite stężenie białka w ekstrakcie za pomocą zestawu do oznaczania stężenia białka kompatybilnego z detergentami (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Immunoprecypitacja
UWAGA: Wszystkie etapy przygotowania ekstraktu powinny być wykonywane na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Zaleca się stosowanie 2 mg białka całkowitego do każdej immunoprecypitacji. Przeprowadzono jednak skuteczne immunoprecypitacje z 0,8–1 mg białka całkowitego. Zawsze używaj świeżych lub świeżo rozmrożonych ekstraktów białkowych. Przedstawiono następujący protokół przeprowadzania immunoprecypitacji od 2 mg białka całkowitego lub pojedynczego eksperymentu immunoprecypitacji. Ilość kulek i przeciwciał może być odpowiednio zwiększona lub zmniejszona dla wielu próbek lub jeśli stosuje się inną ilość ekstraktu białkowego.
- Umieść lub rozmroź ekstrakt białkowy na lodzie. Próbkę można rozcieńczyć do 10 mg/ml lub 5 mg/ml lodowatym buforem do lizy (patrz Tabela 1).
- Ponownie zawiesić kulki magnetyczne przez odwrócenie i przenieść 150 μl zawiesiny 50% kulek do probówki o pojemności 1,5 ml. Namagnesuj kulki na lodzie na stojaku magnetycznym przez 1 minutę lub do momentu, gdy roztwór będzie klarowny. Odrzucić supernatant.
- Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i umyj kulki w 1x buforze do lizy przy użyciu 2 objętości (tj. 300 μl) zawiesiny kulek. Powtórz pranie 2x, w sumie trzy prania.
- Ponownie zawiesić kulki w 150 μl lodowatego buforu do lizy .
- Przenieść 75 μl zawiesiny z kulek do 2 mg ekstraktu białkowego i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem. Pozostałą zawiesinę kulek zachowaj na lodzie do późniejszego wykorzystania.
UWAGA: Ten etap jest wykonywany w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania białek z kulkami podczas etapu immunoprecypitacji. - Umieść probówkę z próbką na stojaku magnetycznym na lodzie na 1 minutę lub do momentu, gdy kulki zostaną całkowicie namagnesowane, a próbka będzie czysta. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml; Nie naruszaj koralików. Jest to wstępnie oczyszczony lizat białkowy. Zaoszczędź 10% próbki do analizy Western blot.
- Dodać 20 μg oczyszczonego przeciwciała o powinowactwie do wstępnie oczyszczonego lizatu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem.
UWAGA: Ilość przeciwciała użytego do immunoprecypitacji jest specyficzna dla przeciwciała i białka i powinna być określona empirycznie, aby zapewnić skuteczną immunoprecypitację białka docelowego. - Dodać pozostałe 75 μl zawiesiny wstępnie umytych kulek (krok 3.5) do mieszaniny przeciwciała/lizatu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem.
- Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na lodzie na 1 minutę lub do momentu, gdy kulki zostaną całkowicie namagnesowane, a próbka będzie czysta. Zachowaj supernatant do analizy Western blot (opcjonalnie).
- Przemyć kulki zawierające immunoprecypitat 3x w 450 μl buforu do przemywania (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM chlorek potasu, 0,1% Triton X, 2 mM chlorek magnezu, 10% glicerol, 1 mM DTT; patrz Tabela 1) na lodzie.
UWAGA: Jeśli preferowane są bardziej rygorystyczne warunki prania, można wykonać dodatkowe prania. - Zawiesić granulkę kulek w 20 μl 2x buforu ładującego żel białkowy SDS/BME (patrz Tabela materiałów) i denaturować przez gotowanie w temperaturze 95 °C przez 5 minut przed załadowaniem do żelu SDS-PAGE. Alternatywnie, próbki zdenaturowane mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
UWAGA: W razie potrzeby część immunoprecypitatu perełkowego można zachować do dalszej izolacji RNA.
4. Wykrywanie Western blot w próbkach IP
- Załaduj próbki IP na żel SDS-PAGE (patrz Tabela materiałów). Unikaj przenoszenia kulek, umieszczając rurki IP na stojaku magnetycznym na 1 minutę przed aspiracją próbki.
- Wykonaj Western blotting15,16 i barwienie przeciwciałami16 z następującymi modyfikacjami: rozcieńczyć przeciwciało ALG-117 1:500 w 5% beztłuszczowym mleku w proszku (NFDM); rozcieńczyć przeciwciało HRPK-12 1:1,000 w 5% NFDM; i rozcieńczyć przeciwciało AIN-118 1:10,000 w 5% NFDM. Przeciwciała drugorzędowe (patrz tabela materiałów) zastosowano zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wykryć pasma za pomocą chemiluminescencji opartej na HRP (patrz Tabela materiałów).
Wyniki
Niniejszy protokół (przedstawiony schematycznie w Rycina 1) został z powodzeniem wykorzystany do otrzymania C. elegans całkowite ekstrakty białkowe (Rysunek 2) do późniejszej immunoprecypitacji kilku białek2 (Rycina 3 i Rycina 4). Przedstawiony protokół homogenizacji w młynku perłowym był porównywalny pod względem całkowitej ekstrakcji białek do metod opartych na homogenizatorze Dounce’a (Rycina 2) i efektywnie ekstrahowanych jąder (COL-19::GFP(NLS) (Rysunek 2) oraz białka cytoplazmatyczne (Rycina 3 i Rycina 4). Jednocześnie pobrano wiele próbek o różnych rozmiarach (Rysunek 2Białka Argonaute oddziałują z członkami rodziny białek GW182, tworząc kompleksy miRISC, które wiążą się z docelowymi cząsteczkami mRNA i represują ich ekspresję.10. Rycina 3 wykazuje pomyślną koimmunoprecypitację kluczowych komponentów kompleksu miRISC, ALG-1 i AIN-1, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami11,17W ostatnim czasie podjęto próby zidentyfikowania dodatkowych białek oddziałujących z białkiem Argonaute ALG-1.3 aby dowiedzieć się więcej na temat tego, w jaki sposób biogeneza i aktywność mikroRNA mogą być regulowane przez czynniki pomocnicze. Białko wiążące RNA HRPK-1 zidentyfikowano w immunoprecypitatach ALG-13Interakcję tę potwierdzono niedawno w eksperymencie wzajemnej immunoprecypitacji HRPK-12Przedstawione protokoły ekstrakcji i immunoprecypitacji pozwoliły na pomyślne wyodrębnienie ALG-1 w koimmunoprecypitatach specyficznych dla HRPK-1 (Rysunek 4). Ponadto interakcję ALG-1—AIN-1 przetestowano w różnych backgroundach genetycznych, wykazując, że HRPK-1 nie jest niezbędny do montażu kompleksu miRISC ALG-1/AIN-12 (Rycina 3). W celu przedstawienia pełnych obrazów analizowanych membran dołączono ryciny uzupełniające (Rysunek uzupełniający 1).
Rycina 1: Schemat przepływu pracy dla przygotowania ekstraktu z C. elegans oraz immunoprecypitacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 2: Porównanie za pomocą Western blot poziomu zlokalizowanego w jądrze białka GFP, COL-19::GFP(NLS), w próbkach przygotowanych za pomocą homogenizatora Dounce oraz homogenizowanych próbkach z osadów 250 µL i 100 µL nicieni. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Homolog GW182 AIN-1 współimmunoprecypituje z ALG-1. Western blotting dla białek ALG-1 i AIN-1 w immunoprecypitatach ALG-1. Współimmunoprecypitacja ALG-1/AIN-1 nie była zależna od obecności hrpk-1. Input = 10% IP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: ALG-1 współwytrąca się w immunoprecypitacji z HRPK-1. Przedstawiono wyniki Western blot dla HRPK-1 i ALG-1 w immunoprecypitatach HRPK-1. Input = 10% IP. * oznacza ciężki łańcuch przeciwciała. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
| Bufor M9 (1 L) | |
| KH2PO4 | 3 g |
| Na2HPO4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| 1 M MgSO4 | 1 mL |
| ddH2O | do 1 L |
| 2x bufor do lizy (5 mL) | |
| HEPES (pH 7.4) | 200 µL |
| 2 M KCl | 250 µL |
| 10% TritonX | 100 µL |
| 1 M MgCl2 | 20 µL |
| 100% glicerol | 1 mL |
| ddH2O | do 5 mL |
| Dodać bezpośrednio przed użyciem: | |
| 1 M DTT | 20 µL |
| inhibitor proteaz bez EDTA | 1 tabletka |
| koktajl inhibitorów fosfataz 2 | 100 µL |
| koktajl inhibitorów fosfataz 3 | 100 µL |
| 1x bufor do lizy | |
| Rozcieńczyć 2x bufor do lizy równą objętością ddH20. | |
| 1x bufor do przemywania (10 mL) | |
| HEPES (pH 7.4) | 300 µL |
| 2 M KCl | 500 µL |
| 10% TritonX | 100 µL |
| 1 M MgCl2 | 20 µL |
| 100% glicerol | 1 mL |
| ddH2O | do 10 mL |
| 1 M DTT | 20 µL (dodać bezpośrednio przed użyciem) |
Tabela 1: Składy odczynników
Rycina dodatkowa 1. Przedstawiono pełne membrany Western blot z detekcją, które posłużyły do przygotowania Ryciny 2-4. (A) Membrana z detekcją do Ryciny 2. Należy zauważyć, że membrana została przecięta, aby umożliwić jednoczesną detekcję GFP i tubuliny, co zmniejszyło całkowity rozmiar blotu. (B) Membrana z detekcją do Ryciny 3. (C) Membrana z detekcją do Ryciny 3. *oznacza ciężki łańcuch przeciwciała. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
C. elegans jest doskonałym modelem do badania podstawowych pytań w biologii komórki, molekularnej i rozwojowej19. Oprócz swojej zdolności jako systemu modelu genetycznego, C. elegans jest podatny na podejścia biochemiczne, w tym między innymi immunoprecypitację białek i koimmunoprecypitację. Jedną z potencjalnych przeszkód podczas przeprowadzania eksperymentów immunoprecypitacyjnych jest brak przeciwciał specyficznych dla badanych białek. Jeśli żadne przeciwciało nie jest dostępne, można wygenerować niestandardowe przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne. Jednak ostatnie innowacje w technologii edycji genomu pozwoliły naukowcom na szybkie wprowadzenie mutacji lub znakowanie endogennych genów C. elegans 20,21, ułatwiając badania, które odkrywają genetyczne, funkcjonalne i fizyczne interakcje między genami i kodowanymi białkami. W szczególności znakowanie genów C. elegans za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w endogennych loci zmniejszyło zależność eksperymentów immunoprecypitacyjnych od dostępności przeciwciał, dzięki czemu eksperymenty z koimmunoprecypitacją są znacznie bardziej wykonalne. Geny C. elegans mogą być znakowane różnymi znacznikami, począwszy od znaczników fluorescencyjnych, takich jak GFP lub mCherry, po małe znaczniki, takie jak FLAG i HA. Przeciwciała rozpoznające te znaczniki są łatwo dostępne na rynku, co ułatwia badania interakcji białko-białko za pomocą metod immunoprecypitacji.
Przedstawiony protokół, przedstawiony na rysunku 1, może być wykonywany dla niewielkiej liczby próbek lub skalowany, co pozwala na przygotowanie do 24 próbek jednocześnie. Podczas gdy początkowe charakterystyki interakcji białko-białko poprzez immunoprecypitację są zwykle wykonywane na tle typu dzikiego w normalnych warunkach wzrostu, badania uzupełniające często wymagają testowania interakcji białko-białko w różnych tłach genetycznych lub w różnych warunkach wzrostu. Możliwość jednoczesnego przygotowania wielu ekstraktów oszczędza czas i, co ważne, zapewnia spójność przygotowania ekstraktu między różnymi próbkami. Zawsze wymagana jest kontrola ujemna, przy czym idealną kontrolą jest mutacja zerowa w genie kodującym białko immunoprecypitowane (patrz przykłady na rycinie 3 i rycinie 4 ).
Ten protokół ekstraktu pozwala na szybkie przygotowanie ekstraktu białkowego z próbek C. elegans i jest porównywalny z homogenizacją opartą na kulkach cyrkonu8. Ogólnie rzecz biorąc, homogenizacja kulek może być skalowana do wielu jednoczesnych przygotowań próbek przy użyciu różnych homogenizatorów granulacyjnych lub podobnych urządzeń. Niektóre bardziej ekonomiczne homogenizatory perełkowe mogą jednak zmniejszyć liczbę próbek, które mogą być przetwarzane jednocześnie. Alternatywnie, prezentowany protokół ekstraktu jest kompatybilny z preparatem ekstraktu na bazie dounce, który stanowi ekonomiczną alternatywę. Chociaż różne homogenizatory do młynów perełkowych nie zostały przetestowane, większość z nich prawdopodobnie będzie zgodna z tym protokołem ekstraktu białkowego, o ile zostanie osiągnięte całkowite rozerwanie próbek C. elegans .
Jak przedstawiono, ten protokół przygotowania ekstraktu jest kompatybilny z wieloma dalszymi eksperymentami, w tym immunoprecypitacją białek2 i ściąganiem mikroRNA12 , i pozwala na dalsze pobieranie zarówno składników białka, jak i RNA. Skutecznie ekstrahuje również białka jądrowe i cytoplazmatyczne (ryc. 2, ryc. 3 i ryc. 4). Podobnie, przedstawiony protokół immunoprecypitacji pozwala na izolację RNA z immunoprecypitatów związanych z białkami. Chociaż protokół immunoprecypitacji został pierwotnie opracowany w celu identyfikacji interakcji białek ALG-1, metodę można dostosować do testowania interakcji między dowolnymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. W rzeczywistości zastosowane warunki immunoprecypitacji działały równie dobrze w przypadku immunoprecypitacji ALG-1 (Figura 3) i HRPK-1 (Figura 4). Protokół ten jest doskonałym punktem wyjścia do immunooczyszczania białek wiążących RNA. Należy jednak zauważyć, że pewne zmiany w składzie buforu mogą być wymagane w przypadku innych białek będących przedmiotem zainteresowania. Zmiany mogą zależeć od właściwości fizycznych i biochemicznych białka będącego przedmiotem zainteresowania i muszą być wdrażane indywidualnie dla każdego przypadku.
Po immunoprecypitacji białka docelowego (w tym przypadku ALG-1 lub HRPK-1) można zastosować Western blot do przetestowania koimmunoprecypitatu pod kątem specyficznych interaktorów białkowych.
Alternatywnie, oczyszczony immunoprecypitat można poddać analizie spektrometrii mas w celu zidentyfikowania wszystkich przypuszczalnie oddziałujących białek. Potwierdzone interakcje koimmunoprecypitacyjne można następnie zbadać w różnych tłach genetycznych lub warunkach w celu zidentyfikowania potencjalnej regulacji określonej interakcji. Na przykład, aby określić, czy hrpk-1 odgrywa rolę w składaniu ALG-1 / AIN-1 miRISC, oceniono współstrącanie ALG-1-AIN-1 zarówno na tle typu dzikiego, jak i przy braku HRPK-1 (Figura 3). Stwierdzono, że hrpk-1 jest zbędny w interakcji ALG-1 / AIN-12 (Figura 3). Ponadto technologia edycji genomu CRISPR/Cas9 może być wykorzystana do generowania mutacji z pojedynczą delecją punktową lub domenową w białkach będących przedmiotem zainteresowania. Ponowne testowanie zdolności wygenerowanych mutantów do koprecypitacji z ich interaktorami białkowymi może ujawnić, które domeny lub reszty pośredniczą w interakcji fizycznej. Takie przyszłe badania mogą dostarczyć bezcennych informacji na temat mechanizmu funkcjonowania i regulacji białek. Podejścia te, w połączeniu z mocą genetyki C. elegans , mogą dostarczyć ważnych informacji na temat podstawowych procesów molekularnych, które rządzą rozwojem zwierząt i funkcjami komórkowymi.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez Kansas INBRE, P20GM103418 do Li i Zinovyevej, a R35GM124828 do Zinovyeva. Dziękujemy Min Hanowi za hojne podzielenie się przeciwciałem anty-AIN-1. Niektóre ze szczepów użytych w trakcie tych prac zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka 15 ml | VWR | 89039-664 | KROK 1.2 |
| 2x Bufor do próbek Laemmli | BioRed | 1610737 | KROK 3.11 |
| 4– 20% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| monoklonalne anty-AIN-1 | generowane na zamówienie | nie dotyczy | KROK 4.2, patrz ref. Zhang i in. 2007 |
| monoklonalne anty-ALG-1 | na zamówienie wygenerowane przez PRF & L | n/a | STEP 4.2 |
| monoklonalne anty-HRPK-1 | na zamówienie wygenerowane przez PRF& L | n/a | KROK 4.2 |
| Homogenizator Bullet Blender Storm | MidSci | BBY24M | KROK 2.3 |
| DL-ditiotreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Tabela 1 |
| Dynabeads Białko A do immunoprecypitacji | Thermo Fisher | 10002D | KROK 3.2 |
| Magnes DynaMag-2 | Thermo Fisher | 12321D | KROK 3.2 |
| Inhibitory proteazy wolne od EDTA | Roche | 11836170001 | Tabela 1 |
| Przeciwciało GFP (FL) | Cruz Biotechnology | sc-8334 | Rysunek 2 |
| Glicerol | Thermo Fisher | G33-500 | Tabela 1 |
| Kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikowi, HRP | BioRed | 1662408 | KROK 4.2 |
| Kozie przeciwciało anty-Rat IgG (H + L) Drugorzędowe, HRP | Thermo Fisher | 31470 | KROK 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Tabela 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Podłoże chemiluminescencyjne, zestaw 100 ml | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Sześciowodny chlorek magnezu ACS | VWR | VWRV0288-500G | Tabela 1 |
| Siarczan magnezu bezwodny | Thermo Fisher | M65-500 | Stół 1 |
| Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml | VWR | 20170-333 | KROK 1.6 |
| N2 typ dziki | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 sztuk (1,5 ml) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Koktajl inhibitorów fosfatazy 2 | Sigma | P5726-1ML | Tabela 1 |
| Koktajl inhibitorów fosfatazy 3 | Sigma | P0044-1ML | Tabela 1 |
| Chlorek potasu | Thermo Fisher | P217-500 | Tabela 1 |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Thermo Fisher | P285-3 | Tabela 1 |
| Zestaw do oznaczania białek RC DC I | BioRed | 5000121 | KROK 2.9 |
| RNaseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazy | Thermo Fisher | 10777019 | Tabela 1 |
| Chlorek sodu | Thermo Fisher | S271-500 | Tabela 1 |
| Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny | Thermo Fisher | S374-500 | Tabela 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Tabela 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | dostępne na żądanie | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | dostępne na żądanie | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | dostępne na żądanie |
Bibliografia
- Liu, X., et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).
- Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development. PLoS Genetics. 15 (10), 1008067(2019).
- Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).
- Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans. Cell. 136 (5), 926-938 (2009).
- Zou, Y., et al. Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers. Science. 340 (6130), 372-376 (2013).
- Zanin, E., Dumont, J., et al. Affinity purification of protein complexes in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).
- Kohl, K., et al. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. Journal of Visualized Experiments. (138), e58117(2018).
- Larance, M., Bailly, A. P., et al. Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes. Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).
- Ding, L., Han, M. GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing. Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).
- Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans. Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).
- Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices. Methods in Molecular Biology. 725, Chapter 16 233-249 (2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), e759(2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).
- Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression. PLoS Genetics. 10 (4), 1004286(2014).
- Zhang, L., et al. Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2. Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Farboud, B., et al. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. Journal of Visualized Experiments. (135), e57350(2018).
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie