Artykuł metodologiczny

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

DOI:

10.3791/61246

⸱

9 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Translational Research Program, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 2Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 3Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Cell and Developmental Biology Center, National Institutes of Health, 4Kosair Charities Pediatric Heart Research Program, Cardiovascular Innovation Institute, University of Louisville, 5Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Louisville, 6Department of Cardiovascular Surgery, Mitsubishi Kyoto Hospital, 7Cincinnati Children's Heart Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje metody generowania skalowalnych, siatkowych tkanek serca (ECT) składających się z komórek sercowo-naczyniowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), które są rozwijane w celu zastosowania klinicznego. Kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki ścienne naczyń krwionośnych pochodzące z HiPSC miesza się z matrycą żelową, a następnie wlewa się do formy tkankowej z polidimetylosiloksanu (PDMS) z prostokątnymi wewnętrznymi schodkowymi słupkami. Do 14 dnia hodowli ECT dojrzewają do struktury siatki o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm z wiązkami włókien mięśniowych o średnicy 0,5 mm. Kardiomiocyty ustawiają się w linii długiej każdej wiązki i spontanicznie biją synchronicznie. Podejście to można przeskalować do większej siatki (3,0 cm x 3,0 cm) ECT przy zachowaniu dojrzałości i funkcji konstrukcji. W związku z tym ECT w kształcie siatki generowane z komórek serca pochodzących z hiPSC mogą być wykonalne dla paradygmatów regeneracji serca.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczne badania przedkliniczne i próby kliniczne potwierdziły skuteczność komórkowych terapii regeneracyjnych serca w przypadku niewydolności serca1,2,3. Wśród różnych typów komórek, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są obiecującym źródłem komórek ze względu na ich zdolność do proliferacji, potencjał do generowania różnych linii sercowo-naczyniowych4,5 i allogeniczność. Ponadto technologie inżynierii tkankowej umożliwiły przeniesienie milionów komórek do uszkodzonego serca5,6,7,8.

Poprzednio informowaliśmy o generowaniu trójwymiarowych (3D) liniowo modyfikowanych tkanek serca (ECT) z linii sercowo-naczyniowych pochodzących od hiPSC, przy użyciu komercyjnie dostępnego systemu hodowli dla biosztucznych tkanek 3D5,7. Stwierdziliśmy, że współistnienie komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i komórek ściennych z kardiomiocytami w obrębie ECT ułatwiało strukturalne i elektrofizjologiczne dojrzewanie tkanek. Ponadto zweryfikowaliśmy potencjał terapeutyczny wszczepionych hiPSC-ECT w immunologicznym modelu zawału mięśnia sercowego szczura w celu poprawy funkcji serca, regeneracji mięśnia sercowego i zwiększenia angiogenezy5. Jednak liniowe ECT skonstruowane tą metodą miały cylindry o wymiarach 1 mm na 10 mm i dlatego nie nadawały się do implantacji w badaniach przedklinicznych z udziałem większych zwierząt lub do użytku klinicznego.

Na podstawie udanego wykorzystania form tkankowych do generowania porowatych formacji tkanek przy użyciu mioblastów szkieletowych i kardiomiocytów szczurów9, ludzkie kardiomiocyty pochodzące z ESC10 i mysie iPSCs11, opracowaliśmy protokół do generowania skalowalnej większej tkanki implantalnej pochodzącej z hiPSC przy użyciu form polidimetylosiloksanu (PDMS). Oceniliśmy szereg geometrii formy, aby określić najbardziej efektywne charakterystyki formy. ECT w kształcie siatki z wieloma wiązkami i połączeniami wykazywały doskonałe cechy w zakresie żywotności komórek, funkcji tkanek i skalowalności w porównaniu z formatami zwykłymi arkuszami lub liniowymi, które nie miały porów ani połączeń. Wszczepiliśmy elektrowstrząs w kształcie siatki do modelu zawału mięśnia sercowego u szczura i potwierdziliśmy jego efekty terapeutyczne podobne do wszczepionych cylindrycznych ECT12. W tym miejscu opisujemy protokół generowania elektrowstrząsu w kształcie siatki pochodzącego z hiPSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Utrzymanie hiPSC i różnicowanie układu sercowo-naczyniowego

  1. Rozszerzanie i utrzymywanie hiPSC na cienkowarstwowej matrycy błony podstawnej (zredukowany czynnik wzrostu, rozcieńczenie 1:60) w kondycjonowanym podłożu wyekstrahowanym z mysich fibroblastów embrionalnych (MEF-CM) z ludzkim podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (hbFGF)4.
    UWAGA: Użyliśmy linii hiPSC (4-czynnikowej (Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-Myc): 201B6). Dodaj hbFGF w odpowiednim stężeniu dla każdej linii komórkowej. Fragment Lamininy-511 może być również stosowany do powlekania naczynia hodowlanego zamiast macierzy błony podstawnej. Dostępna na rynku pożywka przeznaczona do hodowli hiPSC bez karmienia może być stosowana jako substytut MEF-CM.
  2. Użyj Versene (0,48 mM roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)) do odłączenia i dysocjacji komórek, gdy zbieg komórek osiągnie 90\u2012100%.
    UWAGA: Można również stosować inne dostępne na rynku produkty do dysocjacji komórek.
  3. Płytki komórkowe o gęstości 10 000 komórek/mm2 na pokrytych matrycą płytkach do hodowli komórkowych w MEF-CM z hbFGF i hodowla przez dwa do trzech dni.
  4. Gdy hodowla stanie się w pełni zlewająca, przykryj komórki matrycą (rozcieńczenie 1:60 z MEF-CM) na jeden dzień.
  5. Wymień MEF-CM na RPMI 1640 + B27 medium. Dodaj 100 ng/ml aktywiny A i 100 ng/ml Wnt3A do pożywki na jeden dzień.
    UWAGA: To jest dzień 0 różnicowania. Aby zwiększyć kanoniczną sygnalizację Wnt, zamiast Wnt3A można również stosować inhibitory GSK3β.
  6. W 1. dniu różnicowania zmień pożywkę na nową RPMI 1640 + B27 z 10 ng/ml BMP4 i 10 ng/ml hbFGF. Hodowla komórek przez dwa (protokół MC) lub cztery (protokół CM+EC) dni bez zmiany pożywki5.
    UWAGA: Protokół CM+EC jest zoptymalizowany pod kątem jednoczesnej indukcji kardiomiocytów (CM) i komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC). Protokół MC jest zoptymalizowany pod kątem preferencyjnej indukcji komórek ściennych naczyń krwionośnych (MC).
  7. Protokół CM+EC do indukcji CM i EC (Rysunek 1A).
    1. Zastąp pożywkę w 5 dniu różnicowania RPMI 1640 + B27 uzupełnioną 50 ng/ml VEGF165.
    2. Zmieniaj pożywkę co 48 godzin do 13. dnia różnicowania.
  8. Protokół MC do indukcji komórek ściany naczyniowej (Rysunek 1B)
    1. Zastąp pożywkę RPMI1640 + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w 3. dniu różnicowania.
    2. Zmieniaj pożywkę co 48 godzin do 13. dnia różnicowania.

2. Pobieranie komórek i analiza linii w dniu różnicowania 13\u201215

  1. Umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Ca2+ i Mg2+ (PBS).
  2. Dodać roztwór do dysocjacji komórek (zawierający proteazy, kolagenazy i DNAzy) do naczynia do hodowli komórkowych, aby przykryć płytkę. Inkubować płytkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Po inkubacji zebrać i zdysocjować komórki za pomocą pożywki hodowlanej za pomocą pipety.
  4. Przydziel 1 x 106 komórek do analizy linii za pomocą cytometrii przepływowej. Aby wyeliminować martwe komórki, zabarwić je możliwym do naprawienia barwnikiem żywotności.
  5. Wybarwić komórki markerami powierzchni błony w PBS za pomocą 5% FBS. Stosować następujące rozcieńczenia przeciwciała w buforze barwiącym do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS): anty-PDGFRβ (1:100), kadheryna anty-VE (1:100), anty-TRA-1-60 (1:20).
  6. W przypadku białek wewnątrzkomórkowych należy ponownie zawiesić i utrwalić komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS.
  7. Wybarwić komórki antysercową izoformą troponiny T (cTnT) w PBS z 5% FBS i 0,75% saponiny, a następnie oznaczyć przeciwciało cTnT 488 mysią IgG1 (rozcieńczenie 1:50).
  8. Ponownie zawiesić wybarwione komórki w PBS z 5% FBS i umieścić je w probówkach FACS z sitkiem do komórek.
  9. Analizuj skład komórkowy barwionych komórek z każdego protokołu różnicowania za pomocą cytometrii przepływowej, aby ułatwić generowanie zawiesin komórkowych o zdefiniowanym rozkładzie linii.
    UWAGA: Podczas wykonywania tej procedury pozostała zawiesina komórek dla ECT jest przechowywana w lodówce o temperaturze 4 °C.

3. Produkcja formy tkankowej PDMS

  1. Odlać warstwę polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 0,5 mm i ponad 30 mm x 30 mm, mieszając prepolimer i roztwór sieciujący w stosunku 10:1, a następnie utwardzając w temperaturze 80 °C przez 3 godziny.
  2. Wytnij arkusz PDMS i połącz go klejem silikonowym, aby wytworzyć prostokątną tacę o wymiarach 21 mm x 20,5 mm z prostokątnymi słupkami o długości 7 mm, szerokości 0,5 mm i wysokości 2,5 mm w pozycji naprzemiennej. Poziomy odstęp między dwoma liniami słupków wynosi 2,5 mm (Rysunek 2B).
  3. Autoklawować tackę w temperaturze 120 °C przez 20 minut.
  4. Pokryj tackę 1% poloksamem 407 w PBS przez 1 godzinę. Przed użyciem wypłucz poloksamer 407 i wystarczająco wypłucz formę PBS.

4. Konstrukcja ECT

  1. Po analizie linii komórkowej połącz komórki z protokołów CM+EC i MC tak, aby końcowe stężenie MC wynosiło od 10 do 20% w całkowitej liczbie komórek wynoszącej sześć milionów komórek na konstrukt5.
  2. Zawiesić wymieszane sześć milionów komórek w pożywce hodowlanej ECT (minimalna niezbędna pożywka alfa uzupełniona 10% FBS, 50 μM 2-merkaptoetanolem i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny).
  3. Przygotowanie roztworu matrycowego
    1. Wymieszaj 133 μl rozpuszczalnego w kwasach roztworu kolagenu typu I z ogona szczura (2 mg/ml, pH 3) z 17 μl 10 razy minimalnej pożywki (MEM). Następnie wymieszać roztwór z 17 μl buforu alkalicznego (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES i 0,1 M NaOH).
      UWAGA: Kolagen należy przechowywać na lodzie (4 °C). Sprawdź kolor buforu i jeśli podłoże nie stanie się różowawe po zmieszaniu wszystkich roztworów, dodaj dodatkowy bufor alkaliczny do podłoża. Etapy mieszania muszą polegać na wymieszaniu kolagenu I + 10x MEM, a następnie dodać bufor alkaliczny. NIE zmieniaj tej kolejności. NIE generuj bąbelków w mieszance.
    2. Dodać 67 μl macierzy błony podstawnej do zneutralizowanego roztworu kolagenu.
      UWAGA: Wymieszany roztwór należy przechowywać na lodzie (4 °C).
  4. Odwirować przygotowaną zawiesinę komórkową zawierającą sześć milionów komórek z prędkością 1 100 obr./min (240 x g) przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki 167 μl DMEM o wysokiej zawartości glukozy + 20% FBS + 1% penicyliny-streptomycyny (100x).
  5. Wymieszać zawiesinę komórkową i roztwór matrycy. Całkowita objętość mieszaniny komórka/matryca dla jednego konstruktu wynosi 400 μL.
    UWAGA: Na tym etapie mieszanina komórka/matryca powinna być nielepka i mieć różowawy kolor. Trzymaj go na lodzie, ponieważ żel zestala się w temperaturze pokojowej. Końcowe stężenie kolagenu typu I wynosi 0,67 mg/ml.
  6. Mieszaninę komórka/matryca wylać równomiernie na formę tkankową PDMS pokrytą poloksamerem 407, którą umieszcza się na sześciodołkowej płytce hodowlanej12.
    UWAGA: Mieszaninę nalewać ostrożnie, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, aby zapobiec defektom wypełnienia w nalewanym żelu.
  7. Mieszaninę komórka/matryca inkubować w standardowym inkubatorze CO2 (37 °C, 5 % CO2 ) przez 60 minut.
  8. Po uformowaniu tkanki namocz formę tkankową w 4 ml pożywki hodowlanej ECT.
    UWAGA: Chociaż komórka/matryca jest usieciowana w ciągu 60 minut, konstrukcja jest nadal bardzo delikatna. Delikatnie dodaj podłoże, aby go nie uszkodzić.
  9. Hoduj tkankę przez 14 dni z pożywką codziennie zmieniaj.
  10. Przed implantacją ECT należy delikatnie usunąć ECT ze słupków załadowczych za pomocą wysterylizowanych drobnych kleszczy.
    UWAGA: Końcowe wymiary ECT po wyjęciu z formy są mniejsze niż oryginalna forma. Forma o wymiarach 2,1 cm x 2,05 cm generuje uwolniony ECT o wymiarach około 1,5 cm x 1,5 cm. Większa forma o wymiarach 3,9 cm x 4,05 cm generuje ECT o wymiarach około 3 cm x 3 cm. Nienaładowane elektrowstrząsy wykazują wewnętrzne spontaniczne dudnienie w ciepłym pożywce hodowlanej. Chociaż początkowo zachowuje strukturę siatki, nieobciążony ECT z czasem kurczy się i kondensuje. Możliwe jest delikatne przytrzymanie tkanki za pomocą cienkich kleszczy, a następnie użycie jedwabnego szwu 7-0 do przymocowania ECT do nasierdzia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1A,B pokazuje schematy protokołu CM+EC i MC. Po indukowaniu CM i EC z protokołu CM + EC oraz MC z protokołu MC, komórki są mieszane, dostosowując końcowe stężenia MC tak, aby stanowiły od 10 do 20% wszystkich komórek. Forma tkankowa o szerokości 2 cm jest wykonana zgodnie z rysunkiem projektowym z arkusza PDMS o grubości 0,5 mm (Rysunek 2A,B). Sześć milionów komórek CM + EC + MC łączy się z kolagenem I i matrycą i wylewa na formę ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po zakończeniu naszych badań nad formatem liniowym, ECT5 pochodzącym z hiPSC, dostosowaliśmy protokół do mieszania CM, EC i MC pochodzących z hiPSC, aby ułatwić ekspansję in vitro komórek naczyniowych w ECT, a następnie sprzężenie naczyniowe in vivo między ECT a mięśniem sercowym biorcy.

Aby ułatwić generowanie większych, wszczepialnych geometrii ECT siatki, użyliśmy cienkich arkuszy PDMS do zaprojektowania form 3D ze słupkami załadowczymi ustawionymi w pozycji naprzemi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów finansowych ani naukowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była finansowana przez Kosair Charities Pediatric Heart Research Program na Uniwersytecie w Louisville oraz Organoid Project w RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. Wirusy HiPSC użyte w naszych opublikowanych protokołach zostały dostarczone przez Centrum Badań i Zastosowań Komórek iPS na Uniwersytecie w Kioto w Kioto w Japonii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
Naczynia do hodowli komórkowych 100x20 mm stylFalcon/ Thomas scientific9380C51
Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych 6well 50/CSFalcon / Thomas scientific6902A01
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning761036
Reagents
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105
BMP4, rekombinowany (10&mikro; g)R& DRSD-314-BP-010
Kolagen, roztwór typu I z ogona szczuraSigmaC3867
Matrigel o obniżonym czynniku wzrostuCorning356231
Ludzki VEGF (165) IS, klasa premiumMiltenyi130-109-385
Pluronic F-127, 0,2 i mikro; m filtrowane (10% roztwór w wodzie)Sondy molekularneP-6866
Rekombinowany ludzki bFGFWAKO060-04543
Rekombinowana aktywina ludzka/mysz/szczura (50&mikro; g)R& D338-AC-050
rh Wnt-3a (10&mikro; g)R& D5036-WN
Roztwór VerseneGibco15040066
Pożywka hodowlana i suplementy
10x MEMInvitrogen11430
2 Mercaptro EtanolSIGMAM6250
B27 suplement minus insulinaGibco
DMEM, wysoka glukozaGibco11965084
Płodowa surowica bydlęca (500 ml)Dowolna
płodowa surowica bydlęca (500 ml)Dowolna
L-glutaminaGibco25030081
NaHCO3Dowolna
PBS 1xGibco10010-031
Penicylina-Streptomycyna (5000 U/mL)Gibco15070-063
RPMI1640 podłożeGibco21870092
α MEMInvitrogen11900024
cytometria przepływowa
anti-TRA-1-60, FITC, klon: TRA-1-60, BD BiosciencesBD / Fisher560380
anty-troponina T, izoforma serca Ab-1, klon: 13-11, Thermo Scientific Lab VisionFisherMS-295-P0
BD FACS Clean RoztwórBD340345
BD FACSPodcień pochewki dolnejBD342003
BD FACSRinse RoztwórBD340346
EDTADowolna
probówka Falcon z nasadką sitka komórkowego (opakowanie 500 szt.)Corning352235
Płodowa surowica bydlęca (500ml)Dowolna
LIVE/DEAD Zestaw do barwienia martwych komórek Aqua do wzbudzenia 405 nmSondy molekularneL34957
PDGFRb; anty-CD140b, R-PE, Klon: 28D4, BD BiosciencesBD / Fisher558821
SaponinSigma-Aldrich47306-50G-F
VEcad-FITC; anty-CD144, FITC, Klon: 55-7H1, BD BiosciencesBD / Fisher560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mysz IgG1 Zestaw do etykietowaniasond molekularnychZ25002
A1895601

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
  2. Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
  3. Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
  4. Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716(2014).
  5. Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933(2016).
  6. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
  7. Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
  8. Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
  9. Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
  10. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  11. Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963(2013).
  12. Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641(2017).
  13. Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Konstrukcje w kszta cie siatkiforma tkankowa z PDMSustawienie kardiomiocyt wfrakcja naczyniowa zrazowamacierz kolagenowapow oka z poloksameru 407p czki w kien mi niowychregeneracja serca

Powiązane artykuły