Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem transgenicznego Calcium Reporter Aequorin w celu identyfikacji nowych celów w sygnalizacji wapniowej

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61259

⸱

1 sierpnia 2020

 ,  ,  , 
1National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India

W tym artykule

Podsumowanie

Przesiewowe badanie genetyczne oparte na wzroście Ca2+ jako odczyt prowadzi do identyfikacji składników genetycznych zaangażowanych w zależne od wapnia szlaki sygnałowe u roślin.

Streszczenie

Genetyczne badania przesiewowe były ważnymi narzędziami w bezstronnej identyfikacji składników genetycznych zaangażowanych w kilka ścieżek biologicznych. Podstawą badania przesiewowego jest wygenerowanie populacji mutantów, którą można poddać badaniom przesiewowym pod kątem interesującego nas fenotypu. EMS (sulfonian etylometanu) jest powszechnie stosowanym środkiem alkilującym do wywoływania losowych mutacji w klasycznym przesiewowym badaniu genetycznym w celu identyfikacji wielu genów zaangażowanych w dowolny proces. Zwiększenie stężenia wapnia w cytozolu (Ca2+) jest kluczowym wczesnym szlakiem sygnałowym, który jest aktywowany po percepcji stresu. Jednak tożsamość receptorów, kanałów, pomp i transporterów Ca2+ jest nadal nieuchwytna w wielu badanych systemach. Aequorin jest komórkowym białkiem reporterowym wapnia wyizolowanym z Aequorea victoria i stabilnie eksprymowanym w Arabidopsis. Wykorzystując to, zaprojektowaliśmy przesiewowe badanie genetyczne, w którym zmutagizowaliśmy transgeniczną aequorin za pomocą EMS. Nasiona ze zmutowanych roślin zebrano (M1) i przeprowadzono badania przesiewowe pod kątem fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania w populacji segregującej (M2). Korzystając z 96-dołkowego protokołu pomiaru Ca2+ o wysokiej przepustowości, można zidentyfikować kilka nowych mutantów, które mają różną odpowiedź wapniową i są mierzone w czasie rzeczywistym. Mutanty o interesującym nas fenotypie są ratowane i rozmnażane aż do uzyskania homozygotycznej populacji zmutowanych roślin. Protokół ten zapewnia metodę przesiewowych badań genetycznych w tle reporterowym Ca2 + i identyfikacji nowych celów regulowanych przez Ca2 +.

Wprowadzenie

Zmiana stężenia cytozolowego wapnia (Ca2+) po dostrzeżenie bodźca biotycznego lub abiotycznego jest dobrze zbadanym wczesnym zdarzeniem sygnalizacyjnym, które aktywuje wiele szlaków sygnałowych1,2,3,4. Komórka w podstawowym stanie spoczynku utrzymuje niższe stężenie Ca2 + w cytozolu i sekwestruje nadmiar Ca2 + w różnych organellach wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowym apoplast, co prowadzi do stromego gradientu Ca2 + < sup class = "xref" > 5,< sup class = "xref">6. Po percepcji sygnału poziom Ca2+ wzrasta w cytozolu z powodu napływu Ca2+ ze źródeł zewnątrzkomórkowych i / lub wewnątrzkomórkowych i generuje specyficzną dla bodźców sygnaturę wapnia7,8,9. Wzrost Ca2+ w cytozolu jest aktywowany przez wiele bodźców, ale swoistość jest utrzymywana przez odrębne magazyny uwalniające Ca2+, unikalną sygnaturę Ca2+ i odpowiednie białka sensoryczne10,11.

Użycie środka alkilatującego, sulfonianu etylometanu (EMS) do mutagenezy jest potężnym narzędziem w klasycznych badaniach genetycznych do identyfikacji wielu niezależnych genów zaangażowanych w proces. EMS jest mutagenem chemicznym indukującym głównie losowe przejścia C do T i G do A w całym genomie i powoduje zmianę o 1 pz na każde 125 kb genomu. Mutageneza EMS wywoła ≈1000 zmian pojedynczej pary zasad, albo insercji/delecji (InDel), albo polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) na genom12. Mutacje indukowane przez EMS to mutacje wielopunktowe o częstości mutacji od 1/300 do 1/30000 na locus. Zmniejsza to liczbę roślin M1 potrzebnych do znalezienia mutacji w danym genie. Zakres populacji nasion M1 wynoszący 2000-3000 jest zwykle używany do uzyskiwania interesujących mutacji u Arabidopsis thaliana13,14.

transgeniczne Aequorin to rośliny ekotypu Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) wykazujące ekspresję p35S-apoaequorin (pMAQ2) w klasie cytozolu15. Aequorin jest białkiem wiążącym Ca2+ składającym się z apoproteiny i grupy protetycznej składającej się z cząsteczki lucyferyny, koelenterazyny. Wiązanie Ca2 + z ekworyną, która ma trzy miejsca wiązania Ca2 + EF rąk, powoduje utlenianie i cyklizację koelentrazyny w celu nadania dioksetanonowi produktu pośredniego, po której następuje zmiana konformacyjna białka, której towarzyszy uwolnienie dwutlenku węgla i celuenteramidu wzbudzonego singletem16. Wytworzony w ten sposób celenteramid emituje światło niebieskie (λmax, 470 nm), które może być wykryte przez luminometr17. Niezwykle szybkie wzrosty Ca2+ mogą być zatem mierzone w czasie rzeczywistym i wykorzystywane do szybkich badań genetycznych. Protokół ten ma na celu wykorzystanie specyfiki odpowiedzi wapnia do identyfikacji nowych kluczowych graczy, którzy są zaangażowani w sygnaturę Ca2 +. Aby osiągnąć to zadanie, wykorzystujemy mutagenezę EMS w transgenicznej aequorynie i identyfikujemy SNP związane ze zmienioną sygnalizacją Ca2 +. Protokół identyfikuje mutanty, które nie wykazują lub wykazują zmniejszone podwyższenie Ca2+ po dodaniu bodźców. Mutanty te można następnie zmapować w celu zidentyfikowania genów odpowiedzialnych za odpowiedź Ca2+. Metoda ma zastosowanie do każdego rodzaju bodźców płynnych w roślinach, które powodują podniesienie Ca2+. Ponieważ podniesienie Ca2+ jest jedną z pierwszych reakcji na szlaku sygnałowym obrony roślin, identyfikacja składników odpowiedzi na wcześniejszym etapie może dostarczyć kandydatów do inżynierii genetycznej w celu wyhodowania odpornych roślin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mutageneza EMS i zbiór nasion na podstawie pojedynczego rodowodowego (1-3 miesiące)

  1. Zważ 150 mg nasion (~ 7500) aequoryny do mutagenezy EMS (nasiona M0). Zważyć kolejne 150 mg nasion, które mają być użyte jako kontrola.
  2. Przenieś nasiona do probówki o pojemności 50 ml i dodaj 25 ml 0,2% EMS (v/v) (UWAGA) (do zaprawiania) lub 25 ml autoklawizowanej wody (do kontroli).
    UWAGA: Sulfonian etylu metanu jest środkiem chemicznym służącym do mutagenizacji materiału roślinnego.
  3. Uszczelnij rurkę parafilmem i zawiń ją w folię aluminiową. Obracaj rurkę od końca do końca przez 18 godzin w temperaturze pokojowej.
  4. Pozwól nasionom osiąść. Ostrożnie usunąć roztwór EMS i wyrzucić do pojemnika na odpady zawierającego 1 M NaOH w równych objętościach (NaOH pomaga zneutralizować/dezaktywować EMS, dzięki czemu można go bezpiecznie wyrzucić). Wyrzuć zużyte naczynie z tworzywa sztucznego do 1 M roztworu NaOH.
    UWAGA: Po 24 godzinach należy zutylizować odrzuty zgodnie z praktykami laboratoryjnymi dotyczącymi materiałów niebezpiecznych.
  5. Umyj dokładnie zmutagizowane nasiona 40 ml autoklawowanej wody co najmniej 8 razy. Wyrzuć EMS zawierający wodę do pojemnika na odpady NaOH, jak wspomniano powyżej.
  6. Do końcowego prania dodaj 40 ml 100 mM tiosiarczanu sodu i spłucz 3 razy, aby usunąć ślady EMS.
  7. Namocz nasiona w 40 ml autoklawizowanej wody przez ~ 1 godzinę, aby rozproszyć EMS z nasion, a następnie umieść je na bibule filtracyjnej, aż do całkowitego wyschnięcia.
  8. Przenieść nasiona do probówki mikrowirówkowej i rozwarstwić nasiona w temperaturze 4 °C w 40 ml autoklawowanej wody przez 2-4 dni. Pomaga to w przerwaniu spoczynku nasion i zapewnia jednorodny wzrost.
  9. Przenieść zarówno nasiona mutagegenizowane (M0), jak i nasiona kontrolne na glebę (skład gleby: agropet: soilrite, 1:1) i przenieść je do pomieszczeń wzrostowych z 16 h światłem / 8 h ciemnym fotoperiodem, natężeniem światła 150 μmol∙m−2∙s−1 i ~70% wilgotnością względną.
  10. Aby ustalić, czy mutageneza zakończyła się sukcesem, należy zwrócić uwagę na zmniejszoną szybkość kiełkowania i wzrost siewek oraz sektorowanie chlorofilu18 (Rysunek 1A). Porównaj rośliny zmutagizowane z roślinami kontrolnymi, aby zidentyfikować te różnice fizjologiczne i rozwojowe.
    UWAGA: Do zbioru nasion z roślin M1 można stosować różne metody. W tym protokole zastosowaliśmy metodę zbioru nasion opartą na pojedynczym rodowodzie. Każdy zakład M1 ma unikalny numer, począwszy od A1 do A3500.
  11. Utrzymuj indywidualnie ponumerowane rośliny jako odrębne linie roślin (Rysunek 1B).
  12. Po osiągnięciu dojrzałości zbierz nasiona z tych pojedynczych zmutowanych roślin i przechowuj je jako pojedyncze linie M1 (Rysunek 2). Z pojedynczej kolekcji nasion rodowodowych uzyskaliśmy około 5000 linii M1, z czego 3500 linii M1 zostało przesianych.

2. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu wyselekcjonowania mutantów (8 miesięcy)

  1. Identyfikacja nowych mutantów na podstawie odpowiedzi Ca2+ na wybrany bodziec. Tutaj użyliśmy H2O2 jako przykładu.
  2. W celu identyfikacji mutantów należy przeprowadzić badania przesiewowe generacji M2. Ponieważ mutanty recesywne segregują się z częstotliwością 1/8 w pokoleniu M2 po mutagenezie EMS14, badania przesiewowe roślin segregujących 8-12 M2 obejmują jedną linię M1 i identyfikują homozygotycznego recesywnego mutanta (użycie 12 sadzonek zwiększa prawdopodobieństwo znalezienia mutanta). Z każdej niezależnej linii M1 przebadać 12 sadzonek M2 pod kątem odpowiedzi Ca2+ na H2O2 (12 M2 siewek na M1 linia).
  3. Użyj wysokowydajnego protokołu sterylizacji nasion i hydroponicznego wzrostu roślin19. Umieścić prawie 12-15 M2 nasion na linię M1 w indywidualnych studzienkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i sterylizować przy użyciu chloru gazowego (40 ml 12% podchlorynu sodu i kwasu solnego, 3:1, v/v) w eksykatorze przez 4 godziny w dygestorium. Po zabiegu należy otworzyć eksykator i pozostawić na noc do odparowania chloru gazowego.
  4. Po sterylizacji wynieś płytki na zewnątrz i dodaj płynną pożywkę 1/2 MS (MS o połowie mocy bez agaru) do poszczególnych dołków. Uszczelnij płytki parafilmem i rozwarstwiaj nasiona przez 2-4 dni w temperaturze 4 °C, a następnie przenieś nasiona do komory wzrostowej z 10 godzinami światła / 14 godzin ciemnego fotoperiodu w temperaturze 20-22 °C i wilgotności względnej 70%.
  5. Gdy sadzonki osiągną wiek 8-12 dni, umieść 12 M2 sadzonki z każdej linii indywidualnie na 96-dołkowej płytce luminometru. Do pomiaru odpowiedzi Ca2+ na H2O2 należy użyć czytnika płytek luminometru.
  6. Po przeniesieniu sadzonki dodać 150 μl 5-10 μM roztworu koelentrazyny (rozcieńczonego w autoklalawowanej wodzie z 5 mM zapasu metanolu) (UWAGA) do indywidualnych studzienek w ciemnym/słabo oświetlonym miejscu i przechowywać w ciemności w temperaturze 21 °C przez 8 h.
    UWAGA: Koelentrazyna jest grupą protetyczną, która wiąże się z apo-aequorin i odtwarza ją do funkcjonalnej aequorin. Koelentrazyna jest wrażliwa na światło i dlatego jest przechowywana w ciemnych butelkach, chronionych przed światłem.
  7. Następnego dnia wykonaj badanie przesiewowe mutantów przy użyciu 10 mM H2O2 jako bodźca i zmierz późniejszą odpowiedź Ca2+.
  8. Aby uzyskać jednoczesny pomiar 24 dołków, utwórz zautomatyzowany program kinetyczny, który mierzy tło przez 1 minutę, następnie dodawanie bodźców (40 μL) i pomiar przez 10 minut, a następnie całkowite wyładowanie aequorin (2 M CaCl2 w 150 μL 20% etanolu) przez 1-2 min.
    UWAGA: Wyładowanie końcowe dla całkowitej aequoryny jest potrzebne do ilościowego określenia zmierzonego Ca2+ i jako dodatkowa kontrola dla funkcjonalnej aequoryny. Wyładowanie końcowe trwa krótko 1-2 minuty i nie powoduje znacznego obumierania roślin. Alternatywnie, jeśli rośliny umrą po etapie rozładowania, należy ponownie przesiać określoną linięM1 i uratować bez rozładowania. Takie mutanty można potwierdzić w pokoleniach M3 i M4 za pomocą etapu rozładowania.
  9. Użyj metody skanowania w formacie 24-dołkowym, która mierzy każdy rząd w odstępie 7 sekund z czasem integracji 300 ms na dołek na punkt pomiarowy. Użyj sadzonki typu dzikiego jako kontroli w każdym rzędzie do porównania i oceny mutanta.
    UWAGA: Pojedyncza 96-dołkowa płytka zawierająca sadzonki M2 pokryje 8 pojedynczych linii M1 (8 M1 * 12 = 96 M2) i może być przesiewana w ciągu 2,5 godziny, a każdego dnia przesiewane będą 32 linie M1, 640 M1 roślin miesięcznie. Cała procedura przesiewania po tym, jak rośliny są gotowe, trwa około 8 miesięcy.
  10. Identyfikacja mutantów na podstawie utraty lub zmniejszonej odpowiedzi Ca2+ z H2O2 . Uratuj wybrane mutanty dzięki procesowi mycia opartemu na antybiotykach. Umyj sadzonkę dwukrotnie roztworem cefotaksymu o stężeniu 25 mg/l, a następnie przenieś do pożywki ratunkowej zawierającej 25 mg/l cefotaksymu w 1/2 MS agary.
  11. Hoduj płytki w świetle 10 godzin / 14 godzin ciemnego fotoperiodu, aby uzyskać zmutowaną roślinę. Mycie cefotaksymem pomaga usunąć wszelkie szkodliwe mikroorganizmy z sadzonki. Ponieważ sadzonki po rozpuszczeniu są utrzymywane bez zamknięcia, należy zminimalizować zanieczyszczenie podczas przenoszenia z powrotem do stanu sterylnego.
  12. Przenieś zmutowaną roślinę do gleby, aby uzyskać homozygotyczną populacjęM3.

3. Analiza danych i identyfikacja mutantów (1-3 miesiące)

UWAGA: Odczyty dostarczone z powyższej metody są w jednostkach światła względnego (RLU).

  1. Do obliczenia stężenia [Ca2+]cyt należy użyć następującego równania stężenia20.
    pCa = 0,332588(−log (L/Lmax)) + 5,5593
    Liczba luminescencji () i łączna liczba pozostałych (maks.).
  2. Przelicz uzyskane wartości pCa na wartości [Ca2+]cyt w μM, mnożąc przez 106. Następnie wykreśl graficznie względem kontroli aequorin (transgeniczny Col-0 aequorin) w celu zidentyfikowania przypuszczalnych mutantów H2O2 na odpowiedź Ca2 +.
  3. Uratowane sadzonki wykazujące utratę lub zmniejszoną reakcję na aplikacjęH2O2uratowane.
  4. Po osiągnięciu dojrzałości zbierz nasiona z uratowanego mutanta i ponownie przesiewaj je pod kątem reakcji na H2O2 w siewkach M3. Jeśli wszystkie 12 siewek M3 wykazują odpowiedź Ca2+ podobną do rośliny matecznej, należy uznać populację za homozygotyczną populację zmutowanąM3. Jeśli wszystkie 12 siewek nie wykazuje takiej odpowiedzi, przenieś je do pokolenia M4 i ponownie przesiew, aby uzyskać populację homozygotyczną.
  5. Po uzyskaniu homozygotycznej linii roślin zidentyfikuj gen prowadzący do zmiany fenotypu za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Populację EMS przesiewano pod kątem wzrostu stężenia Ca2+ indukowanego przez H2O2 . Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, z każdej linii M1 przesiewano 12 poszczególnych siewek M2. Na Rysunku 3 przedstawiono jedną z takich linii M1, gdzie każdy panel pokazuje 12 poszczególnych siewek M2. Jako kontrolę do porównania i oceny odpowiedzi mutantów wykorzystano aequorynę typu dzikiego. Mutant recesywny segreguje w stosunk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mutageneza EMS jest potężnym narzędziem do generowania mutacji w populacji. Klasyczne przesiewowe badania genetyczne z wykorzystaniem EMS są skutecznym narzędziem do identyfikacji nowych genów z dwóch głównych powodów: po pierwsze, nie wymagają żadnych wcześniejszych założeń dotyczących tożsamości genów, a po drugie, nie wprowadzają żadnych uprzedzeń. Istnieje kilka metod generowania populacji przesiewowych, takich jak EMS, insercje T-DNA, promieniowanie itp. Spośród wszystkich metod, mutageneza oparta na EMS ma niewiele...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Narodowemu Instytutowi Badań nad Genomem Roślinnym - Phytotron Facility for plant growth, Bombay Locale za sesję zdjęciową oraz Departamentowi Biotechnologii - eLibrary Consortium za udostępnienie e-zasobów. Prace te były wspierane przez Departament Biotechnologii Indii w ramach grantu National Institute of Plant Genome Research Core Grant, programu Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; oraz CSIR-Junior Research Fellowship (dla D.M i S.M) oraz Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (dla R.P).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowychJetbiofil11024do uprawy sadzonek
96-dołkowa biała płytka klinicznaThermo Scientific9502887do pomiarów luminometrem
Aequorin
AgropetLab Chem Indiado wzrostu roślin
Chlorek wapniaFisher Scientific12135do rozładowania rozwiązanie
CoelenterazinePJK55779-48-1grupa protetyczna dla aequorin
Sulfonian ehtylmetanuSigma AldrichM0880-5Gdo mutagenezy nasion
EtanolOdczynnik analityczny1170do roztworu odprowadzającego
Kwas solnyMerck Life Sciences1.93001.0521roztwór do sterylizacji
Nadtlenek wodoruFisher Scientific15465jako bodziec do podniesienia poziomu wapnia
Wznoszenie LuminoskanThermo Scientific5300172pomiar luminescencji aequorin
Bufor MES HimediaRM1128-100GWzrost roślin
Murashige i skoog MediaHimediaPT021-25LWzrost roślin
Wodorotlenek soduFisher Scientific27805do neutralizacji EMS
Podchloryn soduMerck Life Sciences1.93607.5021roztwór do sterylizacji
Tiosiarczan soduFisher Scientific28005do mycia nasion w kroku 1.6
soilrytLab Chem Indiado wzrostu roślin
Doniczki kwadratoweLab Chem Indiado wzrostu roślin
SacharozaSigma AldrichS0389wzrost roślin
TaximAlkem7180720do ratowania sadzonek

Bibliografia

  1. Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
  2. Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
  3. Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
  4. Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  5. White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
  6. Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162(2014).
  7. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
  8. Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
  9. Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
  10. Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
  11. McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
  12. Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
  13. Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
  14. Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
  15. Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
  16. Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
  17. Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
  18. Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399(2015).
  19. Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
  20. Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
  21. Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
  22. Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394(2018).
  23. Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
  24. Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362(2007).
  25. Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
  26. Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
  27. Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
  28. Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
  29. Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
  30. Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
  31. Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
  32. Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
  33. Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
  34. Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
  35. Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
  36. Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
  37. Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mutageneza EMSreporter ekuorynaroztw r celenterazynywysokoprzepustowe przesiewaniestymulacja nadtlenkiem wodorupomiar wapnia cytozolowegoArabidopsis thalianamapowanie gen w
Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem transgenicznego Calcium Reporter Aequorin w celu identyfikacji nowych celów w sygnalizacji wapniowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.