Manuskrypt przedstawia pobieranie próbek ludzkich guzów mózgu na miejscu za pomocą mikroekstrakcji w fazie stałej, a następnie ich profil biochemiczny w kierunku odkrycia biomarkerów.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie próbek i ekstrakcja guzów mózgu na miejscu do analizy metabolomicznej i lipidomicznej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomimo różnorodności dostępnych narzędzi do diagnozowania i klasyfikacji nowotworów, metody umożliwiające szybką i prostą charakterystykę nowotworów są nadal potrzebne. W ostatnich latach spektrometria mas stała się metodą z wyboru do nieukierunkowanego profilowania związków dyskryminacyjnych jako potencjalnych biomarkerów choroby. Płyny biologiczne są ogólnie uważane za preferowane matryce ze względu na ich dostępność i łatwiejsze przetwarzanie próbek, podczas gdy bezpośrednie profilowanie tkanek dostarcza bardziej selektywnych informacji o danym nowotworze. Przygotowanie tkanek do analizy tradycyjnymi metodami jest znacznie bardziej złożone i czasochłonne, a co za tym idzie, nie nadaje się do szybkiej analizy na miejscu. W niniejszej pracy przedstawiono protokół łączący przygotowanie próbki i ekstrakcję małych cząsteczek na miejscu, bezpośrednio po resekcji guza. Urządzenie do pobierania próbek, które jest wielkości igły do akupunktury, może być wprowadzone bezpośrednio do tkanki, a następnie przetransportowane do pobliskiego laboratorium w celu analizy instrumentalnej. Wyniki analiz metabolomicznych i lipidomicznych wskazują na zdolność tego podejścia do ustalania fenotypów nowotworów związanych z histologicznym pochodzeniem guza, złośliwością i mutacjami genetycznymi, a także do selekcji związków dyskryminujących lub potencjalnych biomarkerów. Nieniszczący charakter tej techniki pozwala na późniejsze wykonywanie rutynowo stosowanych testów, np. testów histologicznych, na tych samych próbkach, które są używane do analizy SPME, umożliwiając w ten sposób uzyskanie bardziej kompleksowych informacji wspierających spersonalizowaną diagnostykę.
Wprowadzenie
Rezonans magnetyczny (MRI) i tomografia komputerowa (CT) to główne metody używane do analizy zmian w mózgu w czasie rzeczywistym. Różnicowanie guzów mózgu opiera się na ogół na histopatologii z dodatkowym barwieniem i zaawansowanymi technikami immunohistochemicznymi. Zgodnie ze zaktualizowanymi wytycznymi dotyczącymi guzów ośrodkowego układu nerwowego mózgu wydanymi przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) w 2016 roku, testy genetyczne mają kluczowe znaczenie dla różnicowania i klasyfikacji tych nowotworów1. Różnicowanie i klasyfikacja nowotworów pozwala lekarzom wybrać najskuteczniejsze leczenie dla danego typu nowotworu, wydłużając w ten sposób oczekiwaną długość życia pacjenta. Niestety, pomimo dostępności tak zaawansowanych metod, które pomagają lekarzom w doborze optymalnej terapii dla ich pacjentów, oczekiwana długość życia pacjentów, u których zdiagnozowano glejaka (glejaka IV stopnia) wynosi tylko około 15-16 miesięcy2. Nawet przy wyrafinowaniu i zwiększonej dokładności wspomnianych metod obrazowania i histologicznych jako narzędzi diagnostycznych, nadal istnieje duże zapotrzebowanie na nowe techniki, które mogą oferować informacje uzupełniające, aby pomóc lekarzom w podejmowaniu decyzji dotyczących przebiegu leczenia. W ciągu ostatnich lat zaproponowano kilka nowych podejść opartych na spektrometrii mas do śródoperacyjnej analizy raka3,4. Potencjał mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME), metody przedstawionej w niniejszym dokumencie, jako narzędzia do szybkiej analizy na miejscu, został już zademonstrowany w różnych badaniach5. Obecny manuskrypt przedstawia jedno z klinicznych zastosowań metody, nieukierunkowaną metabolomikę i lipidomikę guzów ludzkiego mózgu. Badania nieukierunkowane stanowią ważny punkt wyjścia do odkrywania potencjalnych biomarkerów. Po ustaleniu, takie biomarkery mogą być następnie wykorzystane jako punkty odniesienia diagnostyczne do różnicowania nowotworów przy użyciu tej samej technologii w połączeniu z oprzyrządowaniem na miejscu.
SPME to technika przygotowania próbek oparta na równowadze, która ekstrahuje małe cząsteczki z matryc próbek za pomocą małych ilości fazy ekstrakcji. W najbardziej tradycyjnej konfiguracji urządzenia (sondy) SPME, włókno jest powlekane odpowiednią fazą ekstrakcji i unieruchamiane na solidnym podłożu, tj. metalowym drucie5,6. Biokompatybilne powłoki i urządzenia (sondy) umożliwiają ekstrakcję bezpośrednio ze złożonych matryc biologicznych bez wstępnej obróbki próbki, np. homogenizacji i filtracji. W procesie ekstrakcji anality są dzielone między fazę ekstrakcji a matrycę próbki proporcjonalnie do ich początkowych stężeń. Jeśli ekstrakcja jest przeprowadzana wystarczająco długo, osiągana jest równowaga. Podczas gdy ekstrakcja w stanie równowagi zapewnia najwyższą możliwą czułość i odtwarzalność, ekstrakcja przedrównowagowa jest również możliwa, a nawet preferowana w niektórych przypadkach, np. pobieranie próbek in vivo, gdzie ograniczenia czasowe związane z pobieraniem próbek na miejscu (np. na sali operacyjnej lub na izbie przyjęć) wymagają szybkiej ekstrakcji. Na profil czasu ekstrakcji danego analitu na ogół wpływają właściwości fizykochemiczne analitu, matryca, z której pobierana jest próbka, rodzaj użytego sorbentu i kilka innych warunków ekstrakcji. Mnogość czynników wpływających na kinetykę ich ekstrakcji sprawia, że praktycznie niemożliwe jest zapewnienie równowagi ekstrakcji wszystkich związków, gdy wykonywane są niecelowane analizy, takie jak metabolomika lub lipidomika. Z wyżej wymienionych powodów czas ekstrakcji w obecnym protokole został ustalony arbitralnie, aby zapewnić z jednej strony zadowalającą czułość i pokrycie metabolitów, a z drugiej strony praktyczność stosowania na miejscu.
Należy podkreślić, że bardzo mały rozmiar sond używanych do ekstrakcji próbki z tkanek powoduje tylko minimalne uszkodzenia tkanek, podczas gdy sama procedura pobierania próbek nie zużywa żadnej tkanki, ale bardzo małe ilości małych cząsteczek z badanego obszaru; dlatego ta sama próbka może być dalej używana do rutynowych testów, tj. histologiczne lub genetyczne, umożliwiające uzyskanie podstawowych i uzupełniających informacji z tej samej próbki. Takie komplementarne, kompleksowe dane umożliwiłyby lepsze zrozumienie biologii nowotworów, co miejmy nadzieję ułatwiłoby odkrycie nowych celów leczenia. Wykorzystanie tej metody dodatkowo zwiększa możliwość diagnostyki śródoperacyjnej na miejscu podczas określania docelowych biomarkerów.
Poniżej prezentujemy protokoły pobierania próbek guzów mózgu na miejscu do analiz metabolomicznych i lipidomicznych oraz przetwarzania danych.
Protokół
Przedstawione tutaj badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną Collegium Medicum w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu (KB 628/2015). Pamiętaj, aby zawsze nosić fartuch laboratoryjny i wszelkie inne wymagane środki ochrony osobistej, takie jak (między innymi) rękawice i okulary ochronne. Nie dotykaj fazy ekstrakcji sond do mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME).
1. Przygotowanie urządzeń SPME
- Używaj sond (włókien) z powłokami w trybie mieszanym i C18 odpowiednio do metabolomiki i lipidomiki. Zbierz dwa zestawy próbek, jeden do metabolomiki, a drugi do lipidomiki.
- Dostosuj powłokę sondy do optymalnej długości, przycinając sondę SPME. W niniejszym badaniu wybrana długość powłoki wynosiła 7 mm. Wybierz długość włókna zgodnie z wielkością badanego guza, upewniając się, że cały sorbent może być zanurzony w guzie (Rysunek 1).
- Kondycjonować powłoki sond poprzez moczenie ich w mieszaninie metanol: woda 50:50 v/v przez okres minimum 1 godziny przed procedurą ekstrakcji. Włókna należy transportować do miejsca pobrania próbek (np. do szpitala) w fiolce zawierającej roztwór kondycjonujący.
2. Procedura pobierania próbek
- Nie należy w żaden sposób myć ani wstępnie leczyć guza przed ekstrakcją SPME.
- Pobieranie próbek należy rozpocząć jak najszybciej po usunięciu guza (2 minuty w prezentowanym badaniu).
UWAGA: Dostosuj czas w zależności od konfiguracji na miejscu dla danej placówki (odległość stanowiska pracy badacza od stołu operacyjnego) i utrzymuj go na stałym poziomie przez cały czas trwania badania. Zminimalizowanie czasu, jaki upłynął między usunięciem guza a rozpoczęciem ekstrakcji, ma kluczowe znaczenie dla wychwycenia niestabilnych metabolitów, które ulegają degradacji po odcięciu krążenia krwi od badanej tkanki. - Pobieranie próbek odbywa się w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, podczas przeprowadzania ekstrakcji, należy umieścić próbkę na lodzie. W każdym przypadku należy zachować te same warunki dla całego zestawu próbek.
- Wyjąć sondę z fiolki.
- Płukać włókna wodą klasy LC/MS do chromatografii mas (LC/MS) przez 5 sekund, zanurzając je w wodzie klasy LC/MS. Nie pozwól, aby sorbent wyschł przed włożeniem włókna, aby zapewnić dobrą odtwarzalność danych.
- Wprowadź włókna do tkanki guza mózgu tak daleko od siebie, jak to możliwe, upewniając się, że cała faza ekstrakcji znajduje się wewnątrz guza.
UWAGA: Zaleca się, aby ekstrakcje były przeprowadzane w powtórzeniu w celu określenia niejednorodnej natury guza (Ryc. 2). Zalecane są trzy powtórzenia na próbkę. - Pozostaw sondę na 30 minut w tkance (mierzone za pomocą timera).
- Użyj ślepych kontrolek, aby wyeliminować źródła błędów związane z obecnością artefaktów pochodzących ze źródeł innych niż próbkowany guz. Aby uzyskać ślepą próbę, należy poddać włókna temu samemu analitycznemu procesowi pracy, jak opisano powyżej, ale bez etapu pobierania próbek (wprowadzenie do tkanki lub jakiejkolwiek innej próbki/matrycy). Na etapie przetwarzania danych należy skompilować anality wyekstrahowane z tych włókien w "listę wykluczeń", aby wykluczyć sygnały pochodzące z zanieczyszczeń pochodzących z rozpuszczalników lub produkcji włókien. Zaleca się użycie co najmniej 3 powtórzeń ślepej próby.
UWAGA: Aby sprawdzić ryzyko zanieczyszczenia, konieczne jest pobranie próbek z rękawic, stołów, aparatury lub innych powierzchni, które mogą stwarzać ryzyko zanieczyszczenia. W takich przypadkach protokoły przygotowania włókien, czasu ekstrakcji i desorpcji są takie same, jak w przypadku próbek. - Podczas przeprowadzania ekstrakcji należy oznaczyć fiolki, które mają być używane do przechowywania sond po ekstrakcji.
- Po 30 minutach usuń błonnik(i) z guza mózgu.
- Myj włókna wodą przez 3 sekundy, zanurzając je w wodzie klasy LC / MS w celu usunięcia pozostałości krwi lub resztek komórek z sondy, tak aby końcowy ekstrakt zawierał tylko małe cząsteczki. Dłuższy etap prania nie jest zalecany, ponieważ może to prowadzić do utraty związków polarnych.
- Unieruchomić włókna w wstępnie naciętej przegrodzie nasadki fiolki z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), przebijając przegrodę od dołu niepowlekanym końcem włókna.
- Umieść włókna unieruchomione w nakrętce w oddzielnych fiolkach HPLC i umieść je w wybranym pojemniku transportowym.
- Wykonaj kroki 2.11-2.13 dla światłowodów przeznaczonych do ślepych elementów sterujących.
3. Transport i przechowywanie
UWAGA: Dostępnych jest kilka opcji transportu próbek do laboratorium. Zaleca się używanie do transportu pojemnika Dewara lub styropianu z ciekłym azotem wypełnionego suchym lodem; Alternatywnie do natychmiastowego i szybkiego transportu można użyć okładów z lodu.
- Umieścić fiolki z włóknami w pojemniku transportowym.
- Po przybyciu do laboratorium należy natychmiast umieścić fiolki z włóknami SPME w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub -30 °C. Nie przechowuj włókien dłużej niż 3 lata w temperaturze -30 °C lub 5 lat w temperaturze -80 °C.
4. Przygotowanie próbki do analizy metabolomicznej
UWAGA: Ten krok powinien być wykonany tylko wtedy, gdy wszystkie próbki do eksperymentu zostały zebrane.
- Przed analizą instrumentalną należy przygotować mieszaninę rozpuszczalnika desorpcyjnego: acetonitryl: woda 80:20 v/v.
- Wyjąć z zamrażarki fiolki zawierające włókna w trybie mieszanym. Używaj ich do analizy metabolomicznej.
- Oznaczyć fiolki przeznaczone do użycia do desorpcji.
- Odpipetować 300 μl roztworu desorpcyjnego (przygotowanego w kroku 4.1) do szklanych wkładek umieszczonych w fiolkach o pojemności 2 ml.
- Przeprowadź desorpcję z każdego włókna umieszczonego w osobnej wkładce, całkowicie zanurzając powłokę w rozpuszczalniku desorpcyjnym, a następnie mieszając ją przez 120 minut z prędkością 1 200 obr./min za pomocą wiru.
- Po 120 minutach (po zakończeniu desorpcji) zdjąć nakrętki z sondami.
- Przygotować próbkę kontroli jakości, mieszając 10 μl podwielokrotności każdej próbki z zestawu próbek. Wielkość zestawu próbek zależy od projektu eksperymentalnego. Ważne jest, aby analizować wszystkie próbki jako jedną partię.
- Zamknąć fiolki nowymi nakrętkami.
- Umieścić fiolki w autosamplerze (4 °C) spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości do chromatografii cieczowej (LC-HRMS) i przejść do kroku 5.
UWAGA: Losowo dobieraj kolejność wstrzyknięć w próbkach, w tym ślepe próby kontrolne. Wstrzyknij próbkę QC po każdych 8-10 próbkach, aby monitorować stabilność urządzenia.
5. Analiza metabolomiczna z wykorzystaniem chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości (analiza RPLC-HRMS)
- Ustaw parametry analizy LC-HRMS i trybu jonizacji dodatniej.
UWAGA: Parametry użyte w obecnym badaniu w trybie dodatnim były następujące: zakres skanowania: m/z 80-1000; rezolucja 70 000; akwizycja realizowana przy użyciu AGC (1 000 000 jonów); czas wstrzykiwania do pułapki C: automatyczny; napięcie natrysku: 1,5 kV; Poziom RF obiektywu S: 55%; Napięcie soczewki S: 25 V; napięcie skimmera: 15 V; temperatura kapilarnej: 300 °C; Gaz osłonowy: 40 j.a.; gaz pomocniczy: 15 a.u.; Temperatura nagrzewnicy gazowej: 300 °C. Ta metoda chromatograficzna została zaadaptowana z Vuckovic et al.7. Objętość iniekcji: 10 μL. - Ustaw parametry analizy LC-HRMS i trybu jonizacji ujemnej.
UWAGA: Parametry stosowane w obecnym badaniu w trybie negatywnym: zakres skanowania: m/z 80-1000; rezolucja 70 000; akwizycja realizowana przy użyciu AGC (1 000 000 jonów); czas wstrzykiwania do pułapki C: automatyczny; napięcie natrysku: 2,5 kV; Poziom RF obiektywu S: 55%; Napięcie soczewki S: -25 V; napięcie skimmera: -15 V; temperatura kapilarnej: 256 °C gaz osłonowy: 48 a.u; Gaz pomocniczy: 11 a.u.; Temperatura nagrzewnicy gazowej: 413 °C. Ta metoda chromatograficzna została zaczerpnięta z Vuckovic et al.7. Objętość iniekcji: 10 μL. - Skalibruj przyrząd zgodnie z zaleceniami producenta.
UWAGA: W obecnym badaniu przyrząd był kalibrowany przy użyciu kalibracji zewnętrznej co 48 godzin, co dało dokładność masy <2 ppm. - Rozpocznij analizę, klikając przycisk Start w oprogramowaniu obsługującym urządzenie.
- Po zakończeniu analizy zastąp kolumnę RPLC kolumną HILIC, zmień fazy ruchome i przejdź do kroku 6.
6. Analiza metabolomiczna z wykorzystaniem chromatografii cieczowej oddziaływań hydrofilowych i spektrometru masowego o wysokiej rozdzielczości (analiza HILIC-HRMS)
- Ustaw parametry analizy LC-HRMS i trybu jonizacji dodatniej.
UWAGA: Parametry użyte w obecnym badaniu w trybie dodatnim były następujące: zakres skanowania: m/z 80-1000; rezolucja 70 000; akwizycja realizowana przy użyciu AGC (1 000 000 jonów); czas wstrzykiwania do pułapki C: automatyczny; napięcie natrysku: 1,5 kV; Poziom RF obiektywu S: 55%; Napięcie soczewki S: 25 V; napięcie skimmera: 15 V; Gaz osłonowy: 60 j.a.; gaz pomocniczy: 40 a.u.; temperatura nagrzewnicy gazowej: 425 °C; temperatura kapilarna: 325 °C. Metoda chromatograficzna została zaadaptowana z Vuckovic et al.7. Objętość iniekcji: 10 μL. - Ustaw parametry analizy LC-HRMS i trybu jonizacji ujemnej.
UWAGA: Parametry użyte w obecnym badaniu w trybie ujemnym były następujące: zakres skanowania: m/z 80-1000; rezolucja 70 000; akwizycja realizowana przy użyciu AGC (1 000 000 jonów); czas wstrzykiwania do pułapki C: automatyczny; napięcie natrysku: 1,3 kV; Poziom RF obiektywu S: 55%.; Napięcie soczewki S: -25 V; napięcie skimmera: -15 V; temperatura kapilarnej: 263 °C; Gaz osłonowy: 60 j.a.; gaz pomocniczy: 30 a.u.; Temperatura dodatkowej grzałki gazowej: 425 °C. Metoda chromatograficzna została zaadaptowana z Vuckovic et al.7. Objętość iniekcji: 10 μL. - Skalibruj przyrząd zgodnie z zaleceniami producenta.
UWAGA: W obecnym badaniu przyrząd był kalibrowany przy użyciu kalibracji zewnętrznej co 48 godzin, co dało dokładność masy <2 ppm. - Rozpocznij analizę, klikając przycisk Start w oprogramowaniu obsługującym urządzenie.
7. Przygotowanie próbki do analizy lipidomicznej
UWAGA: Ten krok powinien być wykonany tylko wtedy, gdy wszystkie próbki do eksperymentu zostały zebrane.
- Przed rozpoczęciem analizy należy przygotować mieszaninę rozpuszczalnika desorpcyjnego: izopropanol:metanol 50:50 v/v.
- Wyjąć z zamrażarki fiolki zawierające włókna C18 przeznaczone do analizy lipidomicznej.
- Oznaczyć fiolki przeznaczone do użycia do desorpcji.
- Odpipetować 200 μl roztworu desorpcyjnego (przygotowanego w kroku 7.1) do wkładek ze szkła silanizowanego umieszczonych w fiolkach o pojemności 2 ml.
UWAGA: Można również stosować wkłady niesilanizowane, ale ich stosowanie może skutkować słabą odtwarzalnością związków o wysokim logP, ponieważ takie związki mogą niespecyficznie przyczepiać się do szklanych ścianek. - Przeprowadź desorpcję z każdego włókna w osobnej wkładce, całkowicie zanurzając powłokę w rozpuszczalniku desorpcyjnym, a następnie mieszając ją przez 60 minut z prędkością 1 200 obr./min za pomocą wiru.
- Po 60 minutach po zakończeniu desorpcji usuń nakrętki z sondami.
- Przygotować próbkę kontroli jakości, mieszając 10 μl podwielokrotności każdej próbki z zestawu próbek. Wielkość zestawu próbek zależy od projektu eksperymentalnego. Ważne jest, aby analizować wszystkie próbki jako jedną partię.
- Zamknąć fiolki nowymi nakrętkami.
- Umieścić fiolki w autosamplerze (4 °C) spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości do chromatografii cieczowej (LC-HRMS) i przejść do kroku 8.
8. Analiza lipidomiczna z wykorzystaniem chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (analiza RPLC-HRMS)
- Ustaw parametry analizy LC-HRMS i trybu jonizacji dodatniej.
UWAGA: Parametry użyte w obecnym badaniu w trybie jonów dodatnich były następujące: zakres skanowania: m/z 100-1000; akwizycja realizowana przy użyciu AGC (1 000 000 jonów); czas wstrzykiwania do pułapki C: automatyczny; napięcie natrysku: 3,5 kV, poziom RF soczewki S: 55%; Napięcie soczewki S: 25 V; napięcie skimmera: 15 V; temperatura kapilary 275 °C; Gaz osłonowy: 30 j.a.; gaz pomocniczy: 10 a.u.; zapas paliwa: 2 a.u.; temperatura grzałki sondy 300 °C. Stosowane parametry LC to: faza A: metanol:woda, 40:60 z 10 mM octanem amonu i 1 mM kwasem octowym; faza B: izopropanol:metanol, 90:10 z 10 mM octanem amonu i 1 mM kwasem octowym; nachylenie: 0 min – 20% B; 1,0 min – 20% B; 1,5 min – 50% B; 7,5 min – 70% B; 13,0 min – 95% B; 17,0 min – 95% B; 17,1 min – 95,5 % B; 23,0 min – POSTÓJ; Kolumna C18, 3,5 μm, 2,1 mm x 75 mm; przepływ: 0,2 ml/min; temperatura piekarnika: 55 °C; objętość iniekcji: 10 μL. - Ustaw parametry analizy LC-HRMS i trybu jonizacji ujemnej.
UWAGA: Parametry użyte w niniejszym badaniu były następujące: Parametry HRMS dla trybu jonów ujemnych: zakres skanowania: m/z 100-1000; akwizycja realizowana przy użyciu AGC (1 000 000 jonów); czas wstrzykiwania do pułapki C: automatyczny; napięcie natrysku: 3,5 kV, poziom RF soczewki S: 55%; Napięcie soczewki S: -25 V; napięcie skimmera: -15 V; temperatura kapilary 275 °C; Gaz płaszczowy: 30 j.a.; gaz pomocniczy: 10 a.u.; zapas paliwa: 2 a.u; Temperatura grzałki sondy 300 °C. Metoda chromatograficzna: taka sama jak w ppkt 8.1. - Skalibruj przyrząd zgodnie z zaleceniami producenta.
UWAGA: W obecnym badaniu przyrząd był kalibrowany przy użyciu kalibracji zewnętrznej co 48 godzin, co dało dokładność masy <2 ppm. - Rozpocznij analizę, klikając przycisk Start w oprogramowaniu obsługującym urządzenie.
- Po zakończeniu analizy zastąp kolumnę RPLC kolumną HILIC, zmień fazy ruchome i przejdź do kroku 9.
9. Analiza lipidomiczna z wykorzystaniem chromatografii cieczowej oddziaływań hydrofilowych i spektrometru masowego o wysokiej rozdzielczości (analiza HILIC-HRMS)
- Ustaw parametry analizy LC-HRMS i trybu jonizacji dodatniej.
UWAGA: Parametry użyte w obecnym badaniu w trybie jonów dodatnich były następujące: zakres skanowania: m/z 100-1000; akwizycja realizowana przy użyciu AGC (1 000 000 jonów); napięcie natrysku: 1,5 kV; Poziom RF obiektywu S: 55%; Napięcie soczewki S: 25 V; napięcie skimmera: 15 V; temperatura kapilary 325 °C; Gaz osłonowy: 60 j.a.; gaz pomocniczy: 30 a.u.; zapas paliwa: 2 a.u.; temperatura grzałki sondy 320 °C. Stosowane parametry LC to: faza A: 5 mM octanu amonu w wodzie; faza B: acetonitryl; nachylenie: 0 – 2min – 4% B; 15,0 – 20% B; 15,1 – 4% B, 21,0 min – STOP; kolumna 3 μm 100 mm x 2,1 mm; przepływ: 0,4 ml/min; temperatura piekarnika: 40 °C; objętość iniekcji: 10 μL. - Ustaw parametry analizy LC-HRMS i trybu jonizacji ujemnej.
UWAGA: Parametry użyte w obecnym badaniu w trybie jonów ujemnych były następujące: zakres skanowania: m/z 80-1000; akwizycja realizowana przy użyciu AGC (1 000 000 jonów); napięcie natrysku: 1,5 kV, poziom RF soczewki S: 55%; Napięcie soczewki S: -25 V; napięcie skimmera: -15 V; temperatura kapilarni 320 °C; Gaz osłonowy: 50 j.a.; gaz pomocniczy: 21 a.u.; zapas paliwa: 3 a.u.; temperatura grzałki sondy 320 °C. Metoda chromatograficzna była taka sama, jak opisana w ppkt 9.1. - Skalibruj przyrząd zgodnie z zaleceniami producenta.
UWAGA: W obecnym badaniu przyrząd był kalibrowany przy użyciu kalibracji zewnętrznej co 48 godzin, co dało dokładność masy <2 ppm. - Rozpocznij analizę, klikając przycisk Start w oprogramowaniu obsługującym urządzenie.
10. Przetwarzanie danych i analiza statystyczna
- Przetwarzaj dane za pomocą oprogramowania zgodnego z formatem plików z surowymi danymi.
- Przeprowadzanie analiz statystycznych na podstawie przetworzonych danych.
UWAGA: Rodzaj testu zależy od hipotezy naukowej i projektu badania. W niniejszym badaniu wykorzystano analizę głównych składowych, analizę częściowo-najmniejszą kwadratowo-dyskryminacyjną oraz jednoczynnikową ANOVA.
Wyniki
Wykorzystanie mikroekstrakcji w fazie stałej jako metody przygotowania próbek w połączeniu z chromatografią cieczową sprzężoną z wysokorozdzielczą spektrometrią mas oraz zaawansowanym oprogramowaniem do przetwarzania danych pozwoliło nam na skuteczną charakterystykę metabolomu i lipidomu ludzkich guzów mózgu. Sonda, której rozmiar był porównywalny do igły akupunkturowej, spowodowała minimalne uszkodzenia badanej tkanki i nie doprowadziła do jej zużycia, co umożliwiło dalsze wykorzystanie próbek do badań histologicznych lub genetycznych. Satysfakcjonującą separację wybranych grup uzyskano zarówno dla kolumn fazy odwróconej, jak i HILIC, a także dla obu trybów jonizacji w analizach metabolomicznych i lipidomicznych. Zastosowanie obu metod rozdziału nie tylko w metabolomice, ale również w analizie lipidomicznej dostarczyło cennych, uzupełniających danych. Kolumna fazy odwróconej rozdziela lipidy ze względu na długość ich łańcuchów węglowych i obecność wiązań nienasyconych, natomiast kolumna HILIC jest przydatna do profilowania grup lipidów, w szczególności fosfolipidów8.
Stwierdzono, że powtarzalność analizy instrumentalnej jest bardzo dobra, co wynika z gęstego skupienia próbek QC na wykresie analizy głównych składowych (Rycina 3A; trzy próbki QC wstrzykiwane co osiem próbek pacjentów wzdłuż sekwencji nakładają się na siebie). Ponadto wykazano, że ślepe próby ekstrakcji wykorzystane do analizy kontroli negatywnej wyraźnie oddzielają się od próbek rzeczywistych. Szeroki zakres analitów wyekstrahowanych przez sondy ułatwił zidentyfikowanie reprezentatywnych gatunków, co pozwoliło na skuteczne różnicowanie guzów mózgu u ludzi w oparciu o ich pochodzenie histologiczne, stopień złośliwości oraz inne czynniki (np. genetyczne). Rycina 3B przedstawia dane lipidomiczne dla próbek pobranych od pacjentów z glejakami i oponiakami. Umożliwienie różnicowania między tymi guzami, które charakteryzowały się różnym pochodzeniem histologicznym i stopniem złośliwości, było istotnym celem badania, ponieważ oponiaki są zazwyczaj uważane za guzy łagodne, podczas gdy glejaki należą do jednych z najbardziej złośliwych. Dodatkowo, na Rycynie 4 przedstawiającej dane metabolomiczne, glejaki podzielono w zależności od stopnia złośliwości na wysoką i niską. Podgrupy te porównano z fenotypem molekularnym oponiaków. W obu przypadkach zaobserwowano wyraźne oddzielenie klastrów. Obecnie diagnostyka glejaków opiera się głównie na określaniu specyficznych mutacji genetycznych w próbkach guzów. Dlatego uzyskane wyniki porównano z danymi genotypowania. Rycina 5A przedstawia oddzielenie próbek z wykrytym współdelecyjnym 1p19q od próbek, w których mutacja ta nie wystąpiła.
Analiza statystyczna pozwala również na wybór związków w badanych grupach. Związki te mogą być rozważane jako potencjalne biomarkery w przypadkach, gdy pobrano odpowiednio dużą kohortę. Jednakże, aby wyciągnąć ostateczne wnioski o charakterze biologicznym, wymagana jest bardziej szczegółowa analiza, w tym jednoznaczne potwierdzenie zidentyfikowanych związków poprzez fragmentację oraz porównanie wykrytych gatunków ze standardami analitycznymi. Przykłady takich metabolitów dyskryminujących przedstawiono na Rysunku 3C oraz Rysunku 5B. Tożsamość tych związków, tj. sfingomieliny: SM d36:1 i proliny, została potwierdzona poprzez porównanie wzorców fragmentacji metabolitów z próbki oraz standardów autentycznych.
Rysunek 1: Włókna SPME przygotowane do procesu ekstrakcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Ekstrakcja oponiaka przy użyciu sond SPME. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: PCA i wykresy pudełkowe dla glejaków i oponiaków. Wykres analizy głównych składowych zawierający (A) wszystkie analizowane próbki, w tym próbki ślepe, kontrolę jakości (QC) ekstrakcji, próbki ślepe, oponiaki oraz glejaki; (B) zawierający tylko badane grupy (po wykluczeniu próbek ślepych i QC); (C) wykres pudełkowy z wąsami dla sfingomieliny: SM d36:1 różnicujący pacjentów z glejakiem i oponiakiem. Dane lipidomiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: PCA dla HGG, LGG i oponiaków.Wykres analizy głównych składowych przedstawiający różnicowanie pomiędzy (A) glejakami wysokiego stopnia (HGG) a oponiakami (MEN)9 oraz (B) glejakami niskiego stopnia (LGG) a oponiakami. Dane metabolomiczne przedrukowane z Via Medica ref9 za zgodą autora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Wykresy PCA i pudełkowe dla glejaka z delecją i bez delecji.(A) Wykres analizy głównych składowych wykazał różnice u pacjentów z ko-delecją 1p19q oraz bez niej; (B) wykresy pudełkowe dla proliny u pacjentów z ko-delecją 1p19q oraz bez niej; n-bez delecji, y-z delecją. Dane metabolomiczne Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Nieukierunkowana metabolomika i lipidomika są powszechnie stosowane w badaniach koncentrujących się na identyfikacji biomarkerów nowotworowych. Jednak w większości przypadków naukowcy poszukują związków, które można wykorzystać do badań przesiewowych choroby. W związku z tym preferowanymi próbkami biologicznymi są krew lub mocz ze względu na ich stosunkowo łatwy dostęp. Analiza tkanki nowotworowej jest wykonywana głównie w celu zrozumienia mechanizmów stojących za chorobą, scharakteryzowania różnych typów nowotworów itp. Analiza biomarkerów nowotworowych na miejscu jest rzadko wykonywana, ponieważ takie zastosowania wymagają intensywnego przygotowania próbki. Alternatywnie, strategie oparte na analizie profili tkankowych w czasie rzeczywistym bez wstępnej selekcji określonych biomarkerów przyciągają uwagę społeczności medycznej 3,4. Przedstawione w niniejszym artykule rozwiązanie pozwala spojrzeć z innej perspektywy na przetwarzanie tkanek na miejscu, odsłaniając rodzaj informacji, które można uzyskać za pomocą takich metod.
Połączenie pobierania próbek, przygotowania próbki i ekstrakcji sprawia, że SPME jest bardzo przydatnym narzędziem do analizy na miejscu. Co więcej, brak zużycia tkanek podczas pobierania próbek umożliwia dalsze wykorzystanie tych samych próbek do analizy biomarkerów i rutynowych badań (genotypowanie, analiza histologiczna), a tym samym dodanie nowych informacji do wyników standardowych badań. Urządzenie do pobierania próbek ma bardzo prostą konstrukcję, jego obsługa jest bardzo łatwa, a do przeprowadzenia samej ekstrakcji nie jest wymagane żadne specjalne szkolenie. Osiągnięcie wiarygodnych wyników wymaga jednak znacznie więcej niż tylko odpowiedniego obchodzenia się z urządzeniami. Aby prawidłowo przeprowadzić eksperyment, należy zrozumieć proces ekstrakcji, charakter próbki i zdawać sobie sprawę z potencjalnych błędów, które mogą mieć wpływ na dane.
Ważne jest, aby wziąć pod uwagę niejednorodność tkanki nowotworowej10; Pobrane próbki guzów mogą zawierać części ulegające martwicy, zwapnieniu i niedotlenieniu, a każdy z tych procesów znajdzie odzwierciedlenie w uzyskanym metabolomie i lipidomie, wpływając w ten sposób na wyniki. Dlatego zaleca się, aby pobieranie próbek w rozdzielczości przestrzennej było przeprowadzane przez wprowadzenie kilku włókien do różnych części tkanki nowotworowej lub alternatywnie, aby zastosowano dłuższą powłokę w celu penetracji całego guza w celu uzyskania uśrednionych informacji o guzie. Jeżeli przeprowadzana jest metoda pobierania próbek w rozdzielczości przestrzennej, wszystkie włókna mogą być desorbowane do jednego rozpuszczalnika desorpcyjnego; Pozwoliłoby to nie tylko na uzyskanie ogólnych informacji na temat guza, ale także zwiększyłoby czułość analizy. Alternatywnie, desorpcja pojedynczych włókien do oddzielnych fiolek umożliwiłaby badania mające na celu określenie wewnętrznej różnorodności guza mózgu, który składa się z rdzenia zbudowanego z komórek rakowych i strefy zewnętrznej, która jest granicą zdrowej tkanki. Głębsze części guza są zwykle bardziej uszkodzone przez procesy związane z rakiem11. Badacze muszą jednak pamiętać, że ta opcja pogarsza czułość metody i ogólną liczbę wykrywalnych związków. W obecnych pracach zastosowano powłokę o grubości 7 mm; Długość ta została uznana za optymalną dla różnych rozmiarów guzów objętych badaniem. Powłoki wnikały w guzy, a tym samym zapewniały niespecjalną rozdzielczość, ale uśredniały dane w całej próbce. Niezależnie od wybranego protokołu, ważne jest, aby ten sam protokół był przestrzegany podczas całego badania, w tym liczby włókien użytych do indywidualnego pobierania próbek, długości powłoki, czasu ekstrakcji i wszystkich innych czynników określonych w tej pracy.
Ważne jest, aby kontrolować jakość analizy. Zbiorcza kontrola jakości (patrz kroki 4.7 i 7.7 w protokole) powinna być przygotowana i wykorzystana do monitorowania stabilności przyrządu podczas przebiegu całej partii próbki. Ślepe próby kontrolne (patrz krok 2.8) mogą być później wykorzystane do przygotowania "listy wykluczeń" w celu wyeliminowania sygnałów zanieczyszczeń pochodzących z produkcji rozpuszczalników lub włókien. W szczególnych przypadkach, takich jak ryzyko zanieczyszczenia, konieczne jest pobieranie próbek z rękawiczek, stołów, aparatury lub innych powierzchni, które mogą stwarzać ryzyko zanieczyszczenia. W takich przypadkach protokoły przygotowania włókien, czasu ekstrakcji i desorpcji są takie same jak w przypadku próbek.
Analizy metabolomiczne i lipidomiczne koncentrują się wyłącznie na małych cząsteczkach (poniżej 1500 Da) pojawiających się w organizmie lub określonych składnikach organizmu, takich jak określone narządy, tkanki, płyny, komórki itp. Metabolomika i lipidomika oferują obraz zmian biochemicznych zachodzących w organizmie, a w przypadku raka integrują informacje związane z genomem, histologią i złośliwością guza. Te nauki omiczne tworzą związek między fizjologią a fenotypem, ponieważ metabolity znajdują się wyżej na drabinie biochemicznej niż białka czy geny12. Rozumiejąc metabolom i lipidom guzów nowotworowych, zbliżamy się do odkrycia fenotypu wśród wszystkich nauk -omicznych, ponieważ te gałęzie nauki oferują bardziej dogłębną wiedzę na temat dynamicznych zmian cząsteczek jako odpowiedzi organizmów żywych na różne bodźce. Jak przedstawiono w niniejszej pracy, dane uzyskane w jednej próbce odpowiadają histologii nowotworu, jego stopniowi złośliwości oraz odzwierciedlają zmiany zachodzące na poziomie genomu. W glejakach, jako typie nowotworu będącym przedmiotem zainteresowania w tym badaniu, informacje ukryte w genomie są szczególnie ważne, ponieważ na podstawie wyników badań genetycznych opracowywane jest spersonalizowane leczenie. Poszczególne mutacje są markerami prognostycznymi wyników chemio- lub radioterapii. Jak wykazano w niniejszym dokumencie, wybór biomarkerów odzwierciedlających daną mutację jest możliwy dzięki proponowanej strategii. Markery mutacji, a także dodatkowe typy deskryptorów, takie jak te, które wskazują stopień złośliwości guza, mogą być również wykorzystywane do wspierania rutynowych metod diagnostycznych.
Biopsja chemiczna ex vivo z wykorzystaniem włókien mikroekstrakcji w fazie stałej jest pierwszym krokiem w zastosowaniu tej metody w diagnostyce śródoperacyjnej. Metodę tę można łatwo zastosować do pobierania próbek in vivo w oczekiwaniu na zgodę odpowiednich komisji etycznych. W takich przypadkach sterylizacja urządzeń SPME musi być przeprowadzona zgodnie z przyjętymi procedurami sterylizacji w szpitalu, w którym ma być pobrane próbki, tj. autoklawowanie lub sterylizacja tlenkiem etylenu. Wstępnie kondycjonowane i sterylizowane włókna muszą być przechowywane w szczelnie zamkniętych opakowaniach oznaczonych datą ważności sterylizacji. Należy pamiętać, że włókna nie powinny być czyszczone przy użyciu środków powierzchniowo czynnych. Taka procedura może powodować niespecyficzne zmiany w składzie sorbentu, wpływając tym samym na ekstrakcję analitów. W badaniach opisanych w niniejszym dokumencie zastosowano 30-minutowy okres ekstrakcji, ale inne doniesienia potwierdzają, że krótsze czasy mogą przynieść zadowalające wyniki w badaniach in vivo 13. Huq i wsp. wykazali, że czas równowagi analitu osiąga się szybciej w tkance, jako matrycy złożonej, niż w prostych matrycach14. Jednak odtwarzalność uzyskanych wyników może być zagrożona przy krótszych okresach ekstrakcji, ponieważ więcej analitów zostanie wyekstrahowanych w warunkach przed równowagą; W związku z tym należy wdrożyć precyzyjną kontrolę czasu.
Obie nauki omiczne wykorzystane w ramach tych prac mają ogromny potencjał jako narzędzia do odkrywania biomarkerów. Po wybraniu biomarkerów lub ustaleniu modelu chemometrycznego można opracować i wdrożyć diagnostykę medyczną opartą na oznaczaniu docelowych metabolitów za pomocą metod mających zastosowanie w badaniach na miejscu, takich jak podejście SPME opisane w niniejszej pracy, i wdrożyć je w ramach rutynowej diagnostyki.
Protokół zaproponowany w niniejszym manuskrypcie opisuje, w jaki sposób można przeprowadzać nieukierunkowane analizy metabolomiczne i lipidomiczne tkanki nowotworowej przy użyciu mikroekstrakcji do fazy stałej w celu badań przesiewowych potencjalnych biomarkerów. Ma on za zadanie umożliwić ekstrakcję reprezentatywnych związków, różnicowanie nowotworów oraz identyfikację związków dyskryminujących charakteryzujących dany nowotwór, czyli potencjalnych biomarkerów. Opisane w artykule analizy niecelowane z użyciem SPME stanowią punkt wyjścia do opracowania szybkiej diagnostyki śródoperacyjnej, w której można wyznaczyć wybrany panel związków bez konieczności wykonywania badań przesiewowych wszystkich związków obecnych w próbce. W trosce o szybkie wyniki diagnostyczne, sondy SPME używane do ekstrakcji na miejscu mogą być bezpośrednio sprzężone z oprzyrządowaniem analitycznym znajdującym się w placówce szpitalnej. Proste ekstrakcje przeprowadzone przy minimalnym przygotowaniu próbki, a następnie analizie bez chromatografii znacznie skróciłyby całkowity czas z godzin do kilku minut, jak to już opisano w odniesieniu do monitorowania narkotyków15.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badanie było wspierane przez grant Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 z Narodowego Centrum Nauki. Autorzy pragną podziękować firmie MilliporeSigma, należącej do Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy, za dostarczenie urządzeń SPME wykorzystanych w tej pracy. Dział nauk przyrodniczych firmy Merck działa w Stanach Zjednoczonych i Kanadzie pod nazwą MilliporeSigma. Autorzy chcieliby również podziękować firmie Thermo Fisher Scientific za dostęp do orbitrapowego spektrometru masowego Q-Exactive Focus.
Wkład autorów: JB: optymalizacja przygotowania próbek i parametrów LC-MS, przeprowadzanie eksperymentów SPME-LC-MS, analiza danych, analiza statystyczna i interpretacja danych oraz przygotowanie manuskryptu związanego z częścią lipidomiczną; PZG: koordynacja i wykonanie większości pobrań w szpitalu, optymalizacja parametrów pobierania i przygotowania próbek, wykonywanie eksperymentów SPME-LC-MS, analiza danych, analiza statystyczna i interpretacja danych, przygotowanie manuskryptów związanych z częścią metabolomiczną; MG – pomoc w optymalizacji przygotowania próbek, metoda LC-MS oraz analiza danych związanych z częścią lipidomiczną; KG: współwykonywanie pobierania próbek SPME oraz optymalizacja pobierania próbek i przygotowania próbek, analiza SPME-LC-MS związana z częścią metabolomiczną; KC: wykonanie kilku prób SPME w szpitalu, pomoc w optymalizacji pobierania próbek, przygotowaniu próbek i analizie danych związanych z częścią metabolomiczną; KJ: wykonanie kilku prób SPME w szpitalu, pomoc w analizie lipidomicznej; DP: wykonywanie zabiegów chirurgicznych, rekrutacja pacjentów; JF: wykonywanie zabiegów chirurgicznych, rekrutacja pacjentów; MH: wykonywanie zabiegów chirurgicznych, koordynacja klinicznej części badania; BB: koncepcja, nadzór koordynacyjny nad projektem i przygotowaniem manuskryptu, wykonanie kilku prób
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas octowy | Honeywell | 49199 | Dodatek do fazy mobilnej, acetonitryl klasy LCMS |
| Honeywell | 34967 | klasy LCMS | |
| Honeywell | 14267 | Dodatek do fazy mobilnej, klasa LCMS | |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Nasadki mieszalnika Vortex |
| Agilent | 5183-2076 | Niebieski scrw tp, wstępnie nacięty PTFE/Si septa | |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | oprogramowanie do przetwarzania danych | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm & razy; 2,1 mm, 3 μ m | Supelco | 567571-U | Kolumna ochronna |
| Discovery HS F5, 2,1 mm x 100 mm, 3 μ m | Merck | 567502-U | HPLC Kolumna |
| kwasu mrówkowego | Honeywell | 56302 | Dodatek do fazy mobilnej, |
| szklane wkładki do fiolek klasy LCMS 250ul, dezaktywowane | Agilent | 5181-8872 | |
| szklane wkładki do fiolek 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| szklane fiolki 1,5 ml | Agilent | 5183-2030 | |
| szklane fiolki, 2 ml (bursztynowe, dezaktywowany) | Fiolki szklane Agilent | 5183-2072 | |
| , 2 ml | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 i mu; m, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Kolumna |
| izopropanol | Honeywell | 34965 | Rozpuszczalnik HPLC, klasa LCMS |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | oprogramowanie do przetwarzania danych | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | oprogramowanie online do analizy statystycznej (Chong, J., Wishart, D.S. i Xia, J. (2019) Korzystanie z MetaboAnalyst 4.0 do kompleksowej i integracyjnej analizy danych metabolomicznych. Aktualne protokoły w bioinformatyce 68, e86 ) | |
| metanol | Honeywell | 34966 | Rozpuszczalnik HPLC, klasa LCMS |
| Roztwór kalibracyjny jonów dodatnich Pierce LTQ Velos ESI | Thermo Scientific | 88323 | |
| Roztwór kalibracyjny jonów ujemnych Pierce | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrydowy kwadrupol-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Spektrometr masowy |
| SafetyGuard Kartridż do HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Kolumna ochronna |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µ m,100Å 100 x 2,1 mm | Kolumna HPLC | Merck | 1506570001 |
| Zestaw osłon SeQuant ZIC-HILIC 20 x 2,1 mm | Kolumna ochronna Supelco | 1504360001 | |
| Sondy światłowodowe SPME LC, sondy komercyjne C18 | Supelco | na zamówienie | : 57281-U; sondy użyte w eksperymencie nie były montowane igłowo i zostały wstępnie przycięte na długość opisaną w protokole |
| Sondy światłowodowe SPME LC, mieszane Tryb | Supelco | na zamówienie | |
| Systemy HPLC UltiMate 3000 | Thermo Scientific | 5200.0345 | System HPLC |
| woda | Rozpuszczalnik | 1153331000 | HPLC, LCMS klasa |
| XSelect CSH C18 3,5μ m 2,1x75mm | Woda | 186005644 | Kolumna HPLC |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3,5 i mikro; m, 3.9x5 mm | Zbiornik wodny | 186007813 | Kolumna |
Bibliografia
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Bi, W. L., Beroukhim, R. Beating the odds: extreme long-term survival with glioblastoma. Neuro Oncology. 16 (9), 1159-1160 (2014).
- Ifa, D. R., Eberlin, L. S. Ambient Ionization Mass Spectrometry for Cancer Diagnosis and Surgical Margin Evaluation. Clinical Chemistry. 62, 111-123 (2016).
- Alexander, J., et al. A novel methodology for in vivo endoscopic phenotyping of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife. Surgical Endoscopy. 31 (3), 1361-1370 (2017).
- Reyes-Garcés, N., et al. Advances in Solid Phase Microextraction and Perspective on Future Directions. Analytical Chemistry. 90, 302-360 (2018).
- Pawliszyn, J. Handbook of Solid Phase Microextraction. , Chemical Industry Press. Beijing. (2009).
- Vuckovic, D., Pawliszyn, J. Systematic Evaluation of Solid-Phase Microextraction Coatings for Untargeted Metabolomic Profiling of Biological Fluids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 83, 1944-1954 (2011).
- Cajka, T., Fiehn, O. Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 61, 192-206 (2014).
- Goryńska, P. Z., et al. A new strategy for brain tumour metabolomic analysis. Medical Research Journal. 3 (1), 15-22 (2018).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Fernandes, M., Rosel, D., Brábek, J. Translation in solid cancer: are size-based response criteria an anachronism. Clinical Translational Oncology. 17 (1), 1-10 (2015).
- Lämmerhofer, M., Weckwerth, W. Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data. , Wiley-VCH. (2013).
- Lendor, S., et al. Solid Phase Microextraction- Based Miniaturized Probe and Protocol for Extraction of Neurotransmitters from Brains in Vivo. Analytical Chemistry. 91 (7), 4896-4905 (2019).
- Huq, M., Tascon, M., Nazdrajic, E., Roszkowska, A., Pawliszyn, J. Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study. Analytical Chemistry. 91 (12), 7719-7728 (2019).
- Looby, N., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
Przedruki i uprawnienia
