Artykuł metodologiczny

Platforma technologiczna typu open source do produkcji modeli kultur 3D na bazie hydrożelu w zautomatyzowany i ustandaryzowany sposób

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61261

⸱

31 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre in Regenerative Medicine, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 2School of Mechanical, Medical and Process Engineering, Science and Engineering Faculty, Queensland University of Technology, 3School of Biomedical Sciences, Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Australian Prostate Cancer Research Centre, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 5Translational Research Institute, Queensland University of Technology, 6ARC ITTC in Additive Biomanufacturing, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół służy jako obszerny samouczek do ustandaryzowanego i powtarzalnego mieszania lepkich materiałów za pomocą nowatorskiej technologii automatyzacji open source. Znajdują się tam szczegółowe instrukcje dotyczące obsługi nowo opracowanej stacji roboczej typu open source, korzystania z projektanta protokołów open source oraz walidacji i weryfikacji w celu identyfikacji powtarzalnych mieszanin.

Streszczenie

Obecne etapy mieszania lepkich materiałów opierają się na powtarzalnych i czasochłonnych zadaniach, które są wykonywane głównie ręcznie w trybie niskiej przepustowości. Problemy te stanowią wady w przepływach pracy, które mogą ostatecznie skutkować nieodtwarzalnością wyników badań. Ręczne przepływy pracy dodatkowo ograniczają postęp i powszechne stosowanie lepkich materiałów, takich jak hydrożele używane do zastosowań biomedycznych. Wyzwania te można przezwyciężyć, stosując zautomatyzowane przepływy pracy ze standardowymi procesami mieszania w celu zwiększenia odtwarzalności. W tym badaniu przedstawiamy instrukcje krok po kroku, jak korzystać z projektanta protokołów open source, obsługiwać stację roboczą open source i identyfikować powtarzalne mieszaniny. W szczególności projektant protokołu open source prowadzi użytkownika przez eksperymentalny wybór parametrów i generuje gotowy do użycia kod protokołu do obsługi stacji roboczej. Ta stacja robocza jest zoptymalizowana pod kątem pipetowania lepkich materiałów, aby umożliwić zautomatyzowaną i wysoce niezawodną obsługę dzięki integracji doków temperaturowych dla materiałów termoczułych, pipet wyporowych dla materiałów lepkich oraz opcjonalnej stacji dokującej z końcówką dotykową do usuwania nadmiaru materiału z końcówki pipety. Walidacja i weryfikacja mieszanin odbywa się za pomocą szybkiego i niedrogiego pomiaru absorbancji Orange G. W protokole przedstawiono wyniki w celu uzyskania 80% (v/v) mieszanin glicerolu, serii rozcieńczeń dla żelatyny metakryloylu (GelMA) oraz hydrożeli o podwójnej sieci 5% (w/v) GelMA i 2% (w/v) alginianu. Dołączony jest przewodnik rozwiązywania problemów, który pomaga użytkownikom w przyjęciu protokołu. Opisany przepływ pracy może być szeroko stosowany do wielu lepkich materiałów w celu automatycznego generowania stężeń zdefiniowanych przez użytkownika.

Wprowadzenie

Odtwarzalność i powtarzalność mają ogromne znaczenie w pracy naukowej1,2,3,4. Jednak ostatnie dowody wskazują na poważne wyzwania związane z powtarzaniem badań biomedycznych o dużym wpływie w naukach podstawowych, a także badań translacyjnych4,5,6,7. Czynniki przyczyniające się do nieodtwarzalnych wyników są złożone i wielorakie, takie jak zły lub tendencyjny projekt badania6,8, niewystarczająca moc statystyczna3,9, brak zgodności ze standardami raportowania7,10,11, presja na publikację6 lub niedostępna metody lub kod oprogramowania6,9. Wśród nich zidentyfikowano subtelne zmiany w protokole oraz błędy ludzkie przy przeprowadzaniu eksperymentów jako kolejne elementy odpowiedzialne za nieodtwarzalność4. Na przykład zadania związane z pipetowaniem ręcznym wprowadzają wewnątrz- i międzyosobniczą nieprecyzyjność12,13 i zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia błędów ludzkich14. Podczas gdy komercyjne roboty do obsługi cieczy są w stanie przezwyciężyć te wady i wykazały zwiększoną niezawodność w przypadku cieczy15,16,17, zautomatyzowana obsługa materiałów o znacznych właściwościach lepkości jest nadal wyzwaniem.

Komercyjne roboty do obsługi płynów często używają pipet z poduszką powietrzną, znanych również jako pipety tłokowe lub wyporowe. Odczynnik i tłok są oddzielone poduszką powietrzną, która kurczy się podczas etapów dozowania i rozszerza się podczas etapów zasysania. W przypadku pipet z poduszką powietrzną lepkie materiały "przepływają" do i z końcówki tylko powoli, a wczesne wyjęcie pipety ze zbiornika może spowodować zasysanie pęcherzyków powietrza. Podczas zadań dozowania lepki materiał pozostawia film na wewnętrznej ściance końcówki, który "płynie" powoli lub wcale, gdy jest wtłaczany powietrzem. Aby przezwyciężyć te problemy, wprowadzono na rynek pipety wyporowe, które aktywnie wytłaczają lepki materiał z końcówki za pomocą solidnego tłoka. Chociaż pipety wyporowe umożliwiają dokładne i niezawodne manipulowanie lepkimi materiałami, zautomatyzowane rozwiązania z pipetami wyporowymi są nadal zbyt drogie dla laboratoriów akademickich, dlatego większość procesów pracy z materiałami lepkimi opiera się wyłącznie na ręcznych zadaniach pipetowania18.

Ogólnie, lepkość jest definiowana jako opór przepływu płynu, a materiały lepkie są dalej definiowane jako materiały o większej lepkości wody (0,89 mPa·s s przy 25 °C). W dziedzinie zastosowań biomedycznych zestawy eksperymentalne często zawierają wiele materiałów o lepkości większej niż woda, takich jak dimetylosulfotlenek (DMSO; 1,99 mPa·s w 25 °C), glicerol (208,1 mPa·s w 25 °C dla 90% glicerolu [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s w 25 °C) oraz polimery spęczniane przez wodę, Określane jako hydrożele19,20. Hydrożele to hydrofilowe sieci polimerowe ułożone w trybie fizycznym i/lub chemicznym używane do różnych zastosowań, w tym do enkapsulacji komórek, dostarczania leków i miękkich siłowników19,20,21,22. Lepkość hydrożeli zależy od stężenia polimeru i masy cząsteczkowej19. Rutynowo stosowane hydrożele do zastosowań biomedycznych wykazują wartości lepkości od 1 do 1000 mPa·s, podczas gdy specyficzne systemy hydrożelowe zostały zgłoszone z wartościami do 6 x 107 mPa·s19,23,24. Jednak pomiary lepkości hydrożeli nie są ustandaryzowane pod względem protokołu pomiarowego i przygotowania próbki, a zatem wartości lepkości między różnymi badaniami są trudne do porównania.

Ponieważ komercyjnie dostępne zautomatyzowane rozwiązania zaprojektowane specjalnie dla hydrożeli są albo nieobecne, albo są zbyt drogie, obecne przepływy pracy dla hydrożelu zależą od ręcznej obsługi18. Aby zrozumieć ograniczenia obecnego ręcznego przepływu pracy w zakresie pipetowania hydrożeli, ważne jest, aby zrozumieć podstawowe zadania związane z obsługą18. Na przykład, po zsyntetyzowaniu nowego materiału hydrożelowego, generowane jest pożądane stężenie lub seria rozcieńczeń o różnych stężeniach w celu zidentyfikowania wiarygodnych protokołów syntezy i charakterystyk sieciowania, a następnie analizy właściwości mechanicznych25,26,27,28. Ogólnie rzecz biorąc, przygotowuje się lub kupuje roztwór podstawowy, a następnie miesza się go z rozcieńczalnikiem i/lub innymi odczynnikami w celu uzyskania mieszaniny. Zadania mieszania w większości przypadków nie są wykonywane bezpośrednio na płytce studziennej (lub w dowolnym formacie wyjściowym), a raczej w oddzielnej rurze reakcyjnej, która jest powszechnie określana jako mieszanka główna. Podczas tych zadań przygotowawczych wymagane są różne etapy zasysania i dozowania w celu przeniesienia lepkiego materiału (materiałów), wymieszania odczynników i przeniesienia mieszaniny do formatu wyjściowego (np. płytki 96-dołkowej). Zadania te wymagają dużej ilości pracy ludzkiej18, długich godzin eksperymentalnych i zwiększają prawdopodobieństwo błędów ludzkich, które potencjalnie mogą objawić się niedokładnymi wynikami. Co więcej, ręczna obsługa uniemożliwia efektywne przygotowanie dużej liczby próbek w celu przesiewania różnych kombinacji parametrów w celu szczegółowej charakterystyki. Ręczne przetwarzanie utrudnia również stosowanie hydrożeli do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, takich jak identyfikacja obiecujących związków podczas opracowywania leków. Obecne etapy przygotowania oparte na instrukcjach nie są możliwe do przesiewania bibliotek leków składających się z tysięcy leków. Z tych powodów potrzebne są zautomatyzowane rozwiązania, aby zapewnić wydajny proces rozwoju i umożliwić udaną translację hydrożeli do zastosowań związanych z badaniami przesiewowymi leków.

Aby przejść od manualnych przepływów pracy do zautomatyzowanych procesów, zoptymalizowaliśmy komercyjnego robota pipetującego open source do obsługi lepkich materiałów poprzez integrację doków temperaturowych dla materiałów termoczułych, użycie gotowych pipet wyporowych z końcówkami tłoka kapilarnego oraz opcjonalnej stacji dokującej do czyszczenia końcówek pipet. Ten robot pipetujący został dodatkowo zintegrowany jako moduł pipetujący z nowo opracowaną stacją roboczą typu open source, która składa się z gotowych do instalacji i konfigurowalnych modułów18,29. Szczegółowe instrukcje montażu opracowanej stacji roboczej, w tym pliki sprzętowe i programowe, są swobodnie dostępne w GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) i repozytorium Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Oprócz rozwoju sprzętu, zaprogramowano i wydano aplikację do projektowania protokołów typu open source, która prowadzi użytkownika przez proces wyboru parametrów i generuje gotowy do użycia kod protokołu (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Ten kod działa na komercyjnym robocie pipetującym typu open source, a także na opracowanej stacji roboczej typu open source.

Tutaj znajduje się obszerny samouczek na temat działania stacji roboczej open source do automatyzacji zadań mieszania lepkich materiałów (Rysunek 1). Kroki protokołu specyficzne dla samouczka można wykonać za pomocą opracowanej stacji roboczej typu open source, a także komercyjnego robota pipetującego typu open source. Wspierany przez opracowaną przez nas aplikację do projektowania protokołów open source, zademonstrowano automatyczne mieszanie i przygotowywanie wymaganych stężeń glicerolu, żelatyny, metakryloylu (GelMA) i alginianu. Glicerol został wybrany w tym samouczku, ponieważ jest dobrze scharakteryzowany30,31, jest niedrogi i łatwo dostępny, dlatego jest powszechnie stosowany jako lepki materiał referencyjny do zautomatyzowanych zadań pipetowania. Jako przykłady hydrożeli stosowanych w zastosowaniach biomedycznych, roztwory prekursorów hydrożelu GelMA i alginianu zostały zastosowane do eksperymentów z automatycznym mieszaniem. GelMA przedstawia jeden z najczęściej stosowanych hydrożeli do badań enkapsulacji komórek32,33, a alginian został wybrany w tym badaniu, aby wykazać zdolność do wytwarzania hydrożeli o podwójnej sieci34,35. Wykorzystując Orange G jako barwnik, wdrożono szybką i niedrogą procedurę walidacji i weryfikacji wyników mieszania za pomocą spektrofotometru16.

Komercyjny robot pipetujący typu open source został zintegrowany jako moduł pipetujący z opracowaną stacją roboczą open source (Rysunek 2a), dlatego nazwa 'moduł pipetujący' jest dalej używana do opisania robota pipetującego . Szczegółowy opis zainstalowanego sprzętu wykracza poza zakres tego protokołu i jest dostępny za pośrednictwem udostępnionych repozytoriów, które zawierają również instrukcje krok po kroku dotyczące ogólnego montażu platformy open source. Moduł pipetujący może być wyposażony w dwie pipety (jedno- lub 8-kanałową), które są zainstalowane na osi A (po prawej) i osi B (po lewej) (Rysunek 2b). Moduł pipetujący oferuje pojemność 10 pokładów zgodnie ze standardami American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS), a na pokładzie zdefiniowano następujące pozycje lokalizacji: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (Rysunek 2c). Aby zainicjować fotoindukowaną polimeryzację roztworów hydrożelu, wymagany jest oddzielny moduł sieciujący, który został dodany do stacji roboczej. Moduł sieciujący jest wyposażony w diody LED o długości fali 400 nm, dzięki czemu w obecnych systemach można stosować substancje, które wzbudzają się przy długości fali światła widzialnego, takie jak trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)36,37. Natężenie (w mW/cm2) diod LED może być adresowane przez użytkownika w aplikacji do projektowania protokołu w celu zbadania zachowania sieciowania38. Stacja robocza zawiera również moduł pamięci masowej, który umożliwia badania zwiększonej przepustowości; Moduł ten nie jest jednak wykorzystywany w tym badaniu, a zatem nie jest dalej opisywany. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się używanie modułu pipetującego w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki. Głównym obwodem zasilania do obsługi modułu pipetującego jest obwód 12 V, który w większości krajów jest uważany za zastosowanie niskonapięciowe. Wszystkie komponenty elektryczne znajdują się w dedykowanej skrzynce sterowniczej, co zapobiega kontaktowi użytkowników ze źródłem zagrożenia elektrycznego.

Przestrzegając tych standardowych protokołów mieszania, badacze są w stanie uzyskać niezawodne mieszaniny zarówno dla lepkich, jak i nielepkich materiałów w zautomatyzowany sposób. Podejście open source pozwala użytkownikom optymalizować sekwencje miksowania i udostępniać społeczności nowo opracowane protokoły. Ostatecznie podejście to ułatwi badania przesiewowe wielu kombinacji parametrów w celu zbadania współzależności między różnymi czynnikami, a tym samym przyspieszy niezawodne stosowanie i rozwój lepkich materiałów do zastosowań biomedycznych.

Protokół

UWAGA: Protokół rozpoczyna się od wprowadzenia do (1) oprogramowania i (2) konfiguracji sprzętu, aby zapoznać użytkownika z wymaganymi instalacjami i stacją roboczą. W rozdziale poświęconym (3) przygotowaniu materiału i (4) wykorzystaniu aplikacji do projektowania protokołów, (5) szczegółowo omówiono kalibrację modułu pipetującego oraz (6) wykonanie protokołu automatycznego. Na koniec opisano (7) procedury walidacji i weryfikacji, w tym odczyt absorbancji i analizę danych. Ogólny przepływ pracy protokołu z poszczególnymi zadaniami jest wyświetlany w Rysunek 1.

1. Konfiguracja oprogramowania

UWAGA: Ta sekcja zawiera szczegółową instrukcję instalacji interfejsu programowania aplikacji (API), jak również wymaganej aplikacji do projektowania protokołów i terminala kalibracyjnego. Poniższe instrukcje zostały napisane dla komputera jednopłytkowego Raspberry Pi (RPi); jednak również Windows 8, 10 i macOS 10.13+ zostały z powodzeniem wykorzystane z interfejsem API i aplikacjami.

  1. Konfiguracja środowiska komputerowego.
    UWAGA: Zapoznaj się z podstawami Python39, jak skonfigurować i używać Raspberry Pi40,41 oraz jak połączyć się z internetem42. Poniższe kroki samouczka koncentrują się na krokach specyficznych dla protokołu, a dodatkowe informacje na temat korzystania z Raspberry Pi są dostępne online40.
    1. Otwórz okno terminala z paska zadań lub menu aplikacji.
    2. Zaktualizuj systemową listę pakietów:
      sudo apt-get update
    3. Zaktualizuj wszystkie zainstalowane pakiety:
      sudo apt-get dist-upgrade
    4. Uruchom ponownie Raspberry Pi:
      ponowne uruchomienie sudo
    5. Sprawdź zainstalowaną wersję Pythona:
      python3 --version
      Upewnij się, że zainstalowany jest co najmniej Python 3.5; Jeśli nie, zainstaluj najnowszą wersję43.
    6. Zainstaluj języka Python, który publikuje pakiety języka Python za pomocą klasy Python Package Index44:
      sudo apt-get install python3-
    7. Zainstaluj zależności:
      install numpy
      install python-resize-image
      UWAGA: Jeśli używasz systemu Windows, musisz zainstalować pakiet windows-curses za pomocą: python -m install windows-curses
  2. Zainstaluj interfejs programowania aplikacji (API).
    UWAGA: API zapewnia prosty framework Pythona przeznaczony do pisania eksperymentalnych skryptów protokołów i obsługi stacji roboczej. Następujące dwa interfejsy API są wymagane do pomyślnego wykonania wygenerowanego kodu protokołu.
    1. Zainstaluj interfejs API stacji roboczej:
      install openworkstation (stacja robocza openworkstation)
    2. Zainstaluj API Opentrons, aby obsługiwać moduł pipetowania:
      zainstaluj opentrons==2.5.2
    3. Sprawdź, czy interfejs API został pomyślnie zainstalowany:
      python3
      >>> importuj OpenWorkstation
      >>> importuj opentrons
      UWAGA: Rozmiar interfejsu API i aplikacji do projektowania protokołów wynosi odpowiednio 2,2 MB i 1,2 MB. Podczas instalacji nie wystąpiły żadne problemy w przypadku korzystania z ograniczonej przestrzeni dyskowej (200 MB). Jednak wymagania dotyczące miejsca na dysku zależą od systemu operacyjnego.
  3. Wybierz katalog do pobrania pliku (terminal kalibracyjny, aplikacja do projektowania protokołów itp.).
    UWAGA: Pliki można później skopiować i wkleić w innym miejscu.
  4. Klonuj pliki z repozytorium GitHub:
    git clone https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
    UWAGA: Polecenie 'git clone' klonuje, a następnie zapisuje wszystkie pliki w katalogu, który jest w tym momencie otwarty w terminalu. Ponieważ repozytorium zawiera również pliki sprzętowe dla zestawu, nie całe repozytorium jest wymagane do wykonania prezentowanych protokołów. Wszystkie pliki wymagane do replikacji eksperymentów są dostępne jako plik uzupełniający oraz w repozytorium GitHub pod adresem "/examples/publication-JoVE".
  5. Otwórz pobrany folder. Jeśli całe repozytorium zostało pobrane, przejdź do folderu "publication-JoVE" za pomocą
    cd openworkstation/przykłady/publikacja-JoVE
    UWAGA: Ten folder zawiera pliki wymagane do działania stacji roboczej oraz korzystania z aplikacji do projektowania protokołów i terminala kalibracyjnego.

2. Konfiguracja sprzętu

  1. Umieść stację roboczą w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.
  2. Zainstaluj pipety na stacji roboczej.
    1. Wybierz rozmiar pipety w oparciu o konfigurację eksperymentalną. Ogólnie rzecz biorąc, należy przyjąć rozmiar pipety, której objętość do zassania znajduje się na górnym końcu zakresu. Jeśli w określonej konfiguracji wymagane jest mieszanie o objętości większej niż 1 ml (np. zasysanie/dozowanie 2 ml), wybierz M1000E z maksymalną objętością zasysania/dozowania 1 000 μl, aby zminimalizować liczbę etapów pipetowania i zaoszczędzić czas.
      UWAGA: Szczegółowa instrukcja dotycząca pipet wyporowych jest dostępna w Internecie45. Opracowany moduł pipetujący umożliwia integrację następujących gotowych pipet wyporowych: M10E (1–10 μL), M25E (3–25 μL), M50E (20–50 μL), M100E (10–100 μL), M250E (50–250 μL), M1000E (100–1 000 μL).
    2. Użyj klucza imbusowego M4, aby poluzować i dokręcić.
    3. Przymocuj dwie płytki mocujące pipety (białe płytki akrylowe) do aluminiowej szyny i luźno dokręć M5.
    4. Włóż pipetę do dwóch płytek mocujących pipetę i upewnij się, że ergonomiczna końcówka pipety spoczywa po przeciwnej stronie akrylowej płytki montażowej.
    5. Mocno dokręć cztery dwóch płytek mocujących pipety.
    6. Wsuń dwie kwadratowe nakrętki mocujące, które są przymocowane do akrylowej płyty montażowej, w szczelinę wytłaczania osi z i dokręć.
      UWAGA: Pipetę należy mocno zamocować, aby uniknąć jakichkolwiek ruchów podczas pracy.

3. Przygotowanie materiału

UWAGA: Lepkie materiały (glicerol, GelMA, alginian) są używane do eksperymentów przedstawionych w tym badaniu, a zatem przygotowane objętości i zadania manipulacyjne (np. dodanie 5 ml roztworu podstawowego do probówek reakcyjnych o pojemności 5 ml) są przeznaczone specjalnie dla tego układu eksperymentalnego.

  1. Żelatyna metakryloyl (GelMA)
    UWAGA: Funkcjonalizacja, dializa i liofilizacja GelMA nie są przedmiotem tego artykułu, a protokół krok po kroku jest dostępny w Loessner et al.33. Protokół rozpoczyna się od zastosowania liofilizowanego GelMA, który można przygotować we własnym zakresie lub zakupić komercyjnie.
    1. Obliczyć wymaganą masę GelMA (mGelMA) na podstawie pożądanego końcowego stężenia zapasu (cGelMA) i objętości (VGelMA) za pomocą równania:
      mGelMA = cGelMA x V GelMA /> UWAGA: VGelMA zależy od układu doświadczalnego i zaleca się przygotowanie 20−30% nadmiaru materiału. Przedstawione protokoły rozpoczynają się od 5 ml 20% (w/v) GelMA jako roztworu podstawowego.
    2. Zważyć wymaganą ilość liofilizowanego GelMA, dodać go do probówki reakcyjnej o pojemności 50 ml i dodać wymaganą ilość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    3. Zmieszać GelMA przez zanurzenie w rozpuszczalniku w temperaturze 4 °C przez noc lub przez ogrzewanie do temperatury 60 °C przez 6 godzin w łaźni wodnej.
      UWAGA: Sterylne roztwory GelMA można przechowywać w temperaturze 4 °C chroniąc przed światłem przez co najmniej sześć miesięcy.
    4. Wlać 5 ml GelMA do 5 ml probówek reakcyjnych.
  2. Fotoinicjator: fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)
    UWAGA: Unikaj dodatkowej ekspozycji na światło w pomieszczeniu, ponieważ LAP jest wrażliwy na światło.
    1. Obliczyć wymaganą masę LAP (mLAP) w oparciu o pożądane końcowe stężenie zapasu (cLAP) i wymaganą objętość (VLAP) za pomocą równania:
      m OKRĄŻENIE = cOKRĄŻENIE x VOKRĄŻENIE
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie 3% (w/v) roztworu podstawowego.
    2. Zważyć wymaganą ilość LAP, dodać ją do 15 ml probówki reakcyjnej i dodać PBS.
    3. Owiń rurkę folią aluminiową, aby zapobiec rozkładowi wywołanemu przez światło.
    4. Rozpuścić LAP, umieszczając probówkę reakcyjną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 2 godziny lub do całkowitego rozpuszczenia.
    5. Napełnij 1 ml roztworu podstawowego LAP do probówek o objętości 5 ml.
  3. Alginian
    1. Obliczyć wymaganą ilośćalginianu (m alginianu) na podstawie pożądanego końcowego stężenia zapasu (alginian c) i objętości (alginian V) za pomocą równania:
      malginian =c alginian xV alginian
      UWAGA: Walginian zależy od konfiguracji doświadczalnej i zaleca się przygotowanie 20−30% nadmiaru materiału. Przedstawione protokoły rozpoczynają się od 5 ml 4% (w/v) alginianu jako roztworu podstawowego.
    2. Zważyć wymaganą masę alginianu, dodać go do probówek reakcyjnych o pojemności 50 ml i dodać PBS.
    3. Umieścić mieszaninę alginianów w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 4 godziny
      UWAGA: Zastosowanie mieszalnika wirowego przyspieszy proces rozpuszczania, ale także wygeneruje pęcherzyki powietrza. Rozpuszczony alginian może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez co najmniej sześć miesięcy.
    4. Wlać 5 ml alginianu do 5 ml probówek reakcyjnych.
  4. Napełnij 5 ml glicerolu w 5 ml probówkach reakcyjnych.
  5. Pomarańczowy roztwór G
    1. Przygotować roztwór podstawowy pomarańczy G o stężeniu 10 mg/ml w probówce reakcyjnej o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Objętość zależy od liczby eksperymentów. W zależności od rodzaju rozcieńczalnika należy przygotować roztwór podstawowy w wodzie ultraczystej, PBS lub odpowiednim odczynniku rozcieńczającym. W prezentowanych eksperymentach do rozcieńczania glicerolu użyto wody ultraczystej, a do rozcieńczania GelMA i alginianu PBS. PBS był używany jako rozcieńczalnik do GelMA i alginianu i może być przygotowany przy użyciu tabletek lub zakupiony z półki.
    2. Mieszaj przez 10 sekund, wirując.
    3. Owiń rurkę folią aluminiową, aby zapobiec rozkładowi wywołanemu przez światło.
      UWAGA: Roztwór podstawowy można zużyć po 24 godzinach, aby zapewnić prawidłowe rozpuszczenie Orange G.
    4. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do roztworu roboczego o stężeniu 1 mg/ml w probówce reakcyjnej o pojemności 50 ml.
    5. Przenieść roztwór roboczy do odpowiednich kolb/probówek do konfiguracji doświadczalnej.
      UWAGA: W prezentowanych eksperymentach roztwór roboczy rozlano do probówek o pojemności 5 ml. Roztwór podstawowy i roboczy pomarańczy G można przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu trzech miesięcy od przygotowania.
    6. Napełnić 5 ml roztworu roboczego pomarańczy G o stężeniu 1 mg/ml w probówkach reakcyjnych o pojemności 5 ml.

4. Generuj kod protokołu za pomocą aplikacji do projektowania protokołów

UWAGA: Parametry określone w krokach 4.2−4.7 są takie same dla wszystkich przeprowadzonych eksperymentów, z wyjątkiem stężenia materiału i końcowego stężenia wyjściowego. Parametry te podsumowano w tabeli 1, a w dalszej części parametry wykorzystano do przygotowania hydrożeli o podwójnej sieci z 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginianem, 0,15% (w/v) LAP i PBS jako rozcieńczalnikiem.

  1. Otwórz aplikację projektanta protokołów, uruchamiając polecenie 'ProtocolDesignApp.html'.
    UWAGA: Aplikacja "ProtocolDesignApp.html" prowadzi użytkownika przez proces doboru parametrów i automatycznie generuje gotowy do użycia protokół do obsługi stacji roboczej. Interfejs użytkownika działa na każdej powszechnie używanej przeglądarce internetowej (tj. Chrome, Firefox, Safari, edge, Internet Explorer).
  2. Wprowadź nazwę protokołu (np. double-network-hydrogels) na stronie konfiguracji.
  3. Kliknij "Kontynuuj", aby potwierdzić nazwę protokołu i przejść do następnego kroku.
  4. Zdefiniuj tacę wejściową, wybierając z menu rozwijanego opcję "Blok grzewczy 3x4" i następujące parametry wejściowe:
    1. Z menu rozwijanego wybierz "Żel 1", wpisz nazwę "GelMA", wprowadź stężenie w zapasie "20%", ustaw "Liczba próbek" na "3", aby wypełnić jedną kolumnę. Kliknij "+dodaj", aby zapisać wpisy.
    2. Wybierz "Żel 2" z menu rozwijanego, wprowadź nazwę: "Alginate", wprowadź stężenie zapasu "4%", ustaw "Liczba próbek" na "3", aby wypełnić jedną kolumnę. Kliknij "+dodaj", aby zapisać wpisy.
    3. Wybierz "Fotoinicjator" z menu rozwijanego, wprowadź nazwę: "LAP", wprowadź stężenie zapasu "3%", ustaw "Liczba próbek" na "3", aby wypełnić jedną kolumnę. Kliknij "+dodaj", aby zapisać wpisy.
    4. Wybierz "Rozcieńczalnik 1" z menu rozwijanego, wprowadź nazwę: "PBS", ustaw "Liczba próbek" na "3", aby wypełnić jedną kolumnę. Kliknij '+dodaj', aby zapisać wpisy.
      UWAGA: Wizualizacja zasobnika wejściowego aktualizuje się automatycznie po kliknięciu przycisku "+dodaj". Jeśli zostanie dodanych więcej danych wejściowych niż pojemność zasobnika, użytkownikowi zostanie wyświetlone ostrzeżenie "Zbyt wiele próbek dla tej tacy".
  5. Zdefiniuj parametry sieciowania, zaznaczając opcję "Sieciowanie zdjęć" i wpisując czas w sekundach, "30" oraz intensywność W/m2 za pomocą "2".
  6. Zakończ konfigurację wprowadzania, klikając "KONTYNUUJ".
  7. Zdefiniuj konfigurację tacy wyjściowej, wybierając opcję "Płytka 96-dołkowa" z menu rozwijanego dla typu płytki studzienki.
  8. Kliknij "Grupa1", aby zdefiniować wyniki, tworząc grupę próbek.
    1. Określ skład wyjściowy, wprowadzając żądane stężenia i objętość próbki w polach dla każdego wejścia: GelMA = '5', Alginian = '2', LAP = '0,15', Całkowita objętość = '60'.
    2. Zaznacz pole wyboru, aby zastosować zaawansowany protokół mieszania.
  9. Określić liczbę próbek, wpisując liczbę próbek w polu "Liczba próbek": '96'.
    UWAGA: Wizualizacja zasobnika na próbki jest aktualizowana automatycznie po kliknięciu przycisku "+dodaj grupę". Jeśli zostanie dodanych więcej próbek niż wynosi pojemność tacy, użytkownikowi zostanie wyświetlone ostrzeżenie "Zbyt wiele próbek dla tej tacy".
  10. Zakończ konfigurację wyjścia, klikając "KONTYNUUJ".
    1. Wybierz pozycję tacy w układzie pokładu i odpowiednio przygotuj platformę:
    2. Zaznacz pole wyboru "SLOT A1" i wybierz "Empty_Cell" z menu rozwijanego.
    3. Zaznacz pole wyboru "SLOT A2" i wybierz "Trash_Cell" z menu rozwijanego.
    4. Zaznacz pole wyboru "SLOT B1" i wybierz "Tips_Cell_100 μL" z menu rozwijanego.
    5. Zaznacz pole wyboru "SLOT B2" i wybierz "Tips_Cell_1000 μL" z menu rozwijanego.
    6. Zaznacz pole wyboru "SLOT C1" i wybierz "Input_Cell" z menu rozwijanego.
    7. Zaznacz znacznik wyboru w polu "SLOT C2" i wybierz "Empty_Cell" z menu rozwijanego.
    8. Zaznacz pole wyboru "SLOT D1" i wybierz "Mixing_Cell" z menu rozwijanego.
    9. Zaznacz znacznik wyboru w polu "SLOT D2" i wybierz "Output_Cell" z menu rozwijanego.
    10. Określ typ i charakterystykę pierwszej pipety (M100E), zaznaczając opcję "Pipeta po lewej", wybierając z menu rozwijanego opcję "10-100 μl wypornościowa" i ustawiając prędkość ssania = "600", prędkość dozowania = "800".
    11. Określ typ i charakterystykę drugiej pipety (M1000E), zaznaczając opcję "Pipeta w prawo", wybierając z menu rozwijanego opcję "100-1000 μl wyporności" i ustawiając prędkość zasysania = "800", prędkość dozowania = "1200".
  11. Kliknij "GENERUJ PROTOKÓŁ", aby potwierdzić konfigurację i wygenerować skrypt protokołu.
    UWAGA: Opracowana aplikacja do projektowania protokołów automatycznie generuje nowy folder za każdym razem, gdy generowany jest nowy protokół. Wszystkie pliki, które są wymagane do tego eksperymentu i do obsługi stacji roboczej, są zapisywane w tym folderze, którego nazwa pochodzi od nazwy protokołu. Folder można skopiować do różnych katalogów bez powodowania problemów.
  12. Nie zamykaj interfejsu, ponieważ będzie on używany do wykonywania protokołu (patrz krok 6.6.).

5. Kalibracja modułu pipetującego

UWAGA: Pojemniki (np. płytki studzienne, stojak na końcówki, kosze) i pipety (np. M1000E) muszą być początkowo skalibrowane. Jeśli pozycja pojemnika i/lub pipety zostanie zmodyfikowana/zmieniona, nowa pozycja musi zostać skalibrowana.

  1. Przejdź do folderu protokołu i otwórz terminal kalibracyjny, wykonując file 'calibrate.py' w terminalu windox (patrz krok 1.1.1):
    phython.calibrate.py
    UWAGA: Interfejs "calibrate.py" prowadzi użytkownika przez proces kalibracji konfiguracji urządzenia i pipet. Upewnij się, że plik znajduje się w tym samym folderze, co plik protokołu i pliki modułu. Jest on generowany automatycznie w kroku 4.10.
  2. Za pomocą klawiatury numerycznej (1−8) wybrać przyrosty ruchu tłoka, y, z (1−8): "1" dla 0,1 mm, "2" dla 0,5 mm, "3" dla 1 mm, "4" dla 5 mm, "5" dla 10, "6" dla 20 mm, "7" dla 40 mm, i "8" dla 80 mm.
  3. Skalibruj pipetę.
    1. Naciśnij skrót klawiaturowy P, aby wybrać rozmiar pipety.
    2. Naciśnij skrót klawiaturowy V, aby przejść do trybu kalibracji tłoka.
      UWAGA: Zaleca się rozpoczęcie od małych przyrostów (2, 5 i 10 mm), aby zapoznać się z wielkością przyrostu i ruchem głowicy pipety.
    3. Skalibruj następujące pozycje tłoka dla pipety wyporowej: T–Top = pozycja spoczynkowa; B–Dół = tłok jest popychany do momentu napotkania oporu; P–Pick-up = tłok jest przesuwany do pozycji, w której można zamocować końcówkę tłoka; E–Eject = tłok jest popychany, aż dołączona końcówka zostanie wyrzucona. Zmieniaj pozycje tłoka za pomocą strzałek w górę i w dół na klawiaturze i zapisz końcową pozycję za pomocą S na klawiaturze.
    4. Wyjdź z trybu kalibracji tłoka pipety, naciskając skrót klawiaturowy V.
  4. Skalibruj położenie pojemnika względem końcówki pipety.
    1. Naciśnij skrót klawiaturowy P, aby wybrać typ pipety. Upewnij się, że końcówka jest podłączona do wybranej pipetowanej.
    2. Naciśnij skrót klawiaturowy C, aby wybrać typ kontenera.
    3. Wybierz odpowiedni przyrost ruchu i przesuń końcówkę pipety do następujących pozycji. W przypadku płytek studzienkowych należy skalibrować do pozycji studzienki "A1" na dole; W przypadku stojaka na końcówki skalibruj do pozycji "A1"; W przypadku śmieci wybierz pozycję (zdefiniowaną jako punkt), w której końcówka może zostać wyrzucona do kosza.
    4. Naciśnij skrót klawiaturowy S, aby zapisać pozycję.
    5. Powtórz kroki 5.3.1−5.3.3 dla wszystkich pojemników wymienionych w pozycji "C" dla wybranego typu pipety.
    6. Powtórzyć czynności 5.3.1−5.3.5 dla drugiego typu pipety.
    7. Zamknij skrypt kalibracji.

6. Wykonanie protokołu za pomocą stacji roboczej

UWAGA: Pliki protokołu są dostępne za pośrednictwem repozytorium i są również dostępne jako plik uzupełniający.

  1. Umieść pojemnik na śmieci, półki na końcówki, tacę wejściową, tacę do mieszania i wyjście na pokładzie (zdefiniowane w kroku 4.3).
  2. Skalibrować pipety i przyrządy zgodnie z opisem w rozdziale 5.
  3. W razie potrzeby włącz stację dokującą temperatury i wybierz temperaturę dla tacki wejściowej i mieszającej.
    UWAGA: Eksperymenty w tym samouczku przeprowadzono bez kontroli temperatury i w temperaturze 40 °C dla glicerolu i 37 °C dla pipetowania GelMA i alginianów.
  4. Umieść probówki z odczynnikami wejściowymi w aluminiowych blokach w dokach temperatury zgodnie z wybraną konfiguracją.
  5. Poczekaj, aż odczynniki wejściowe osiągną żądaną temperaturę.
    UWAGA: Aby zapewnić prawidłowy rozkład temperatury, zalecany jest czas inkubacji wynoszący 30 minut dla GelMA i alginianu.
  6. Uruchom plik protokołu, klikając "URUCHOM SKRYPT PYTHONA"
    UWAGA: Wybrany protokół jest teraz wykonywany przez stację roboczą. Załączony film przedstawia automatyczne mieszanie GelMA i rozprowadzanie 60 μl w 96-dołkowej płytce.
  7. Przebieg jest zakończony, gdy wyświetlany jest komunikat "Zakończono".

7. Proces walidacji i weryfikacji

  1. Wyjąć płytkę studzienkową ze stanowiska roboczego i przetransportować płytkę studzienkową wraz z próbkami do spektrofotometru.
  2. Odczytać absorbancję za pomocą spektrofotometru przy długości fali 450 nm. Przeczytaj każdą płytkę 2x, aby porównać wyniki i zapewnić spójne wyniki.
  3. Eksport i zapisywanie odczytów absorbancji.
  4. Analiza danych.
    UWAGA: Dane eksperymentalne można przetwarzać pojedynczo lub kopiować i wklejać do dostarczonego szablonu w celu oceny średniej, odchylenia standardowego i wartości współczynnika wariancji (CV) za pomocą oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych.
    1. Otwórz plik uzupełniający "supplementary_template-analysis.xlsx", który jest również dostępny w repozytorium GitHub pod adresem "openworkstation/examples/publication-JoVE.
    2. Skopiuj odczyty absorbancji do arkusza "danych surowych", upewnij się, że wszystkie odniesienia do komórek są poprawnie zdefiniowane we wszystkich tabelach, a następnie kliknij arkusz "analiza", aby uzyskać informacje na temat wartości średniej, odchylenia standardowego i współczynnika wariancji (CV).
      UWAGA: W zależności od rozkładu próbki na płytce studzienki, w szablonie dostępne są następujące wstępnie ustawione typy oceny: typ "Jednolity" jest używany, gdy wszystkie próbki mają ten sam skład, typ "Według wierszy" jest używany, gdy próbki w różnych rzędach mają różny skład, Typ "Według kolumn" jest używany, gdy próbki w różnych kolumnach mają różny skład, a typ "Dostosowany" jest używany, gdy przykładowe pozycje są specyficzne dla użytkownika.

Wyniki

Ten samouczek przedstawia wyniki eksperymentów z glicerolem (Rysunek 3) oraz z GelMA z LAP i alginianem (Rysunek 4).

Badano przygotowanie roztworu glicerolu o stężeniu 80% (v/v) bez kontroli temperatury (temperatura pokojowa, 22 °C) i bez dotykania końcówki (określone jako zestaw 1), z kontrolą temperatury (40 °C) i bez dotykania końcówki (zestaw 2) oraz z kontrolą temperatury (40 °C) i z dotykaniem końcówki (zestaw 3) (Rycina 3a-i). Wybrano te dwie wartości temperatury, aby ocenić różnicę w manipulowaniu, ponieważ lepkość glicerolu zmniejsza się niemal trzykrotnie podczas podgrzania od 22 °C (139,5 mPa·s) do 40 °C (46,6 mPa·s)30. Stężony roztwór glicerolu o stężeniu 85% (v/v) rozcieńszono do stężenia końcowego 80% i równomiernie rozdzielono do płytki 96-ściennej (n = 96 na zestaw). Czas trwania eksperymentu, obejmujący dozowanie każdego składnika do rurki mieszania, odpowiednie mieszanie oraz rozdział próbek do płytki 96-ściennej, wyniósł 30 min 42 s. Aby wykryć różnice między roztworami rozcieńczającymi, wodę ultraczystą – jako rozpuszczalnik glicerolu – przygotowano z dodatkiem 1 mg/mL Orange G. Wyniki pomiaru absorbancji wykazują, że zastosowanie kontroli temperatury oraz dotykania końcówki znacząco wpływa na jakość mieszanin (p < 0,0001). Oprócz przeprowadzonej dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) obliczono wartości współczynnika zmienności (CV), aby oszacować względną odchylenie standardowe. Współczynnik zmienności stanowi ujednolicony wskaźnik określający stopień odchylenia w stosunku do średniej i wyrażany jest w procentach. Jeśli średnie wartości próbek nie są głównym przedmiotem zainteresowania, lecz raczej zmienność wewnątrz pomiarów, współczynnik zmienności dostarcza dodatkowych informacji umożliwiających identyfikację powtarzalnych mieszanin46. W tym eksperymencie z trzema różnymi zestawami wartości absorbancji wykazały malejące wartości CV: odpowiednio 5,6%, 4,2% i 2,0% dla zestawu 1, zestawu 2 i zestawu 3, co demonstruje istotny wpływ zastosowania podgrzewanej platformy i funkcji dotykania końcówki na uzyskiwanie wiarygodnych wyników (Rycina 3a-ii). Wykres wartości absorbancji próbek dla zestawu 3 (numer próbki #1 do #96 na płytce 96-ściennej) nie wykazuje wzrostu ani spadku wartości w trakcie eksperymentu, co wskazuje na brak wpływu pozycji próbki na wartości absorbancji (Rycina 3a-iii). Wizualizacja danych dla każdej zmierzonej płytki w postaci map cieplnych pozwala uzyskać dodatkowe informacje umożliwiające wykrycie niejednorodności w konkretnym wierszu lub kolumnie, a także zmian wartości absorbancji w trakcie dozowania. Mapy cieplne dla trzech zestawów wykazują zmniejszanie się niejednorodności na całej powierzchni płytek od zestawu 1 do zestawu 3 (Rycina 3b). Ostatecznie powtarzalność przeprowadzonego mieszania oceniono w ośmiu niezależnych seriach (Rycina 3c-i,ii), z których każda trwała 6 min 57 s. Poszczególne serie mieszania wykazały niskie wartości CV w zakresie od 1,1% do 2,6%, co wskazuje na bardzo wiarygodne procesy mieszania i dozowania w ramach pojedynczych serii. Wartości absorbancji ze wszystkich ośmiu serii dały wartość CV wynoszącą 3,3% i potwierdziły powtarzalność opracowanego protokołu mieszania.

Serie rozcieńczeń GelMA przygotowano przez rozcieńczenie roztworu macierzystego o stężeniu 20% (w/v) za pomocą buforu PBS do stężeń 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 oraz 0% (w/v) i dodanie LAP do stałego stężenia 0,15% (w/v) (Rycina 4a-i), co w sumie zajęło 55 minut 12 sekund. Zgodnie z instrukcją protokołu eksperymentalnego, hydrożel był wiązany poprzecznie przez 30 sekund z natężeniem 2,0 mW/cm2 przy długości fali 400 nm. Aby ocenić różnice między mieszaninami, bufor PBS — jako rozcieńczalnik GelMA i alginianu — został przygotowany z dodatkiem 1 mg/mL Orange G. W związku z tym różnice w absorbancji między próbkami w obrębie jednej mieszaniny, jak również między kolejnymi rozcieńczeniami, identyfikowano za pomocą spektrofotometru. Zmierzone wartości absorbancji dla każdego etapu stężeniowego różnią się istotnie (p < 0,0001) i charakteryzują się bardzo niskimi wartościami współczynnika zmienności (CV) w zakresie od 1,2% do 3,4% we wszystkich etapach stężeniowych (n = 12 dla każdego etapu stężeniowego). Regresja liniowa wykazała wysoki dopasowanie z wartością R² wynoszącą 0,9869 (Rycina 4a-ii), a mapa cieplna potwierdziła jednorodny rozkład dla każdego stężenia oraz różnice między stężeniami (Rycina 4a-iii). Automatyczne mieszanie czterech odczynników przeprowadzono w celu uzyskania 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginianu, 0,15% (w/v) LAP oraz buforu PBS jako rozcieńczalnika bez (układ 2) i z (układ 3) dotknięciem końcówki (n = 96 dla każdego układu), przy tych samych parametrach wiązania poprzecznego (30 s, 2,0 mW/cm2, 400 nm). Dozowanie czterech materiałów, ich wymieszanie i rozmieszczenie w płytce 96-dołkowej zajęło 32 minuty 22 sekundy. Wszystkie eksperymenty z udziałem GelMA i alginianu przeprowadzono w temperaturze 37 °C, aby zapobiec termicznemu żelowaniu, które uniemożliwia pipetowanie GelMA. Dzięki opcji dotknięcia końcówki wartość CV zmniejszyła się z 5,2% do 3,4% i, w szczególności, wyeliminowano wartości odstające w dolnym zakresie poprzez usunięcie nadmiaru materiału z końcówki (Rycina 4b-i). Chociaż średnie wartości dla układu 2 i układu 3 wynoszą odpowiednio 1,927 i 1,944 i są bardzo zbliżone, współczynnik zmienności wskazuje na zmniejszające się odchylenie względem średniej. Poszczególne rzędy płytki 96-dołkowej można porównać ze sobą za pomocą wizualizacji w postaci mapy cieplnej, aby wykryć różnice w rzędach i/lub kolumnach (Rycina 4b-ii).

Diagram przepływu pracy: proces laboratoryjny od przygotowania do analizy, zawierający szczegółowe informacje na temat konfiguracji oprogramowania, kalibracji sprzętu oraz pomiaru absorbancji.
Rysunek 1: Przepływ protokołu z poszczególnymi zadaniami. Opisany przepływ pracy podzielony jest na siedem zadań, które zostały ugrupowane w etapy: przygotowanie, wykonanie i analizę. Na początku należy skonfigurować oprogramowanie (zadanie 1) oraz sprzęt (zadanie 2). Po przygotowaniu materiałów (zadanie 3) i utworzeniu skryptu protokołu (zadanie 4), kalibruje się moduł pipetujący poprzez określenie pozycji pipety i pojemników (zadanie 5). Następnie skrypt protokołu jest uruchamiany na stanowisku roboczym (zadanie 6), a następnie przeprowadzana jest walidacja i weryfikacja mieszanek (zadanie 7) w celu ich oceny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Stacja robocza typu open-source z modułami pipetowania i crosslinkera; układ talerza z pokazanymi stojakami na końcówki i tackami.
Rysunek 2: Stacja robocza typu open-source oraz układ talerza modułu pipetowania. (a) Opracowana stacja robocza inspirowana jest podejściem linii montażowej, w której próbki są przemieszczane przez różne moduły, i składa się z następujących modułów: pipetowania, crosslinkera, magazynowania, transportu oraz modułu obliczeniowego. (b) Układ talerza modułu pipetowania dobiera się w zależności od układu eksperymentalnego (np. typ płytki do dołków, objętość probówek itp.). Przedstawiony układ talerza został użyty w zaprezentowanych eksperymentach i obejmuje pipety wyporowe o zakresie od 10–100 µL (M100E) oraz 100–1 000 µL (M1000E), stojaki na końcówki z tłokami kapilarnymi (CP) o pojemności 100 µL (CP100) i 1 000 µL (CP1000), pojemnik na odpady, tackę do mieszania oraz tackę wejściową dla odczynników. (c) Dostępne pozycje na talerzu są oznaczone wyświetlonymi liczbami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Optymalizacja układu dla 85% glicerolu; rozkład wartości absorbancji; powtarzalne mieszanie w płytce 96-well.
Rysunek 3: Wyniki automatycznego pipetowania mieszanin glicerolu. (a) Elastyczna konstrukcja stanowiska umożliwia ocenę trzech różnych układów (i) w celu określenia optymalnych parametrów zapewniających powtarzalne wyniki. (ii) Zastosowanie dotknięcia końcówki oraz podgrzewania materiału skutkowało obniżeniem wartości współczynnika zmienności (CV) i uzyskaniem wysoce powtarzalnych mieszanin w układzie 3. Każde doświadczenie przeprowadzono z 96 próbkami. (iii) Wykres pojedynczych wartości próbek nie wykazał wpływu sekwencji pipetowania. (b) Wyniki doświadczalne każdego układu zwizualizowano za pomocą map cieplnych, aby określić wpływ różnic w rzędach/kolumnach, krawędziach lub mieszaninie głównej. (c) Powtarzalność układu 3 analizowano w ramach ośmiu niezależnych powtórzeń, wykorzystując (i) medianę, odchylenie standardowe, wartość CV oraz (ii) mapy cieplne. Dane w panelach a-ii (n = 96) i b-i (n = 12) przedstawiono jako średnie oraz pojedyncze punkty danych. Istotność statystyczną określono jako ****p < 0,0001 przy zastosowaniu dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Serie rozcieńczeń GelMA; absorbancja przy 450 nm; wykresy i mapy cieplne; analiza stężenia w płytce 96-dołkowej.
Rysunek 4: Wyniki zadań mieszania z użyciem hydrożeli. (a) Z roztworu macierzystego żelatyny metakrylowej (GelMA) o stężeniu 20% (w/v) w jednym przebiegu eksperymentalnym przygotowano serie rozcieńczeń: 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 i 0% (w/v) w płytce 96-dołkowej (n = 12 na stężenie). (i) Wartości współczynnika zmienności (CV) wahają się od 1,2% do 3,4% w całym zakresie przygotowanych stężeń, a (ii) regresja liniowa wykazała wysoki dopasowanie z wartością R² wynoszącą 0,9869. (iii) Jednorodność rozcieńczeń potwierdzono wizualnie za pomocą uzyskanej mapy cieplnej. (b) Hydrożele o podwójnej sieci uzyskano z użyciem 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginianu i 0,15% (w/v) LAP (i) z dotknięciem końcówki i bez niego (n = 96 dla każdego układu) oraz utwardzono przez 30 s przy natężeniu 2,0 mW/cm2 i długości fali 400 nm. Zastosowanie dotknięcia końcówki skutkowało obniżeniem wartości CV z 5,2% do 3,4%. (ii,iii) Mapy cieplne potwierdzają mniejszą liczbę odchyleń przy użyciu dotknięcia końcówki w celu usunięcia nadmiaru materiału z końcówki. Dane w panelach a-i i b-i przedstawiono jako średnie oraz pojedyncze punkty danych. Istotność statystyczną określono jako *p < 0,05, ***p < 0,001 oraz ****p < 0,0001 przy zastosowaniu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Techniki pipetowania: bufor powietrzny a pipeta przesuwu pozytywnego, kroki zarządzania nadmiarem materiału.
Rysunek 5: Podsumowanie różnic między typami pipet oraz problemów związanych z lepkimi materiałami biologicznymi. (a) Odczynnik i tłok są oddzielone buforem powietrznym, który ulega skróceniu podczas dozowania i wydłużeniu podczas aspiracji. Podczas aspiracji i dozowania lepkich materiałów, powolny „przepływ” powoduje problemy, takie jak pęcherzyki powietrza czy nieregularne zachowanie pipety. (b) Pipety przesuwu pozytywnego umożliwiają wiarygodną aspirację i dozowanie lepkich materiałów dzięki zastosowaniu tłoka umieszczonego w końcówce. (c) Pipetowanie bardzo lepkich materiałów (np. alginianu 4% (w/v)) może prowadzić do gromadzenia się nadmiaru materiału na końcówce, co powoduje niedokładność w trakcie eksperymentów. (d) Zastosowanie prostej tacki do dotykania końcówek umożliwia usunięcie nadmiaru materiału z końcówki i zapewnia dokładne objętości aspiracji i dozowania. Realizuje się to poprzez użycie wewnętrznej strony pokrywy płytki umieszczonej na pojemniku do końcówek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Materiał #1 (stężenie magazynowe)Ostateczne stężenie materiału #1Materiał #2 (stężenie magazynowe)Ostateczne stężenie materiału #2Materiał #3 (stężenie magazynowe)Ostateczne stężenie materiału #3Rozpuszczalnik (roztwór roboczy Orange G)Ostateczne stężenie Orange G w mieszaninieWyświetlone na rysunku
Gliceryna (85% (w/v))80% (w/v)woda (1 mg/mL Orange G)0,059 mg/mLRysunek 3a−c
GelMA (20% (w/v))0% (w/v)LAP (3% (w/v))0,15% (w/v)PBS (1 mg/mL Orange G)1 mg/mLRysunek 4a
GelMA (20% (w/v))2% (w/v)LAP (3% (w/v))0,15% (w/v)PBS (1 mg/mL Orange G)0,85 mg/mLRysunek 4a
GelMA (20% (w/v))4% (w/v)LAP (3% (w/v))0,15% (w/v)PBS (1 mg/mL Orange G)0,75 mg/mLRysunek 4a
GelMA (20% (w/v))6% (w/v)LAP (3% (w/v))0,15% (w/v)PBS (1 mg/mL Orange G)0,65 mg/mLRysunek 4a
GelMA (20% (w/v))8% (w/v)LAP (3% (w/v))0,15% (w/v)PBS (1 mg/mL Orange G)0,55 mg/mLRysunek 4a
GelMA (20% (w/v))10% (w/v)LAP (3% (w/v))0,15% (w/v)PBS (1 mg/mL Orange G)0,45 mg/mLRysunek 4a
GelMA (20% (w/v))12% (w/v)LAP (3% (w/v))0,15% (w/v)PBS (1 mg/mL Orange G)0,35 mg/mLRysunek 4a
GelMA (20% (w/v))14% (w/v)LAP (3% (w/v))0,15% (w/v)PBS (1 mg/mL Orange G)0,25 mg/mLRysunek 4a
GelMA (20% (w/v))5% (w/v)Alginian (4% (w/v))2% (w/v)LAP (3% (w/v))0,15% (w/v)PBS (1 mg/mL Orange G)0,2 mg/mLRysunek 4b

Tabela 1: Przegląd parametrów dla przeprowadzonych eksperymentów.

Krok protokołuProblemMożliwa przyczynaRozwiązanie
1.1Nie można zainstalować lub zaktualizować oprogramowaniaZbyt mało miejsca na karcie SDSprawdź ilość wolnego miejsca na karcie SD. W razie potrzeby usuń niepotrzebne pliki, opróżnij kosz lub użyj karty SD o odpowiedniej pojemności
1.2Nie można zainstalować APIOgraniczone uprawnienia użytkownika do instalacji (brak uprawnień użytkownika root)Użyj polecenia „sudo” przed określonymi komendami, aby uzyskać prawa administratora. W systemie Linux ten rodzaj dostępu nazywany jest superużytkownikiem.
3.1Problemy z GelMAFunkcjonalizacja, dializa lub liofilizacjaSzczegółowy protokół krok po kroku wraz z listą rozwiązywania problemów dostępny jest w pracy Loessner et al.33.
5.1 i 6.2Stacja robocza nie reaguje na poleceniaProblemy z połączeniemWyłącz wszystko i zakończ pracę komputera. Odłącz zasilanie na 10 s. Włącz ponownie komputer i stację roboczą.
5.1 i 6.2Stacja robocza nie reaguje na poleceniaProblemy z połączeniemSprawdź, czy komputer wykrywa połączenie USB i czy port USB jest poprawnie zdefiniowany. Upewnij się, że zapora sieciowa nie blokuje procesu połączenia (zobacz link poniżej tabeli 2).
5.1 i 6.2Nie można otworzyć plikuBłędny katalogSprawdź katalog (ścieżkę folderu), aby upewnić się, że używana jest poprawna ścieżka. Jeśli plik (np. interface.py) nie może zostać odnaleziony, najprawdopodobniej używana jest nieprawidłowa ścieżka.
6.6.2Tip nie jest prawidłowo zamocowany lub odpada podczas ruchuProblem z kalibracjąPowtórz kroki kalibracji pipety i upewnij się, że tłok kapilarny jest poprawnie połączony z pipetą.
6.6.2Tip nie jest prawidłowo zamocowany lub odpada podczas ruchuProblem z mocowaniemPipeta nie jest prawidłowo połączona z osią pipety i przesuwa się podczas ruchu. Dokręć śruby, aby temu zapobiec.
6.6.2Tip pobiera materiał powyżej jego poziomuProblem z kalibracjąPowtórz kalibrację tego typu tacki, aby poprawnie zdefiniować wysokość.
6.6.2Tip pobiera materiał powyżej jego poziomuProblem z kalibracjąSprawdź objętość w probówce i upewnij się, że odpowiada ona objętości zdefiniowanej w aplikacji projektanta protokołu.
6.6.2Materiał ocieka podczas ruchuZbyt duża ilość nadmiaru materiału na tipieWłącz opcję dotknięcia tipem podstawki; opcjonalnie można również wydłużyć czas dotknięcia tipem.
6.6.2Materiał jest stały lub zbyt lepki do pipetowaniaZachowanie termoobwodowe materiałuSprawdź charakterystykę materiału termoobwodowego i odpowiednio dostosuj temperaturę nagrzewania/chłodzenia podstawki temperaturowej.
https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting

Tabela 2: Tabela rozwiązywania problemów zawierająca zidentyfikowane problemy, możliwe przyczyny oraz rozwiązania umożliwiające usunięcie usterek.

Plik uzupełniający. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Pipetowanie lepkich materiałów, zwłaszcza hydrożeli do zastosowań biomedycznych 19,20,21,33,47, jest rutynowym zadaniem w wielu laboratoriach badawczych w celu przygotowania zdefiniowanego przez użytkownika stężenia lub serii rozcieńczeń o różnych stężeniach. Chociaż jest powtarzalny, a wykonanie jest raczej proste, najczęściej wykonuje się go ręcznie z niską przepustowością próbki18. Ten samouczek przedstawia działanie stacji roboczej typu open source, która została specjalnie zaprojektowana dla materiałów lepkich, aby umożliwić automatyczne mieszanie lepkich materiałów w celu powtarzalnego generowania pożądanych stężeń. Ta stacja robocza jest zoptymalizowana pod kątem pipetowania hydrożeli, aby umożliwić zautomatyzowaną i wysoce niezawodną obsługę dzięki integracji doków temperaturowych dla materiałów termoczułych, pipet wyporowych dla materiałów lepkich oraz opcjonalnej stacji dokującej z końcówką do usuwania nadmiaru materiału z końcówki. Moduł pipetujący został specjalnie zoptymalizowany, aby umożliwić przetwarzanie lepkiego materiału w ustandaryzowany i zautomatyzowany sposób. W porównaniu z pipetami z poduszką powietrzną (ilustracja 5a), pipety wyporowe (ilustracja 5b) dozują lepkie materiały bez pozostawiania resztek materiału w końcówce, co zapewnia dokładne objętości zasysania i dozowania. Opcjonalna stacja dokująca z końcówką dotykową usuwa nadmiar materiału próbki z końcówki (rysunek 5c,d), co jest przydatne w przypadku materiałów klejących (np. 4% (w/v) alginianu).

Aplikacja do projektowania protokołów została specjalnie zaprogramowana dla hydrożeli i umożliwia rozcieńczenie do czterech odczynników o różnych stężeniach i do dwóch rozcieńczalników. W tej aplikacji zapobiega się ryzyku błędów w obliczeniach końcowych rozcieńczeń, ponieważ użytkownicy wybierają tylko żądane stężenie lub etapy seryjnego rozcieńczania. Wymagane objętości zasysania i dozowania są obliczane automatycznie, zapisywane w osobnym pliku tekstowym dokumentacji, a następnie wprowadzane do skryptu protokołu. Ta aplikacja do projektowania protokołów daje użytkownikowi pełną kontrolę nad wszystkimi parametrami eksperymentalnymi (np. prędkością pipetowania) i zapewnia wewnętrzną dokumentację ważnych parametrów. Aplikacja do projektowania protokołów uwzględnia poziom napełnienia zbiornika (np. studni) i zmienia wysokość zasysania/dozowania, aby zapobiec niepotrzebnemu zanurzaniu się w lepkich materiałach. Ta zintegrowana funkcja zapobiega gromadzeniu się materiału na zewnętrznej ściance końcówki, a tym samym zapewnia niezawodne zadania zasysania i dozowania w całym protokole. Chociaż aplikacja do projektowania protokołów została opracowana z myślą o etapach rozcieńczania hydrożelu, może być również używana do rozcieńczania cieczy nielepkich, takich jak barwniki Orange G. Aplikacja do projektowania protokołów, która jest dostępna za pośrednictwem repozytorium pod adresem '/examples/publication-JoVE', to wersja, która jest wyjaśniona w sekcji protokołu i wyróżniona w filmie. Ta wersja nie będzie aktualizowana. Jednak zaktualizowana wersja aplikacji do projektowania protokołów jest dostępna za pośrednictwem głównej strony repozytorium. Terminal kalibracyjny został pierwotnie opracowany przez firmę Sanderson48 i został zoptymalizowany pod kątem kalibracji pipet wyporowych.

Jak opisano w rozdziale 4 protokołu, pipety oraz pojemniki muszą zostać wstępnie skalibrowane. Ten proces kalibracji ma kluczowe znaczenie dla zdefiniowania i zapisania pozycji, które są następnie wykorzystywane do obliczania przyrostów ruchu. W związku z tym pomyślne wykonanie protokołu opiera się na dobrze zdefiniowanych pozycjach kalibracji, ponieważ niewłaściwe punkty kalibracji mogą spowodować rozbicie końcówki o pojemnik. Ponieważ pozycje tłoków pipet muszą być kalibrowane ręcznie, dokładność i precyzja pipetowania zależy w dużej mierze od przeprowadzonej kalibracji. Te procedury kalibracji zależą w dużym stopniu od doświadczenia użytkownika z modułem pipetowania, dlatego na początku zaleca się szkolenie z doświadczonym personelem w celu zapewnienia prawidłowych procedur kalibracji. Oprócz ręcznej kalibracji w module pipetującym, sama pipeta musi zostać skalibrowana, aby zapewnić dokładne pipetowanie. Zaleca się wzorcowanie pipet co najmniej co 12 miesięcy, aby spełniały kryteria akceptacji określone w normie ISO 8655. Aby wewnętrznie ocenić kalibrację pipety, dostępna jest walidacja i weryfikacja zgodnie z opisem Stangegaarda i wsp.16.

Do wygenerowania wiarygodnego zestawu danych kluczowe jest rozpoczęcie od odczynników wysokiej jakości. Jest to szczególnie ważne w przypadku zadań przetwarzania hydrożelu, ponieważ różnice między partiami mogą mieć wpływ na wyniki generowane w ramach tego protokołu. Oprócz różnic między partiami, subtelne zmiany w przygotowaniu małych objętości mogą również przyczyniać się do różnic we właściwościach. Aby temu zapobiec, zaleca się przygotowanie większych objętości, które można wykorzystać do całych eksperymentów.

Procedury walidacji i weryfikacji opierają się na użyciu barwnika w celu identyfikacji wiarygodnych mieszanin. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie Orange G, ale ogólny protokół i przebieg analizy można również dostosować do barwników fluorescencyjnych49,50. Zastosowanie Orange G zmniejsza wymagania techniczne spektrofotometru i eliminuje środki ostrożności podjęte w celu zapobieżenia bieleniu barwników fluorescencyjnych po ekspozycji na światło. Problemy z rozpuszczaniem lub tworzeniem się klastrów barwnika nie zostały zaobserwowane w prezentowanych materiałach podczas eksperymentów, ale mogą pojawić się w przypadku innych materiałów. Potencjalne tworzenie się klastrów, a tym samym interakcję między barwnikiem a materiałem, można łatwo wykryć za pomocą mikroskopu.

Procedury i techniki przedstawione w tym samouczku dodają możliwości automatyzacji do obecnych procesów pracy dla materiałów lepkich w celu uzyskania wysoce niezawodnych zadań przy minimalnym nakładzie pracy ludzkiej. Dostarczona tabela rozwiązywania problemów (Tabela 2) zawiera zidentyfikowane problemy i przedstawia możliwe przyczyny, a także rozwiązania problemów. Prezentowana stacja robocza została z powodzeniem zastosowana do naturalnych (żelatyna, guma gellan, matrigel) i syntetycznych (np. poli(glikol etylenowy) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) materiałów polimerowych do zautomatyzowanych zadań pipetowania. W szczególności połączenie stacji roboczej typu open source i aplikacji do projektowania protokołów open source przeznaczonej dla materiałów lepkich będzie bardzo przydatne dla naukowców pracujących w dziedzinie inżynierii biomedycznej, materiałoznawstwa i mikrobiologii.

Oświadczenia

CM i DWH są założycielami i udziałowcami Gelomics Pty Ltd. CM jest również dyrektorem Gelomics Pty Ltd. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów istotnego z punktu widzenia tematyki niniejszego artykułu. Autorzy nie mają żadnych innych istotnych powiązań ani powiązań finansowych z żadną organizacją lub podmiotem mającym interes finansowy lub konflikt finansowy z tematyką lub materiałami omawianymi w artykule, poza tymi, które zostały ujawnione.

Podziękowania

Autorzy dziękują członkom Centrum Medycyny Regeneracyjnej na QUT, w szczególności Antonii Horst i Pawłowi Mieszczankowi za ich pomocne sugestie i opinie. Prace te były wspierane przez QUT's Postgraduate Research Award for SE oraz przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych (ARC) w ramach umowy o grant IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB był wspierany przez National Health and Medical Research Council (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 probówek reakcyjnychFisher Scientific, Inc. (USA)14-959-53A
Probówki 5 mlPacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)Rozmiar SCT-5MLzależy od protokołu eksperymentalnego; można również użyć probówek Eppies (0,5, 1, 1,5 mL) lub Falcon (15, 50 ml); produkt jest wytwarzany przez Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name
Probówki reakcyjne 50 mlFisher Scientific, Inc. (USA)14-432-22
70% w/w etanoluLabChem, Inc. (USA)aja726-5Lpl
96-dołkowa płytkaThermo Fisher Scientific, Inc. (USA)https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055
AlginianNovaMatrix4200001https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/
Woda demineralizowana lub ultraczysta (MilliQ)
Żelatyna metakryloylowa (GelMA)Syntetyzowany we własnym zakresieszczegółowy protokół (w tym materiały i referencje) jest dostępny w Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037
Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)Sigma-Aldrich, Inc. (USA)900889
M4 i M5 Klucz imbusowyOpenBuilds, inc. (USA)179, 190dostępne również w każdym sklepie z narzędziami. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/
OrangeGFisher Scientific (USA)O267-25https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)14190-144alternatywnie: Tabletki PBS: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)
Sprzęt
Aluminiowe bloki do doku temperaturowegoRatek Instruments Pty. Ltd. (Australia)SB16dla różnych rozmiarów rur. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html
Waga analitycznaSartorius AG (Niemcy)ED224S
Robot do obsługi cieczy typu open source: produkt komercyjnyOpentrons Laboratories, Inc. (USA)OT-One S Prohttps://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro
Robot do obsługi cieczy o otwartym kodzie źródłowym: otwarty Sprzęt źródłowyZmontowany wewnętrznie zgodnie z podejściemPliki sprzętowe i programowe są swobodnie dostępne na GitHub i Zenodo (podane linki); instrukcje budowania są dostarczone. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24
Pipeta wyporowa: MicromanEGilson, Inc. (USAFD10006zależy od wymaganego rozmiaru. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html
SpektrofotometrBMG LABTECH GmbH (Niemcy)CLARIOstar
Końcówki: tłoki kapilarneGilson, Inc. (USA)F148180zależy od wymaganego rozmiaru. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191
Dostępne są bloki open source

Bibliografia

  1. Jarvis, M. F., Williams, M. Irreproducibility in Preclinical Biomedical Research: Perceptions, Uncertainties, and Knowledge Gaps. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (4), 290-302 (2016).
  2. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
  3. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The economics of reproducibility in preclinical research. PLoS Biology. 13 (6), 1-9 (2015).
  4. Niepel, M., et al. A Multi-center Study on the Reproducibility of Drug-Response Assays in Mammalian Cell Lines. Cell Systems. 9 (1), 35-48 (2019).
  5. Prinz, F., Schlange, T., Asadullah, K. Believe it or not: how much can we rely on published data on potential drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (9), 712(2011).
  6. Baker, M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature. 533 (7604), 452-454 (2016).
  7. Begley, C. G., Ellis, L. M. Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
  8. Sena, E. S., van der Worp, H. B., Bath, P. M. W., Howells, D. W., Macleod, M. R. Publication Bias in Reports of Animal Stroke Studies Leads to Major Overstatement of Efficacy. PLoS Biology. 8 (3), 1000344(2010).
  9. Ioannidis, J. P. A., Kim, B. Y. S., Trounson, A. How to design preclinical studies in nanomedicine and cell therapy to maximize the prospects of clinical translation. Nature Biomedical Engineering. 2 (11), 797-809 (2018).
  10. Enserink, M. Sloppy reporting on animal studies proves hard to change. Science. 357 (6358), 1337-1338 (2017).
  11. Freedman, L. P., Inglese, J. The Increasing Urgency for Standards in Basic Biologic Research. Cancer Research. 74 (15), 4024-4029 (2014).
  12. Lippi, G., Lima-Oliveira, G., Brocco, G., Bassi, A., Salvagno, G. L. Estimating the intra- and inter-individual imprecision of manual pipetting. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 55 (7), 962-966 (2017).
  13. Hentz, N. G., Knaide, T. R. Effect of Liquid-Handling Accuracy on Assay Performance. Journal of Laboratory Automation. 19 (2), 153-162 (2014).
  14. Reason, J. Understanding adverse events: human factors. Quality and Safety in Health Care. 4 (2), 80-89 (1995).
  15. Schober, L., et al. Cell Dispensing in Low-Volume Range with the Immediate Drop-on-Demand Technology (I-DOT). Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 154-163 (2015).
  16. Stangegaard, M., Hansen, A. J., Frøslev, T. G., Morling, N. A Simple Method for Validation and Verification of Pipettes Mounted on Automated Liquid Handlers. Journal of Laboratory Automation. 16 (5), 381-386 (2011).
  17. Crombie, D. E., et al. Development of a Modular Automated System for Maintenance and Differentiation of Adherent Human Pluripotent Stem Cells. SLAS Discovery. 22 (8), 1016-1025 (2017).
  18. Eggert, S., Hutmacher, D. W. In vitro disease models 4.0 via automation and high-throughput processing. Biofabrication. 11 (4), 043002(2019).
  19. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Advanced Materials. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  20. Zhang, Y. S., Khademhosseini, A. Advances in engineering hydrogels. Science. 356 (6337), (2017).
  21. Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
  22. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  23. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
  24. Gao, G., Huang, Y., Schilling, A. F., Hubbell, K., Cui, X. Organ Bioprinting: Are We There Yet. Advanced Healthcare Materials. 7 (1), 1701018(2018).
  25. Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
  26. Lim, K. S., et al. New Visible-Light Photoinitiating System for Improved Print Fidelity in Gelatin-Based Bioinks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1752-1762 (2016).
  27. Müller, M., et al. Development and thorough characterization of the processing steps of an ink for 3D printing for bone tissue engineering. Materials Science and Engineering C. 108, 110510(2020).
  28. Sewald, L., et al. Beyond the Modification Degree: Impact of Raw Material on Physicochemical Properties of Gelatin Type A and Type B Methacryloyls. Macromolecular Bioscience. 18 (12), 1-10 (2018).
  29. Eggert, S., Mieszczanek, P., Meinert, C., Hutmacher, D. W. A modular open source technology for automated in vitro workflows. Zenodo. , (2020).
  30. Volk, A., Kähler, C. J. Density model for aqueous glycerol solutions. Experiments in Fluids. 59 (5), 75(2018).
  31. Zhang, H., Grinstaff, M. W. Recent Advances in Glycerol Polymers: Chemistry and Biomedical Applications. Macromolecular Rapid Communications. 35 (22), 1906-1924 (2014).
  32. Klotz, B. J., Gawlitta, D., Rosenberg, A. J. W. P., Malda, J., Melchels, F. P. W. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair. Trends in Biotechnology. 34 (5), 394-407 (2016).
  33. Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  34. Ansari, S., et al. Regulation of the fate of dental-derived mesenchymal stem cells using engineered alginate-GelMA hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2957-2967 (2017).
  35. Axpe, E., Oyen, M. Applications of Alginate-Based Bioinks in 3D Bioprinting. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 1976(2016).
  36. Ma, X., et al. 3D printed micro-scale force gauge arrays to improve human cardiac tissue maturation and enable high throughput drug testing. Acta Biomaterialia. 95, 319-327 (2019).
  37. Bas, O., et al. Rational design and fabrication of multiphasic soft network composites for tissue engineering articular cartilage: A numerical model-based approach. Chemical Engineering Journal. 340, 15-23 (2018).
  38. O'Connell, C. D., et al. Tailoring the mechanical properties of gelatin methacryloyl hydrogels through manipulation of the photocrosslinking conditions. Soft Matter. 14 (11), 2142-2151 (2018).
  39. LearnPython.org. , Available from: https://www.learnpython.org (2020).
  40. Raspberry Pi Foundation: Using your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-using (2020).
  41. Raspberry Pi Foundation: Setting up your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/4 (2020).
  42. Raspberry Pi Foundation: Connect your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/3 (2020).
  43. Python Software Foundation: python.org. , Available from: https://www.pthon.org (2020).
  44. Python Software Foundation: pypi.org. , Available from: https://pypi.org (2020).
  45. Opentrons Labworks, Inc: Installing pipettes. , Available from: https://support.opentrons.com/en/articles/689945-installing-pipettes (2020).
  46. Kang, C. W., Lee, M. S., Seong, Y. J., Hawkins, D. M. A Control Chart for the Coefficient of Variation. Journal of Quality Technology. 39 (2), 151-158 (2007).
  47. Annabi, N., et al. 25th Anniversary Article: Rational Design and Applications of Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
  48. Theo Sanderson: OpenTronsTerminalCalibration. , Available from: https://github.com/theosanderson/OpentronsTerminalCalibration (2020).
  49. Rhode, H., et al. An Improved Method for Checking HTS/uHTS Liquid-Handling Systems. Journal of Biomolecular Screening. 9 (8), 726-733 (2004).
  50. Taylor, P. B., et al. A Standard Operating Procedure for Assessing Liquid Handler Performance in High-Throughput Screening. Journal of Biomolecular Screening. 7 (6), 554-569 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trójwymiarowa hodowla w hydrożelachzautomatyzowana stacja roboczaprotokół open sourceobchodzenie się z materiałami lepkimihydrożel GelMA-alginianowypipeta wypierającaintegracja z uchwytem temperaturowymfunkcja dotykania końcówkąwalidacja absorbancjihydrożel o podwójnej sieci
Platforma technologiczna typu open source do produkcji modeli kultur 3D na bazie hydrożelu w zautomatyzowany i ustandaryzowany sposób
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.