Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61262

⸱

11 lipca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Rekombinowany BDNF zawierający sekwencję Avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293 w opłacalny sposób i oczyszczany przez chromatografię powinowactwa. BDNFavi jest następnie bezpośrednio monobiotynylowany enzymem BirA w probówce. BDNFavi i monobiotynylowany BDNFavi zachowują swoją aktywność biologiczną w porównaniu z dostępnym na rynku BDNF.

Streszczenie

Rekombinowany BDNF zawierający sekwencję Avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293, a następnie ekonomicznie oczyszczany przez chromatografię powinowactwa. Opracowano powtarzalny protokół bezpośredniego monobiotynylowania BDNFAvi enzymem BirA w probówce. W tej reakcji monobiotynylowany BDNFAvi zachowuje swoją aktywność biologiczną.

Neurotrofiny są czynnikami wzrostu pochodzenia docelowego, odgrywającymi rolę w rozwoju i utrzymaniu neuronów. Wymagają szybkich mechanizmów transportowych wzdłuż szlaku endocytarnego, aby umożliwić sygnalizację na duże odległości między różnymi przedziałami neuronalnymi. Opracowanie narzędzi molekularnych do badania transportu neurotrofin umożliwiło precyzyjne śledzenie tych białek w komórce za pomocą rejestracji in vivo. W tym protokole opracowaliśmy zoptymalizowaną i opłacalną procedurę produkcji monobiotynylowanego BDNF. Rekombinowany wariant BDNF zawierający biotynylowaną sekwencję avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293 w zakresie mikrogramów, a następnie oczyszczany w łatwo skalowalnej procedurze przy użyciu chromatografii powinowactwa. Oczyszczony BDNF może być następnie jednorodnie monobiotynylowany w bezpośredniej reakcji in vitro z enzymem BirA w probówce. Aktywność biologiczna monobiotynylowanego BDNF (mbtBDNF) może być sprzężona ze streptawidyną sprzężoną z różnymi fluoroforami. BDNFAvi i mbtBDNF zachowują swoją aktywność biologiczną, o której wykazano odpowiednio poprzez wykrywanie dalszych fosforylowanych celów za pomocą western blot i aktywacji czynnika transkrypcyjnego CREB. Korzystając z kropek kwantowych streptawidyny, byliśmy w stanie zwizualizować internalizację mbtBDNF towarzyszącą aktywacji CREB, którą wykryto za pomocą przeciwciała specyficznego dla fosfo-CREB. Ponadto mbtBDNF sprzężony ze streptawidyną-kropkami kwantowymi nadawał się do analizy transportu wstecznego w neuronach korowych hodowanych w komorach mikroprzepływowych. Tak więc wytwarzany w probówce mbtBDNF jest niezawodnym narzędziem do badania fizjologicznej dynamiki endosomów sygnalizacji i transportu w neuronach.

Wprowadzenie

Neurony to funkcjonalne jednostki układu nerwowego posiadające złożoną i wyspecjalizowaną morfologię, która umożliwia komunikację synaptyczną, a tym samym generowanie skoordynowanych i złożonych zachowań w odpowiedzi na różne bodźce. Projekcje neuronalne, takie jak dendryty i aksony, są krytycznymi cechami strukturalnymi zaangażowanymi w komunikację neuronalną, a neurotrofiny odgrywają kluczową rolę w określaniu ich morfologii i funkcji1. Neurotrofiny to rodzina wydzielanych czynników wzrostu, która obejmuje NGF, NT-3, NT-4 i neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)2. W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) BDNF uczestniczy w różnych procesach biologicznych, w tym między innymi w neurotransmisji, arboryzacji dendrytycznej, dojrzewaniu kolców dendrytycznych, długotrwałym wzmocnieniu3,4. Dlatego BDNF odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji neuronów.

Różnorodne procesy komórkowe regulują dynamikę i funkcję BDNF. Na powierzchni neuronu BDNF wiąże kinazę receptora tropomiozyny B (TrkB) i/lub receptor neurotrofiny p75 (p75). Kompleksy BDNF-TrkB i BDNF-p75 są endocytozowane i sortowane w różnych organellach endocytarnych5,6,7,8. Prawidłowy transport wewnątrzkomórkowy kompleksu BDNF/TrkB jest wymagany do prawidłowej sygnalizacji BDNF w różnych obwodach neuronalnych9,10,11. Z tego powodu głębokie zrozumienie dynamiki transportu BDNF i jej zmian w procesach patofizjologicznych jest niezbędne do zrozumienia sygnalizacji BDNF w zdrowiu i chorobie. Opracowanie nowatorskich i specyficznych narzędzi molekularnych do monitorowania tego procesu przyczyni się do rozwoju tej dziedziny i umożliwi lepsze zrozumienie związanych z tym mechanizmów regulacyjnych.

Istnieje kilka narzędzi dostępnych do badania handlu BDNF w neuronach. Powszechnie stosowana metodologia polega na transfekcji rekombinowanego BDNF oznaczonego cząsteczkami fluorescencyjnymi, takimi jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) lub monomeryczny fluorescencyjny wariant GFP z przesunięciem ku czerwieni mCherry12,13. Jednak główną wadą nadekspresji BDNF jest to, że eliminuje ona możliwość dostarczania znanych stężeń tej neurotrofiny. Może to również powodować toksyczność komórkową, zasłaniając interpretację wyników14. Alternatywną strategią jest transfekcja TrkB oznaczonego epitopem, takiego jak Flag-TrkB. Metodologia ta pozwala na badanie dynamiki internalizacji TrkB15, ale obejmuje również transfekcję, która może skutkować zmienioną funkcją TrkB i toksycznością komórkową. Aby przezwyciężyć te przeszkody metodologiczne, opracowano rekombinowane warianty NGF i BDNF zawierające sekwencję Avi (BDNFAvi), która może być monobiotynylowana przez enzym ligazy biotyny BirA, 16,17. Biotynylowany rekombinowany BDNF może być sprzężony z różnymi narzędziami związanymi ze streptawidyną, które obejmują między innymi fluorofory, kulki, nanocząstki paramagnetyczne do wykrywania. Jeśli chodzi o obrazowanie żywych komórek, kropki kwantowe (QD) stały się często używanymi fluoroforami, ponieważ mają pożądane cechy do śledzenia pojedynczych cząstek, takie jak zwiększona jasność i odporność na fotowybielanie w porównaniu z fluoroforami drobnocząsteczkowymi18.

Produkcja mono-biotynylowanego BDNF (mbtBDNF) przy użyciu BDNFAvi została osiągnięta poprzez kotransfekcję plazmidów napędzających ekspresję BDNFAvi i BirA, a następnie oczyszczanie rekombinowanego białka za pomocą chromatografii powinowactwa z wydajnością 1-2 μg BDNF na 20 ml pożywki hodowlanej kondycjonowanej HEK29317. W tym miejscu proponujemy modyfikację tego protokołu, która pozwala na oczyszczanie BDNFAvi z 500 ml pożywki kondycjonowanej HEK293, co ma na celu maksymalizację odzysku białka w protokole opartym na kolumnie chromatograficznej w celu ułatwienia manipulacji. Zastosowany środek do transfekcji, polietylenoimina (PEI), zapewnia opłacalną metodę bez poświęcania wydajności transfekcji. Etap monobiotynylacji został dostosowany do reakcji in vitro, aby uniknąć powikłań związanych z kotransfekcją i zapewnić jednorodne znakowanie BDNF. Aktywność biologiczną mbtBDNF wykazano w eksperymentach z użyciem western blot i mikroskopii fluorescencyjnej, w tym aktywacji pCREB i obrazowaniu żywych komórek w celu zbadania wstecznego transportu aksonalnego BDNF w komorach mikroprzepływowych. Zastosowanie tego protokołu pozwala na zoptymalizowaną, wysokowydajną produkcję jednorodnego monobiotynylowanego i biologicznie aktywnego BDNF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi CONICYT (Chilijska Narodowa Komisja Badań Naukowych i Technologicznych). Protokoły wykorzystane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komisje ds. Bezpieczeństwa Biologicznego oraz Bioetyki i Dobrostanu Zwierząt Pontificia Universidad Católica de Chile. Eksperymenty na kręgowcach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Bioetyki i Dobrostanu Zwierząt Pontificia Universidad Católica de Chile.

UWAGA: Poniższy protokół został opracowany do oczyszczania BDNFAvi z całkowitej objętości 500 ml kondycjonowanej pożywki wyprodukowanej w komórkach HEK293. Ilość kondycjonowanego podłoża, które jest produkowane i przetwarzane w celu oczyszczenia BDNFAvi, może być w razie potrzeby zwiększana lub zmniejszana. Jednak w takich okolicznościach może być konieczna dalsza optymalizacja. Skład pożywek hodowlanych i stosowanych w całym protokole można znaleźć w materiałach uzupełniających.

1. Produkcja i oczyszczanie BDNFAvi z pożywek kondycjonowanych HEK293

  1. Transfekcja komórek HEK293
    1. Hoduj komórki HEK293 do 70% konfluencji w uzupełnionym pożywce DMEM (10% bydlęca surowica płodowa, 1x suplement glutaminianu, 1x antybiotyk/antybiotyk / antybiotyk przeciwgrzybiczy) w 15 cm szalkach hodowlanych w temperaturze 37 ºC.
    2. Zmień pożywkę na bufor transfekcji.
    3. Przygotować mieszaninę PEI-DNA do transfekcji. Użyj dwóch różnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml, aby rozcieńczyć odpowiednio DNA i PEI 25 K. Rozcieńczyć 20 μg plazmidowego DNA w końcowej objętości 500 μl w jednej probówce. Rozcieńczyć 60 μg liniowego PEI 25K w końcowej objętości 500 μl w drugiej probówce. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Ostrożnie odpipetować roztwór DNA do probówki PEI, mieszając raz ruchem góra-dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
    5. Wlej 1 ml mieszaniny PEI-DNA do każdej 15-centymetrowej płytki. Inkubować komórki z mieszaniną PEI-DNA przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    6. Zmienić pożywkę na świeży bufor inkubacyjny.
  2. Gromadzenie i przechowywanie multimediów
    1. Zebrać pożywkę ze wszystkich szalek 48 godzin po transfekcji komórek HEK293. Przygotować skoncentrowane zapasy roztworów opisanych w sekcji "Bufor do modyfikacji sklarowanego nad osadem" w pliku uzupełniającym 1 i dodać je do supernatantu HEK293 w celu uzyskania wymienionych stężeń końcowych.
      UWAGA: Komórki można wyrzucić lub odzyskać w celu dalszej analizy.
    2. Inkubować pożywkę w lodzie przez 15 minut.
    3. Podwielokrotność pożywki przelać do probówek wirówkowych.
    4. Odwirować pożywkę o stężeniu 10 000 x g przez 45 minut w wirówce o temperaturze 4 °C. Ten etap pozwala na eliminację resztek komórkowych i martwych komórek zawieszonych w pożywce.
    5. Zebrać supernatanty, dodać BSA w końcowym stężeniu 0,1%, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C. Pożywkę można porcjować przed zamrożeniem w celu szybszego rozmrożenia na etapie oczyszczania.
      UWAGA: Czas przechowywania zamrożonych pożywek kondycjonowanych do 2 miesięcy przyniósł pozytywne wyniki, dłuższe czasy przechowywania nie zostały ocenione.
  3. Zagęszczanie i oczyszczanie mediów
    1. Rozmrozić podłoże w łaźni termoregulowanej o temperaturze 37 °C.
    2. Podzielić pożywkę na porcje do probówek wirówkowych.
    3. Odwirowywać pożywkę przez 1 godzinę przy 3 500 x g w wirówce schłodzonej w temperaturze 4 °C. Ten etap pozwala na eliminację pozostałych resztek komórkowych, aby zapewnić odpowiedni przepływ przez kolumnę chromatograficzną.
    4. Użyj koncentratorów białka z odcięciem 10 kDa, aby zmniejszyć pożywkę z 500 ml do 100 ml. Postępuj zgodnie z zalecanymi przez producenta parametrami wirowania, aby uzyskać optymalne stężenie.
    5. Dodać 500 μl kulek agarozy Ni-NTA do zagęszczonej pożywki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w bujaku.
    6. Zmontować aparaturę chromatograficzną i wlać do niej pożywkę. Pozostaw na 5 minut, a następnie otwórz 2-kierunkowy kran, aby przepuścić medium.
    7. Przemyj koraliki 5 ml buforu do płukania przez 5 minut. Upewnij się, że koraliki zostały ponownie zawieszone w kolumnie. Opróżnij bufor płuczkowy, otwierając 2-drogowy kurek. Powtórz 3 razy.
    8. Dodać 1 ml buforu elucyjnego do kolumny. Upewnij się, że koraliki w kolumnie zostały ponownie zawieszone. Inkubować przez 15 minut, a następnie zebrać eluat w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz ten krok 3 razy, aby uzyskać całkowitą eliminację BDNFAvi.
    9. Załaduj 5 μl każdego eluatu i różne stężenia dostępnego w handlu BDNF (40-160 ng) w 15% żelu poliakrylamidowym. Wykryj oczyszczone białko za pomocą western blotting przy użyciu przeciwciała anty-BDNF.
    10. Oznaczyć stężenie oczyszczonego BDNFAvi w każdym eluacie, stosując krzywą stężeń przygotowaną z dostępnym w handlu BDNF.
    11. Podwielokrotnić i przechowywać oczyszczony BDNFAvi w temperaturze -80 °C.

2. Monobiotynylacja BDNFAvi in vitro przy użyciu enzymu BirA

  1. Reakcja monobiotynylacji in vitro
    1. Przygotować skoncentrowane roztwory podstawowe odczynników buforowych biotynylacji. Zastosowanie skoncentrowanych wywarów zminimalizuje rozcieńczenie rekombinowanego białka.
    2. Pobrać podwielokrotność 800 ng BDNFAvi i dodać odczynniki buforowe do biotynylacji oraz enzym BirA w stosunku molowym 1:1 do BDNF. Na przykład w przypadku 200 μl końcowej objętości reakcyjnej dodać; 100 μl roztworu zawierającego 800 ng BDNFAvi, 20 μl bicyny 0,5 M pH 8,3, 20 μl ATP 100 mM, 20 μl MgOAc 100 mM, 20 μl d-biotyny 500 μM, 0,8-1 μg do 1 μl BirA-GST i uzupełnić do 200 μl wodą ultraczystą.
      UWAGA: Pomyślne reakcje biotynylacji przeprowadzono z podwielokrotnościami 400 μL zawierającymi stężenie około 30 ng/μL BDNFAvi, w wyniku czego uzyskano jednorodnie biotynylowany BDNFAvi do końcowego stężenia ~20 ng/μL w końcowej reakcji.
    3. Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 °C w piecu do hybrydyzacji przez 1 godzinę. Mieszać zawartość przez odwrócenie rurki co 15 minut.
    4. Dodaj taką samą objętość ATP i BirA jak w kroku 2.1.2 i powtórz krok 2.1.3.
    5. Przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz lub przechowywać na lodzie do natychmiastowego użycia (np. kontrola jakości biotynylacji).
  2. Analiza biotynylacji
    1. Zablokuj 30 μl kulek magnetycznych streptawidyny na próbkę BDNF w 1 ml buforu blokującego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w rotatorze probówek do mikrowirówek.
    2. Wytrącić kulki magnetyczne za pomocą stojaka do separacji magnetycznej przez 3 do 5 minut lub do momentu, gdy bufor wydaje się całkowicie oczyszczony z kulek i wyrzucić bufor blokujący.
    3. Dodać 50 μl świeżego buforu blokującego i 80 ng monobiotynylowanej próbki BDNFAvi (mbtBDNF) do kulek, upewniając się, że zostały całkowicie ponownie zawieszone przez pipetowanie.
    4. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w rotatorze probówki do mikrowirówki, obracającym się z prędkością około 20 obr./min.
    5. Zebrać kulki za pomocą stojaka do separacji magnetycznej przez 3 do 5 minut i zebrać supernatant, zachowując 30 μl podwielokrotności do analizy.
    6. Umyj kulki jednorazowo 500 μl PBS, a następnie zbieraj je za pomocą magnetycznego stojaka separacyjnego przez 3 do 5 minut. Odzyskać supernatant i zachować 30 μl podwielokrotności do analizy.
    7. Dodaj 10 μl 4x bufora ładującego do kulek.
    8. Podgrzewać próbki do temperatury 97 °C przez 7 minut w celu elucji mbtBDNF.
    9. Wykryj mbtBDNF za pomocą przeciwciała specyficznego dla anty-BDNF19.

3. Weryfikacja aktywności biologicznej mbtBDNF

  1. Wykrywanie pTrkB i pERK przez western blot.
    1. Umieść 2 miliony neuronów korowych szczurów w 60-milimetrowych szalkach hodowlanych.
    2. Hoduj neurony przez 7 dni (DIV7). Następnie, rozpoczynając eksperyment, zmień pożywkę na nieuzupełniony mediun neurobazalny.
    3. Godzinę po zmianie pożywki dodać mbtBDNF do końcowego stężenia 50 ng/ml. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przechowywać naczynie do kontroli ujemnej (niestymulowane BDNF) i naczynie do kontroli dodatniej (poddane działaniu 50 ng/ml dostępnego w handlu BDNF).
    4. Zbierz podłoże i delikatnie umyj każde naczynie 1x PBS. Zbierz i wyrzuć 1x PBS.
    5. Umieść naczynia na lodzie i dodaj 50-80 μl buforu do lizy do każdego naczynia. Użyj skrobaka do komórek, aby zlizować komórki.
      UWAGA: Etap lizy należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć defosforylacji i degradacji białek. Wystarczą 1-2 minuty energicznego skrobania, aby uwidocznić interesujące białka za pomocą western blotting.
    6. Zebrać bufor do lizy i mieszać w mieszalniku wirowym z najwyższą prędkością przez 5 sekund.
    7. Odwirować bufor do lizy w temperaturze 14 000 x g (4 °C) przez 10 minut. Zebrać supernatant.
    8. Określić ilościowo zawartość białka w supernatantze za pomocą protokołu kwantyfikacji białka BCA20.
    9. Dodać bufor ładujący do podwielokrotności zawierającej 30-50 μg białka na warunek i załadować go do 12% żelu poliakrylamidowego do western blotting. Wykrywanie pTrkB i pERK za pomocą specyficznych przeciwciał fosfologicznych w celu weryfikacji aktywności biologicznej BDNFAvi.
  2. Weryfikacja aktywności biologicznej BDNF-QD metodą immunofluorescencji pCREB.
    1. Wysiewamy 40 000 neuronów kory mózgowej szczurów w 10-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych, uprzednio autoklawowanych i traktowanych poli-L-lizyną, jak opisano wcześniej21.
    2. Hodować neurony przez 7-8 dni w buforze podtrzymującym neurony (patrz materiały dodatkowe) w temperaturze 37 ºC.
    3. Aby rozpocząć eksperyment, należy zmienić pożywkę na niesuplementowaną pożywkę neuropodstawową i inkubować w temperaturze 37 ºC przez 1 godzinę.
    4. Przygotuj mbtBDNF sprzężony z kropkami kwantowymi (BDNF-QD), dodając do podwielokrotności mbtBDNF niezbędną objętość koniugatu streptawidyny z kropkami kwantowymi (streptawidyna-QD), aby uzyskać stosunek molowy BDNF-QD 1:1. Następnie rozcieńczyć do 20 μl pożywką neuropodstawową. Owiń rurkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
      UWAGA: Przygotować kolejną probówkę z tą samą objętością koniugatu streptawidyny z kropkami kwantowymi i rozcieńczyć ją do 20 μl podłożem neurobazalnym jako kontrolę ujemną.
    5. Inkubować mieszaninę mbtBDNF/streptawidyny-QD przez 30 minut w temperaturze pokojowej w bujaku.
    6. Rozcieńczyć BDNF-QD do pożądanego stężenia końcowego (200 pM i 2 nM) w podłożu neuropodstawnym.
    7. Po 1 godzinie inkubacji z nieuzupełnioną pożywką neurobazalną stymulować neurony BDNF-QD lub streptawidyną-QD (kontrola) do końcowego stężenia 200 pM i 2 nM BDNF przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    8. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy 1x PBS (37 °C) i utrwal komórki na 15 minut, traktując szkiełko nakrywkowe 4% roztworem paraformaldehydu zawierającym inhibitory fosfatazy.
    9. Przemyć komórki 3 razy PBS, a następnie inkubować z buforem blokującym/permeabilizacyjnym (BSA 5%, Triton X-100 0,5%, 1x inhibitor fosfatazy) przez 1 godzinę.
    10. Inkubować z przeciwciałem anty-pCREB 1:500 (w 3% BSA, 0,1% Triton X-100) przez noc w temperaturze 4 °C.
    11. Następnego dnia przemyć 3 razy 1x PBS i inkubować przez 1 godzinę z przeciwciałem drugorzędowym 1:500 (3% BSA, 0,1% Triton X-100).
    12. Umyj 3 razy za pomocą 1x PBS. Dodawać roztwór barwienia jądrowego Hoechst (5 μg/ml) przez 7 min.
    13. Umyj 3 razy za pomocą 1x PBS i zamontuj.
  3. Wizualizacja wstecznego transportu aksonalnego BDNF-QD w żywych neuronach
    1. Przygotuj komory mikroprzepływowe i neurony nasienne zgodnie z wcześniejszym opisem16.
    2. Po 7-8 dniach w hodowli zmień pożywkę na niesuplementowaną pożywkę neuropodstawową.
    3. Przygotuj mbtBDNF sprzężony z kropkami kwantowymi (BDNF-QD), dodając do podwielokrotności mbtBDNF niezbędną objętość koniugatu streptawidyny z kropkami kwantowymi (streptawidyna-QD), aby uzyskać stosunek molowy BDNF-QD 1:1. Następnie rozcieńczyć do 20 μl pożywką neuropodstawową. Owiń rurkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
      UWAGA: Przygotować kolejną probówkę z tą samą objętością koniugatu streptawidyny z kropkami kwantowymi i rozcieńczyć ją do 20 μl pożywką neurobazalną jako kontrolą.
    4. Inkubować mieszaninę mbtBDNF/streptawidyny-QD przez 30 minut w temperaturze pokojowej w bujaku.
    5. Rozcieńczyć BDNF-QD do pożądanego stężenia końcowego (2 nM).
    6. Po 1 godzinie inkubacji z nieuzupełnioną pożywką neurobazalną dodać BDNF-QD lub mieszaninę kontrolną do przedziałów aksonalnych komory mikroprzepływowej. Inkubować przez 210 minut w temperaturze 37 °C, aby zapewnić wsteczny transport netto BDNF-QD.
    7. W przypadku obrazowania żywych komórek należy zobrazować aksonalny transport wsteczny w segmencie mikrorowków, który jest proksymalny do przedziału ciała komórki, za pomocą obiektywu 100x przy użyciu mikroskopu odpowiedniego do tego celu (37 °C i 5% CO2). Rejestruj obrazy z szybkością 1 klatki/s.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie protokołu opartego na kolumnie chromatograficznej pozwala na przetwarzanie znacznych objętości pożywki kondycjonowanej komórek HEK293. Na Rysunku 1 przedstawiono wyniki oczyszczania BDNFAvi z 500 mL pożywki kondycjonowanej. Kolejne elucje BDNFAvi z kulek agarozy Ni-NTA dają malejące stężenia BDNFAvi (Rysunek 1A). Po czterech następujących po sobie elucjach (każda trwająca 15 min) odzyskano większość BDNF związanego z kulkami. Stężenia eluatów wahają...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule opisano zoptymalizowaną metodologię produkcji i oczyszczania mbtBDNF w procedurze opartej na chromatografii powinowactwa, w oparciu o pracę Sunga i współpracowników17. Optymalizacje obejmują zastosowanie opłacalnego odczynnika do transfekcji (PEI) przy jednoczesnym zachowaniu wydajności droższych metod transfekcji, takich jak lipofektamina. Taka optymalizacja przekłada się na znaczne obniżenie kosztów w protokole, pozwalając na skalowalność przy zachowaniu wysokiej efektywności kosz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od Fondecyt (1171137) (FCB), Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) oraz nagrody UK Dementia Research Institute Foundation (GS). Prace te były wspierane przez Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zawór 2-drogowyBioRad7328102Komponent aparatury chromatograficznej
2-merkaptoetanolSigmaM6250BDNF bufor elucyjny
Akrylamid/BisakryloamidBioRad1610154preparat żelowy SDS-PAGE
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024stężenie BDNF
Nadsiarczan amonuSigmaA9164SDS-PAGE preparat żelowy
przeciwciało anty B-III-tubulinaSigmaT8578Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF
przeciwciało anty BDNFAlomoneAGP-021Testy Western blot do oznaczania ilościowego BDNF
przeciwciało anty BDNFAlomoneANT-010Testy Western blot do oznaczania ilościowego BDNF
Komórka przeciwciała anty ERK Sygnalizacja9102Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF
przeciwciało anty pCREB (S133)Sygnalizacja komórkowa9198Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej przeciwciała
anty pERK BDNF (T202, Y204)Sygnalizacja komórkowa4370Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF
przeciwciało anty pTrkB (Y515)Abcamab109684Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF
Antybiotyk/Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyGibco15240-062HEK293 utrzymanie
ATPSigmaA26209BDNF bufor monobiotynylacyjny
B-27 SuplementGibco17504-044Utrzymanie neuronów
BicineSigmaB3876BDNF bufor monobiotynylacyjny
BirA-GSTBPS Bioscience70031Enzym do monobiotynylacji BDNF AviTag
Surowica bydlęca płoduHyCloneHC. SH30396.02HEK293 utrzymanie
Albumina surowicy bydlęcejJackson ImmunoResearch001-000-162Składnik modyfikacji buforu BDNF, bufor blokujący dla western blot i immunofluorescencji
D-BiotynaSigmaB4639Bufor monobiotynylacyjny BDNF
DMEM Medium o wysokiej zawartości glukozyGibco11965-092Neuron wysiewający
DMEM MediumGibco11995-081HEK293 konserwacja
Lejek kolumny EconoBioRad7310003Komponent aparatury chromatograficznej
EDTAMerck108418
Zestaw EZ-ECLPrzemysł biologiczny1633664Wykrywanie białek za pomocą western blotting
GlutamaxGibco35050-061Konserwacja Neuron i HEK293
GlicerolMerck104094Bufor elucyjny BDNF, bufor do lizy do testów western blot
Hettich Rotina 46R WirówkaHettichwycofana z produkcjiWirówka używana do usuwania zanieczyszczeń
Hettich Wirówka uniwersalna 32R HettichprodukcjiWirówka używana do wirowania koncentratora białek
Surowica końskaGibco16050-122Wysiew neuronów
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Nauki przyrodnicze29005063Western blot Akwizycja obrazu Western blot
ImidazolSigmaI55513Komponent modyfikacji bufora BDNF
KClWinklerBM-1370PBS
Komponent KH2PO4Merck104873PBS komponent
LamininInvitrogen23017-015Powłoka pokrywy dla neuronów podzielonych na przedziały
Adapter rurki Luer BioRad7323245Komponent aparatury chromatograficznej
Luminata™ Forte Western HRP SubstrateMilliporeWBLUF0100Wykrywanie białka przez western blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF bufor monobiotynylacyjny
Mowiol 4-88Calbiochem475904Odczynnik montażowy do testów immunofluorescencyjnych
MyOne C1 Streptawidyna Kulki magnetyczneInvitrogen65001Weryfikacja biotynylacji
Na2HPO4Merck106586Składnik modyfikacji bufora BDNF
NaClWinklerBM-1630PBS, składnik modyfikacji buforu BDNF
NaH2PO4Merck106346Składnik modyfikacji bufora BDNF
Podłoże neurobazoweGibco21103-049Konserwacja neuronów
Koraliki agarozowe Ni-NTAQiagen30210BDNF Oczyszczanie AviTag
Mikroskop Nikon Ti2-ENikonobrazowania fluorescencyjnego
Membrana nitrocelulozowaBioRad1620115Transfer białka do western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Cyfrowa kamera CMOSHamamatsuC13440-20CUKamera do obrazowania epifluorescencyjnego
P8340 Koktajl inhibitorów proteazySigmaP8340Składnik modyfikacji buforu BDNF
ParaformaldehydMerck104005Utrwalacz do testów immunofluorescencyjnych
Penicylina/StreptomycynaGibco15140-122Utrzymanie neuronów
Poli-D-LizynaCorningDLW354210Powłoka pokrywająca dla neuronów podzielonych na przedziały
Poli-L-LizynaMiliporaP2363Powłoka pokrywająca dla neuronów niepodzielonych na przedziały
Kolumna chromatograficzna Poly-PrepBioRad7311550Składnik aparatury chromatograficznej
Polietylenoimina 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 transfekcja
Kropki kwantowe 655 koniugat streptawidynyInvitrogenQ10121MPMonobiotynylowana etykieta BDNF AviTag do eksperymentów z żywymi i stałymi komórkami
SaponinSigmaS4521Detergent do testów immunofluorescencyjnych
Syldgard 184 silikonowa baza elastomerowaPoirot4019862Przygotowanie komory mikroprzepływowej
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE preparat żelowy
TrisWinklerBM-2000Składnik buforu do lizy
Triton X100Merck108603Permeabilizacja komórek w testach immunofluorescencyjnych i western blot
Trypsyna-EDTA 0,5%Gibco15400-054HEK293 pasażowanie
wycofana z do

Bibliografia

  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1(2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293(2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070(2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684(2015).
  14. Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899(2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493(2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
  24. Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77(2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie BDNFchromatografia powinowactwamonobiotynylacjaBDNF z jajowodukomórki HEK293enzym BirAkropki kwantowe streptawidynyneurony korowekomory mikrofluidyczneWestern blot
Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.