Artykuł metodologiczny

Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach

DOI:

10.3791/61262

⸱

11 lipca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinowany BDNF zawierający sekwencję Avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293 w opłacalny sposób i oczyszczany przez chromatografię powinowactwa. BDNFavi jest następnie bezpośrednio monobiotynylowany enzymem BirA w probówce. BDNFavi i monobiotynylowany BDNFavi zachowują swoją aktywność biologiczną w porównaniu z dostępnym na rynku BDNF.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinowany BDNF zawierający sekwencję Avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293, a następnie ekonomicznie oczyszczany przez chromatografię powinowactwa. Opracowano powtarzalny protokół bezpośredniego monobiotynylowania BDNFAvi enzymem BirA w probówce. W tej reakcji monobiotynylowany BDNFAvi zachowuje swoją aktywność biologiczną.

Neurotrofiny są czynnikami wzrostu pochodzenia docelowego, odgrywającymi rolę w rozwoju i utrzymaniu neuronów. Wymagają szybkich mechanizmów transportowych wzdłuż szlaku endocytarnego, aby umożliwić sygnalizację na duże odległości między różnymi przedziałami neuronalnymi. Opracowanie narzędzi molekularnych do badania transportu neurotrofin umożliwiło precyzyjne śledzenie tych białek w komórce za pomocą rejestracji in vivo. W tym protokole opracowaliśmy zoptymalizowaną i opłacalną procedurę produkcji monobiotynylowanego BDNF. Rekombinowany wariant BDNF zawierający biotynylowaną sekwencję avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293 w zakresie mikrogramów, a następnie oczyszczany w łatwo skalowalnej procedurze przy użyciu chromatografii powinowactwa. Oczyszczony BDNF może być następnie jednorodnie monobiotynylowany w bezpośredniej reakcji in vitro z enzymem BirA w probówce. Aktywność biologiczna monobiotynylowanego BDNF (mbtBDNF) może być sprzężona ze streptawidyną sprzężoną z różnymi fluoroforami. BDNFAvi i mbtBDNF zachowują swoją aktywność biologiczną, o której wykazano odpowiednio poprzez wykrywanie dalszych fosforylowanych celów za pomocą western blot i aktywacji czynnika transkrypcyjnego CREB. Korzystając z kropek kwantowych streptawidyny, byliśmy w stanie zwizualizować internalizację mbtBDNF towarzyszącą aktywacji CREB, którą wykryto za pomocą przeciwciała specyficznego dla fosfo-CREB. Ponadto mbtBDNF sprzężony ze streptawidyną-kropkami kwantowymi nadawał się do analizy transportu wstecznego w neuronach korowych hodowanych w komorach mikroprzepływowych. Tak więc wytwarzany w probówce mbtBDNF jest niezawodnym narzędziem do badania fizjologicznej dynamiki endosomów sygnalizacji i transportu w neuronach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony to funkcjonalne jednostki układu nerwowego posiadające złożoną i wyspecjalizowaną morfologię, która umożliwia komunikację synaptyczną, a tym samym generowanie skoordynowanych i złożonych zachowań w odpowiedzi na różne bodźce. Projekcje neuronalne, takie jak dendryty i aksony, są krytycznymi cechami strukturalnymi zaangażowanymi w komunikację neuronalną, a neurotrofiny odgrywają kluczową rolę w określaniu ich morfologii i funkcji1. Neurotrofiny to rodzina wydzielanych czynników wzrostu, która obejmuje NGF, NT-3, NT-4 i neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)2. W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) BDNF ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi CONICYT (Chilijska Narodowa Komisja Badań Naukowych i Technologicznych). Protokoły wykorzystane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komisje ds. Bezpieczeństwa Biologicznego oraz Bioetyki i Dobrostanu Zwierząt Pontificia Universidad Católica de Chile. Eksperymenty na kręgowcach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Bioetyki i Dobrostanu Zwierząt Pontificia Universidad Católica de Chile.

UWAGA: Poniższy protokół został opracowany do oczyszczania BDNFAvi z całkowitej objętości 500 ml kondycjonowanej pożywki wyprodukowanej w komórkach HEK293. Ilość kondycjon....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie protokołu opartego na kolumnach chromatograficznych pozwala na przetwarzanie znacznych ilości pożywek kondycjonowanych przez HEK293. W Rysunek 1, pokazane są wyniki oczyszczania BDNFAvi z 500 ml kondycjonowanych pożywek. Kolejne eluacje BDNFAvi z kulek agarozy Ni-NTA powodują zmniejszenie stężenia BDNFAvi (Rysunek 1A). Po czterech kolejnych elucjach (każda trwająca 15 minut) większość BDNF wychwyconego przez kulki jest odzyskiwana. Stężenia eluatów wahają się od 6 .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisano zoptymalizowaną metodologię produkcji i oczyszczania mbtBDNF w procedurze opartej na chromatografii powinowactwa, w oparciu o pracę Sunga i współpracowników17. Optymalizacje obejmują zastosowanie opłacalnego odczynnika do transfekcji (PEI) przy jednoczesnym zachowaniu wydajności droższych metod transfekcji, takich jak lipofektamina. Taka optymalizacja przekłada się na znaczne obniżenie kosztów w protokole, pozwalając na skalowalność przy zachowaniu wysokiej efektywności kosz.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od Fondecyt (1171137) (FCB), Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) oraz nagrody UK Dementia Research Institute Foundation (GS). Prace te były wspierane przez Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zawór 2-drogowyBioRad7328102Komponent aparatury chromatograficznej
2-merkaptoetanolSigmaM6250BDNF bufor elucyjny
Akrylamid/BisakryloamidBioRad1610154preparat żelowy SDS-PAGE
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024stężenie BDNF
Nadsiarczan amonuSigmaA9164SDS-PAGE preparat żelowy
przeciwciało anty B-III-tubulinaSigmaT8578Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF
przeciwciało anty BDNFAlomoneAGP-021Testy Western blot do oznaczania ilościowego BDNF
przeciwciało anty BDNFAlomoneANT-010Testy Western blot do oznaczania ilościowego BDNF
Komórka przeciwciała anty ERK Sygnalizacja9102Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF
przeciwciało anty pCREB (S133)Sygnalizacja komórkowa9198Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej przeciwciała
anty pERK BDNF (T202, Y204)Sygnalizacja komórkowa4370Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF
przeciwciało anty pTrkB (Y515)Abcamab109684Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF
Antybiotyk/Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyGibco15240-062HEK293 utrzymanie
ATPSigmaA26209BDNF bufor monobiotynylacyjny
B-27 SuplementGibco17504-044Utrzymanie neuronów
BicineSigmaB3876BDNF bufor monobiotynylacyjny
BirA-GSTBPS Bioscience70031Enzym do monobiotynylacji BDNF AviTag
Surowica bydlęca płoduHyCloneHC. SH30396.02HEK293 utrzymanie
Albumina surowicy bydlęcejJackson ImmunoResearch001-000-162Składnik modyfikacji buforu BDNF, bufor blokujący dla western blot i immunofluorescencji
D-BiotynaSigmaB4639Bufor monobiotynylacyjny BDNF
DMEM Medium o wysokiej zawartości glukozyGibco11965-092Neuron wysiewający
DMEM MediumGibco11995-081HEK293 konserwacja
Lejek kolumny EconoBioRad7310003Komponent aparatury chromatograficznej
EDTAMerck108418
Zestaw EZ-ECLPrzemysł biologiczny1633664Wykrywanie białek za pomocą western blotting
GlutamaxGibco35050-061Konserwacja Neuron i HEK293
GlicerolMerck104094Bufor elucyjny BDNF, bufor do lizy do testów western blot
Hettich Rotina 46R WirówkaHettichwycofana z produkcjiWirówka używana do usuwania zanieczyszczeń
Hettich Wirówka uniwersalna 32R HettichprodukcjiWirówka używana do wirowania koncentratora białek
Surowica końskaGibco16050-122Wysiew neuronów
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Nauki przyrodnicze29005063Western blot Akwizycja obrazu Western blot
ImidazolSigmaI55513Komponent modyfikacji bufora BDNF
KClWinklerBM-1370PBS
Komponent KH2PO4Merck104873PBS komponent
LamininInvitrogen23017-015Powłoka pokrywy dla neuronów podzielonych na przedziały
Adapter rurki Luer BioRad7323245Komponent aparatury chromatograficznej
Luminata™ Forte Western HRP SubstrateMilliporeWBLUF0100Wykrywanie białka przez western blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF bufor monobiotynylacyjny
Mowiol 4-88Calbiochem475904Odczynnik montażowy do testów immunofluorescencyjnych
MyOne C1 Streptawidyna Kulki magnetyczneInvitrogen65001Weryfikacja biotynylacji
Na2HPO4Merck106586Składnik modyfikacji bufora BDNF
NaClWinklerBM-1630PBS, składnik modyfikacji buforu BDNF
NaH2PO4Merck106346Składnik modyfikacji bufora BDNF
Podłoże neurobazoweGibco21103-049Konserwacja neuronów
Koraliki agarozowe Ni-NTAQiagen30210BDNF Oczyszczanie AviTag
Mikroskop Nikon Ti2-ENikonobrazowania fluorescencyjnego
Membrana nitrocelulozowaBioRad1620115Transfer białka do western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Cyfrowa kamera CMOSHamamatsuC13440-20CUKamera do obrazowania epifluorescencyjnego
P8340 Koktajl inhibitorów proteazySigmaP8340Składnik modyfikacji buforu BDNF
ParaformaldehydMerck104005Utrwalacz do testów immunofluorescencyjnych
Penicylina/StreptomycynaGibco15140-122Utrzymanie neuronów
Poli-D-LizynaCorningDLW354210Powłoka pokrywająca dla neuronów podzielonych na przedziały
Poli-L-LizynaMiliporaP2363Powłoka pokrywająca dla neuronów niepodzielonych na przedziały
Kolumna chromatograficzna Poly-PrepBioRad7311550Składnik aparatury chromatograficznej
Polietylenoimina 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 transfekcja
Kropki kwantowe 655 koniugat streptawidynyInvitrogenQ10121MPMonobiotynylowana etykieta BDNF AviTag do eksperymentów z żywymi i stałymi komórkami
SaponinSigmaS4521Detergent do testów immunofluorescencyjnych
Syldgard 184 silikonowa baza elastomerowaPoirot4019862Przygotowanie komory mikroprzepływowej
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE preparat żelowy
TrisWinklerBM-2000Składnik buforu do lizy
Triton X100Merck108603Permeabilizacja komórek w testach immunofluorescencyjnych i western blot
Trypsyna-EDTA 0,5%Gibco15400-054HEK293 pasażowanie
wycofana z do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie BDNFchromatografia powinowactwamonobiotynylacjaBDNF z jajowodukom rki HEK293enzym BirAkropki kwantowe streptawidynyneurony korowekomory mikrofluidyczneWestern blot

Powiązane artykuły