Kalibracja i użycie mikrocewki MRM zademonstrowane na korzeniach pałki Medicago przy 22 tach

Podsumowanie

Przedstawiono protokół badania tkanki biologicznej w wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą mikroskopii rezonansu magnetycznego o ultrawysokim polu (MRM) przy użyciu mikrocewek. Znajdują się instrukcje krok po kroku dotyczące charakteryzowania mikrocewek. Na koniec zademonstrowano optymalizację obrazowania na korzeniach roślin.

Streszczenie

Ten protokół opisuje metodę kalibracji stosunku sygnału do szumu (SNR) i przygotowania próbki dla mikrocewek solenoidalnych w połączeniu z próbkami biologicznymi, przeznaczoną do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) o wysokiej rozdzielczości, określanego również jako mikroskopia MR (MRM). Może być stosowany w przedklinicznych spektrometrach MRI, demonstrowanych na próbkach korzenia Medicago truncatula. Mikrocewki zwiększają czułość poprzez dopasowanie wielkości rezonatora RF do wielkości próbki będącej przedmiotem zainteresowania, umożliwiając w ten sposób uzyskanie wyższych rozdzielczości obrazu w danym czasie akwizycji danych. Ze względu na stosunkowo prostą konstrukcję, mikrocewki elektromagnetyczne są proste i tanie w budowie oraz można je łatwo dostosować do wymagań próbki. Systematycznie wyjaśniamy, jak kalibrować nowe lub zbudowane w domu mikrocewki przy użyciu rozwiązania referencyjnego. Etapy kalibracji obejmują: określenie mocy impulsu za pomocą krzywej nutacji; oszacowanie jednorodności pola RF; oraz obliczanie znormalizowanego głośności stosunku sygnału do szumu (SNR) przy użyciu standardowych sekwencji impulsów. Omówiono ważne etapy przygotowania próbek do małych próbek biologicznych, a także możliwe czynniki łagodzące, takie jak różnice w podatności magnetycznej. Zastosowania zoptymalizowanej cewki elektromagnetycznej są demonstrowane przez obrazowanie 3D próbki głównej w wysokiej rozdzielczości (13 x 13 x 13 μm³, 2,2 pL).

Wprowadzenie

Rezonans magnetyczny to wszechstronne narzędzie do nieinwazyjnego obrazowania szerokiej gamy próbek biologicznych, począwszy od ludzi, a skończywszy na pojedynczych komórkach^1,2,3. Podczas gdy skanery MRI do zastosowań w obrazowaniu medycznym zazwyczaj wykorzystują magnesy o natężeniu pola od 1,5 T do 3 T, aplikacje jednokomórkowe są obrazowane przy znacznie wyższym natężeniu pola^1,3,4. Badanie próbek w rozdzielczościach poniżej stu mikrometrów określa się mianem mikroskopii rezonansu magnetycznego (MRM)⁵. Jednak MRM cierpi na niski stosunek sygnału do szumu (SNR) w porównaniu z innymi dostępnymi technikami mikroskopii lub obrazowania (np. mikroskopią optyczną lub tomografią komputerową). Można zastosować kilka podejść do optymalizacji SNR⁶. Jednym z podejść jest zastosowanie pola magnetycznego o wyższym natężeniu, podczas gdy podejście uzupełniające polega na optymalizacji detektora sygnału dla poszczególnych próbek. W tym drugim przypadku wymiary detektora należy dostosować tak, aby odpowiadały wymiarom próbki będącej przedmiotem zainteresowania. W przypadku małych próbek o średnicy ≈0,5-2 mm (np. tkanek korzeniowych) przydatne są mikrocewki, ponieważ SNR jest odwrotnie proporcjonalny do średnicy cewki^6,7. Rozdzielczości do 7,8 x 7,8 x 15^μm3 zostały osiągnięte na komórkach zwierzęcych za pomocą dedykowanych mikrocewek⁸. Istnieje wiele typów mikrocewek, przy czym cewki płaskie i elektromagnetyczne są najczęściej używane w zależności od zastosowania i geometrii tkanki⁹. Cewki planarne mają wysoką czułość blisko ich powierzchni, co jest przydatne do zastosowań na cienkich plasterkach. Na przykład metoda zaprojektowana specjalnie do obrazowania perfundowanej tkanki została opisana dla płaskich mikrocewek¹⁰. Jednak cewki planarne charakteryzują się wysokim spadkiem czułości i nie mają dobrze zdefiniowanej mocy impulsu odniesienia. Cewki elektromagnetyczne, będące cylindryczne, mają szerszy obszar zastosowania i są bardziej preferowane w przypadku grubszych próbek. W tym miejscu opisujemy charakterystykę cewki elektromagnetycznej, protokół przygotowania próbek do rezonansu magnetycznego mikrocewki, a także kalibrację mikrocewki elektromagnesu (Rysunek 1A).

Cewka elektromagnesu składa się z drutu przewodzącego zwiniętego, jak korkociąg, wokół kapilary przytrzymującej próbkę (Rysunek 1B). Zespoły mikrocewek mogą być konstruowane wyłącznie przy użyciu emaliowanego drutu miedzianego, asortymentu kondensatorów i odpowiedniej podstawy do komponentów (Rysunek 1B). Głównymi zaletami są prostota i niski koszt w połączeniu z dobrymi parametrami wydajności pod względem SNR na jednostkę objętości i jednorodności pola B₁. Łatwość konstrukcji umożliwia szybką iterację projektów i geometrii cewek. Szczegółowe wymagania dotyczące projektowania mikrocewek elektromagnetycznych i charakterystyki sondy (tj. teoria elektroniki, pomiary na stanowisku warsztatowym i pomiary spektrometru dla różnych geometrii cewek) zostały obszernie opisane w innym miejscu^{7,11,12,13,14}.

Cewkę elektromagnetyczną można zbudować, pamiętając o zasadach projektowania dla pożądanych wymiarów zgodnie z wytycznymi opisanymi gdzie indziej^15,16. W tym konkretnym przypadku zastosowano cewkę o średnicy wewnętrznej 1,5 mm, wykonaną z emaliowanego drutu miedzianego o średnicy 0,4 mm, zapętlonego wokół kapilary o średnicy zewnętrznej 1,5 mm. Ten elektromagnes jest utrzymywany na płycie podstawy, na której wykonany jest obwód, składający się z kondensatora strojeniowego (2,5 pF), kondensatora o zmiennym dopasowaniu (1,5-6 pF) oraz miedzianych przewodów łączących (Rysunek 1A, 1C). Kondensator strojeniowy dobiera się tak, aby osiągnąć pożądaną częstotliwość rezonansową 950 MHz, natomiast kondensator dopasowujący dobiera się tak, aby osiągnąć maksymalną transmisję sygnału przy impedancji 50 Ohm. Większy kondensator jest zmienny, aby umożliwić dokładniejszą regulację. W normalnej pracy strojenie i dopasowywanie odbywa się za pomocą kondensatorów w podstawie sondy. Zmontowaną mikrocewkę należy zamontować na sondzie, aby można ją było włożyć do magnesu. W zależności od systemu może być wymagany dodatkowy uchwyt. Tutaj używamy kombinacji magnesu 22,3 T z konsolą Bruker Avance III HD w połączeniu z sondą Micro5. W tym przypadku zastosowaliśmy zmodyfikowaną wkładkę wsporczą wyposażoną w niezbędne przyłącza do podłączenia do kanału ¹H sondy (Rysunek 1A).

Dopasowany do podatności projekt cewki zawiera zbiornik z perfluorowaną cieczą, aby zmniejszyć niedopasowania podatności, wynikające z tego, że cewka miedziana znajduje się w bliskiej odległości od próbki¹⁷. Zbiornik został wykonany z plastikowej strzykawki do zamknięcia cewki i wypełniony fombliną. Ponieważ perfluorowana ciecz musi otaczać cewkę, dostępna średnica próbki jest zmniejszana do średnicy zewnętrznej 1 mm. W celu ułatwienia wymiany próbki przygotowano w kapilarze o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 700 μm. Niezbędne narzędzia do przygotowania próbki są pokazane w Rysunek 2A.

Podstawowe parametry eksperymentalnego MR są w dużym stopniu zależne od sprzętu używanego systemu, w tym systemu gradientu, natężenia pola i konsoli. Do opisania wydajności systemu można użyć kilku parametrów, z których najbardziej praktyczne znaczenie mają długość i moc impulsu 90°, jednorodność B₁ i SNR na jednostkę objętości (SNR/mm³). SNR/mm³ jest przydatny do porównywania wydajności różnych cewek w tym samym systemie¹⁸. Chociaż mogą istnieć różnice sprzętowe między systemami, jednolite stosowanie protokołu testów porównawczych ułatwia również porównywanie wydajności systemu.

Ten protokół skupia się na kalibracji i przygotowaniu próbki. Przedstawiono stopniową charakterystykę działania mikrocewek elektromagnetycznych: kalibracja długości lub mocy impulsu 90°; ocena jednorodności pola RF; i obliczanie SNR na jednostkę objętości (SNR/mm³). Opisano znormalizowany pomiar echa spinowego za pomocą fantomu, aby ułatwić porównanie konstrukcji cewek, co pozwala na optymalizację różnych zastosowań. Opisano preparaty próbek fantomowych i biologicznych, specyficzne dla mikrozwojów. Protokół ten może być zaimplementowany na dowolnym odpowiednim magnesie pionowym o wąskim otworze (≤60 mm) wyposażonym w dostępny na rynku system mikroobrazowania. W przypadku innych systemów może służyć jako wskazówka i może być używany z pewnymi korektami.

Przygotowanie próbki biologicznej do pomiarów MRI zazwyczaj nie jest zbyt obszerne, ponieważ próbka jest obrazowana w jak najbardziej nienaruszonym stanie. Jednak przestrzenie powietrzne w tkance biologicznej mogą powodować artefakty obrazu ze względu na różnice w podatności magnetycznej¹⁹. Efekt ten nasila się wraz ze wzrostem natężenia pola magnetycznego²⁰. W związku z tym należy unikać przestrzeni powietrznych o dużym natężeniu pola, co może wymagać zanurzenia próbki w płynie, aby uniknąć przepływu powietrza wokół tkanki i usunięcia przestrzeni powietrznych w strukturach tkanki. W szczególności, gdy stosowane są mikrocewki, może być wymagane wycięcie pożądanej tkanki próbki, a następnie zanurzenie jej w odpowiednim płynie. Następnie wprowadza się próbkę do wstępnie wyciętej kapilary, a na koniec uszczelnia kapilarnę woskiem kapilarnym. Użycie wosku jako uszczelniacza zamiast kleju, uszczelniania płomieniowego lub alternatyw oznacza, że próbkę można łatwo usunąć. Ta procedura jest pokazana na korzeniu Medicago truncatula, małej rośliny strączkowej. Zaletą tego protokołu jest możliwość późniejszej jednoczesnej rejestracji danych MRI z mikroskopią optyczną, ponieważ próbka nie jest niszczona podczas pomiaru MRI.

Prezentowany protokół nadaje się do pomiarów in situ o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, a bardziej skomplikowane projekty mogłyby pozwolić na obrazowanie próbek in vivo, gdzie trzeba byłoby rozwiązać problemy związane z systemami podtrzymywania życia.

Protokół

UWAGA: Ten protokół opisuje procedury użytkowania i oceny charakterystyki cewki elektromagnetycznej o średnicy wewnętrznej (ID) 1,5 mm (Rysunek 1). Cewka używana do zademonstrowania protokołu jest umieszczona w zbiorniku dopasowanym do podatności, ale protokół ma również zastosowanie do niedopasowanych cewek. Protokół może być dostosowany do innych rozmiarów i różnych konfiguracji spektrometru.

1. Przygotowanie próbki referencyjnej

1. Aby przygotować 100 ml roztworu odniesienia dla czułości, rozpuścić 156,4 mg CuSO₄ ∙ 5 H₂O w 80 ml_D2Ozawartego w kolbie GL45 o pojemności 100 ml. Siarczan miedzi skraca zarówno czas relaksacji _T1, jak i T2, umożliwiając szybsze pomiary, podczas gdy_D2Ozapobiega tłumieniu promieniowania i efektom nasycenia. Mieszaj ręcznie, aż ciała stałe całkowicie się rozpuszczą.
   1. Dostosuj objętość do 100 ml za pomocą wody dejonizowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 1 g/l CuSO₄ (bezwodne, 6,3 mM). Stężenie to jest wystarczające do skrócenia relaksacji T1 i T2, ale nie jest zbyt wysokie, aby miało wpływ na nie opady. Uszczelnić próbkę referencyjną, aby zapobiec zmianie stosunku_H2O:_D2O.
2. Opcjonalnie podłącz sondę do analizatora sieci, aby sprawdzić, czy cewka rezonuje z żądaną częstotliwością rezonansową. Wykonaj test współczynnika odbicia S₁₁, aby zmierzyć zakres częstotliwości uzyskany przez strojenie oraz dla pomiarów współczynnika Q, jak szczegółowo opisano przez Haase et al.¹⁴. Podłącz mikrocewkę do analizatora sieci za pomocą koncentrycznego. W razie potrzeby użyj adaptera BNC.
   1. Ustaw częstotliwość środkową w analizatorze sieci na żądaną częstotliwość rezonansową, w zależności od zamierzonego natężenia pola magnetycznego, dla którego zaprojektowano cewkę. Następnie ustaw szerokość przemiatania na 10 MHz. Wyreguluj zmienny kondensator na zespole mikrocewki, jeśli jest obecny, aby precyzyjnie dostroić spadek odbicia do żądanej częstotliwości.
   2. Zapisz poziom odbicia przy częstotliwości środkowej oraz częstotliwość f₁ i f₂ przy poziomie -7 dB. Użyj ich, aby obliczyć współczynnik Q na poziomie -7 dB zgodnie z Haase i wsp.¹⁴

2. Przygotowanie próbki

1. W przypadku przygotowywania próbki referencyjnej do kalibracji cewki należy przenieść 1 ml roztworu_CuSO4 do szklanej czaszy zegarka pod mikroskopem stereoskopowym.
2. W przypadku przygotowywania próbki biologicznej należy przenieść 1 ml perfluorodekaliny (PFD) do szkiełka zegarka pod mikroskopem stereoskopowym, który zostanie użyty do zanurzenia próbki. PFD jest stosowany, ponieważ może wypełniać przestrzenie powietrzne w próbce, bez wnikania do komórek biologicznych. Nie jest również obserwowalny za pomocą protonowego rezonansu magnetycznego. Natychmiast przykryj szkiełko zegarka pokrywką z szalki Petriego, aby zapobiec utracie parowania, zanim PFD będzie potrzebny.
   UWAGA: PFD jest bardzo lotnym i silnym długoterminowym gazem cieplarnianym²¹. Gdy jego właściwości rozpuszczania tlenu i niska lepkość nie są wymagane, można go zastąpić Fomblinem, perfluoroeterem, który również nie daje obserwowalnego sygnału ¹H, ale nie odparowuje tak szybko¹⁷.
3. Przytnij kapilary o odpowiedniej średnicy zewnętrznej na wymiar, aby zmieściły się w średnicy uchwytu mikrocewki (18 mm) i umożliwiły zmianę położenia (Rysunek 1C). Za pomocą ceramicznego noża wykonaj nacięcie co 10-12 mm i ostrożnie złamij w miejscu nacięcia.
4. Przygotowując próbkę referencyjną, użyj pęsety i mikroskopu stereoskopowego, aby wstępnie nacięta kapilara zetknęła się z powierzchnią roztworu CuSO₄ wewnątrz szkiełka zegarka, umożliwiając działanie kapilarne w celu wypełnienia kapilary.
5. Przygotowując próbkę biologiczną, użyj pęsety i mikroskopu stereoskopowego, aby wstępnie wycięta kapilara zetknęła się z powierzchnią PFD wewnątrz szkiełka zegarka, umożliwiając działanie kapilarne w celu pełnego wypełnienia kapilary. Zwolnij kapilar do szkiełka zegarka, aby był całkowicie zanurzony.
   1. Ostrożnie wyodrębnij pięciotygodniowy cały system korzeniowy z jego podłoża wzrostowego, takiego jak zamiennik gleby z perlitu. Skrupulatnie oczyść próbkę korzenia z pochewki ryzoowej. Usuń duże cząstki gleby za pomocą pęsety, a jeśli obecne są mniejsze cząstki, usuń je, myjąc system korzeniowy wodą destylowaną. Zdjęcie w razie potrzeby do wykorzystania w przyszłości. Wybierz i wytnij niewielką część włóknistego korzenia wolnego od pochewki ryzoowej za pomocą skalpela.
   2. W celu obróbki próżniowej należy umieścić próbkę w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej odpowiedni roztwór utrwalający. Pozostaw nakrętkę probówki zdjętą, a następnie uszczelnij probówkę parafilmem, aby uszczelnić otwór tuby. Następnie przebij otwory w folii ostrym narzędziem, aby umożliwić wentylację rurki.
   3. Umieść probówkę z próbką w komorze próżniowej, uszczelnij komorę i podłącz laboratoryjną membranową pompę próżniową do komory. Próbkę należy poddać obróbce próżniowej przez okres do 30 minut, aby zmniejszyć obecność kieszeni powietrznych w próbkach biologicznych. Zatrzymaj obróbkę próżniową, gdy nie zauważysz żadnych pęcherzyków powietrza wydostających się z próbki.
   4. Patrząc przez mikroskop stereoskopowy, za pomocą pęsety zanurz próbkę w przygotowanym wcześniej medium infiltracyjnym. Umyj próbkę z potencjalnych zanieczyszczeń.
   5. Włożyć próbkę do kapilary za pomocą pęsety, podczas gdy zarówno kapilara, jak i próbka są całkowicie zanurzone, aby uniknąć wtrącenia pęcherzyków powietrza. Użyj mniejszej końcówki igły kapilarnej lub strzykawki jako popychacza (Rysunek 2B).
   6. Pobrać kapilarę próbki z pożywki ze szkiełka zegarka za pomocą pęsety. W przypadku PFD przykryć pokrywę szalki Petriego.
6. Uformuj bibułę w drobny punkt i użyj jej do usunięcia około 1 mm płynu z obu końców kapilary.
7. Rozpuść niewielką objętość wosku kapilarnego za pomocą pisaka do wosku. Nałóż wosk po obu stronach. Wosk stanie się nieprzezroczysty po zestaleniu. Uważaj, aby wykluczyć pęcherzyki powietrza z kapilary (Rysunek 2C).
   UWAGA: Unikaj przegrzewania wosku lub kapilary, ponieważ może to spowodować wybuchowe odparowanie, a także kieszenie kawitacyjne, gdy gotowa próbka ostygnie.
8. Następnie zeskrob nadmiar wosku z zewnętrznej strony kapilary za pomocą skalpela i wytrzyj do czysta drobną bibułą.

3. Montowanie próbki

1. Umieść mikrocewkę pod mikroskopem stereoskopowym i włóż próbkę za pomocą pęsety, utrzymując mikrocewkę stabilnie (Rysunek 2D).
2. Użyj pręta, aby wyśrodkować próbkę w mikrozwoju, wsuwając kapilar do cewki elektromagnetycznej.
3. Opcjonalnie należy nałożyć taśmę klejącą, aby ustalić położenie kapilary.
4. Sprawdź kapilarę, aby upewnić się, że wewnątrz cewki elektromagnesu nie są widoczne pęcherzyki powietrza, aby uniknąć zniszczenia sygnału MR spowodowanego różnicami podatności.
5. Przymocuj mikrocewkę do gniazda podstawy sondy, trzymając mikrocewkę w pozycji pionowej (Rysunek 3A,3B).
6. Ostrożnie nasuń trójosiowe cewki gradientowe na mikrocewkę, dopasowując złącza chłodzenia wodą gradientu do złącza podstawy sondy (Rysunek 3C). Przekręć gwint na podstawie sondy, aby zamocować gradient na miejscu.
   UWAGA: Ten krok dotyczy tylko sondy Micro5. W przypadku innych systemów, takich jak Micro2.5 lub Biospect, gradienty znajdują się na osobnym gnieździe niż cewka.

4. Określanie charakterystyki cewki

1. Jeśli cewka jest testowana po raz pierwszy, należy użyć roztworu próbki referencyjnej, aby utworzyć jednorodną próbkę, która jest przydatna do kalibracji mocy i testów jednorodności B₁. Potencjalne problemy z podatnością spowodowane drutami cewki można łatwo przetestować za pomocą tej próbki referencyjnej.
2. Włóż sondę do magnesu i podłącz niezbędne: nadawczo-odbiorczy RF, przewody chłodzenia wodnego, termopary i przewód chłodzenia powietrzem.
3. Ustaw żądaną temperaturę chłodzenia wodą (zalecana 298 K) dla agregatu chłodzącego wodę.
4. Ustawić temperaturę docelową (298 K) i docelowy przepływ gazu (300 l/h). Przepływ gazu może być różny dla różnych konstrukcji wężownicy lub objętości próbki. Dotyczy to tylko systemów z systemem kontroli temperatury.
   UWAGA: Kolejne kroki są konieczne tylko w przypadku testowania nowych (domowych) cewek.
5. Podłącz sondę za pomocą koncentrycznego o długości 50 Ω do analizatora sieci o odpowiednio szerokiej szerokości przemiatania (400 MHz), wyśrodkowanej na zamierzonej częstotliwości rezonansowej.
6. Obserwuj tryby rezonansowe, regulując zmienne kondensatory dopasowujące i strojące, które są obecne w podstawie sondy.
7. Dostosuj i dopasuj tryb rezonansowy do żądanej częstotliwości.
8. Opcjonalnie należy określić współczynnik jakości cewki (współczynnik Q) w analizatorze sieci. Jedną z metod uzyskania współczynnika jakości jest użycie sieci sprzęgającej i podzielenie częstotliwości środkowej (f_c) przez szerokość spadku odbicia przy -7 dB (tj. Q = _{f c} /(f₁ - f₂)¹⁴. Ustaw f_c na częstotliwość roboczą magnesu, podczas gdy f₁ i f₂ są ustawione odpowiednio na -7 dB po lewej i prawej stronie f_c. Niektóre analizatory sieci mają wbudowane określanie współczynnika Q.
9. Zainicjuj test odbicia na skanerze, zwykle nazywany krzywą chybotania, i w razie potrzeby dostosuj strojenie i dopasowanie. Zaleca się ustawienie wszelkich kondensatorów strojących i dopasowujących do środka ich zakresu dla nowych cewek. Dlatego zacznij od dużej szerokości przeciągnięcia spektralnego. W niektórych przypadkach wygodniejsze może być dostrojenie i dopasowanie cewki na zewnątrz magnesu w analizatorze sieci.
10. Wybierz plik podkładki regulacyjnej dla największej cewki objętościowej sondy obrazowej, jeśli jest dostępna. Jeśli zaczynasz od zwoju, który był wcześniej używany, użyj dostępnego pliku podkładki. Jeśli obie opcje nie są dostępne, zacznij od wartości wszystkich podkładek ustawionych na 0.
11. Wybierz odpowiednią konfigurację cewki dla mikrocewki, jeśli jest ona dostępna w oprogramowaniu do obrazowania (np. ParaVision). W przeciwnym razie utwórz nową konfigurację cewki pasującą do specyfikacji cewki (np. pojedynczo strojona lub podwójnie dostrojona) zgodnie z instrukcją systemu. Szacunkowe granice bezpieczeństwa dla tej mikrocewki elektromagnetycznej użytej w tych badaniach o średnicy wewnętrznej 1,5 mm wynoszą 1 ms przy mocy szczytowej 1 W i mocy ciągłej 1 mW.
    UWAGA: Małe kondensatory (zwykle o wielkości 1 mm) potrzebne do mikrocewek są bardzo czułe i łatwo ulegają uszkodzeniu przez wysokie napięcie. Automatyczne określanie mocy impulsu może nie działać w przypadku niestandardowych cewek, a zbyt wysokie moce mogą spowodować uszkodzenie cewki lub innych części spektrometru. Dlatego zalecane są ręczne regulacje.
12. Zapisz krzywą nutacyjną dla nowej cewki, aby uzyskać wskazanie prawidłowej mocy RF dla cewki (Rysunek 4). W przypadku, gdy bezpieczne granice cewki są nieznane, zacznij od 10 μs przy niskiej mocy impulsu 0,6 W i powoli zwiększaj długości impulsów o 1 μs na raz, aż pojawi się sygnał.
    1. Korzystając z eksperymentu FID przy braku kodowania gradientowego, systematycznie zmieniaj długość impulsu RF, utrzymując stałą moc impulsu. Idealna długość impulsu to długość impulsu, w której intensywność sygnału osiąga maksimum. Jeśli testujesz nową cewkę, najpierw użyj impulsu 10 μs o bardzo niskiej mocy i zacznij stopniowo zwiększać moc impulsu.
       UWAGA: W przypadku, gdy moc jest znacznie wyższa niż oczekiwano dla kombinacji charakterystyki cewki i spektrometru, jest to już wskazówka, że wybrano niewłaściwy tryb rezonansowy.
    2. W przypadku cewki o jednorodnym polu B₁, takiej jak cewka elektromagnetyczna, wyznacz impuls 180°, w którym intensywność sygnału spada do zera²².
13. Ustaw wyznaczoną moc impulsu 90° na karcie regulacji utworzonego badania. W ParaVision karta regulacji mocy referencyjnej może być użyta do wprowadzenia mocy impulsu twardego.
14. Użyj skanowania lokalizatora z 3 plasterkami, po jednym plasterku w każdej z trzech głównych osi, aby zlokalizować położenie cewki w magnesie. W tym celu należy załadować skan lokalizatora z domyślnej biblioteki spektrometru. Zaleca się rozpoczęcie od dużego pola widzenia bez odsunięcia. Wykonaj automatyczną regulację wzmocnienia odbiornika i ręcznie rozpocznij pomiar.
    UWAGA: Jeśli próbka znajduje się dokładnie w środku układu gradientu, skanowanie lokalizatora pokaże próbkę. Jeśli cewka lub próbka nie jest wyśrodkowana w warstwach obrazu lub jej brakuje, skanowanie lokalizatora musi zostać dostosowane, w takim przypadku należy ponownie wykonać krok 4.12.
15. Alternatywnie możesz skorzystać z komplementarnego sposobu, aby znaleźć prawidłowy impuls 90° na podstawie oceny obrazu. Po znalezieniu przybliżonej mocy impulsu za pomocą krzywej nutacji, stopniowo dostosowuj moce impulsów, aby sprawdzić obraz pod kątem jednorodności pola B₁. W przypadku niektórych cewek z niejednorodnym polem B1 moc impulsu 90° określona za pomocą krzywej nutacji może być zawyżona, co prowadzi do przechylenia w pożądanym słodkim miejscu cewki. W takim przypadku zmniejsz moc impulsu referencyjnego i porównaj nowe obrazy z poprzednimi obrazami (Rysunek 5).
16. Ręcznie podkładka pod pole magnetyczne na podstawie sygnału FID. Zalecana kolejność początkowego podkładkowania to Z-Z 2-Z-X-Y-Z-Z 2-Z-XY-XZ-YZ-Z. W przypadku elektromagnesu główna oś symetrii znajduje się w płaszczyźnie XY. W związku z tym podkładki regulacyjne w różnych kierunkach mogą skutkować silniejszą korektą jednorodności B₀ dla tej konfiguracji cewki. Podkładki regulacyjne wyższego rzędu mają niewielki wpływ i mogą być ignorowane.
17. Oblicz stosunek sygnału do szumu znormalizowany objętościowo, aby umożliwić porównanie charakterystyk mikrocewek w różnych systemach, zaadaptowanych z protokołu producenta¹⁸. Dla zastosowanych tu mikrocewek zastosowaliśmy sekwencję spin-echo o następujących parametrach: pole widzenia (FOV) 6 mm x 6 mm, czas powtarzania (TR) 1000 ms, czas echa (TE) 7 ms, matryca 256 x 256 i grubość warstwy = 0,5 mm. Dostosuj grubość plasterka, aż wzmocnienie odbiornika będzie jednolite. Następnie dostosuj liczbę wycinków tak, aby wykraczały poza obszar jednorodności pola B₁. Jeśli to możliwe, nagrywaj obrazy bez uśredniania sygnału.
    1. Określ znormalizowany stosunek sygnału do szumu (SNR/mm³) w dwóch krokach. Najpierw oblicz głośność woksela (V_woksel)(Równanie 1):
       (1)
       UWAGA: Jednostki _{dla plasterka} D_x, D_y i D są w mm. To obliczenie można również wykonać dla serii wycinków.
    2. Wybierz obszary zainteresowania, aby określić intensywność sygnału (μ_ROI) próbki oraz intensywność sygnału (_szum μ) i odchylenie standardowe (_szum σ) dla obszaru poza próbką (tj. szumu). Średni sygnał jest pobierany ze środka obrazu, podczas gdy sygnał szumu jest obliczany z łatek narożnych (Rysunek 6). Do obliczeń tych można użyć oprogramowania sterującego spektrometrem lub oprogramowania do przetwarzania obrazu ogólnego przeznaczenia. Jeśli to możliwe, użyj pojedynczego powtórzenia, aby zachować porównywalność między różnymi cewkami.
    3. Wartości te służą do obliczania znormalizowanego stosunku sygnału do szumu (równanie 2):
       (2)
       Dla cewki użytej tutaj w połączeniu z roztworem odniesienia, użycie równania 2 daje następujący roztwór:
       (3)
       UWAGA: Porównując SNR cewek o różnym natężeniu pola magnetycznego, należy zmierzyć właściwości relaksacyjne fantomu²³, chyba że używany jest bardzo długi czas powtarzania i bardzo krótki czas echa.
18. Sprawdź, czy nie występują problemy z podatnością spowodowane niejednorodnością pola magnetycznego: załaduj i uruchom sekwencję wielokrotnego echa gradientowego (MGE) (Rysunek 7). Niejednorodności pola magnetycznego wynikające z różnic podatności są widoczne na obrazach o dłuższych czasach echa, ponieważ echo gradientowe nie skupia się ponownie na spinach, które zanikają z powodu niejednorodności pola statycznego. W ten sposób można uwidocznić niejednorodności w próbce (wynikające z przestrzeni powietrznych w próbce), a także niejednorodności pola B₀ wprowadzone przez materiał cewki. Należy zastosować następujące parametry, które należy dostosować w zależności od specyfikacji zastosowanego spektrometru i cewki: TR 200 ms, TE 3,5 ms z 48 echami oddalonymi od siebie o 3,5 ms, kąt odwrócenia 30 stopni. Rozmiar matrycy 128 x 128,
    UWAGA: Jeśli na krzywej rezonansowej (chybotania) zaobserwowano wiele (potencjalnych) modów rezonansowych lub spadków odbicia, powtórz powyższe kroki dla każdego trybu rezonansowego, aby określić najbardziej czuły. W zależności od mikrocewki, różne części zespołu mikrocewki mogą być podatne na niezamierzone tryby rezonansu.

5. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości

1. Przeprowadź eksperyment 3D-FLASH z następującymi parametrami: TR 70 ms, TE 2,5 ms, rozmiar matrycy 128 x 64 x 64, FOV 1,6 x 0,8 x 0,8 mm, kąt obrotu 30° i szerokość pasma odbiornika 50 kHz.
2. Moc impulsu należy wyprowadzić z określonej wcześniej mocy impulsu referencyjnego; w większości programów do obrazowania odbywa się to automatycznie. Określ wzmocnienie odbiornika za pomocą automatycznych regulacji. W razie potrzeby dostosuj pole widzenia, pokrywając cały obiekt w obu kierunkach kodowania fazy, aby uniknąć aliasingu. Uruchom symulację gradientowego cyklu pracy, jeśli jest dostępna w systemie, aby sprawdzić, czy cykl pracy eksperymentu pozostaje w zakresie specyfikacji cewek gradientowych.
   UWAGA: Te parametry są specyficzne dla cewki używanej do demonstracji; Ważne jest, aby zoptymalizować pod kątem lokalnej specyfiki systemu.

6. Odzyskiwanie próbek do dalszych badań lub przechowywania

1. Usunąć kapilar próbki z mikrocewki.
2. Za pomocą pęsety usuń korki woskowinowe pod mikroskopem stereoskopowym.
3. Za pomocą strzykawki wypłukać próbkę z kapilary wybranym roztworem. Alternatywnie można użyć szklanego popychacza, aby wyrzucić próbkę.
4. Aby zapobiec odwodnieniu próbki, należy ją przechowywać w odpowiednim podłożu do przechowywania.

Wyniki

Charakterystyka cewki
Po pomyślnym dostrojeniu i dopasowaniu cewki, jej wydajność można scharakteryzować za pomocą współczynnika Q cewki, impulsu odniesienia 90° i SNR/mm³. W przypadku pokazanej tutaj cewki elektromagnetycznej o dopasowanej podatności ID 1,5 mm zmierzony współczynnik Q (nieobciążony) wynosił 244, w porównaniu do 561 dla cewki z klatką dla ptaków o średnicy 5 mm.

Referencyjny impuls 90° wynosił 12 μs przy poziomie mocy 0,6 W; por. 5 μs przy 45 W dla cewki klatki dla ptaków 5 mm (Rysunek 4 i Rysunek 5). Odpowiada to natężeniu pola impulsowego RF (B₁), przy użyciu 0,53 mT dla mikrocewki i 1,17 mT dla cewki klatki dla ptaków¹⁴, gdzie y jest stosunkiem żyromagnetycznym, a tau jest czasem trwania impulsu. Ponieważ poziomy mocy impulsów (P) są różne, cewki mogą być porównywane pod względem wydajności nadawania : 0,69 mT/W^1/2 i 0,18 mT/W^1/2 odpowiednio dla mikrocewki i klatki dla ptaków¹⁴. Porównując impuls 90°, okazuje się, że mikrocewka jest czynnikiem ≈ 4 razy bardziej czułym niż cewka klatki dla ptaków.

Efekt dopasowania podatności
Przy bardzo wysokich natężeniach pola, podatność próbki i cewki staje się dominującym czynnikiem wpływającym na jakość obrazu, co widać na Rysunek 7A,7B. W porównaniu z cewką pozbawioną zbiornika płynu pasującego do podatności, sygnał jest zatrzymywany dłużej i bardziej jednorodnie w próbce referencyjnej. Jednak ze względu na zbiornik podatności, maksymalne wymiary próbki zmniejszają się w stosunku do cewki bez zbiornika.

Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości
Wysoka rozdzielczość 13 x 13 x 13^μm3 próbki korzenia Medicago truncatula została osiągnięta w ciągu 20 godzin i 23 minut (Ryc. 8). Zaczynając od powierzchni korzenia, widoczna jest kora korzeniowa wraz z resztkami wody na zewnątrz korzenia. Co więcej, ksylem jest obserwowany jako ciemny pas otaczający łyko. Niektóre kieszenie powietrzne są obserwowane jako ciemne punkty z całkowitą utratą sygnału.

Symbiotyczne guzki korzeniowe M. truncatula mogą być również obrazowane za pomocą tego protokołu (Rysunek 9). Za pomocą nieco większej, niedopasowanej cewki (długość ok. 3500 μm, średnica wewnętrzna 1500 μm) uzyskano obrazy o rozdzielczości do 16 x 16 x 16^μm3 w ciągu 33 minut.

Rysunek 1: Mikrocewka elektromagnetyczna. (A) Konstrukcja cewki elektromagnetycznej składa się z drutu spiralnie zapętlonego, zwykle owiniętego wokół kapilary. Geometria drutu, taka jak jego grubość, średnica, liczba uzwojeń i odstępy między drutami, wpływają na charakterystykę cewki. (B) Domowej roboty mikrocewka elektromagnetyczna ze zbiornikiem płynu dopasowującego podatność (Fomblin). Składa się z powlekanego drutu miedzianego o grubości 0,4 mm, nawiniętego sześciokrotnie wokół kapilary o średnicy zewnętrznej 1500 μm i długości cewki 3500 μm. Cewka jest zanurzona w zbiorniku, który jest wykonany ze strzykawki. Można wprowadzić kapilary na próbki o średnicy zewnętrznej do 1000 μm. Stosowane są dwa kondensatory, kondensator 1,5 pF połączony szeregowo z cewką indukcyjną i drugi kondensator zmienny 1,5-6 pF jest umieszczony równolegle do cewki indukcyjnej. Wszystkie elementy są przylutowane do płytki z włókna szklanego (żółta). Jest zamontowany na komercyjnym uchwycie (szary polimer), który jest zmodyfikowany w celu podparcia zbiornika. (C) Elementy konstrukcyjne cewki elektromagnetycznej: 1. cewka elektromagnetyczna, 2. kapilara próbki, 3. kondensator strojeniowy 1,5 pF, 4. kondensator o zmiennym dopasowaniu, 5. płyta podstawy z włókna szklanego, 6. przewody z drutu miedzianego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowanie próbki pod mikroskopem stereoskopowym. (A) Elementy potrzebne do przygotowania mikrocewek. Od lewej do prawej: 1. Roztwór referencyjny CuSO₄, 2. perfluorodekalina, 3. mikrocewka, 4. skalpel, 5. Pęseta z dodatnim napięciem, 6. pęseta, 7. średnica zewnętrzna kapilar = 1000 μm, 8. pióro woskowe, 9. wosk kapilarny, 10. rękawice nitrylowe, 11. mikroskop stereoskopowy, 12. szkiełko zegarkowe z pokrywą szalki Petriego, 13. materiał roślinny w podłożu wzrostowym. Nie pokazano: strzykawka 2 ml z igłą ø 0,8 x 40 mm i cienką bibułą. (B) Zbliżenie na wprowadzenie próbki do kapilary za pomocą pęsety, podczas gdy obie są zanurzone. (C) Uszczelnienie kapilary za pomocą stopionego wosku. (D) Wprowadzenie przygotowanej kapilary do mikrocewki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Element sondy do mikroobrazowania. (A) Podstawa sondy Micro5, zawierająca wszystkie niezbędne przyłącza do chłodzenia wodą, ogrzewania, czujników temperatury, mocy gradientu, RF (widoczne złącze koncentryczne) i opcjonalnie identyfikację sondy (PICS). Pod podstawą sondy znajdują się pokrętła, które pozwalają na regulację zmiennego strojenia i dopasowywanie kondensatorów, a także mocujące do utrzymywania sondy na miejscu wewnątrz spektrometru. (B) Domowej roboty mikrocewka mocująca się na podstawie sondy. Zwróć uwagę na kondensatory zmienne (biała ceramika) zamontowane na podstawie sondy, które pozwalają na strojenie i dopasowywanie. (C) Zintegrowany 3-osiowy gradient zamontowany na podstawie sondy z gniazdami chłodzącymi wodę i pozłacanymi stykami do uziemienia gradientu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Krzywa nutacji. Pobierana jest krzywa nutacji w celu określenia mocy impulsu odniesienia. Moc impulsu referencyjnego (impuls 90°) definiuje się jako kombinację mocy i długości impulsu potrzebną do wytworzenia pola B1, które odwraca całe dostępne namagnesowanie w kierunku z do płaszczyzny poprzecznej. Seria impulsu jest rejestrowana przy braku kodowania gradientowego. Z każdym impulsem zwiększa się długość impulsu lub moc impulsu. Tutaj moc impulsu jest ustawiona na 0,6 W, natomiast długość impulsu jest za każdym razem zwiększana o 1 μs. Maksymalne natężenie sygnału wskazuje impuls 90°, około 12 μs. Impuls 180° można również określić w ten sposób, używając minimalnego natężenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wizualne określenie mocy impulsu 90°. Po ustaleniu przybliżonej mocy impulsu referencyjnego za pomocą krzywej nutacji, można ją sprawdzić wizualnie, zmieniając długość impulsu. W zależności od cewki, pole B1 może być mniej lub bardziej wrażliwe na zmiany. (A) Długość impulsu 11 μs. (B) Długość impulsu 12 μs, optymalna dla tej cewki. (C) Długość impulsu 13 μs. (D) Długość impulsu 20 μs. Jeśli moc impulsu jest ustawiona zbyt wysoko, może dojść do nadmiernego przechylenia, zmniejszając w ten sposób intensywność obrazu w środku cewki (grot strzałki). Zwiększone pole B1 zwiększa również zasięg cewki, co można zaobserwować w szerokości obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Rozmieszczenie obszaru zainteresowania. Można zobaczyć obszary zainteresowania (ROI) dla obliczenia znormalizowanego stosunku sygnału do szumu (SNR). Średnia intensywność próbki jest pobierana z ROI, który mieści się w próbce roztworu odniesienia. Średni szum i odchylenie standardowe są obliczane na podstawie co najmniej jednego zwrotu z inwestycji znajdującego się w rogach obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Jednorodność RF oceniana za pomocą obrazowania echa gradientowego. Sekwencja wielokrotnego echa gradientowego (MGE) służy do oceny jednorodności RF (B₁ -Field) za pomocą serii echa gradientowego. Podstawowymi parametrami były: czas powtórzenia 200 ms, czas echa 3,5 ms przy liczbie echa 48, odstęp echa 3,5 ms, 64 średnie, czas akwizycji 27 m 18 s, kąt odwrócenia 30°. Pole widzenia wynosiło 5 x 5 mm, matryca 128 x 128, rozdzielczość 39 x 39 x 200 μm. (A) Cewka dopasowana do podatności. Płyn dopasowujący podatność (Fomblin) otaczający cewkę RF zmniejsza efekty podatności spowodowane drutem cewki. Małe pęcherzyki powietrza powodują utratę sygnału wraz ze wzrostem czasu echa. (B) Cewka (niedopasowana podatność) o równej średnicy cewki. Przy dłuższych czasach echa obserwuje się narastające artefakty spowodowane niejednorodnością pola B₀. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Obrazowanie 3D przekroju korzenia pałki Medicago. (Góra) Obraz FLASH. Można wyróżnić kilka cech odcinka korzeniowego, w tym naskórek (e), korę (c), łyko (ph) i ksylem (xy). Kieszenie powietrzne (a) w korzeniu powodują całkowitą utratę sygnału. Podstawowe parametry były następujące: czas powtórzenia 70 ms, czas echa 2,5 ms, 256 średnich, czas akwizycji 20 h 23 m. Rozdzielczość 13 x 13 x 13 μm³. Rozmiar matrycy wynosił 128 x 64 x 64, a pole widzenia 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Szerokość pasma odbiornika 50 kHz. (Na dole) Obraz MMŚP. Podstawowe parametry były następujące: czas powtórzenia 500 ms, czas echa 5,2 ms, 28 średnich, czas akwizycji 15 h 55 m. Rozdzielczość 13 x 13 x 13 μm³. Rozmiar matrycy wynosił 128 x 64 x 64, a pole widzenia 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Szerokość pasma odbiornika 70 kHz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 9: Obrazowanie 3D guzka korzenia pałki Medicago truncatala. (Góra) Obraz o niskiej rozdzielczości. Podstawowe parametry były następujące: czas powtórzenia 60 ms, czas echa 2,3 ms, 4 średnie, czas akwizycji 4 m. Rozdzielczość 31 x 31 x 31 μm³. Rozmiar matrycy wynosił 64 x 32 x 32, a pole widzenia 2 x 1 x 1 mm. Szerokość pasma odbiornika 50 kHz. (Na dole) Obraz w wysokiej rozdzielczości. Podstawowe parametry były następujące: czas powtórzenia 60 ms, czas echa 2,3 ms, 8 średnich, czas akwizycji 33 m. Rozdzielczość 16 x 16 x 16 μm³. Rozmiar matrycy wynosił 128 x 64 x 64, a pole widzenia 2 x 1 x 1 mm. Szerokość pasma odbiornika 50 kHz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół ten najlepiej nadaje się do próbek biologicznych, ponieważ wiele materiałów i próbek geologicznych ma znacznie krótsze czasy relaksacji T2, których nie można zobrazować za pomocą zastosowanych tutaj sekwencji. Nawet niektóre tkanki biologiczne, które wykazują wysoką niejednorodność podatności magnetycznej próbki, mogą być trudne do zobrazowania w ultrawysokim polu, ponieważ efekty są skorelowane z natężeniem pola²⁴. Protokół jest przydatny nie tylko w przypadku nowych cewek, ale może również pomóc w rozwiązywaniu problemów i diagnozowaniu potencjalnych problemów. W przypadku testowania nowych lub nieznanych próbek, protokół ten można wykonać z wyprzedzeniem na roztworze referencyjnym w celu sprawdzenia, czy konfiguracja eksperymentalna działa zgodnie ze specyfikacją. Pomaga to w rozwiązywaniu problemów, ponieważ spektrometr może zostać wykluczony jako źródło artefaktów i usterek. Dodatkowo ustawia to kondensatory strojące i dopasowujące na sondzie na wartości typowe dla mikrocewki.

Gdy w pierwszym eksperymencie nie zostanie zarejestrowany żaden sygnał, pole widzenia skanowania lokalizatora można powiększyć, aby sprawdzić, czy próbka jest widoczna. Następnie sprawdź ponownie, czy cewka jest prawidłowo dostrojona i spróbuj ponownie przeskanować lokalizator. Możliwe, że cewka wykazuje dodatkowe niezamierzone mody rezonansowe, w takim przypadku należy określić właściwy. Jeśli nadal nie można uzyskać obrazu, wyjmij próbkę, aby sprawdzić jej położenie w zespole mikrocewki i sprawdź, czy próbka jest nienaruszona (tj. nie ma pęcherzyków powietrza ani nieszczelności w uszczelkach). Na koniec próbkę można przygotować z użyciem wody zamiast PFD. W przypadku, gdy próbka daje niewielki wykrywalny sygnał w skanowaniu lokalizatora, nadal można wykryć otaczającą wodę w kapilarze.

Ponieważ mikrocewki znajdują się idealnie bardzo blisko próbki, różnice w podatności magnetycznej między powietrzem a drutem mogą powodować dodatkowe straty sygnału, jak pokazano na rysunku 7B. Potencjalne artefakty obejmują błędne mapowanie przestrzenne i anomalne zmiany intensywności sygnału. Szczególnie sekwencje impulsów typu gradient-echo są dotknięte tą niejednorodną utratą sygnału. Z tego powodu zaprezentowaliśmy cewkę dopasowaną do podatności, zanurzając drut w cieczy fluoroobojętnej (Fomblin lub FC-43). Metoda szacowania B₁ zawarta w tym protokole może pomóc w ustaleniu, czy różnice w podatności B₁ uzasadniają włączenie strategii dopasowania podatności do projektu zespołu cewki. Alternatywnym podejściem do konstruowania cewki dopasowanej do podatności jest użycie drutu²⁵ dopasowanego do podatności. Co więcej, w ramach tego podejścia rozwiązywane są tylko problemy z podatnością ze względu na cewkę. Niedopasowanie podatności wewnątrz próbki (np. spowodowane przestrzeniami powietrznymi) nadal stanowi wyzwanie.

Kieszenie lub pęcherzyki powietrza stanowią wyzwanie eksperymentalne, które powoduje rozległe straty sygnału, spowodowane różnicami podatności na styku powietrza i płynu lub próbki¹⁹ (ryc. 5A). Krytycznym aspektem udanego przygotowania próbki jest zanurzenie zarówno próbki, jak i kapilary. Jednak nawet małe pęcherzyki mogą powodować straty sygnału, szczególnie w przypadku sekwencji typu echo gradientowe. Ruchome pęcherzyki powietrza mogą migrować przez kapilarę, dopóki nie zetkną się z próbką. Niektóre z tych efektów można złagodzić, lekko przechylając kapilatę tak, aby jeden koniec był wyższy od drugiego. Przechylanie zapewnia, że potencjalne pęcherzyki powietrza są utrzymywane na miejscu na wyższym końcu, bez naruszania próbki. Ważne jest również, aby sprawdzić, czy wosk kapilarny tworzy dobre uszczelnienie, ponieważ odwodnienie może powodować tworzenie się dużych pęcherzyków powietrza.

W przypadku przestrzeni powietrznych wewnątrz próbki, PFD użyto do wypełnienia międzykomórkowych przestrzeni powietrznych, nie przenikając przez błony komórkowe²⁶. Jednak nawet przy takim podejściu nie byliśmy w stanie usunąć wszystkich przestrzeni powietrznych. Dodatkowo takie podejście oznacza, że potrzebujemy dodatkowego środka, który zwykle nie jest preferowany ze względu na chęć jak najbardziej nieinwazyjnego zbadania systemu.

Cylindryczny kształt naczyń włosowatych oznacza, że układy perfuzyjne powinny być żywotne, szczególnie w przypadku tkanek podatnych na rozpad, takich jak biopsje lub badanie procesów zachodzących w żywym materiale korzeniowym. Dwa kroki mogą zrealizować konfigurację perfuzji. Po pierwsze, podłączenie rurki zasilającej pożywki oraz rurki drenującej po obu stronach kapilary wystarczyłoby do wytworzenia chemostatu. Po drugie, dodanie wgłębienia w kapilarze próbki może utrzymać próbkę w miejscu w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu. Jest to analogiczne do protokołu opublikowanego dla mikrocewek płaskich¹⁰.

Nieinwazyjny charakter obrazowania MR w połączeniu z obojętnym płynem stosowanym w tym protokole (PFD lub Fomblin) oznacza, że po zakończeniu eksperymentów próbki mogą być usuwane z naczyń włosowatych w celu dalszych badań. Kombinacje obejmują mikroskopię optyczną lub elektronową oraz inne techniki obrazowania niszczącego. Niedawno zademonstrowaliśmy połączenie z mikroskopią optyczną na guzkach korzeniowych Medicago truncatula ²⁷.

Zademonstrowaliśmy metodę obrazowania materiału roślinnego za pomocą dedykowanych mikrocewek na spektrometrze NMR w ultra wysokim polu. Stosunkowo duże objętości próbek mogą być badane w wysokiej rozdzielczości z dobrą jednorodnością RF. Co więcej, obrazowanie spektroskopowe może być wykonywane w wyższych rozdzielczościach niż jest to możliwe w innym przypadku. Dostosowanie konstrukcji mikrocewki do próbek jest ułatwione dzięki wydajnej metodzie określania charakterystyki działania cewki. Metoda cewki elektromagnetycznej może być również z łatwością zastosowana do próbek innych niż rośliny, w tym tkanek zwierzęcych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przygotowanie roztworu referencyjnego
CuSO4	Sigma-aldrich	469130	Krystaliczny proszek do tworzenia roztworu referencyjnego
D2O	Sigma-aldrich	151882	Ciecz używana do przygotowania próbki referencyjnej
Waga	Skala Sartorius	PRACTUM513-1S	do ważenia związków
Przygotowanie próbki
Kapilara 1000 μ m (Średnica zewnętrzna)	Hilbenberg GmbH	1408410	Kapilary na próbki
Wosk kapilarny	Hampton Research	HR4-328	Wosk stały używany do uszczelniania próbek
Skalpel jednorazowy	Swann-Morton	nr 11	Służy do ekstrakcji próbek
Perfluorodekalina	Sigma-aldrich	P9900	Płyn używany do zanurzania próbki
Mikroskop stereoskopowy	Olympus	SZ40	Stołowy mikroskop dwuokularowy
Strzykawka		Generic-Służy	do nakładania PFD i manipulowania próbką
Pompa próżniowa	Vacuubrand	MZ2C	Dwustopniowa membranowa pompa próżniowa służąca do usuwania kieszeni powietrznych z próbek.
Długopis woskowy	Hampton Research	HR4-342	Ręczny długopis woskowy służący do topienia i nakładania wosku kapilarnego na próbki
Sprzęt do obrazowania
22.3 T Magnet	Bruker GmbH	950 US2	Wąskootworowy magnes nadprzewodzący
Chłodnica powietrza	Bruker	GmbH-Służy	do regulacji temperatury
sondyKonsola	Bruker GmbH	Avance III HD	Sterowanie działaniem spektrometru
Cewki gradientowe Micro5	Bruker GmbH	Mic5	Wyjmowane cewki gradientowe montowane na korpusie sondy
Micro5 Korpus sondy	Micro5 Bruker GmbH	Mic5	Zawiera mikrocewki i cewki gradientowe Mikrocewka
RF	Zbudowany w domu	-	zawiera Fomblin
Vector Network Analyzer	Copper Mountain Technologies	TR1300/1	Służy do wykonywania testu odbicia S11, zakres częstotliwości od 300 kHz do 1,3 GHz
Chłodnica wodna	Bruker GmbH	BCU-20	Chłodzenie wodne w pętli otwartej do odprowadzania ciepła z pracy cewki gradientowej.