Kalibracja i użycie mikrocewki MRM zademonstrowane na korzeniach pałki Medicago przy 22 tach

Podsumowanie

Przedstawiono protokół badania tkanki biologicznej w wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą mikroskopii rezonansu magnetycznego o ultrawysokim polu (MRM) przy użyciu mikrocewek. Znajdują się instrukcje krok po kroku dotyczące charakteryzowania mikrocewek. Na koniec zademonstrowano optymalizację obrazowania na korzeniach roślin.

Streszczenie

Ten protokół opisuje metodę kalibracji stosunku sygnału do szumu (SNR) i przygotowania próbki dla mikrocewek solenoidalnych w połączeniu z próbkami biologicznymi, przeznaczoną do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) o wysokiej rozdzielczości, określanego również jako mikroskopia MR (MRM). Może być stosowany w przedklinicznych spektrometrach MRI, demonstrowanych na próbkach korzenia Medicago truncatula. Mikrocewki zwiększają czułość poprzez dopasowanie wielkości rezonatora RF do wielkości próbki będącej przedmiotem zainteresowania, umożliwiając w ten sposób uzyskanie wyższych rozdzielczości obrazu w danym czasie akwizycji danych. Ze względu na stosunkowo prostą konstrukcję, mikrocewki elektromagnetyczne są proste i tanie w budowie oraz można je łatwo dostosować do wymagań próbki. Systematycznie wyjaśniamy, jak kalibrować nowe lub zbudowane w domu mikrocewki przy użyciu rozwiązania referencyjnego. Etapy kalibracji obejmują: określenie mocy impulsu za pomocą krzywej nutacji; oszacowanie jednorodności pola RF; oraz obliczanie znormalizowanego głośności stosunku sygnału do szumu (SNR) przy użyciu standardowych sekwencji impulsów. Omówiono ważne etapy przygotowania próbek do małych próbek biologicznych, a także możliwe czynniki łagodzące, takie jak różnice w podatności magnetycznej. Zastosowania zoptymalizowanej cewki elektromagnetycznej są demonstrowane przez obrazowanie 3D próbki głównej w wysokiej rozdzielczości (13 x 13 x 13 μm³, 2,2 pL).

Wprowadzenie

Rezonans magnetyczny to wszechstronne narzędzie do nieinwazyjnego obrazowania szerokiej gamy próbek biologicznych, począwszy od ludzi, a skończywszy na pojedynczych komórkach^1,2,3. Podczas gdy skanery MRI do zastosowań w obrazowaniu medycznym zazwyczaj wykorzystują magnesy o natężeniu pola od 1,5 T do 3 T, aplikacje jednokomórkowe są obrazowane przy znacznie wyższym natężeniu pola^1,3,4. Badanie próbek w rozdzielczościach poniżej stu mikrometrów określa się mianem mikroskopii rezonansu magnetycznego (MRM)⁵. Jednak MRM cierpi na niski stosunek sygnału do szumu (SNR) w porównaniu z innymi dostępnymi technikami mikroskopii lub obrazowania (np. mikroskopią optyczną lub tomografią komputerową). Można zastosować kilka podejść do optymalizacji SNR⁶. Jednym z podejść jest zastosowanie pola magnetycznego o wyższym natężeniu, podczas gdy podejście uzupełniające polega na optymalizacji detektora sygnału dla poszczególnych próbek. W tym drugim przypadku wymiary detektora należy dostosować tak, aby odpowiadały wymiarom próbki będącej przedmiotem zainteresowania. W przypadku małych próbek o średnicy ≈0,5-2 mm (np. tkanek korzeniowych) przydatne są mikrocewki, ponieważ SNR jest odwrotnie proporcjonalny do średnicy cewki^6,7. Rozdzielczości do 7,8 x 7,8 x 15^μm3 zostały osiągnięte na komórkach zwierzęcych za pomocą dedykowanych mikrocewek⁸. Istnieje wiele typów mikrocewek, przy czym cewki płaskie i elektromagnetyczne są najczęściej używane w zależności od zastosowania i geometrii tkanki⁹. Cewki planarne mają wysoką czułość blisko ich powierzchni, co jest przydatne do zastosowań na cienkich plasterkach. Na przykład metoda zaprojektowana specjalnie do obrazowania perfundowanej tkanki została opisana dla płaskich mikrocewek¹⁰. Jednak cewki planarne charakteryzują się wysokim spadkiem czułości i nie mają dobrze zdefiniowanej mocy impulsu odniesienia. Cewki elektromagnetyczne, będące cylindryczne, mają szerszy obszar zastosowania i są bardziej preferowane w przypadku grubszych próbek. W tym miejscu opisujemy charakterystykę cewki elektromagnetycznej, protokół przygotowania próbek do rezonansu magnetycznego mikrocewki, a także kalibrację mikrocewki elektromagnesu (Rysunek 1A).

Cewka elektromagnesu składa się z drutu przewodzącego zwiniętego, jak korkociąg, wokół kapilary przytrzymującej próbkę (Rysunek 1B). Zespoły mikrocewek mogą być konstruowane wyłącznie przy użyciu emaliowanego drutu miedzianego, asortymentu kondensatorów i odpowiedniej podstawy do komponentów (Rysunek 1B). Głównymi zaletami są prostota i niski koszt w połączeniu z dobrymi parametrami wydajności pod względem SNR na jednostkę objętości i jednorodności pola B₁. Łatwość konstrukcji umożliwia szybką iterację projektów i geometrii cewek. Szczegółowe wymagania dotyczące projektowania mikrocewek elektromagnetycznych i charakterystyki sondy (tj. teoria elektroniki, pomiary na stanowisku warsztatowym i pomiary spektrometru dla różnych geometrii cewek) zostały obszernie opisane w innym miejscu^{7,11,12,13,14}.

Cewkę elektromagnetyczną można zbudować, pamiętając o zasadach projektowania dla pożądanych wymiarów zgodnie z wytycznymi opisanymi gdzie indziej^15,16. W tym konkretnym przypadku zastosowano cewkę o średnicy wewnętrznej 1,5 mm, wykonaną z emaliowanego drutu miedzianego o średnicy 0,4 mm, zapętlonego wokół kapilary o średnicy zewnętrznej 1,5 mm. Ten elektromagnes jest utrzymywany na płycie podstawy, na której wykonany jest obwód, składający się z kondensatora strojeniowego (2,5 pF), kondensatora o zmiennym dopasowaniu (1,5-6 pF) oraz miedzianych przewodów łączących (Rysunek 1A, 1C). Kondensator strojeniowy dobiera się tak, aby osiągnąć pożądaną częstotliwość rezonansową 950 MHz, natomiast kondensator dopasowujący dobiera się tak, aby osiągnąć maksymalną transmisję sygnału przy impedancji 50 Ohm. Większy kondensator jest zmienny, aby umożliwić dokładniejszą regulację. W normalnej pracy strojenie i dopasowywanie odbywa się za pomocą kondensatorów w podstawie sondy. Zmontowaną mikrocewkę należy zamontować na sondzie, aby można ją było włożyć do magnesu. W zależności od systemu może być wymagany dodatkowy uchwyt. Tutaj używamy kombinacji magnesu 22,3 T z konsolą Bruker Avance III HD w połączeniu z sondą Micro5. W tym przypadku zastosowaliśmy zmodyfikowaną wkładkę wsporczą wyposażoną w niezbędne przyłącza do podłączenia do kanału ¹H sondy (Rysunek 1A).

Dopasowany do podatności projekt cewki zawiera zbiornik z perfluorowaną cieczą, aby zmniejszyć niedopasowania podatności, wynikające z tego, że cewka miedziana znajduje się w bliskiej odległości od próbki¹⁷. Zbiornik został wykonany z plastikowej strzykawki do zamknięcia cewki i wypełniony fombliną. Ponieważ perfluorowana ciecz musi otaczać cewkę, dostępna średnica próbki jest zmniejszana do średnicy zewnętrznej 1 mm. W celu ułatwienia wymiany próbki przygotowano w kapilarze o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 700 μm. Niezbędne narzędzia do przygotowania próbki są pokazane w Rysunek 2A.

Podstawowe parametry eksperymentalnego MR są w dużym stopniu zależne od sprzętu używanego systemu, w tym systemu gradientu, natężenia pola i konsoli. Do opisania wydajności systemu można użyć kilku parametrów, z których najbardziej praktyczne znaczenie mają długość i moc impulsu 90°, jednorodność B₁ i SNR na jednostkę objętości (SNR/mm³). SNR/mm³ jest przydatny do porównywania wydajności różnych cewek w tym samym systemie¹⁸. Chociaż mogą istnieć różnice sprzętowe między systemami, jednolite stosowanie protokołu testów porównawczych ułatwia również porównywanie wydajności systemu.

Ten protokół skupia się na kalibracji i przygotowaniu próbki. Przedstawiono stopniową charakterystykę działania mikrocewek elektromagnetycznych: kalibracja długości lub mocy impulsu 90°; ocena jednorodności pola RF; i obliczanie SNR na jednostkę objętości (SNR/mm³). Opisano znormalizowany pomiar echa spinowego za pomocą fantomu, aby ułatwić porównanie konstrukcji cewek, co pozwala na optymalizację różnych zastosowań. Opisano preparaty próbek fantomowych i biologicznych, specyficzne dla mikrozwojów. Protokół ten może być zaimplementowany na dowolnym odpowiednim magnesie pionowym o wąskim otworze (≤60 mm) wyposażonym w dostępny na rynku system mikroobrazowania. W przypadku innych systemów może służyć jako wskazówka i może być używany z pewnymi korektami.

Przygotowanie próbki biologicznej do pomiarów MRI zazwyczaj nie jest zbyt obszerne, ponieważ próbka jest obrazowana w jak najbardziej nienaruszonym stanie. Jednak przestrzenie powietrzne w tkance biologicznej mogą powodować artefakty obrazu ze względu na różnice w podatności magnetycznej¹⁹. Efekt ten nasila się wraz ze wzrostem natężenia pola magnetycznego²⁰. W związku z tym należy unikać przestrzeni powietrznych o dużym natężeniu pola, co może wymagać zanurzenia próbki w płynie, aby uniknąć przepływu powietrza wokół tkanki i usunięcia przestrzeni powietrznych w strukturach tkanki. W szczególności, gdy stosowane są mikrocewki, może być wymagane wycięcie pożądanej tkanki próbki, a następnie zanurzenie jej w odpowiednim płynie. Następnie wprowadza się próbkę do wstępnie wyciętej kapilary, a na koniec uszczelnia kapilarnę woskiem kapilarnym. Użycie wosku jako uszczelniacza zamiast kleju, uszczelniania płomieniowego lub alternatyw oznacza, że próbkę można łatwo usunąć. Ta procedura jest pokazana na korzeniu Medicago truncatula, małej rośliny strączkowej. Zaletą tego protokołu jest możliwość późniejszej jednoczesnej rejestracji danych MRI z mikroskopią optyczną, ponieważ próbka nie jest niszczona podczas pomiaru MRI.

Prezentowany protokół nadaje się do pomiarów in situ o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, a bardziej skomplikowane projekty mogłyby pozwolić na obrazowanie próbek in vivo, gdzie trzeba byłoby rozwiązać problemy związane z systemami podtrzymywania życia.

Protokół

UWAGA: Ten protokół opisuje procedury dotyczące użytkowania i oceny cech cewnika o średnicy wewnętrznej (ID) 1,5 mm w kształcie solenoidu (Rycina 1). Cewnik użyty do zademonstrowania protokołu znajduje się w zbiorniku dopasowanym pod względem podatności magnetycznej, jednak protokół ten jest równie dobrze stosowany do cewników niezrównoważonych. Protokół można dostosować do innych rozmiarów oraz różnych konfiguracji spektrometru.

1. Przygotowanie próbki odniesienia

1. Aby przygotować 100 mL roztworu wzorcowego wrażliwości, rozpuść 156,4 mg CuSO₄ ∙ 5 H₂O w 80 mL D₂O umieszczonego w kolbie GL45 o pojemności 100 mL. Siarczan miedzi skraca zarówno czas relaksacji T₁, jak i T₂, umożliwiając szybsze pomiary, natomiast D₂O zapobiega efektom tłumienia promieniowania i nasycenia. Mieszaj ręcznie, aż substancja całkowicie się rozpuści.
   1. Doprowadź objętość do 100 mL, używając wody zdejonizowanej, aby uzyskać stężenie końcowe 1 g/L CuSO₄ (bezwodny, 6,3 mM). Takie stężenie jest wystarczające, by skrócić czasy relaksacji T₁ i T₂, ale nie na tyle wysokie, by wystąpiło wytrącanie. Zamknij próbkę wzorcową, aby zapobiec zmianie stosunku H₂O : D₂O.
2. W razie potrzeby podłącz sondę do analizatora sieci, aby sprawdzić, czy cewka rezonuje na pożądanej częstotliwości rezonansowej. Wykonaj test odbicia S₁₁, aby zmierzyć zakres częstotliwości osiągany po strojeniu oraz aby wyznaczyć współczynnik dobroci Q, zgodnie z szczegółowym opisem Haase et al.¹⁴. Podłącz mikrocewkę do analizatora sieci za pomocą kabla koncentrycznego. W razie potrzeby użyj kabla z przejściówką BNC.
   1. Ustaw na analizatorze sieci częstotliwość środkową na pożądanej częstotliwości rezonansowej, w zależności od zaplanowanej wartości indukcji pola magnetycznego, dla której zaprojektowano cewkę. Następnie ustaw szerokość zakresu na 10 MHz. Dostosuj kondensator nastawny na mikrocewce, jeśli jest obecny, aby precyzyjnie wyregulować minimum odbicia na pożądaną częstotliwość.
   2. Zanotuj poziom odbicia na częstotliwości środkowej oraz częstotliwości f₁ i f₂ na poziomie -7 dB. Użyj tych wartości do obliczenia współczynnika dobroci Q na poziomie -7 dB, zgodnie z metodą Haase et al.¹⁴

2. Przygotowanie próbek

1. Jeśli przygotowuje się próbkę referencyjną do kalibracji cewnika, przenieść 1 mL roztworu CuSO­₄ do naczynia szklanego pod mikroskopem stereoskopowym.
2. Jeśli przygotowuje się próbkę biologiczną, przenieść 1 mL perfluorodekaliny (PFD) do naczynia szklanego pod mikroskopem stereoskopowym, aby zanurzyć próbkę. PFD jest stosowana, ponieważ wypełnia przestrzenie powietrzne w preparacie, nie przenikając do komórek biologicznych. Ponadto nie daje sygnału w protonowym MRI. Natychmiast przykryć naczynie szklane pokrywką od płytki Petriego, aby zapobiec parowaniu, zanim PFD będzie potrzebna.
   UWAGA: PFD jest wysoce lotna i silnym długotrwałym gazem cieplarnianym²¹. Gdy nie są wymagane jej właściwości rozpuszczania tlenu ani niska lepkość, można ją zastąpić Fomblin, perfluoroeterem, który również nie daje obserwowalnego sygnału ¹H, ale nie paruje tak szybko¹⁷.
3. Przygotować kapilary o odpowiedniej średnicy zewnętrznej, dopasowanej do średnicy trzymaczki mikrocewnika (18 mm), umożliwiającej ich ponowne ustawienie (Rysunek 1C). Użyć noża ceramicznego, by wykonać nacięcie co 10–12 mm, a następnie ostrożnie złamać kapilarę w miejscu nacięcia.
4. Jeśli przygotowuje się próbkę referencyjną, użyć szczypiec i mikroskopu stereoskopowego, by doprowadzić wyciętą kapilarę do powierzchni roztworu CuSO₄ w naczyniu szklanym, pozwalając siłom kapilarnym na wypełnienie kapilary.
5. Jeśli przygotowuje się próbkę biologiczną, użyć szczypiec i mikroskopu stereoskopowego, by doprowadzić wyciętą kapilarę do powierzchni PFD w naczyniu szklanym, pozwalając siłom kapilarnym na pełne wypełnienie kapilary. Puścić kapilarę do naczynia szklanego, by stała się całkowicie zanurzona.
   1. Ostrożnie wyjąć pięciotygodniowy cały system korzeniowy z podłoża wzrostowego, np. z perlitowej substytucji gleby. Dokładnie oczyścić próbkę korzenia z ryzoszety. Usunąć duże cząstki gleby za pomocą szczypiec, a jeśli występują drobne cząstki, usunąć je poprzez płukanie systemu korzeniowego wodą destylowaną. W razie potrzeby wykonać zdjęcie do późniejszej dokumentacji. Wybrać i wyciąć mały odcinek korzenia włóknistego wolnego od ryzoszety za pomocą skalpela.
   2. Aby przeprowadzić obróbkę próżniową, umieścić próbkę w probówce o pojemności 1,5 mL zawierającej odpowiedni roztwór utrwalający. Zostawić pokrywkę otwartą, a następnie uszczelnić probówkę folią parafinową. Następnie przebić otwory w folii ostrym narzędziem, aby umożliwić wentylację probówki.
   3. Umieścić probówkę z próbką w komorze próżniowej, uszczelnić komorę i podłączyć do niej membranową pompę próżniową. Poddać próbkę obróbce próżniową przez maksymalnie 30 minut, aby zmniejszyć obecność pęcherzyków powietrza w próbkach biologicznych. Zakończyć obróbkę próżniową, gdy nie będą widoczne uciekające pęcherzyki powietrza.
   4. Przyglądając się przez mikroskop stereoskopowy, użyć szczypiec, by zanurzyć próbkę w wcześniej przygotowanym medium infiltracyjnym. Przepłukać próbkę, usuwając ewentualne zanieczyszczenia.
   5. Używając szczypiec, umieścić próbkę w kapilarze, podczas gdy zarówno kapilara, jak i próbka są całkowicie zanurzone, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza. Użyć mniejszej kapilary lub końcówki igły strzykawki jako tłoczka (Rysunek 2B).
   6. Wziąć kapilarę z próbką z naczynia szklanego z medium, używając szczypiec. W przypadku PFD przykryć naczynie szklane pokrywką od płytki Petriego.
6. Uformować papier ścierny w cienki róg i użyć go do usunięcia około 1 mm cieczy z obu końców kapilary.
7. Ogrzać niewielką ilość wosku do kapilar przy użyciu pióra woskowego. Nałożyć wosk z obu stron. Wosk staje się matowy po zastygnięciu. Uważać, by nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do kapilary (Rysunek 2C).
   UWAGA: Unikać przegrzewania wosku lub kapilary, ponieważ może to spowodować gwałtowne zagotowanie oraz powstawanie kawitacyjnych pęcherzyków podczas ostygnięcia gotowej próbki.
8. Następnie, za pomocą skalpela usunąć nadmiar wosku z zewnętrznej powierzchni kapilary i przetrzeć ją delikatnym papierem ściernym.

3. Montowanie próbki

1. Umieść mikrozwojnicę pod stereoskopem i za pomocą pęsety wsuń próbkę, trzymając mikrozwojnicę nieruchomo (Rycina 2D).
2. Użyj pręta, aby wyśrodkować próbkę w mikrozwojnicy, przesuwając kapilarę wewnątrz zwojnicy solenoidowej.
3. Opcjonalnie przyłóż taśmę samoprzylepną, aby ustalić położenie kapilary.
4. Sprawdź kapilarę, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza wewnątrz zwojnicy solenoidowej, aby uniknąć zniszczenia sygnału MR spowodowanego różnicami w przenikalności magnetycznej.
5. Podłącz mikrozwojnicę do gniazda podstawy sondy, trzymając mikrozwojnicę w pionie (Rycina 3A,3B).
6. Delikatnie wsuń trójosiowe cewki gradientowe na mikrozwojnicę, dopasowując złącza chłodzenia wodnego gradientu do tych na podstawie sondy (Rycina 3C). Obróć gwintem na podstawie sondy, aby ustalić gradient w miejscu.
   UWAGA: Ten krok dotyczy wyłącznie sondy Micro5. W przypadku innych systemów, takich jak Micro2.5 lub Biospect, gradienty znajdują się w osobnym gnieździe niż cewka.

4. Oznaczanie właściwości cewki

1. Jeśli cewkę testuje się po raz pierwszy, użyj roztworu próbkowego wzorcowego do przygotowania próbki jednorodnej, która jest przydatna do kalibracji mocy i B₁ testy jednorodności. Potencjalne problemy z podatnością spowodowane przewodami cewki można łatwo sprawdzić za pomocą tego próbki odniesienia.
2. Włóż sondę do magnesu i podłącz niezbędne przewody: kabel transmisji/odbioru sygnału RF, przewody chłodzenia wodnego, kabel termopary oraz przewód chłodzenia powietrznego.
3. Ustaw żądaną temperaturę chłodzenia wodą (zalecana wartość: 298 K) dla jednostki chłodzenia wodą.
4. Ustaw docelową temperaturę (298 K) i docelowy przepływ gazu (300 L/h). Przepływ gazu może się różnić w zależności od konstrukcji cewki lub objętości próbki. Dotyczy to wyłącznie systemów wyposażonych w układ regulacji temperatury.
   UWAGA: Następne kroki są konieczne wyłącznie podczas testowania nowych cewek (zbudowanych samodzielnie).
5. Podłącz sondę za pomocą 50 Ω kabel koncentryczny do analizatora sieciowego o odpowiednio szerokiej szerokości zakresu (400 MHz), ustawionego na środku zamierzonej częstotliwości rezonansu
6. Obserwuj tryby rezonansowe, regulując zmienne kondensatory dopasowania i strojenia znajdujące się w podstawce sondy.
7. Dostosuj i dopasuj tryb rezonansowy do pożądanej częstotliwości.
8. Opcjonalnie określ dobroć cewki (czynnik Q) za pomocą analizatora sieci. Jedną z metod wyznaczenia czynnika dobroci jest użycie sieci sprzęgającej i podzielenie częstotliwości środkowej (f_c) przez szerokość wklęsłości odbicia przy -7 dB (tj. Pytanie = f_c /(f₁ - f₂)¹⁴Ustawienie f_c do częstotliwości pracy magnesu, podczas gdy f₁ i f₂ są ustawione na punkcie -7 dB po lewej i prawej stronie f_codpowiednio. Niektóre analizatory sieciowe mają wbudowaną funkcję wyznaczania współczynnika dobroci Q.
9. Rozpocznij test refleksyjności na skanerze, zazwyczaj nazywany krzywą wahania, i w razie potrzeby dostosuj strojenie i dopasowanie. Zaleca się ustawienie wszystkich kondensatorów strojenia i dopasowania w połowie ich zakresu dla nowych cewek. Dlatego rozpocznij od dużej szerokości zakresu spektralnego. W niektórych przypadkach może być wygodniejsze przeprowadzenie strojenia i dopasowania cewki poza magnesem za pomocą analizatora sieci.
10. Wybierz plik szumowy dla cewki o największej objętości sondy obrazującej, jeśli jest dostępny. Jeśli zaczyna się od cewki, która była wcześniej używana, należy wykorzystać dostępny plik szumowy. Jeśli żadna z tych opcji nie jest dostępna, rozpocznij pracę z wartościami szumów ustawionymi na 0.
11. Wybierz odpowiednią konfigurację cewki dla mikrocewki, jeśli jest ona dostępna w oprogramowaniu do obrazowania (tj., ParaVision). W przeciwnym razie utwórz nową konfigurację cewki zgodną z jej specyfikacją (np. pojedynczo lub dwukrotnie strojoną) zgodnie z instrukcją systemu. Szacunkowe bezpieczne limity dla tej mikrocewki solenoidowej używanej w badaniach, o średnicy wewnętrznej 1,5 mm, wynoszą 1 ms przy mocy szczytowej 1 W i mocy ciągłej 1 mW.
    UWAGA: Małe kondensatory (zwykle o rozmiarze 1 mm) potrzebne do mikrozwojnic są bardzo wrażliwe i łatwo ulegają uszkodzeniu pod wpływem wysokich napięć. Automatyczne wyznaczanie mocy impulsu może nie działać z niestandardowymi zwojnicami, a zbyt wysoka moc może spowodować uszkodzenie zwojnicy lub innych części spektrometru. Dlatego zaleca się ręczne dostrojenie.
12. Zarejestruj krzywą nutacji dla nowej cewki, aby uzyskać wskazanie właściwej mocy RF dla cewki (Rycina 4). W przypadku nieznajomości bezpiecznych limitów dla cewki rozpocznij od 10 µs przy niskiej mocy impulsu 0,6 W i powoli zwiększaj długość impulsów przez 1 µs jednocześnie, aż pojawi się sygnał.
    1. Przeprowadzając eksperyment z wykorzystaniem sygnału FID w warunkach braku kodowania gradientowego, systematycznie zmieniaj długość impulsu RF przy stałej mocy impulsu. Optymalna długość impulsu to taka, przy której natężenie sygnału osiąga maksimum. W przypadku testowania nowej cewki należy użyć 10 µs najpierw zastosuj impuls o bardzo niskiej mocy, a następnie stopniowo zwiększaj moc impulsu
       UWAGA: W przypadku, gdy moc jest znacznie wyższa niż oczekiwano dla danej kombinacji cech cewki i spektrometru, jest to już wskazanie, że wybrano niewłaściwy tryb rezonansowy.
    2. Dla cewki o jednorodnym B₁-pole, takie jak cewka solenoidu, określają 180° puls, w którym natężenie sygnału maleje do zera²².
13. Ustaw wyznaczoną 90° wstrzyknij moc impulsu do karty regulacji utworzonego badania. W oprogramowaniu ParaVision karta regulacji mocy referencyjnej może zostać wykorzystana do wprowadzenia mocy impulsu stałego.
14. Użyj skanu lokalizacyjnego z 3 warstwami, po jednej w każdej z trzech głównych osi, aby określić położenie cewki wewnątrz magnesu. W tym celu załaduj skan lokalizacyjny z domyślnej biblioteki spektrometru. Zaleca się rozpoczęcie od dużego pola widzenia bez przesunięcia. Wykonaj automatyczną regulację wzmocnienia odbiornika i ręcznie uruchom pomiar.
    UWAGA: Jeśli próbka znajduje się dokładnie w centrum układu gradientowego, obraz lokalizacyjny pokaże próbkę. Jeśli cewka lub próbka nie są wyśrodkowane w plasterkach obrazu lub brakuje ich, konieczna jest korekta skanu lokalizacyjnego, w takim przypadku należy ponownie wykonać krok 4.12.
15. Alternatywnie, zastosuj uzupełniający sposób na znalezienie poprawnego 90° puls na podstawie oceny obrazu. Gdy przybliżona moc impulsu zostanie ustalona przy użyciu krzywej nutacji, stopniowo dostosowuj moce impulsów, aby sprawdzić obraz pod kątem B₁-jednorodność pola. Dla niektórych cewek o niejednorodnym B₁ pole, pole 90° moc impulsu wyznaczona na podstawie krzywej nutacji może być zawyżona, co prowadzi do nadmiernego przechylenia w pożądanym punkcie optymalnym cewki. W takim przypadku należy zmniejszyć moc impulsu odniesienia i porównać nowe obrazy z poprzednimiRysunek 5).
16. Ręczne dopasowanie pola magnetycznego na podstawie sygnału FID. Zalecana kolejność wstępnego dopasowania to Z-Z²-Z-X-Y-Z-Z²-Z-XY-XZ-YZ-Z. W przypadku solenoidu główna oś symetrii znajduje się w płaszczyźnie XY. W związku z tym szymy w różnych kierunkach mogą prowadzić do silniejszej korekcji pola B₀ jednorodność dla tej konfiguracji cewek. Współczynniki wyższych rzędów mają niewielki wpływ i mogą być pominięte.
17. Oblicz znormalizowane ze względu na objętość SNR, aby umożliwić porównanie charakterystyk mikrokątek w różnych systemach, zgodnie z adaptacją protokołu producenta¹⁸. W przypadku mikrocewników użytych w tym eksperymencie zastosowano sekwencję spin-echo o następujących parametrach: pole widzenia (FOV) 6 mm × 6 mm, czas powtarzania (TR) 1000 ms, czas echa (TE) 7 ms, macierz 256 × 256 oraz grubość warstwy = 0,5 mm. Dostosuj grubość warstwy tak, aby wzmocnienie odbiornika miało wartość jednostkową. Następnie dostosuj liczbę warstw tak, aby obejmowały one obszar poza B₁-jednorodność pola. Rejestruj obrazy bez uśredniania sygnału, jeśli to możliwe.
    1. Określ znormalizowaną do objętości wartość SNR (SNR/mm³) w dwóch krokach. Najpierw oblicz objętość wokseli (V_woksel)(równ. 1):
          (1)
       UWAGA: Jednostki dla D_x, D_y i D_przekrój są w mm. Obliczenie to można również wykonać dla serii przekrojów.
    2. Wybierz obszary zainteresowania w celu określenia intensywności sygnału (µ_ROI) próbki oraz intensywność sygnału (µ_szum­) oraz odchylenie standardowe (σ_szum­) dla obszaru poza próbką (tj., sygnał średni jest pobierany ze środka obrazu, podczas gdy sygnał szumu jest obliczany na podstawie pól w narożnikach (Rycina 6). Do obliczeń można wykorzystać oprogramowanie sterujące spektrometrem lub uniwersalne oprogramowanie do przetwarzania obrazów. Należy stosować pojedyncze powtórzenie, o ile to możliwe, aby zachować porównywalność między różnymi cewkami.
    3. Użyj wartości do obliczenia znormalizowanego objętościowo SNR (równanie 2):
          (2)
       Dla cewki użytej w niniejszym przypadku w połączeniu z roztworem wzorcowym, zastosowanie równania 2 daje następujące rozwiązanie:
          (3)
       UWAGA: W przypadku porównywania SNR cewek w różnych wartościach natężenia pola magnetycznego, konieczne jest zmierzenie właściwości relaksacyjnych fantomu²³, chyba że stosuje się bardzo długi czas powtórzeń i bardzo krótki czas echa.
18. Sprawdź podatność na problemy spowodowane niejednorodnościami pola magnetycznego: załaduj i uruchom sekwencję wielokrotnych gradientowych echo (MGE)Rycina 7). Niejednorodności pola magnetycznego spowodowane różnicami podatności magnetycznej są widoczne na obrazach z dłuższymi czasami echo, ponieważ echo gradientowe nie refokusuje spinów, które ulegają defazie z powodu statycznych niejednorodności pola. W ten sposób można wizualizować niejednorodności w próbce (spowodowane przestrzeniami powietrznymi w próbce), jak również B₀ niejednorodności pola wprowadzone przez materiał cewnika. Użyj następujących parametrów, które należy dostosować w zależności od specyfikacji używanego spektrometru i cewnika: TR 200 ms, TE 3,5 ms, z 48 echo oddalonymi o 3,5 ms, kąt wzbudzenia 30 stopni. Wielkość macierzy 128 x 128.
    UWAGA: Jeśli w krzywej rezonansu (wahania) zaobserwowano wiele (potencjalnych) modów rezonansowych lub wżęć odbiciowych, należy powtórzyć powyższe kroki dla każdego moda rezonansowego, aby określić ten najbardziej wrażliwy. W zależności od mikrocewki różne części zestawu mikrocewki mogą być podatne na niezamierzone mody rezonansowe.

5. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości

1. Przeprowadź eksperyment 3D-FLASH z następującymi parametrami: TR 70 ms, TE 2,5 ms, rozmiar macierzy 128 x 64 x 64, pole widzenia (FOV) 1,6 x 0,8 x 0,8 mm, kąt wzbudzenia 30° oraz szerokość pasma odbioru 50 kHz.
2. Ustal moc impulsów na podstawie mocy impulsu referencyjnego wyznaczonej wcześniej; w większości oprogramowań do obrazowania proces ten odbywa się automatycznie. Ustal wzmocnienie odbiornika za pomocą automatycznych dostrojeń. Dostosuj pole widzenia (FOV) w razie potrzeby, tak aby objęło cały obiekt w obu kierunkach kodowania fazowego, aby uniknąć aliasingu. Uruchom symulację cyklu pracy gradientu, jeśli jest ona dostępna w systemie, w celu potwierdzenia, że cykl pracy eksperymentu pozostaje w granicach specyfikacji cewek gradientowych.
   UWAGA: Parametry te są specyficzne dla cewki użytej do demonstracji; istotne jest dostosowanie ich do specyfiki lokalnego systemu.

6. Odzyskiwanie próbek do dalszych badań lub przechowywania

1. Wyjmij kapilarę z próbki z mikrocewki.
2. Za pomocą pęsety usuń pod mikroskopem stereoskopowym zatyczki woskowe.
3. Użyj strzykawki, aby wypłukać próbkę z kapilary za pomocą wybranego roztworu. Alternatywnie, użyj szklanej tłoczki do wypchnięcia próbki.
4. Aby zapobiec odwodnieniu próbki, przechowuj ją w odpowiednim środowisku do przechowywania.

Wyniki

Charakterystyka cewki
Po pomyślnym dostrojeniu i dopasowaniu cewki jej wydajność można scharakteryzować za pomocą dobroci cewki Q, impulsu referencyjnego 90° oraz SNR/mm³. Dla zaprezentowanej tutaj cewki solenoidalnej o średnicy wewnętrznej 1,5 mm, dopasowanej pod względem podatności, zmierzona dobroć Q (bez obciążenia) wyniosła 244, w porównaniu do 561 dla cewki typu birdcage o średnicy 5 mm.

Literatura 90° tętno wynosiło 12 µs przy mocy 0,6 W; por. 5 µs przy mocy 45 W dla cewki typu birdcage o średnicy 5 mm (Rycina 4 i Rycina 5). Odpowiada to natężeniu pola impulsu RF (B₁), wykorzystując wynoszącą 0,53 mT dla mikcewki i 1,17 mT dla cewki typu birdcage¹⁴ gdzie $\gamma$ jest stosunkiem gyromagnetycznym, a $\tau$ określa czas trwania impulsu. Ponieważ poziomy mocy impulsu (P) różnią się, cewki można porównać pod kątem wydajności nadawania : 0,69 mT/W^1/2 oraz 0,18 mT/W^1/2 odpowiednio dla mikrocewki i cewki typu birdcage¹⁴Porównując za pomocą a 90° impuls, stwierdzono, że mikicewka stanowi czynnik ≈ czterokrotnie wyższa czułość niż w przypadku cewki klatkowej.

Wpływ dopasowania podatności
Przy ultrawysokich natężeniach pola magnetycznego podatność próbki i cewki staje się dominującym czynnikiem wpływającym na jakość obrazu, co widać w Rysunek 7A,7BW porównaniu z cewką pozbawioną zbiornika z płynem dopasowującym podatność magnetyczną, sygnał w próbce referencyjnej jest utrzymywany dłużej i bardziej homogenicznie. Jednak ze względu na obecność zbiornika podatności maksymalne wymiary próbki ulegają zmniejszeniu w stosunku do cewki bez zbiornika.

Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości
W ciągu 20 godzin i 23 minut uzyskano wysoką rozdzielczość 13 x 13 x 13 μm³ próbki korzenia Medicago truncatula (Rycina 8). Począwszy od powierzchni korzenia, widoczna jest kora korzenia wraz z niewielką ilością pozostałej wody na zewnątrz korzenia. Ponadto ksylem widoczny jest jako ciemny pas otaczający floem. Niektóre pęcherzyki powietrza widoczne są jako ciemne plamy z całkowitą utratą sygnału.

Symbiotyczne guzki korzeniowe M. truncatula mogą być również obrazowane przy użyciu tego protokołu (Rysunek 9). Wykorzystując nieco większą cewkę niedopasowaną (długość około 3500 µm, średnica wewnętrzna 1500 μm), uzyskano obrazy o rozdzielczości do 16 x 16 x 16 μm³ w czasie 33 minut.

Rysunek 1: Mikrocewka solenoidowa. (A) Konstrukcja cewki solenoidowej składa się z drutu nawiniętego helikalnie, zazwyczaj wokół kapilary. Geometria drutu, taka jak jego grubość, średnica, liczba zwojów i odstępy między nimi, wpływa na charakterystykę cewki. (B) Samodzielnie wykonana mikrocewka solenoidowa z zbiornikiem na ciecz dopasowującą podatność (Fomblin). Składa się z powlekanego miedzianego drutu o grubości 0,4 mm, nawiniętego sześć razy wokół kapilary o średnicy zewnętrznej 1500 µm i długości cewki 3500 µm. Cewka jest zanurzona w zbiorniku wykonanym ze strzykawki. Można wstawić kapilary z próbką o średnicy zewnętrznej do 1000 µm. Wykorzystano dwa kondensatory: kondensator 1,5 pF szeregowo z cewką oraz drugi, zmienny kondensator 1,5-6 pF umieszczony równolegle do cewki. Wszystkie elementy są przylutowane do płyty z włókna szklanego (żółta). Jest ona zamocowana na komercyjnym uchwycie (szary polimer), który został zmodyfikowany w celu podparcia zbiornika.  (C) Elementy konstrukcyjne cewki solenoidowej: 1. cewka solenoidowa, 2. kapilara z próbką, 3. kondensator strojący 1,5 pF, 4. zmienny kondensator dopasowujący, 5. baza z włókna szklanego, 6. miedziane wyprowadzenia drutu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowanie próbki pod stereomikroskopem. (A) Elementy niezbędne do przygotowania mikrocewek. Od lewej do prawej: 1. roztwór wzorcowy CuSO₄, 2. perfluorodekalina, 3. mikrocewka, 4. skalpel, 5. pęseta o dodatnim naciągu, 6. pęseta, 7. kapilary o średnicy zewnętrznej = 1000 μm, 8. pisak woskowy, 9. wosk kapilarny, 10. rękawiczki nitrylowe, 11. stereomikroskop, 12. szkło zegarkowe z pokrywką do szalki Petriego, 13. materiał roślinny w podłożu wzrostowym. Nie pokazano: strzykawka 2 mL z igłą ø 0.8 x 40 mm i cienki papier tkankowy. (B) Zbliżenie na wprowadzanie próbki do kapilary za pomocą pęsety, podczas gdy oba elementy pozostają zanurzone. (C) Uszczelnianie kapilary za pomocą roztopionego wosku. (D) Wprowadzanie przygotowanej kapilary do mikrocewki. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Elementy sondy do mikroobrazowania. (A) Podstawa sondy Micro5, zawierająca wszystkie niezbędne przyłącza do chłodzenia wodą, grzania, czujników temperatury, zasilania gradientu, RF (widoczne złącze koncentryczne) oraz opcjonalnie identyfikacji sondy (PICS). Pod podstawą sondy znajdują się pokrętła umożliwiające regulację zmiennych kondensatorów strojących i dopasowujących, a także śruby mocujące, które utrzymują sondę na miejscu wewnątrz spektrometru. (B) Własnej konstrukcji uchwyt mikrocewki zamontowany na podstawie sondy. Zwróć uwagę na kondensatory zmienne (biała ceramika) zamontowane na podstawie sondy, które umożliwiają strojenie i dopasowanie. (C) Zintegrowany gradient 3-osiowy zamontowany na podstawie sondy z gniazdami chłodzenia wodnego i pozłacanymi stykami do uziemienia gradientu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4: Krzywa nutacji. Krzywą nutacji wyznacza się w celu określenia referencyjnej mocy impulsu. Referencyjna moc impulsu (impuls 90°) jest definiowana jako kombinacja mocy i długości impulsu niezbędna do wygenerowania pola B₁, które obraca całą dostępną magnetyzację z kierunku z na płaszczyznę poprzeczną. Seria impulsów jest rejestrowana wyłącznie bez kodowania gradientowego. Przy każdym impulsie zwiększana jest albo długość impulsu, albo jego moc. W tym przypadku moc impulsu została ustawiona na 0,6 W, natomiast długość impulsu była zwiększana o 1 µs przy każdej próbie. Maksymalna intensywność sygnału wskazuje impuls 90°, który występuje przy około 12 µs. W ten sam sposób, wykorzystując minimum intensywności, można również wyznaczyć impuls 180°. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Wizualne wyznaczanie mocy impulsu 90°. Po znalezieniu przybliżonej referencyjnej mocy impulsu za pomocą krzywej nutacji, można ją zweryfikować wizualnie poprzez zmianę długości impulsu. W zależności od cewki, pole B₁ może być w różnym stopniu wrażliwe na zmiany. (A) Długość impulsu 11 µs. (B) Długość impulsu 12 µs, optymalna dla tej cewki. (C) Długość impulsu 13 µs. (D) Długość impulsu 20 µs. Jeśli moc impulsu zostanie ustawiona zbyt wysoko, może dojść do tzw. over-tippingu, co zmniejszy intensywność obrazu w centrum cewki (grot strzałki). Zwiększone pole B₁ zwiększa również zakres cewki, co można zaobserwować po szerokości obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Wyznaczenie obszarów zainteresowania. Przedstawiono obszary zainteresowania (ROI) wykorzystane do obliczenia znormalizowanego objętościowo stosunku sygnału do szumu (SNR). Średnia intensywność próbki jest pobierana z ROI znajdującego się w obrębie próbki roztworu referencyjnego. Średni szum oraz odchylenie standardowe są obliczane z jednego lub większej liczby ROI zlokalizowanych w rogach obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Homogeniczność pola RF oceniona za pomocą obrazowania echem gradientowym. W celu oceny RF stosuje się sekwencję wielokrotnego echa gradientowego (MGE) (B­_1­ -homogeniczność pola za pomocą serii ech gradientowych. Parametry podstawowe były następujące: czas repetycji 200 ms, czas echa 3,5 ms przy liczbie ech 48, odstęp między echami 3,5 ms, 64 średnie, czas akwizycji 27 min 18 s, kąt odchylenia 30°Pole widzenia wynosiło 5 x 5 mm, macierz 128 x 128, rozdzielczość 39 x 39 x 200 µm. (A) Cewka o dopasowanej podatności. Ciecz dopasowująca podatność (Fomblin) otaczająca cewkę RF redukuje efekty podatności wynikające z obecności drutu cewki. Małe pęcherzyki powietrza powodują utratę sygnału wraz ze wzrostem czasu echa. (B) Cewka (nieodpowiednia pod względem podatności magnetycznej) o tej samej średnicy. Przy dłuższych czasach echa nasilają się artefakty wywołane przez B₀ obserwuje się niejednorodność pola. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Rycina 8: Obrazowanie 3D przekroju korzenia Medicago truncatula. (Góra) Obraz FLASH. Można rozróżnić kilka struktur przekroju korzenia, w tym epidermę (e), korę (c), floem (ph) oraz ksylem (xy). Pęcherzyki powietrza (a) w korzeniu powodują całkowitą utratę sygnału. Parametry podstawowe były następujące: czas repetycji 70 ms, czas echa 2,5 ms, 256 średnich, czas akwizycji 20 h 23 m. Rozdzielczość 13 x 13 x 13 µm³_­. Rozmiar macierzy wynosił 128 x 64 x 64, a pole widzenia 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Pasmo odbiornika 50 kHz. (Dół) Obraz MSME. Parametry podstawowe były następujące: czas repetycji 500 ms, czas echa 5,2 ms, 28 średnich, czas akwizycji 15 h 55 m. Rozdzielczość 13 x 13 x 13 µm³_­. Rozmiar macierzy wynosił 128 x 64 x 64, a pole widzenia 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Pasmo odbiornika 70 kHz. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rysunek 9: Obrazowanie 3D brodawki korzeniowej Medicago truncatula. (Góra) Obraz o niskiej rozdzielczości. Podstawowe parametry były następujące: czas repetycji 60 ms, czas echa 2,3 ms, 4 uśrednienia, czas akwizycji 4 m. Rozdzielczość 31 x 31 x 31 µm³_­. Rozmiar macierzy wynosił 64 x 32 x 32, a pole widzenia 2 x 1 x 1 mm. Pasmo odbiorcze 50 kHz. (Dół) Obraz o wysokiej rozdzielczości. Podstawowe parametry były następujące: czas repetycji 60 ms, czas echa 2,3 ms, 8 uśrednień, czas akwizycji 33 m. Rozdzielczość 16 x 16 x 16 µm³_­. Rozmiar macierzy wynosił 128 x 64 x 64, a pole widzenia 2 x 1 x 1 mm. Pasmo odbiorcze 50 kHz. Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Protokół ten najlepiej nadaje się do próbek biologicznych, ponieważ wiele materiałów i próbek geologicznych ma znacznie krótsze czasy relaksacji T2, których nie można zobrazować za pomocą zastosowanych tutaj sekwencji. Nawet niektóre tkanki biologiczne, które wykazują wysoką niejednorodność podatności magnetycznej próbki, mogą być trudne do zobrazowania w ultrawysokim polu, ponieważ efekty są skorelowane z natężeniem pola²⁴. Protokół jest przydatny nie tylko w przypadku nowych cewek, ale może również pomóc w rozwiązywaniu problemów i diagnozowaniu potencjalnych problemów. W przypadku testowania nowych lub nieznanych próbek, protokół ten można wykonać z wyprzedzeniem na roztworze referencyjnym w celu sprawdzenia, czy konfiguracja eksperymentalna działa zgodnie ze specyfikacją. Pomaga to w rozwiązywaniu problemów, ponieważ spektrometr może zostać wykluczony jako źródło artefaktów i usterek. Dodatkowo ustawia to kondensatory strojące i dopasowujące na sondzie na wartości typowe dla mikrocewki.

Gdy w pierwszym eksperymencie nie zostanie zarejestrowany żaden sygnał, pole widzenia skanowania lokalizatora można powiększyć, aby sprawdzić, czy próbka jest widoczna. Następnie sprawdź ponownie, czy cewka jest prawidłowo dostrojona i spróbuj ponownie przeskanować lokalizator. Możliwe, że cewka wykazuje dodatkowe niezamierzone mody rezonansowe, w takim przypadku należy określić właściwy. Jeśli nadal nie można uzyskać obrazu, wyjmij próbkę, aby sprawdzić jej położenie w zespole mikrocewki i sprawdź, czy próbka jest nienaruszona (tj. nie ma pęcherzyków powietrza ani nieszczelności w uszczelkach). Na koniec próbkę można przygotować z użyciem wody zamiast PFD. W przypadku, gdy próbka daje niewielki wykrywalny sygnał w skanowaniu lokalizatora, nadal można wykryć otaczającą wodę w kapilarze.

Ponieważ mikrocewki znajdują się idealnie bardzo blisko próbki, różnice w podatności magnetycznej między powietrzem a drutem mogą powodować dodatkowe straty sygnału, jak pokazano na rysunku 7B. Potencjalne artefakty obejmują błędne mapowanie przestrzenne i anomalne zmiany intensywności sygnału. Szczególnie sekwencje impulsów typu gradient-echo są dotknięte tą niejednorodną utratą sygnału. Z tego powodu zaprezentowaliśmy cewkę dopasowaną do podatności, zanurzając drut w cieczy fluoroobojętnej (Fomblin lub FC-43). Metoda szacowania B₁ zawarta w tym protokole może pomóc w ustaleniu, czy różnice w podatności B₁ uzasadniają włączenie strategii dopasowania podatności do projektu zespołu cewki. Alternatywnym podejściem do konstruowania cewki dopasowanej do podatności jest użycie drutu²⁵ dopasowanego do podatności. Co więcej, w ramach tego podejścia rozwiązywane są tylko problemy z podatnością ze względu na cewkę. Niedopasowanie podatności wewnątrz próbki (np. spowodowane przestrzeniami powietrznymi) nadal stanowi wyzwanie.

Kieszenie lub pęcherzyki powietrza stanowią wyzwanie eksperymentalne, które powoduje rozległe straty sygnału, spowodowane różnicami podatności na styku powietrza i płynu lub próbki¹⁹ (ryc. 5A). Krytycznym aspektem udanego przygotowania próbki jest zanurzenie zarówno próbki, jak i kapilary. Jednak nawet małe pęcherzyki mogą powodować straty sygnału, szczególnie w przypadku sekwencji typu echo gradientowe. Ruchome pęcherzyki powietrza mogą migrować przez kapilarę, dopóki nie zetkną się z próbką. Niektóre z tych efektów można złagodzić, lekko przechylając kapilatę tak, aby jeden koniec był wyższy od drugiego. Przechylanie zapewnia, że potencjalne pęcherzyki powietrza są utrzymywane na miejscu na wyższym końcu, bez naruszania próbki. Ważne jest również, aby sprawdzić, czy wosk kapilarny tworzy dobre uszczelnienie, ponieważ odwodnienie może powodować tworzenie się dużych pęcherzyków powietrza.

W przypadku przestrzeni powietrznych wewnątrz próbki, PFD użyto do wypełnienia międzykomórkowych przestrzeni powietrznych, nie przenikając przez błony komórkowe²⁶. Jednak nawet przy takim podejściu nie byliśmy w stanie usunąć wszystkich przestrzeni powietrznych. Dodatkowo takie podejście oznacza, że potrzebujemy dodatkowego środka, który zwykle nie jest preferowany ze względu na chęć jak najbardziej nieinwazyjnego zbadania systemu.

Cylindryczny kształt naczyń włosowatych oznacza, że układy perfuzyjne powinny być żywotne, szczególnie w przypadku tkanek podatnych na rozpad, takich jak biopsje lub badanie procesów zachodzących w żywym materiale korzeniowym. Dwa kroki mogą zrealizować konfigurację perfuzji. Po pierwsze, podłączenie rurki zasilającej pożywki oraz rurki drenującej po obu stronach kapilary wystarczyłoby do wytworzenia chemostatu. Po drugie, dodanie wgłębienia w kapilarze próbki może utrzymać próbkę w miejscu w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu. Jest to analogiczne do protokołu opublikowanego dla mikrocewek płaskich¹⁰.

Nieinwazyjny charakter obrazowania MR w połączeniu z obojętnym płynem stosowanym w tym protokole (PFD lub Fomblin) oznacza, że po zakończeniu eksperymentów próbki mogą być usuwane z naczyń włosowatych w celu dalszych badań. Kombinacje obejmują mikroskopię optyczną lub elektronową oraz inne techniki obrazowania niszczącego. Niedawno zademonstrowaliśmy połączenie z mikroskopią optyczną na guzkach korzeniowych Medicago truncatula ²⁷.

Zademonstrowaliśmy metodę obrazowania materiału roślinnego za pomocą dedykowanych mikrocewek na spektrometrze NMR w ultra wysokim polu. Stosunkowo duże objętości próbek mogą być badane w wysokiej rozdzielczości z dobrą jednorodnością RF. Co więcej, obrazowanie spektroskopowe może być wykonywane w wyższych rozdzielczościach niż jest to możliwe w innym przypadku. Dostosowanie konstrukcji mikrocewki do próbek jest ułatwione dzięki wydajnej metodzie określania charakterystyki działania cewki. Metoda cewki elektromagnetycznej może być również z łatwością zastosowana do próbek innych niż rośliny, w tym tkanek zwierzęcych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przygotowanie roztworu referencyjnego
CuSO4	Sigma-aldrich	469130	Krystaliczny proszek do tworzenia roztworu referencyjnego
D2O	Sigma-aldrich	151882	Ciecz używana do przygotowania próbki referencyjnej
Waga	Skala Sartorius	PRACTUM513-1S	do ważenia związków
Przygotowanie próbki
Kapilara 1000 μ m (Średnica zewnętrzna)	Hilbenberg GmbH	1408410	Kapilary na próbki
Wosk kapilarny	Hampton Research	HR4-328	Wosk stały używany do uszczelniania próbek
Skalpel jednorazowy	Swann-Morton	nr 11	Służy do ekstrakcji próbek
Perfluorodekalina	Sigma-aldrich	P9900	Płyn używany do zanurzania próbki
Mikroskop stereoskopowy	Olympus	SZ40	Stołowy mikroskop dwuokularowy
Strzykawka		Generic-Służy	do nakładania PFD i manipulowania próbką
Pompa próżniowa	Vacuubrand	MZ2C	Dwustopniowa membranowa pompa próżniowa służąca do usuwania kieszeni powietrznych z próbek.
Długopis woskowy	Hampton Research	HR4-342	Ręczny długopis woskowy służący do topienia i nakładania wosku kapilarnego na próbki
Sprzęt do obrazowania
22.3 T Magnet	Bruker GmbH	950 US2	Wąskootworowy magnes nadprzewodzący
Chłodnica powietrza	Bruker	GmbH-Służy	do regulacji temperatury
sondyKonsola	Bruker GmbH	Avance III HD	Sterowanie działaniem spektrometru
Cewki gradientowe Micro5	Bruker GmbH	Mic5	Wyjmowane cewki gradientowe montowane na korpusie sondy
Micro5 Korpus sondy	Micro5 Bruker GmbH	Mic5	Zawiera mikrocewki i cewki gradientowe Mikrocewka
RF	Zbudowany w domu	-	zawiera Fomblin
Vector Network Analyzer	Copper Mountain Technologies	TR1300/1	Służy do wykonywania testu odbicia S11, zakres częstotliwości od 300 kHz do 1,3 GHz
Chłodnica wodna	Bruker GmbH	BCU-20	Chłodzenie wodne w pętli otwartej do odprowadzania ciepła z pracy cewki gradientowej.