Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

9.3K wyświetleń

DOI:

10.3791/61270

20 maja 2020

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Streszczenie

Przerzuty, główna przyczyna zachorowalności i śmiertelności większości pacjentów z rakiem, mogą być trudne do modelowania przedklinicznie u myszy. Dostępnych jest niewiele modeli spontanicznych przerzutów. Tak więc eksperymentalny model przerzutów polegający na wstrzyknięciu odpowiednich linii komórkowych do żyły ogonowej jest podstawą badań nad przerzutami. Kiedy komórki rakowe są wstrzykiwane do bocznej żyły ogonowej, płuco jest ich preferowanym miejscem kolonizacji. Potencjalnym ograniczeniem tej techniki jest dokładne określenie ilościowe obciążenia przerzutowym guzem płuca. Podczas gdy niektórzy badacze liczą makroprzerzuty o wcześniej określonej wielkości i/lub obejmują mikroprzerzuty po przekroju tkanki, inni określają obszar zmian przerzutowych w stosunku do normalnego obszaru tkanki. Obie te metody oznaczania ilościowego mogą być niezwykle trudne, gdy obciążenie przerzutami jest wysokie. W tym miejscu demonstrujemy model przerzutów do płuc po wstrzyknięciu dożylnym, a następnie zaawansowaną metodę ilościowego określania obciążenia guzem z przerzutami za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Proces ten pozwala na badanie wielu parametrów punktu końcowego, w tym średniej wielkości przerzutów, całkowitej liczby przerzutów i całkowitego obszaru przerzutów, w celu zapewnienia kompleksowej analizy. Co więcej, metoda ta została sprawdzona przez komisję patologów weterynaryjnych certyfikowaną przez American College of Veterinary Pathologists (SEK) w celu zapewnienia dokładności.

Wprowadzenie

Pomimo tego, że jest to bardzo skomplikowany i nieefektywny proces1, przerzuty są znaczącym czynnikiem przyczyniającym się do zachorowalności i śmiertelności pacjentów z rakiem2. W rzeczywistości większość zgonów związanych z rakiem przypisuje się przerzutowemu rozprzestrzenianiu się choroby3,4. Aby komórki nowotworowe mogły pomyślnie dać przerzuty, muszą oderwać się od miejsca pierwotnego, zaatakować przez sąsiedni zrąb, wprowadzić się do krążenia krwi lub układu limfatycznego, przemieszczać się do łożyska naczynia włosowatego w miejscu wtórnym, wynaczyniać się ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wykorzystanie zwierząt było zgodne z przepisami University Laboratory Animal Resources (ULAR) na mocy zatwierdzonego przez OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokołu 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).

1. Iniekcja komórek raka piersi do żyły ogonowej

  1. Przygotowanie komórek i strzykawki do wstrzyknięcia
    1. Na płytkę należy umieścić odpowiednią liczbę komórek w zależności od liczby myszy i stężenia komórek, które mają być użyte.
      UWAGA: Liczba wstrzykniętych komórek i czas do rozwoju przerzutów będą zależeć od użytej linii komórkowej i będą musiały zostać zoptymalizowane. W tej demonstracji ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przypadku użycia nieoznaczeń komórek do wstrzyknięcia do żyły ogonowej, potwierdzenie kolonizacji płuc może być trudne aż do momentu (1) sekcji zwłok, jeśli widoczne są makrometastazy, lub (2) przeprowadzenia analizy histologicznej w przypadku występowania przerzutów mikroskopowych. Przy rozległym obciążeniu płuc guzem przerzutowym u myszy wystąpią trudności w oddychaniu. Jak przy każdym badaniu nad nowotworami, myszy powinny być uważnie monitorowane przez cały czas trwania badania. Użycie komórek znakowanych jest pros.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ponieważ naukowcy nadal stosują dożylne wstrzyknięcie komórek nowotworowych jako eksperymentalny model przerzutów, brakuje standardowych praktyk do analizy wynikowego obciążenia guzem z przerzutami. W niektórych przypadkach można zaobserwować istotne różnice w obciążeniu guzem przerzutowym po manipulacji poszczególnymi liniami komórkowymi i/lub zastosowaniu związków chemicznych w skali makroskopowej. Jednak w innych przypadkach subtelne różnice w wysiewie i wzroście przerzutów mogą zostać przeoczone lub błędnie zinterpre.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Reprezentatywne dane zostały sfinansowane przez National Cancer Institute (K22CA218549 do S.T.S.). Oprócz pomocy w opracowaniu opisanej w niniejszym dokumencie kompleksowej metody analizy, dziękujemy The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (dyrektor – Krista La Perle, DVM, PhD) za usługi histologiczne i immunohistochemiczne oraz Pathology Imaging Core za opracowanie i analizę algorytmów.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podkładki nasączone alkoholemFisher Scientific22-363-750do czyszczenia ogona przed wstrzyknięciem
nożyczki preparacyjneFisher Scientific08-951-5do preparowania myszy i nadmuchiwania tkanki płucnej
DMEM z L-glutaminą, 4,5 g/l glukozy i pirogronianem soduFisher ScientificMT10013CVbaza pożywek do hodowli komórkowych dla linii komórkowych MDA-MB-231 i MVT1
Roztwór soli buforowany fosforanami Dulbecco 1xFisher ScientificMT21030CVstosowany do zawieszania komórek nowotworowych do wstrzykiwań
etanol (70% roztwór)OSUstosowany w celu zminimalizowania sierści myszy podczas sekcji; Zachowaj ostrożność - łatwopalny
niebieski barwnik Evan'sMillipore SigmaE2129stosowany w stężeniu 1 % w sterylnym PBS do ćwiczeń z metodą iniekcji do żyły ogonowej; Zachowaj ostrożność - niebezpieczny odczynnik
Fetal Bull Bydlęca SurowicaMillipore SigmaF4135dodatek do pożywek do hodowli komórkowych; stosowany w 10% w
kleszczachFisher Scientific10-270do rozwarstwiania i inflacji tkanki płucnej
Myszy FVB/NJSyngeniczny szczep myszyJackson Laboratory001800
hemacytometru komórek MVT1 (Bright-Line)Millipore SigmaZ359629do stosowania w hodowlach komórkowych w celu uzyskania liczby komórek
strzykawka insulinowa (28 G)Fisher Scientific14-829-1Bdo wstrzykiwań do żył ogonowych (BD 329424)
Komórki MDA-MB-231ATCCludzka linia komórkowa raka piersi
komórki MVT1igły do komórek guza sutka
myszy (26 G)Fisher Scientific14-826-15używane do nadmuchiwania myszy płuca
neutralna buforowana formalina (10%)Fisher Scientific245685stosowany jako utrwalacz tkanek i do nadmuchiwania tkanki płucnej; należy zachować ostrożność - niebezpieczny odczynnik
NOD. Myszy Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)Laboratorium Jacksona005557utrzymywane przez OSUCCC Walidacja celów Wspólny zasób
Penicylina Streptomycyna 100xThermoFisher15140163dodatek do pożywki do hodowli komórkowych
sterylna gazaFisher ScientificNC9379092do nakładania nacisku na ogon myszy w przypadku wystąpienia krwawienia
strzykawka (5 ml)Fisher Scientific14-955-458używany do nadmuchiwania tkanki płucnej myszy
ograniczający żyły ogonoweBraintree Scientific, Inc.TV-150 STDużywany do krępowania myszy do wstrzykiwań do żył ogonowych
Błękit trypanowy (0,4 %)ThermoFisher15250061stosowany w hodowli komórkowej do oceny żywotności
Trypsyna-EDTA 0,25 %ThermoFisher25200-114stosowany w hodowli komórkowej do oddzielania komórek nowotworowych od płytki
DMEM do, , , ,

Bibliografia

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  2. Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
  3. Gupta, G. P., Massague, J.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

Tagi

Oprogramowanie do analizy obraz wobci enie guzami przerzutowymitkanka barwiona H Ecyfrowa analiza obrazusegmentacja tkanki p ucnejkwantyfikacja przerzut wobrazowanie bioluminescencyjnepatologia weterynaryjna