Artykuł metodologiczny

Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien

DOI:

10.3791/61278

⸱

1 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowy jednoosiowy system bioreaktora do stymulacji mechanicznej jest idealnym bioreaktorem do specyficznego dla tenogenicznego różnicowania komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien i tworzenia neościęgien.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tendinopatia to powszechna przewlekła choroba ścięgien związana ze stanem zapalnym i zwyrodnieniem w okolicy ortopedycznej. Ze względu na wysoką zachorowalność, ograniczoną zdolność do samonaprawy i, co najważniejsze, brak ostatecznych metod leczenia, tendinopatia nadal negatywnie wpływa na jakość życia pacjentów. Komórki macierzyste pochodzące ze ścięgien (TDSC), jako pierwotne komórki prekursorowe komórek ścięgien, odgrywają istotną rolę zarówno w rozwoju tendinopatii, jak i w odbudowie funkcjonalnej i strukturalnej po tendinopatii. W związku z tym przydatna byłaby metoda, która może in vitro naśladować różnicowanie in vivo TDSC w komórki ścięgien. W tym przypadku niniejszy protokół opisuje metodę opartą na trójwymiarowym (3D) jednoosiowym systemie rozciągania w celu stymulacji TDSC do różnicowania się w tkanki przypominające ścięgna. Istnieje siedem etapów obecnego protokołu: izolacja TDSC myszy, hodowla i ekspansja TDSC myszy, przygotowanie pożywki do hodowli stymulacyjnej do tworzenia arkusza komórkowego, tworzenie arkusza komórkowego przez hodowlę w pożywce stymulującej, przygotowanie konstrukcji komórek macierzystych ścięgna 3D, montaż jednoosiowo-rozciągającego kompleksu stymulacji mechanicznej oraz ocena mechanicznie stymulowanej tkanki przypominającej ścięgno in vitro. Skuteczność wykazano za pomocą badania histologicznego. Cała procedura trwa niecałe 3 tygodnie. Aby pobudzić odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej, w pożywce do hodowli stymulacyjnej zastosowano kwas askorbinowy o stężeniu 4,4 mg/mL. Oddzielona komora z silnikiem liniowym zapewnia dokładne obciążenie mechaniczne i jest przenośna i łatwa do regulacji, co jest stosowane w bioreaktorze. Reżim obciążenia w niniejszym protokole wynosił 6% obciążenia, 0,25 Hz, 8 godzin, po których następowało 16 godzin odpoczynku przez 6 dni. Protokół ten może naśladować różnicowanie komórek w ścięgnie, co jest pomocne w badaniu patologicznego procesu tendinopatii. Co więcej, tkanka przypominająca ścięgno jest potencjalnie wykorzystywana do wspomagania gojenia się ścięgien w urazie ścięgna jako zmodyfikowany przeszczep autologiczny. Podsumowując, obecny protokół jest prosty, ekonomiczny, powtarzalny i ważny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tendinopatia jest jednym z najczęstszych urazów sportowych. Objawia się głównie bólem, miejscowym obrzękiem, zmniejszonym napięciem mięśniowym w dotkniętym obszarze i dysfunkcją. Częstość występowania tendinopatii jest wysoka. Obecność tendinopatii Achillesa występuje najczęściej u biegaczy średnio- i długodystansowych (do 29%), podczas gdy obecność tendynopatii rzepki jest również wysoka u sportowców siatkówki (45%), koszykówki (32%), lekkoatletyki (23%), piłki ręcznej (15%) i piłki nożnej (13%)1,2,3,4,5. Jednak ze względu na ograniczoną zdolność ścięgna do samoleczenia i brak skutecznych metod leczenia, tendinopatia nadal negatywnie wpływa na życie pacjentów6,7. Ponadto patogeneza tendinopatii pozostaje niejasna. Przeprowadzono wiele badań nad jego patogenezą, w tym głównie "teorię zapalenia", "teorię zwyrodnienia", "teorię nadużywania" i tak dalej8. Obecnie wielu badaczy uważa, że tendinopatia jest spowodowana nieudaną samonaprawą mikrourazów spowodowanych nadmiernym obciążeniem mechanicznym, którego doświadcza ścięgno9,10.

Komórki macierzyste pochodzące ze ścięgien (TDSC), jako pierwotne komórki prekursorowe komórek ścięgien, odgrywają istotną rolę zarówno w rozwoju tendinopatii, jak i w funkcjonalnym i strukturalnym odbudowie po tendinopatii11,12,13. Doniesiono, że stymulacja stresem mechanicznym może powodować proliferację i różnicowanie osteocytów, osteoblastów, komórek mięśni gładkich, fibroblastów, mezenchymalnych komórek macierzystych i innych komórek wrażliwych na siłę14,15,16,17,18. Dlatego TDSC, jako jedna z mechanowrażliwych i multipotencjalnych komórek, może być podobnie stymulowana do różnicowania przez obciążenie mechaniczne19,20.

Jednak różne parametry obciążenia mechanicznego (siła obciążenia, częstotliwość obciążenia, typ obciążenia i okres obciążenia) mogą skłonić TDSC do różnicowania się w różne komórki21. W związku z tym skuteczny i ważny reżim obciążenia mechanicznego jest bardzo istotny dla tenogenezy. Ponadto istnieją różne rodzaje bioreaktorów jako systemów stymulacji, które są obecnie wykorzystywane do mechanicznego obciążania TDSC. Zasada działania każdego rodzaju bioreaktora jest inna, więc parametry obciążenia mechanicznego odpowiadające różnym bioreaktorom są również różne. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na prosty, ekonomiczny i powtarzalny protokół stymulacji, obejmujący typ bioreaktora, odpowiednie medium stymulacyjne i reżim obciążenia mechanicznego.

Niniejszy artykuł opisuje metodę opartą na trójwymiarowym (3D) jednoosiowym systemie rozciągania, który stymuluje TDSC do różnicowania się w tkankę podobną do ścięgna. Protokół składa się z siedmiu etapów: izolacja TDSC myszy, hodowla i ekspansja TDSC myszy, przygotowanie pożywki do hodowli stymulacyjnej do tworzenia arkusza komórkowego, tworzenie arkusza komórkowego przez hodowlę w pożywce stymulującej, przygotowanie konstrukcji komórek macierzystych ścięgna 3D, montaż jednoosiowo-rozciągającego kompleksu stymulacji mechanicznej oraz ocena mechanicznie stymulowanej tkanki przypominającej ścięgno in vitro. Cała procedura zajmuje mniej niż 3 tygodnie, aby uzyskać konstrukcję komórki 3D, czyli znacznie mniej niż niektóre istniejące metody22,23. Udowodniono, że obecny protokół jest w stanie skłonić TDSC do różnicowania się w tkankę ścięgna i jest bardziej niezawodny niż obecnie powszechnie stosowany dwuwymiarowy (2D) system rozciągania21. Skuteczność wykazano za pomocą badania histologicznego. Krótko mówiąc, obecny protokół jest prosty, ekonomiczny, powtarzalny i ważny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane metody zostały zatwierdzone i wykonane zgodnie z wytycznymi i przepisami Komitetu Etyki Zwierząt Uniwersytetu Australii Zachodniej.

1. Izolacja myszy TDSC

  1. Poddaj eutanazji 6-8-tygodniowe myszy C57BL/6 przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Żniwo ścięgien rzepki24 i ścięgna Achillesa25.
  3. Trawić ścięgna z jednego z 6 ml kolagenazy typu I (3 mg/ml) przez 3 godziny
    UWAGA: Ponieważ rozmiar ścięgna u myszy jest mały, w tym kroku należy użyć wszystkich ścięgien pobranych od jednej myszy.
  4. Zebrać komórki i hodowlę w kompletnym minimalnym podłożu niezbędnym (Alpha-MEM) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% mieszaniny streptomycyny i penicyliny przez 7 dni.
  5. Identyfikacja TDSC za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją za pomocą cytometrii przepływowej (ekspresja markerów powierzchniowych komórek, w tym CD44, CD90 i Sca-1; brak ekspresji CD34 i CD45).
  6. Przejście i zamrożenie komórek (pasaż 4 komórki zostaną wykorzystane do dalszych kroków).

2. Hodowla i ekspansja myszy TDSC

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Weź rozgrzane komórki (myszy TDSC, 1 milion komórek, pasaż 4, do 37 °C).
  2. Powoli dodawaj dodatkowe 4-5 ml kompletnego Minimal Essential Medium (Alpha-MEM).
  3. Przenieść mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety.
  4. Uzupełnić pożywką do 8 ml za pomocą pipety.
    1. Podgrzewanie podłoża w inkubatorze w piekarniku o temperaturze 37 °C.
  5. Umieść probówkę w wirówce i zrównoważ.
  6. Odwirować i osadzać komórki przy 347 x g przez 5 min.
  7. Wyjmij po odwirowaniu i sprawdź osad na dnie.
  8. Zdekantuj pożywkę do zamrażania i delikatnie zawieś komórki w 1-2 ml kompletnego podłoża (unikaj tworzenia zbyt wielu pęcherzyków).
  9. Przenieść zawieszone komórki do kolby T-75 za pomocą pipety.
  10. Za pomocą pipety dodaj kompletną pożywkę Alpha-MEM do kolby, aby osiągnąć całkowitą objętość 10 ml przy końcowym stężeniu 13 000 komórek/cm2.
  11. Umieścić kolbę w inkubatorze i hodować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  12. Zmieniaj podłoże co 3 dni.
  13. Obserwuj i monitoruj komórki pod mikroskopem podczas zmiany pożywki, aż komórki zostaną wyhodowane do 100% zbiegu (około 40 000 komórek/cm2).

3. Przygotowanie pożywki do hodowli stymulacyjnej do tworzenia arkuszy komórkowych

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Wlać 15 ml kompletnej pożywki Alpha-MEM do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
  2. Dodać 6 μl kwasu askorbinowego (11 mg/ml) do 15 ml pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 4,4 μg/ml.
    UWAGA: Dodatkowo dodanie czynnika wzrostu tkanki łącznej o stężeniu 25 ng / ml do pożywki hodowlanej stymulującej może przyspieszyć cały proces wzrostu i różnicowania.
  3. Mieszaj delikatnie, odwracając górę idół.

4. Tworzenie arkuszy komórkowych przez hodowlę w pożywce stymulacyjnej

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Ostrożnie wyrzucić normalną, kompletną pożywkę alfa-MEM i unikać dotykania komórek przymocowanych do dna kolby.
  2. Powoli dodawaj 10 ml pożywki stymulacyjnej, unikając powodowania jakichkolwiek zakłóceń w pełni zlewających się komórek.
  3. Hodować komórki w pożywce stymulacyjnej przez 9 dni (zmieniać pożywkę co 3 dni), aby w wystarczającym stopniu wytworzyć arkusz komórek w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Macierz zewnątrzkomórkowa stanie się gruba i będzie mętna, gdy będzie obserwowana z dna kolby po stymulacji kwasem askorbinowym, co oznacza, że arkusz komórkowy jest wystarczająco wygenerowany.

5. Przygotowanie konstrukcji 3D z komórek macierzystych ścięgna

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Wyjąć kolbę z inkubatora.
  2. Całkowicie wyrzuć pożywkę stymulującą.
  3. Przepłukać jednowarstwowy arkusz komórek solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), obracając kolbą.
  4. Całkowicie wyrzuć PBS.
  5. Za pomocą pipety dodaj 1 ml 0,25% trypsyny do rogu kolby.
  6. Postukaj w róg kolby, aby odczepić jednowarstwowy arkusz komórek, aż róg arkusza komórek znajdzie się poza dnem kolby.
  7. Natychmiast dodaj 9 ml kompletnej pożywki Alpha-MEM, aby zatrzymać trypsynizację.
  8. Kontynuować obracanie kolby, aby całkowicie oderwać jednowarstwowy arkusz komórek.
  9. Wlej cały odczepiony arkusz komórek na szalkę Petriego z pożywką.
  10. Użyj sterylnej pęsety, aby podnieść jeden róg arkusza komórek i obróć w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara 15 razy.
  11. Podnieś drugi koniec arkusza komórkowego i obróć go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara 10 razy, aby mocno wytworzyć konstrukcję in vitro przypominającą ścięgno (ryc. 1A).

6. Montaż jednoosiowo-rozciągającego kompleksu stymulacji mechanicznej w specjalnie zaprojektowanym bioreaktorze

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Połącz haczyki za pomocą łącznika i ustaw żądaną odległość (2 cm) między dwoma hakami.
  2. Delikatnie nawiń konstrukcję 3D TDSC na zmontowany hak 3 razy na każdym haku (Rysunek 1B).
  3. Przymocuj haki z konstrukcją komórkową do komory bioreaktora, dokręcając na dwóch końcach.
    UWAGA: Cała komora, łącznie ze i haczykami, jest sterylna (autoklaw przez 1,5 h w temperaturze 134 °C i naświetlanie promieniami ultrafioletowymi (UV) przez 24 godziny przed użyciem). W przypadku metalowego uchwytu komór światło UV należy wystawiać na działanie promieni UV przez 48 godzin przed użyciem.
  4. Napełnij komorę kompletną pożywką Alpha-MEM.
  5. Podłącz siłownik do komory hodowlanej za pomocą.
  6. Przetnij łącznik haczyków sterylnymi nożyczkami.
  7. Włącz zasilanie i odpowiedni kontroler kanałów, aby rozpocząć stymulację mechaniczną.
  8. Załóż pokrywę na komorę.
  9. Sprawdź lampki kontrolne i upewnij się, że bioreaktor działa prawidłowo.
  10. Umieść bioreaktor w inkubatorze i poddaj konstrukcję komórki 3D mechanicznemu rozciąganiu przez 6 dni (6% rozciąganie, 0,25 Hz, 8 godzin, a następnie 16 godzin odpoczynku).

7. Ocena mechanicznie stymulowanej tkanki ścięgna in vitro

  1. Poluzuj śrubokrętem i ostrożnie zdejmij zespół.
  2. Umieść tkankę przypominającą ścięgno w 4% paraformaldehydzie w celu utrwalenia na 15 minut.
  3. Umieść utrwaloną tkankę przypominającą ścięgno w kasecie biopsyjnej z podkładkami z pianki biopsyjnej.
  4. Proces odwadniania próbki i ostateczna ocena za pomocą barwienia histologicznego H&E.
  5. Powtórz cały protokół i wyekstrahuj RNA z tkanki przypominającej ścięgno w celu oceny ekspresji markerów tenogennych za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Startery dla wybranych genów są wymienione w tabeli 1.
    UWAGA: Protokół histologiczny i protokół qPCR są standardowe i zgodne z poprzednim badaniem21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed stymulacją mechaniczną, TDSC były uprawiane do 100% zbieżności w pełnym podłożu i wykazywały zdezorganizowaną morfologię ultrastrukturalną (Rysunek 2A). Po 6 dniach jednoosiowego obciążenia mechanicznego rozciągającego, macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) i wyrównanie komórek były dobrze zorientowane (ryc. 2B). Komórki były dobrze wypełnione i dobrze otoczone ECM po mechanicznym obciążeniu. Wykazano, że morfologia komórek jest wydłużona i była bardziej podobna do normalnej komórki ścię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ścięgno jest mechanicznie wrażliwą włóknistą tkanką łączną. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, nadmierne obciążenie mechaniczne może prowadzić do osteogennego różnicowania komórek macierzystych ścięgien, podczas gdy niewystarczające obciążenie prowadziłoby do zaburzenia struktury włókien kolagenowych podczas różnicowania ścięgien21.

Powszechny pogląd głosi, że kluczem do idealnego bioreaktora jest możliwość symulacji mikrośrodowiska komórkowego in vitro, w którym znajd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania zostały przeprowadzone w czasie, gdy autor otrzymywał "stypendium University of Western Australia International Fee oraz University Postgraduate Award na Uniwersytecie Australii Zachodniej". Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81802214).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas askorbinowySigma-aldrichPHR1008-2G
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibcoä od Life Technologies1908361
Procesor histologicznyLeicaTP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)Gibcoä firmy Life Technologies2003802
Komórkamacierzysta pochodząca ze ścięgna myszyIzolowany ze ścięgien Achillesa myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni. Następnie trawiony kolagenazą typu I (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) przez 3 godziny i przepuszczono przez sitko o średnicy 70 mm, aby uzyskać zawiesiny jednokomórkowe.
ParaformaldehydSigma-aldrich441244
mieszanina streptomycyny i penicylinyGibcoä firmy Life Technologies15140122
Trójwymiarowy jednoosiowy system bioreaktorów do stymulacji mechanicznejCentrum Ortopedycznych Badań Translacyjnych, Szkoła Medyczna, Uniwersytet AustraliiZachodniejDostępne u autora korespondencyjnego na życzenie. Lub zrób to zgodnie z naszym projektem* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programowalna stymulacja mechaniczna wpływa na homeostazę ścięgien w układzie bioreaktora. Biotechnol Bioeng. 2013; 110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
TrypsinGibcoä by Life Technologies1858331

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper's knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), Bristol, Avon. 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), Oxford, England. 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), Oxford, England. 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221(2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075(2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), Bristol, England. 014109(2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251(2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810(2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280(2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164(2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), Cambridge, England. 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43(2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Jednoosiowe rozci ganie 3Dtworzenie arkuszy kom rkowychfrakcja naczyniowo stromalnacytometria przep ywowatraktowanie kwasem askorbinowymocena histologicznaanaliza qPCR

Powiązane artykuły