2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Podsumowanie

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (<35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

Streszczenie

Metody sekwencjonowania oparte na spektrometrii mas (MS) okazały się przydatne w bezpośrednim sekwencjonowaniu RNA bez potrzeby stosowania komplementarnego DNA (cDNA) pośredniego. Jednak takie podejścia są rzadko stosowane jako metoda sekwencjonowania de novo RNA, ale stosowane głównie jako narzędzie, które może pomóc w zapewnieniu jakości w celu potwierdzenia znanych sekwencji oczyszczonych jednoniciowych próbek RNA. Niedawno opracowaliśmy metodę bezpośredniego sekwencjonowania RNA, integrując dwuwymiarową strategię hydrofobowego znakowania końców w czasie zatrzymywania masy z sekwencjonowaniem opartym na MS (2D-HELS MS Seq). Metoda ta jest w stanie dokładnie sekwencjonować pojedyncze sekwencje RNA, a także mieszaniny zawierające do 12 różnych sekwencji RNA. Oprócz czterech kanonicznych rybonukleotydów (A, C, G i U), metoda ma zdolność sekwencjonowania oligonukleotydów RNA zawierających zmodyfikowane nukleotydy. Jest to możliwe, ponieważ zmodyfikowana zasada nukleotydowa ma albo wewnętrznie unikalną masę, która może pomóc w jej identyfikacji i lokalizacji w sekwencji RNA, albo może zostać przekształcona w produkt o unikalnej masie. W tym badaniu wykorzystaliśmy RNA, zawierający dwa reprezentatywne zmodyfikowane nukleotydy (pseudourydyna (Ψ) i 5-metylocytozyna (m⁵C)), aby zilustrować zastosowanie metody sekwencjonowania de novo pojedynczego oligonukleotydu RNA, a także mieszaniny oligonukleotydów RNA, z których każdy ma inną sekwencję i / lub zmodyfikowane nukleotydy. Opisane tutaj procedury i protokoły sekwencjonowania tych modelowych RNA będą miały zastosowanie do innych krótkich próbek RNA (<35 nt) przy użyciu standardowego systemu LC-MS o wysokiej rozdzielczości, a także mogą być stosowane do weryfikacji sekwencji zmodyfikowanych terapeutycznych oligonukleotydów RNA. W przyszłości, wraz z opracowaniem bardziej niezawodnych algorytmów i lepszych instrumentów, Metoda ta może pozwolić na sekwencjonowanie bardziej złożonych próbek biologicznych.

Wprowadzenie

Metody sekwencjonowania oparte na spektrometrii mas (MS), w tym MS z góry na dół i tandemowe MS1^,2,3,4, zostały opracowane do bezpośredniego sekwencjonowania RNA. Jednak techniki fragmentacji in situ do skutecznego generowania wysokiej jakości drabinek RNA w spektrometrach mas nie mogą być obecnie stosowane do sekwencjonowania de novo5^,6. Co więcej, analiza tradycyjnych jednowymiarowych (1D) danych MS do sekwencjonowania de novo nawet jednej oczyszczonej sekwencji RNA nie jest zbyt trywialna, a jeszcze trudniejsze byłoby dla sekwencjonowania MS mieszanych próbek RNA^7,8. W związku z tym opracowano dwuwymiarową (2D) metodę sekwencjonowania RNA opartą na chromatografii cieczowej (LC)-MS, obejmującą produkcję drabinek czasu retencji masy 2D (t_R) w celu zastąpienia drabinek masowych 1D, co znacznie ułatwia identyfikację komponentów drabinki potrzebnych do sekwencjonowania de novo RNAs⁸. Jednak metoda sekwencjonowania RNA oparta na 2D LC-MS ogranicza się głównie do oczyszczonego syntetycznego krótkiego RNA, ponieważ nie może odczytać pełnej sekwencji wyłącznie w oparciu o jedną drabinkę, ale musi polegać na dwóch współistniejących sąsiednich drabinkach (drabinkach 5' i 3')8. Mówiąc dokładniej, podejście to wymaga dwukierunkowych odczytów sparowanych końców do odczytu końcowych zasad nukleotydowych w regionie o niskiej masie⁸. Dodatkowa złożoność odczytu sparowanych końców powoduje, że metoda ta jest nie do utrzymania w przypadku sekwencjonowania mieszanin RNA, ponieważ powstaje zamieszanie co do tego, który fragment drabiny należy do której drabiny dla nieznanych próbek.

Aby pokonać wyżej wymienione bariery w podejściu do sekwencjonowania RNA opartego na MS i rozszerzyć takie zastosowania w bezpośrednim sekwencjonowaniu RNA, należy zająć się dwoma kwestiami: 1) jak wygenerować wysokiej jakości drabinkę masy, która może być użyta do odczytania pełnej sekwencji, od pierwszego nukleotydu do ostatniego w nici RNA, oraz 2) jak skutecznie zidentyfikować każdą drabinkę RNA/masa w złożonym zestawie danych MS. Wraz z dobrze kontrolowaną degradacją kwasów, opracowaliśmy nową metodę sekwencjonowania, wprowadzając hydrofobową strategię znakowania końców (HELS) do techniki sekwencjonowania opartej na MS i z powodzeniem rozwiązaliśmy te dwa problemy, dodając znacznik hydrofobowy na końcu 5' i/lub 3' RNA, które mają być sekwencjonowane⁹. Ta metoda tworzy "idealną" drabinkę sekwencji z RNA - każdy fragment drabinki pochodzi z rozszczepienia RNA specyficznego dla miejsca wyłącznie na każdym wiązaniu fosfodiestrowym, a różnica masy między dwoma sąsiednimi fragmentami drabinki jest dokładną masą modyfikacji nukleotydu lub nukleotydu w tej pozycji ^8,9,10. Jest to możliwe, ponieważ uwzględniamy wysoce kontrolowany etap hydrolizy kwasowej, w którym RNA jest fragmentowane średnio raz na cząsteczkę, zanim zostanie wstrzyknięte do urządzenia. W rezultacie, każdy produkt degradacji fragmentu jest wykrywany na spektrometrze mas, a wszystkie fragmenty razem tworzą drabinkę sekwencjonowania^8,9,10. Ta nowa strategia umożliwia pełny odczyt sekwencji RNA z jednej pojedynczej drabinki nici RNA bez odczytu sparowanego końca z drugiej drabinki RNA, a dodatkowo umożliwia sekwencjonowanie MS mieszanin RNA z wieloma różnymi niciami, które zawierają kombinatoryczne modyfikacje nukleotydów⁹. Dodając znacznik na końcu 5' i/lub 3' RNA, znakowane fragmenty drabinki wykazują znaczne opóźnienie t_R, co może pomóc w odróżnieniu dwóch drabinek masowych od siebie, a także od hałaśliwego obszaru o niskiej masie. Przesunięcie_{masy R} spowodowane dodaniem znacznika hydrofobowego ułatwia identyfikację drabinki masy i upraszcza analizę danych w celu generowania sekwencji. Co więcej, dodanie znacznika hydrofobowego może pomóc w identyfikacji końcowej zasady w nici, zapobiegając znajdowaniu się odpowiadającego mu fragmentu drabinki w hałaśliwym obszarze_R o niskiej masie z powodu wzrostu masy i hydrofobowości spowodowanego przez znacznik, umożliwiając w ten sposób identyfikację pełnej sekwencji RNA z pojedynczej drabinki; Nie są wymagane żadne odczyty sparowanych końców. W rezultacie, wcześniej wykazaliśmy udane sekwencjonowanie złożonej mieszaniny do 12 odrębnych nici RNA bez użycia jakiegokolwiek zaawansowanego algorytmu sekwencjonowania⁹, co otwiera drzwi do sekwencjonowania de novo MS RNA zawierającego zarówno kanoniczne, jak i zmodyfikowane nukleotydy i sprawia, że sekwencjonowanie mieszanych i bardziej złożonych próbek RNA jest bardziej wykonalne. W rzeczywistości, korzystając z 2D-HELS MS Seq, udało nam się nawet zsekwencjonować mieszaną populację próbek tRNA^{10 i aktywnie rozszerzamy} jego zastosowanie na inne złożone próbki RNA.

Aby ułatwić 2D-HELS MS Seq bezpośrednie sekwencjonowanie szerszego zakresu próbek RNA, tutaj skupimy się na technicznych aspektach tego podejścia do sekwencjonowania i omówimy wszystkie niezbędne kroki potrzebne do zastosowania techniki bezpośredniego sekwencjonowania próbek RNA. Konkretne przykłady zostaną wykorzystane do zilustrowania techniki sekwencjonowania, w tym syntetycznych pojedynczych sekwencji RNA, mieszanin wielu odrębnych sekwencji RNA oraz zmodyfikowanych RNA zawierających zarówno kanoniczne, jak i zmodyfikowane nukleotydy, takie jak pseudourydyna (ψ) i 5-metylocytozyna (m⁵C). Ponieważ wszystkie RNA zawierają wiązania fosfodiestrowe, każdy rodzaj RNA może być hydrolizowany kwasem w celu wygenerowania idealnej drabiny sekwencji dla 2D-HELS MS Seq w optymalnych warunkach^8,9. Jednak wykrycie wszystkich fragmentów drabinkowych danego RNA jest zależne od instrumentu. W standardowym LC-MS o wysokiej rozdzielczości (40K) minimalna ilość ładunku do sekwencjonowania oczyszczonej próbki krótkiego RNA (<35 nt) wynosi 100 pmol na serię. Potrzeba jednak więcej materiału (do 400 pmol na próbkę RNA), gdy konieczne jest przeprowadzenie dodatkowych eksperymentów (np. w celu rozróżnienia modyfikacji zasad izomerycznych, które mają identyczne masy). Protokół stosowany w sekwencjonowaniu modelowych syntetycznych zmodyfikowanych RNA będzie miał również zastosowanie do sekwencjonowania szerszych próbek RNA, w tym próbek biologicznego RNA z nieznanymi modyfikacjami zasad. Jednak do sekwencjonowania kompletnego tRNA ze wszystkimi modyfikacjami wymagana jest jeszcze większa ilość próbki, taka jak 1000 pmol do sekwencjonowania tRNA (~76 nt) przy użyciu standardowego instrumentu LC-MS, a do jego sekwencjonowania de novo należy opracować zaawansowany algorytm sekwencjonowania de novo¹⁰.

Protokół

1. Projektowanie oligonukleotydów RNA

1. Zaprojektuj syntetyczne oligonukleotydy RNA o różnych długościach (19 nt, 20 nt i 21 nt), w tym jeden (RNA #6) zarówno z kanonicznymi, jak i zmodyfikowanymi nukleotydami. ψ jest stosowany jako model dla modyfikacji niezmieniających masy, co jest wyzwaniem dla sekwencjonowania MS, ponieważ ma identyczną masę jak U. m⁵C jest wybierany jako model dla modyfikacji zmieniających masę, aby zademonstrować solidność podejścia.
   
   RNA #1: 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCAAAA-OH-3'
   RNA #2: 5'-HO-AUAGCCCAGUCAGUCUACGC-OH-3'
   RNA #3: 5'-HO-AAACCGUUACCAUUACUGAG-OH-3'
   RNA #4: 5'-HO-GCGUACAUUCCCCUUUAU-OH-3'
   RNA #5: 5'-HO-GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGA-OH-3'
   RNA #6: 5'-HO-AAACCGUψACCAUUAm⁵CUGAG-OH-3'
    
2. Rozpuścić każdy syntetyczny RNA w wodzie poddanej działaniu pirowęglanu dietylu (DEPC) bez nukleaz (wyrażonej jako H₂O poddane działaniu DEPC), aby otrzymać roztwór podstawowy 100 mM RNA. Roztwory podstawowe są przechowywane przez długi czas w temperaturze -20 °C.
3. Aby uniknąć możliwej degradacji próbki RNA, należy używać materiałów eksperymentalnych wolnych od RNaz, w tym wody uzdatnionej DEPC, probówek do mikrowirówek i końcówek do pipet. Często wycieraj powierzchnie materiałów laboratoryjnych za pomocą chusteczek do usuwania RNazy.

2. Oznacz koniec 3' RNA biotyną

1. Dwuetapowy protokół reakcji (adenylacja i ligacja)
   1. Dodać 1 μL 10x buforu do reakcji adenylacji zawierającego 50 mM octanu sodu, pH 6,0, 10 mM MgCl₂, 5 mM dichlorodifenylotrichloroetanu (DTT), 0,1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 1 μL 1 mM ATP, 1 μL 100 μM biotynylowanego bisfosforanu cytydyny (pCp-biotyny), 1 μL 50 μM ligazy Mth RNA, i 6 μl_{2 O}poddanego działaniu DEPC (całkowita objętość 10 μl) do cienkościennej probówki PCR o pojemności 0,2 ml bez RNaz.
      UWAGA: Odczynniki należy przechowywać w temperaturze -20 °C przed reakcją dwuetapową. Rozmrozić odczynniki w temperaturze pokojowej i dobrze wymieszać przez wirowanie i odwirowanie przed dodaniem do reakcji.
   2. Inkubować reakcję w maszynie do PCR w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę i dezaktywować reakcję w temperaturze 85 °C przez 5 minut.
   3. Przeprowadzić etap ligacji w wolnej od RNaz, cienkościennej probówce PCR o pojemności 0,2 ml zawierającej 10 μl roztworu reakcyjnego z poprzedniego etapu, dodając 3 μl 10x buforu reakcyjnego ligazy T4 RNA zawierającego 50 mM tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1,5 μl 100 mM próbki RNA, która ma być sekwencjonowana, 3 μl bezwodnego dimetylosulfotlenku (DMSO) do osiągnięcia 10% (v/v), 1 μl ligazy RNA T4 (10 jednostek/μl) i 11,5 μl_H2Opoddanego działaniu DEPC (dla całkowitej objętości 30 ml). Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C w maszynie do PCR.
      UWAGA: Połączyć składniki reakcji w temperaturze pokojowej ze względu na wysoką temperaturę zamarzania DMSO (18,45 °C).
   4. Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C.
   5. Stłumić i oczyścić reakcję przez oczyszczanie kolumnowe w celu usunięcia enzymów i wolnej pCp-biotyny za pomocą Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA, USA). W zestawie znajduje się bufor wiążący oligo, bufor do przemywania DNA, kolumny wirowe i probówki zbiorcze. Dodać 20 ml H₂O poddanego działaniu DEPC do roztworu reakcyjnego, aby osiągnąć objętość 50 ml próbki przed dodaniem buforu wiążącego.
   6. Dodać 100 ml buforu wiążącego do każdego roztworu reakcyjnego. Dodać 400 μl etanolu, wymieszać pipetując i przenieść mieszaninę do kolumny. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s. Odrzuć przepływ.
   7. Dodać 750 μl buforu do przemywania DNA do kolumny. Wirować przy 10 000 x g i maksymalnej prędkości odpowiednio przez 30 s i 1 minutę.
   8. Przenieść kolumnę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 15 μl H₂O poddanego działaniu DEPC do kolumny i odwirować przy 10 000 x g przez 30 s w celu elucji produktu RNA.
      UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu wykonania następnego etapu.
2. Jednoetapowy protokół reakcji
   1. Przeprowadzić jednoetapową reakcję znakowania, łącząc 2 μl 150 μM adenozyno-5'-5'-difosforanu-{5'-(cytydyno-2'-O-metylo-3'-fosforanu-TEG}C-biotyny (AppCp-biotyny), 3 μL 10x buforu reakcyjnego ligazy, 1,5 μL 100 mM próbki RNA, która ma być sekwencjonowana, 3 μL bezwodnego DMSO do osiągnięcia 10% (v/v), 1 μl ligazy T4 RNA (10 jednostek/μl) i 19,5 μl_H2Opoddanych działaniu DEPC (dla całkowitej objętości 30 ml) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz.
   2. Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C w maszynie do PCR.
   3. Wykonaj oczyszczanie kolumny zgodnie z powyższym opisem w krokach 2.1.5-2.1.8.
      UWAGA: Przygotuj oddzielną/wyłączną probówkę reakcyjną dla każdej próbki RNA (skala 150 pmol RNA). Może być konieczne znakowanie końca 5' RNA za pomocą sulfocyjaniny3 (Cy3) lub Cy3 (np. do weryfikacji sekwencjonowania dwukierunkowego). Metoda ta różni się od metody 3'-biotynylacji i została opisana w poprzedniej publikacji⁹.

3. Przechwytywanie próbki biotynylowanego RNA na kulkach streptawidyny

1. Aktywuj 200 μl kulek magnetycznych streptawidyny C1, dodając 200 μl 1x bufor czarno-biały (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml bez RNaz. Zwiruj ten roztwór i umieść go na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Następnie wyrzucić supernatant, ostrożnie odpipetowując roztwór.
2. Przemyć kulki dwukrotnie 200 μl roztworu A (0,1 M NaOH poddanego działaniu DEPC i 0,05 M NaCl poddanego działaniu DEPC) i raz w 200 μl roztworu B (0,1 M NaCl poddanego działaniu DEPC). Na każdym etapie płukania należy wymieszać roztwór i umieścić go na stojaku magnetycznym na 2 minuty, a następnie wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 100 μL 2x B&W buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl).
3. Dodać 1x bufor czarno-biały do biotynylowanej próbki RNA, aż objętość osiągnie 100 μl. Następnie dodaj ten roztwór do umytych kulek przechowywanych w 100 μL 2x bufora czarno-białego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z platformą kołyszącą z prędkością 100 obr./min. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty i wyrzuć supernatant.
4. Umyj powlekane kulki 3 razy w 1x buforze czarno-białym i zmierz końcowe stężenie supernatantu w każdym kroku płukania za pomocą Nanodrop w celu analizy odzysku, aby potwierdzić, że docelowe cząsteczki RNA pozostają na kulkach.
5. Inkubować kulki w 10 mM EDTA, pH 8,2 z 95% formamidem w temperaturze 65 °C przez 5 minut w maszynie do PCR. Trzymaj probówkę na stojaku magnetycznym przez 2 minuty i zbierz supernatant (zawierający biotynylowane RNA uwolnione z kulek streptawidyny) pipetą.
   UWAGA: Ten fizyczny etap separacji przed degradacją kwasu jest używany tylko do sekwencjonowania RNA#1 na rysunku 1c i nie jest obowiązkowy dla 2D-HELS MS Seq, ponieważ hydrofobowa etykieta biotyny może spowodować, że fragmenty drabiny znakowane 3' będą miały znacznie opóźnione t_R podczas pomiaru LC-MS, co może wyraźnie odróżnić oznakowane fragmenty drabiny 3' od nieznakowanych fragmentów drabiny 5' na wykresie_2D mass-t R.

4. Kwasowa hydroliza RNA w celu wytworzenia drabinek MS do sekwencjonowania

1. Podziel każdą próbkę RNA na trzy równe podwielokrotności. Na przykład próbkę RNA o objętości 15 μl RNA podzielić na trzy porcje po 5 μl.
2. Dodać równą objętość kwasu mrówkowego, aby uzyskać 50% (v/v) kwasu mrówkowego w mieszaninie reakcyjnej^8,9.
3. Inkubować reakcję w temperaturze 40 °C w maszynie do PCR, przy czym jedna reakcja trwa odpowiednio 2 minuty, druga 5 minut, a druga 15 minut.
4. Degradację kwasu należy stłumić poprzez natychmiastowe zamrożenie próbki na suchym lodzie po zakończeniu każdej reakcji.
5. Do wysuszenia próbki należy użyć odśrodkowego koncentratora próżni. Próbka jest zazwyczaj całkowicie suszona w ciągu 30 minut, a kwas mrówkowy jest usuwany wraz z_H2Opodczas procesu suszenia, ponieważ kwas mrówkowy ma temperaturę wrzenia (100,8 °C) podobną do_H2O(100 °C).
6. Zawiesić i połączyć łącznie trzy wysuszone próbki w 20 μl_H2Opoddanego działaniu DEPC w celu pomiaru LC-MS.
   UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w oczekiwaniu na pomiar LC-MS.

5. Konwersja ψ na CMC-ψ addduct

1. Dodać 80 μl 2O H_poddanegodziałaniu DEPC do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz zawierającej 0,0141 g N-cykloheksylo-Nʹ-(2-morfolinoetylo)-karbodimidu meto-p-toluenosulfonianu (CMC) i 0,07 g mocznika. Dodać 10 μl 100 μM próbki RNA do sekwencjonowania, 8 μl 1 M buforu bicyny (pH 8,3) i 1,28 μl 0,5 M EDTA. Dodać H₂O poddane działaniu DEPC, aby osiągnąć całkowitą objętość 160 μL. Końcowe stężenia wynoszą 0,17 M CMC, 7 M mocznika i 4 mM EDTA w 50 mM bicine (pH 8,3)¹¹.
   UWAGA: Protokół ten ma zastosowanie zarówno do pojedynczej syntetycznej sekwencji RNA, jak i mieszanin RNA.
2. Podzielić 160 μl roztworu reakcyjnego na cztery równe podwielokrotności w wolnych od RNaz, cienkościennych probówkach PCR o pojemności 0,2 ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut w maszynie do PCR.
   UWAGA: 50 μL na probówkę to maksymalna objętość reakcji, jaką można zastosować w maszynie do PCR.
3. Każdą reakcję ugasić 10 μl 1,5 M octanu sodu i 0,5 mM EDTA (pH 5,6).
4. Przeprowadzić oczyszczanie kolumny za pomocą czterech równoległych kolumn wirowych w celu usunięcia nadmiaru reagentów zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.1.5-2.1.8. Rozpuścić oczyszczony produkt w 15 μl_H2Opoddanego działaniu DEPC w każdej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz.
5. Przenieś oczyszczony produkt do czterech niezawierających RNaz, cienkościennych probówek PCR o pojemności 0,2 ml. Dodać 20 μl 0,1 M Na₂buforu CO₃ (pH 10,4) do każdych 15 μl oczyszczonego produktu i dodać H₂O poddane działaniu DEPC, aby uzyskać końcową objętość 40 μl dla każdej probówki reakcyjnej (w sumie cztery probówki). Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w maszynie do PCR.
6. Schładzić i oczyścić reakcję przez oczyszczanie kolumnowe za pomocą czterech równoległych kolumn wirowych, jak opisano w kroku 2.1.5. Eluować produkt przekształcony w CMC-ψ do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz, z której każda zawiera 15 μl_2Opoddanego działaniu DEPC.
7. Połączyć oczyszczoną CMC-ψ przekształconą próbkę z czterech probówek zbiorczych w jedną probówkę. Przeprowadzić degradację kwasu mrówkowego w 50% (v/v) zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 4.1-4.6 w celu wygenerowania drabinek MS do sekwencjonowania.

6. Pomiar LC-MS

1. Przygotowanie faz ruchomych do pomiaru LC-MS. Faza ruchoma A to 25 mM heksafluoro-2-propanol z 10 mM diizopropyloaminą w wodzie klasy LC-MS; faza ruchoma B to metanol.
2. Przenieść próbkę do fiolki z próbką LC-MS w celu analizy. Każda objętość wstrzyknięcia próbki wynosi 20 μl i zawiera 100-400 pmol RNA.
3. Stosować następujące warunki LC: temperatura kolumny 35 °C, natężenie przepływu 0,3 ml/min; gradient liniowy od 2–20% fazy ruchomej B przez 15 minut, a następnie 2-minutowy etap mycia z fazą ruchomą B.
   UWAGA: W przypadku bardziej hydrofobowych etykiet końcowych, takich jak Cy3 i sulfo-Cy3, jak wspomniano w sekcji 2, do elucji próbki może być konieczny wyższy procent rozpuszczalnika organicznego (tj. można zastosować podobny gradient, ale ze zwiększonym zakresem procentowym fazy ruchomej B). Na przykład 2–38% mobilna faza B w ciągu 30 minut z 2-minutowym krokiem mycia z 90% ruchoma faza B.
4. Oddziel i przeanalizuj próbki na spektrometrze mas Agilent Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight) sprzężonym z systemem LC wyposażonym w automatyczny podajnik próbek i system MS HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Kolumna LC to kolumna C18 o wymiarach 50 mm x 2,1 mm i wielkości cząstek 1,7 μm. Użyj następujących ustawień MS: tryb jonów ujemnych; zasięg, od 350 m/z do 3200 m/z; szybkość skanowania, 2 widma/s; przepływ gazu suszącego, 17 l/min; temperatura gazu schnącego, 250 °C; ciśnienie nebulizatora, 30 psig; napięcie kapilarne, 3500 V; i napięcie fragmentora, 365 V. Należy pamiętać, że parametry te są specyficzne dla typu lub modelu używanego spektrometru masowego.
5. Pozyskiwanie danych za pomocą oprogramowania do akwizycji Agilent MassHunter. Użyj przepływu pracy ekstrakcji cech molekularnych (MFE) Agilent, aby wyodrębnić informacje o związkach, w tym masę, czas retencji, objętość (obfitość MFE dla odpowiednich gatunków jonów) i wynik jakości itp. Użyj następujących ustawień MFE: "format danych centroidu, małe cząsteczki (chromatograficzne), pik o wysokości ≥ 100, do maksimum 1000, wynik jakości ≥ 50".
   UWAGA: Zoptymalizuj ustawienia MFE, aby wyodrębnić jak najwięcej potencjalnych związków, maksymalnie do 1000, z wynikami jakości ≥ 50.

7. Automatyzacja generowania sekwencji RNA za pomocą algorytmu obliczeniowego

UWAGA: Ta procedura jest pokazana tylko dla RNA #1 w Rysunek 1c.

1. Sortuj związki wyekstrahowane MFE w kolejności malejącej objętości (intensywności szczytu) i t_R. Dokonaj wstępnej selekcji danych poprzez: 1) ustawienie t_R od 4 do 10 minut, aby wybrać fragmenty RNA znakowane biotyną, ponieważ t_Rskładników drabinki masowej znakowanych biotyną jest przesuwane do tego okna_{t R} (4 min do 10 min) oraz 2) przy użyciu o rząd wielkości więcej związków wejściowych niż liczba fragmentów drabinki do obliczeń algorytmu w celu zmniejszenia ilości danych na podstawie objętości. Na przykład dla 20 nt RNA do sekwencjonowania 20 nt RNA wymagane będzie 20 znakowanych składników_{drabinki R} o masie 20 nt, a zatem 200 związków z pliku danych MFE zostanie wybranych na podstawie objętości. Należy pamiętać, że okno_{t R} może być inne, gdy używany jest inny typ lub model spektrometru mas.
2. Przeprowadź przetwarzanie danych i wygenerowanie sekwencji RNA #1 przy użyciu poprawionej wersji opublikowanego algorytmu⁸. Kody źródłowe poprawionego algorytmu są opisane wcześniej (https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)⁹.
3. Oprócz automatyzacji generowania sekwencji za pomocą algorytmu, należy ręcznie obliczyć różnice mas między dwoma sąsiednimi komponentami drabinki w celu wywołania bazy. Wszystkie zasady w RNA mogą być wywoływane ręcznie i dopasowywane do teoretycznych w bazie danych nukleotydów i modyfikacji RNA⁸; w ten sposób cała sekwencja nici RNA może być dokładnie odczytana ręcznie, co służy do potwierdzenia dokładności odczytanej sekwencji zgłoszonej przez algorytm. Więcej struktur modyfikacji RNA można znaleźć w bazach danych modyfikacji RNA¹², a odpowiadające im masy teoretyczne są uzyskiwane przez ChemBioDraw. W tabelach S1–S2 różnica masy ppm (części na milion) jest pokazana podczas porównywania obserwowanej masy z jej masą teoretyczną dla określonego komponentu drabiny, a wartość mniejsza niż 10 ppm jest uważana za dobre dopasowanie dla każdego wywołania bazy.

8. Sekwencjonowanie mieszanin RNA

1. Oznacz mieszaninę pięciu nici RNA (RNA #1 do #5) na ich końcach 3' biotyną A(5')pp(5')Cp-TEG-biotyna, stosując jednoetapowy protokół opisany w kroku 2.2. W całkowitej objętości 150 μL roztworu reakcyjnego dodać 15 μL 10x buforu reakcyjnego ligazy RNA T4, 1,5 μL każdej nici RNA (100 μM zapasu RNA #1 do #5, odpowiednio, dla całkowitej objętości 7,5 μL), 10 μL 150 μM A(5')pp(5')Cp-TEG-biotyny, 15 μl bezwodnego DMSO, 5 μl ligazy RNA T4 (10 jednostek/μl) i 97,5 μl H₂O poddanych działaniu DEPC. Równomiernie rozprowadzić roztwór reakcyjny na pięć podwielokrotności. Każda probówka wirówkowa bez RNaz zawiera 30 μl roztworu reakcyjnego.
2. Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C w maszynie do PCR.
3. Przeprowadzić oczyszczanie kolumny zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.1.5-2.1.8 za pomocą pięciu równoległych kolumn wirujących. Eluować próbkę mieszaniny 3'-biotynylowanych 5 nici RNA (mieszanina RNA #1 do #5) do 1,5 ml probówki wirówkowej bez RNaz każda z 15 μl_H2O poddanego działaniu DEPC.
4. Połączyć oczyszczone próbki mieszaniny z pięciu probówek zbiorczych w jedną probówkę. Przeprowadzić degradację kwasu mrówkowego zgodnie z procedurą opisaną w rozdziale 4.
5. Zmierz próbki za pomocą LC-MS zgodnie z opisem w sekcji 6 i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych ze zoptymalizowanymi ustawieniami MFE, aby wyodrębnić dane zawierające masę,_{t R} i objętość, jak opisano w kroku 6.5. Typowy algorytm przetwarzania i wywoływania zasad nie jest stosowany ze względu na znacznie zwiększoną złożoność danych wynikającą z mieszaniny. Wszystkie zasady w RNA zmieszanej próbki są wywoływane ręcznie w metodzie podobnej do sekcji 7.3 i dobrze pasują do zasad teoretycznych w bazie danych nukleotydów i modyfikacji RNA⁸, dzięki czemu pełne sekwencje wszystkich pięciu nici RNA w mieszanej próbce są dokładnie odczytywane. W tabelach S7–S11 wymieniono wszystkie informacje, w tym obserwowaną masę,_{t R}, objętość, wynik jakości i różnicę masy w ppm.

Wyniki

Wprowadzenie znacznika biotyny do końca 3' RNA, aby stworzyć łatwe do zidentyfikowania drabinki_R o masie t. Przebieg pracy podejścia 2D-HELS MS Seq jest pokazany w Rysunek 1a. Hydrofobowy znacznik biotyny wprowadzony do końca 3' RNA (patrz sekcja 2) zwiększa masy i t_Rskładników drabinki znakowanych 3' w porównaniu z ich nieznakowanymi odpowiednikami. W ten sposób krzywa drabinkowa 3' jest przesunięta do większych wartości osi y (ze względu na wzrost t

Dyskusja

W przeciwieństwie do fragmentacji MS opartej na tandemie, wysoce kontrolowana hydroliza kwasowa jest stosowana w podejściu 2D-HELS MS Seq do fragmentacji RNA przed analizą za pomocą spektrometru mas ^9,10. W rezultacie, każdy zdegradowany kwasem fragment może zostać wykryty przez urządzenie, tworząc odpowiednik drabinki sekwencjonowania. W optymalnych warunkach metoda ta tworzy "idealną" drabinę sekwencji z RNA poprzez średnio jedno na cząsteczkę specyfic...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do denylacji DNA 5'	New England Biolabs	E2610S	Stężenie 50uM
Spektrometr masowy Q-TOF	Agilent Technologies	5991-2116EN	Sprzężony z systemem 1290 Infinity LC
A(5´)pp(5´)Cp-TEG-biotyna-3&ostry;	ChemGenes	91718	HPLC oczyszczony
ATPγ S	Sigma-Aldrich	11162306001	Sól litowa
Bicine	Sigma-Aldrich	B8660	BioXtra, ≥ 99% (miareczkowanie)
Maleimid biotyny	Vector Laboratories	SP-1501	z długim ramieniem
	Wody		186003532 50 mm i razy 2,1 mm Kolumna Xbridge C18 o wielkości cząstek 1,7 μ
m Odśrodkowy koncentrator próżni	Labconco	Refrig 115v/60hz 7310022	Labconco CentriVap
ChemBioDraw	PerkinElmer	ChemDraw Prime	Generuj dane o strukturze chemicznej i właściwościach struktur i fragmentów
CMC (N-cykloheksylo-N?-(2-morfolinoetylo)-karbodimid meto-p-toluenosulfonian)	Sigma-Aldrich	2491-17-0	95% Oczyszczanie
Cyjanina3 maleimid (Cy3)	Lumiprobe	11080	Nierozpuszczalna
w wodzie woda uzdatniona DEPC	Thermo Fisher Scientific	AM9906	Autoklawowana, certyfikowana
diizopropyloamina (DIPA)	Fisher Scientific	108-18-9	99% Alfa Aesar
DMSO	Sigma-Aldrich	276855	Bezwodny dimetylosulfotlenek, 99,9%
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	Bezwodny, krystaliczny, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
Kwas mrówkowy	Merck	64-18-6	98-100%, ACS reag, Ph Eur
Heksafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	920-66-1	99% Fiolki na próbki Acros Organics
LC-MS	Thermo Fisher Scientific	C4000-11	Fiolki z plastikowym gwintem gwintowanym
LC-MS	Thermo Fisher Scientific	C5000-54A	Nasadki gwintowane fiolki autosamplera
Na2CO3 bufor	Sigma-Aldrich	88975	BioUltra, >0,1 M Na2CO3, >0,2 M NaHCO3
Oligo Clean & Koncentrator	Zymo Research	D4060	Kolumna wirowa
OriginLab	OriginLab	OriginPro	Oprogramowanie do analizy i tworzenia wykresów
danych pCp-biotyna	TriLink BioTechnologies	NU-1706-BIO	20 ul (1 mM)
RNA #1--#6	Zintegrowane technologie DNA	Niestandardowe oligonukleotydy	19nt-21nt jednoniciowe RNA, używane bez dalszego oczyszczania
Kołysanie wytrząsarka platformowa		Wytrząsarka orbitalna VWR Standard 1000	Zakres prędkości od 40 do 300 obr./min
Koraliki magnetyczne Streptawidyna	Thermo Fisher Scientific	88816	Wiązanie ok. 55ug biotynylowany królik lgG na mg kulek
Sulfonowany cyjaninin3 maleimid	Lumiprobe	11380	Rozpuszczalna
w wodzie ligaza DNA T4 1	New England Biolabs	M0202S	400 jednostek/uL
T4 kinaza polinukleotydowa	Sigma-Aldrich	T4PNK-RO	Z faga T4 am N81 pse T1 zakażony Escherichia coli
BB Bufor Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T6455	Tris-HCl Buffer, pH 10, 10& razy;, Antigen Retriever
Mocznik	Sigma-Aldrich	81871	Mocznik do syntezy. Numer CAS 57-13-6, numer WE 200-315-5.