Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla neuronów współczulnych szczurów z embrionalnych górnych zwojów szyjnych do analizy morfologicznej i proteomicznej

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61283

⸱

27 września 2020

 ,  , 
1Department of Biology, Saint Mary's College of California

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje izolację i hodowlę embrionalnych neuronów współczulnych szczurów z górnych zwojów szyjnych. Zawiera również szczegółowe protokoły barwienia immunocytochemicznego i przygotowywania ekstraktów neuronalnych do analizy spektrometrii mas.

Streszczenie

Neurony współczulne z embrionalnych górnych zwojów szyjnych szczura (SCG) zostały użyte jako system modelowy in vitro dla neuronów obwodowych do badania wzrostu aksonów, transportu aksonalnego, synaptogenezy, wzrostu dendrytycznego, plastyczności dendrytycznej i interakcji nerw-cel w systemach kokulturowych. Protokół ten opisuje izolację i dysocjację neuronów z górnych zwojów szyjnych zarodków szczurów E21, a następnie przygotowanie i utrzymanie czystych kultur neuronalnych w pożywce wolnej od surowicy. Ponieważ neurony nie przylegają do niepowlekanego plastiku, neurony będą hodowane na 12-milimetrowych szklanych szkiełkach nakrywkowych lub 6-dołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną. Po leczeniu środkiem antymitotycznym (Ara-C, cytozyna β-D-arabinofuranozyd), protokół ten generuje zdrowe kultury neuronalne z mniej niż 5% komórek nieneuronalnych, które można utrzymać przez ponad miesiąc in vitro. Chociaż embrionalne neurony SCG szczurów są wielobiegunowe z 5-8 dendrytami in vivo; W warunkach bez surowicy neurony te rozciągają tylko jeden akson w hodowli i pozostają jednobiegunowe przez cały czas trwania hodowli. Jednak neurony te mogą być indukowane do wydłużania dendrytów w obecności ekstraktu z błony podstawnej, białek morfogenetycznych kości (BMP) lub 10% płodowej surowicy cielęcej. Te jednorodne kultury neuronalne można wykorzystać do barwienia immunocytochemicznego i do badań biochemicznych. W artykule opisano również zoptymalizowany protokół barwienia immunocytochemicznego białka związanego z mikrotubulami-2 (MAP-2) w tych neuronach oraz przygotowania ekstraktów neuronalnych do spektrometrii mas.

Wprowadzenie

Neurony współczulne pochodzące z embrionalnych górnych zwojów szyjnych (SCG) były szeroko stosowane jako podstawowy system hodowli neuronów do badania wielu aspektów rozwoju neuronów, w tym zależności od czynnika wzrostu, interakcji neuron-cel, sygnalizacji neuroprzekaźników, wzrostu aksonów, rozwoju i plastyczności dendrytów, synaptogenezy i mechanizmów sygnalizacyjnych leżących u podstaw interakcji nerw-cel/neuron-glej1,2,3,4,5,6,7,8,9. Pomimo ich niewielkich rozmiarów (około 10000 neuronów/zwojów), istnieją trzy główne powody rozwoju i szerokiego wykorzystania tego systemu hodowli: i) będąc pierwszymi zwojami w łańcuchu współczulnym, są większe, a zatem łatwiejsze do wyizolowania, niż reszta zwojów współczulnych10; ii) w przeciwieństwie do neuronów centralnych, neurony w SCG są dość jednorodne, a wszystkie neurony pochodzą z grzebienia nerwowego, mają podobny rozmiar, zależność od czynnika wzrostu nerwów i są nor-adrenergiczne. To sprawia, że są one cennym modelem do badań morfologicznych i genomicznych10,11 i iii) neurony te mogą być utrzymywane w określonym pożywce wolnej od surowicy zawierającej czynnik wzrostu nerwów przez ponad miesiąc10,12. Okołoporodowe neurony SCG są szeroko wykorzystywane do badania mechanizmów leżących u podstaw inicjacji i utrzymania dendrytów2. Dzieje się tak głównie dlatego, że chociaż neurony SCG mają rozległą dendrytyczną altanę in vivo, nie rozszerzają dendrytów in vitro przy braku surowicy, ale mogą być indukowane do wzrostu dendrytów w obecności pewnych czynników wzrostu, takich jak białka morfogenetyczne kości2,12,13.

Ten artykuł opisuje protokół izolacji i hodowli embrionalnych szczurzych neuronów SCG. W ciągu ostatnich 50 lat pierwotne hodowle neuronów z SCG były wykorzystywane głównie do badań morfologicznych, z ograniczoną liczbą badań analizujących zmiany genomiczne lub proteomiczne na dużą skalę. Wynika to głównie z małego rozmiaru tkanki, co skutkuje izolacją niewielkich ilości DNA lub białka, co utrudnia przeprowadzanie analiz genomicznych i proteomicznych tych neuronów. Jednak w ostatnich latach zwiększona czułość wykrywania umożliwiła opracowanie metod badania genomu, miRNome i proteomu w neuronach SCG podczas rozwoju wzrostu dendrytycznego14,15,16,17. W artykule opisano również metodę analizy morfologicznej tych neuronów z wykorzystaniem immunocytochemii oraz protokół otrzymywania ekstraktów białek neuronalnych do analizy spektrometrii mas.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury przeprowadzone w badaniach na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Saint Mary's College of California. Wytyczne dotyczące opieki i użytkowania zwierząt w Saint Mary's College zostały opracowane w oparciu o wytyczne dostarczone przez Biuro ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych w Narodowym Instytucie Zdrowia (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf i https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej (zwanej również pożywką kontrolną)

  1. Dodać następujące składniki, w kolejności podanej poniżej, do sterylnej kolby o pojemności 500 ml: 190 ml 1x DMEM o niskiej zawartości glukozy, 10 ml albuminy surowicy bydlęcej wolnej od kwasów tłuszczowych 20 mg / ml (FAF-BSA) w DMEM, 2,8 ml 200 mM L-glutaminy, 4 ml 100 ml mieszaniny insulina-selen-transferyna, 0,4 ml 125 μg/ml czynnika wzrostu nerwów (w 0,2% obojętnym stabilizatorze białka w DMEM), i 200 ml pożywki F-12 firmy Ham's.
  2. Upewnij się, że pipeta została pokryta pożywką zawierającą FAF-BSA przed dodaniem roztworów zawierających białko, takich jak insulina-selen-transferyna i NGF, aby zapobiec przywieraniu białek do pipety.
  3. Obracać kolbą, aby wymieszać składniki po każdym dodaniu. Po dodaniu F-12 dokładnie wymieszać pipetą o pojemności 25 ml.
  4. Podwielokrotność pożywki należy rozmieścić w 10 ml podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C. Podwielokrotności mogą być przechowywane przez sześć miesięcy bez utraty aktywności.

2. Przygotowanie płytek do hodowli neuronów

  1. Rozcieńczyć 1 mg/ml poli-D-lizyny (sporządzonej w 0,5 M buforze Tris, pH 8) do 100 μg/ml sterylną wodą destylowaną.
  2. W celu analizy proteomicznej lub genomicznej, na jeden do dwóch dni przed preparacją, pokryj 6-dołkowe płytki około 2 ml sterylnego 100 g/ml poli-D-lizyny (PDL). Jest to konieczne, aby zapewnić przyleganie komórek do studni. Owinąć talerze folią spożywczą i przechowywać je przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. W celu analizy morfologicznej i mikroskopii umieść 12 mm2 wstępnie obrobione szkiełka nakrywkowe z niemieckiego szkła (które można oczyścić za pomocą kwasu azotowego, jak opisano wcześniej18 lub zakupione) w każdym z dołków płytki 24-dołkowej.
    1. Pokryj szkiełka nakrywkowe 0,3 ml sterylnego 100 g/ml poli-D-lizyny (PDL). Przechowywać płytki przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. W dniu sekcji, przed rozpoczęciem sekcji, należy usunąć roztwór poli-D-lizyny ze studzienek i przepłukać studzienki pięć razy sterylną wodą destylowaną, a następnie raz DMEM o niskiej stężeniu glukozy.
  5. Podczas trawienia enzymatycznego zwojów nerwowych (około godziny przed posiewem komórek) odessać DMEM z płytek i zastąpić go 0,3 ml pożywki kontrolnej. Przechowywać płytki w temperaturze 35,5 °C poniżej 5% CO2 w wilgotnej komorze.

3. Ustawienia sekcji

  1. Przygotowanie 200 ml pożywki do rozwarstwienia (określanej jako pożywka preparacyjna)
    1. Dodać 8 ml albuminy surowicy bydlęcej bez kwasów tłuszczowych o stężeniu 20 mg/ml (FAF-BSA) w DMEM o niskiej stężeniu glukozy (z 1 mg/ml glukozy) i 2 ml 100x penicyliny-streptomycyny do 193 ml sterylnej pożywki L-15 firmy Leibovitz (lub dowolnej pożywki buforowanej powietrzem)
  2. W kapturze ustaw następujące elementy do sekcji: cztery sterylne stożkowe probówki o pojemności 50 ml z około 20 ml pożywki preparacyjnej w każdej probówce, cztery sterylne szalki o średnicy 35 mm z 1,5 ml pożywki do preparacji, jedną sterylną probówkę stożkową o pojemności 50 ml z 20 ml pożywki do odwirowania, jedną sterylną probówkę stożkową o pojemności 15 ml do odwirowania zwojów jajowych, i jedną sterylną probówkę o pojemności 10 ml do zbierania zdysocjowanych komórek.
  3. Użyj suchego sterylizatora do kulek, aby wysterylizować parę cienkich kleszczy (kleszczyków nr 4 lub nr 5) przez co najmniej jedną minutę.

4. Izolacja górnych zwojów szyjnych od embrionalnych szczeniąt szczurów

  1. Pobieranie zarodków E21 od ciężarnej szczurki
    UWAGA: Usunięcie rogu macicy można wykonać na zewnątrz kaptura, jeśli otoczenie jest dokładnie wysterylizowane.
    1. Poddaj ciężarną szczur eutanazji za pomocą inhalacji CO2 . Ścinaj sierść w okolicy brzucha i przetrzyj skórę w tym obszarze 70% alkoholem, aby ją wysterylizować.
    2. Za pomocą świeżego zestawu sterylnych nożyczek i kleszczy przetnij skórę, a następnie warstwę mięśniową, aby odsłonić rogi macicy zawierające zarodki. Usuń rogi macicy z zarodkami za pomocą nowego zestawu nożyczek i kleszczy, uważając, aby nie uszkodzić przy tym jelit.
    3. Przenieś rogi macicy z zarodkami na sterylną szalkę Petriego o średnicy 150mm2 i przenieś je do kaptura.
    4. Za pomocą nowego zestawu kleszczy i nożyczek usuń zarodki z rogu macicy i oddziel zarodki od błon owodniowych i łożyska.
    5. Aby poddać eutanazji zarodki, przetnij rdzeń kręgowy zarodków wzdłuż linii środkowej pod prawym ramieniem. Zmniejszy to również krwawienie z tętnicy szyjnej podczas usuwania SCG.
    6. Przenieść te zarodki do przygotowanych stożkowych probówek o pojemności 50 ml zawierających pożywkę do preparacji. Upewnij się, że zarodki są zanurzone w pożywce. Każda probówka może pomieścić do 3 zarodków.
  2. Izolacja górnego zwoju szyjnego od zarodka
    1. Przenieść jedno szczenię z pożywki preparacyjnej na sterylną szalkę Petriego o średnicy 150 mm2 wypełnioną do połowy stałym podłożem (woskiem parafinowym lub polimerem silikonowym), tak aby jej powierzchnia grzbietowa znajdowała się na podłożu. Używając trzech sterylnych igieł o wadze 23 G, przypnij szczeniaka do naczynia za pomocą jednej igły pod każdym ramieniem i trzeciej igły przez usta, aby ostrożnie przeprostować szyję.
    2. Przeciąć skórę w okolicy szyi za pomocą sterylnych cienkich kleszczyków (kleszczyki nr 4 lub nr 5), aby odsłonić gruczoły ślinowe znajdujące się pod spodem. Usuń te gruczoły za pomocą cienkich kleszczy.
    3. Zlokalizuj mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe i omohyoidalne odpowiednio w pobliżu obojczyka i tchawicy. Najpierw przetnij mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe, a następnie ostrożnie przetnij cienki mięsień omohyoidalny za pomocą cienkich kleszczy. Po usunięciu tych mięśni rozwidlenie w tętnicy szyjnej na przednim końcu będzie widoczne po obu stronach tchawicy, przy czym SCG znajduje się pod tym rozwidleniem w tętnicy szyjnej.
    4. Za pomocą zamkniętych kleszczy delikatnie unieś tętnicę szyjną, aby uwidocznić SCG. Używając jednego kleszcza po obu stronach SCG, wyciągnij tętnicę szyjną i przenieś ją do przygotowanych sterylnych szalek o średnicy 35 mm2. Tkanka ta najprawdopodobniej będzie zawierać SCG z tętnicą szyjną, nerw błędny z zwojami bez dawki, a także inne segmenty mięśni lub tłuszczu w okolicy.
    5. Powtórz proces preparowania po drugiej stronie. Usuń SCG ze wszystkich zarodków przed kontynuowaniem pozostałych etapów sekcji opisanych poniżej. Rozmieścić wyizolowane tkanki między dwiema szalkami o średnicy 35 mm2 w celu ułatwienia przetwarzania próbek tkanek.
  3. Przetwarzanie końcowe SCG
    1. Aby oddzielić SCG od wypreparowanej tkanki, najpierw użyj cienkich kleszczy, aby usunąć wszelkie obce tkanki, takie jak tłuszcz lub mięśnie, uważając, aby uniknąć obszaru w pobliżu rozwidlenia tętnicy szyjnej.
    2. Po usunięciu tych tkanek widoczne są dwa zwoje. Zwój nodose jest mniejszy i okrągły, podczas gdy SCG ma kształt migdała. Delikatnie pociągnij za nerw błędny, aby oddzielić nerw błędny i zwoje nerwowe bez dawki od tętnicy szyjnej, a następnie oddziel SCG od tętnicy szyjnej.
    3. Użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć kapsułkę otaczającą SCG. Przenieś SCG do nowej płytki hodowlanej o średnicy 35 mm. Powtórz proces ze wszystkimi wypreparowanymi próbkami tkanek.
    4. Pokryj wysterylizowaną, bawełnianą szklaną pipetę środkiem do preparowania, aby zapobiec przywieraniu tkanki do ścianek pipety. Za pomocą pipety zastąpić pożywkę separacyjną sterylnymi 2 ml kolagenazy typu II (1 mg/ml)/dyspazy typu II (5 mg/ml) w HBSS wolnym od wapnia i magnezu i inkubować przez 50 minut w temperaturze 37 °C, aby pomóc w rozbiciu tkanek.
      UWAGA: Czas inkubacji może wymagać optymalizacji dla różnych partii kolagenazy/dypazy i zwykle wynosi od 40 minut do godziny.
    5. Podczas inkubacji należy odessać DMEM z płytek i zastąpić go 0,3 ml pożywki kontrolnej. Przechowywać płytki w temperaturze 35,5 °C poniżej 5% CO2 w wilgotnej komorze.
    6. Po inkubacji przenieść SCG w kolagenazie/dypazie do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Użyj pożywki do preparacji, aby przepłukać płytki i przenieść roztwór do probówki. Dodaj tyle pożywki do preparacji, aby zwiększyć objętość do około 10 ml.
    7. Wirować przy 200 x g (1000 - 1200 obr./min) przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia próbki. Odessać supernatant, uważając, aby nie usunąć osadu. Zawiesić osad z 10 ml pożywki do preparacji. Powtórzyć wirowanie i odrzucić supernatant.
    8. Zastąp 1-2 ml pożywki hodowlanej. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura o wąskim otworze i wygiętej końcówce (wstępnie pokrytej pożywką hodowlaną) mechanicznie rozdzielić grudki, delikatnie rozcierając 5-6 razy. Pozwól większym grudkom osiąść na około minutę. Przenieść zawiesinę komórek sklarowanych nad osadem do nowej probówki o pojemności 10 ml.
    9. Powtórz ten proces jeszcze 3 razy, za każdym razem ze zwiększającą się siłą rozcierania, aby zapewnić prawie całkowitą dysocjację SCG. Przenieś supernatant po każdej rundzie rozcierania do probówki o pojemności 10 ml z supernatantem z pierwszego rozcierania.
    10. Dodaj tyle pożywki hodowlanej, aby zwiększyć objętość do 8 - 10 ml. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek i określ ilościowo gęstość komórek za pomocą hemocytometru.
    11. Rozprowadzić zawiesinę komórkową do studzienek o gęstości komórek odpowiedniej do eksperymentów. Podczas procesu powlekania należy w sposób ciągły mieszać zawiesinę komórek, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek w studzienkach.
      UWAGA: W celu analizy morfologicznej umieść komórki wokół 8 000 komórek / dołek na 24-dołkowych płytkach, a w przypadku protokołów genomicznych i proteomicznych plateruj komórki do 30 000 komórek / studzienkę.
    12. Przenieś płytki do szklanego eksykatora ze sterylną wodą na dnie, aby utworzyć nawilżoną komorę. Wstrzyknąć wystarczającą ilość CO2 (około 120 ml), aby uzyskać środowisko o stężeniu 5% CO2 w eksykatorze, przed uszczelnieniem. Utrzymuj płytki w temperaturze 35,5 °C. Jest to określane jako Dzień 0 w protokole.
      UWAGA: Płytki te można również przechowywać w zwykłym inkubatorze o stężeniu 5% CO2. Opisana powyżej metoda minimalizuje zmiany temperatury i pH, a także pomaga zapobiegać zanieczyszczeniu krzyżowemu.

5. Utrzymanie hodowanych neuronów SCG i leczenie

  1. W dniu 1 (24 godziny po posiewie) ostrożnie usunąć połowę pożywki hodowlanej i zastąpić 2 μM Ara-C (cytozyna β-D-arabinofuranozyd, środek antymitotyczny). Pozostaw zabieg na komórkach na 48 godzin. Zwykle taka długość leczenia jest wystarczająca do wyeliminowania komórek nieneuronalnych w hodowli.
  2. W dniu 3 delikatnie odessać połowę pożywki i zastąpić ją pożywką kontrolną.
  3. W 4. dniu komórki są gotowe do eksperymentalnego leczenia. Podawaj kultury co drugi dzień odpowiednią pożywką, delikatnie zastępując połowę pożywki w studzience świeżą pożywką.
  4. Hodowane neurony SCG w pożywce wolnej od surowicy rozciągają tylko aksony. Jeśli eksperymenty wymagają obecności dendrytów, potraktuj komórki 10% płodową surowicą cielęcą, 75-100 μg / ml ekstraktu z macierzy błony podstawnej lub 50 ng / ml białka morfogenetycznego kości-7. Wzrost dendrytyczny obserwuje się w ciągu 48 godzin od zabiegu, a skomplikowaną altanę dendrytyczną obserwuje się w ciągu tygodnia od leczenia.

6. Immunologiczne barwienie hodowanych neuronów SCG

  1. Stopniowo zastępować pożywkę do hodowli komórkowej w studzience 4% paraformaldehydem w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,2 w dygestorium.
    1. Usuń połowę pożywki hodowlanej ze studzienki i delikatnie zastąp ją 4% paraformaldehydem. Następnie powtórz proces jeszcze co najmniej dwa razy, za każdym razem usuwając dwie trzecie pożywki ze studzienki i zastępując 4% paraformaldehydem. Pod koniec tego procesu kolor podłoża w studni powinien zmienić się z różowego na bezbarwny.
    2. Gdy cała pożywka zostanie zastąpiona 4% paraformaldehydem, inkubować studzienki przez 15 - 20 minut w temperaturze pokojowej.
  2. W podobnym procesie, jak opisano powyżej, stopniowo zastępuj 4% roztwór paraformaldehydu solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), pH 7,2. Pozostaw na 5 minut. Przepłucz studzienki jeszcze dwa razy przez 5 minut każdy za pomocą PBS.
    1. Po usunięciu 4% paraformaldehydu przenieś płytki na stół w celu dalszej obróbki. Ten etap jest dobrym punktem przystankowym, w którym talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Usuń wszystkie PBS. Dodaj wystarczającą objętość 0,1% Triton X-100 do PBS, aby pokryć komórki. Pozostaw go na kulturach na 5 minut, aby przeniknąć do neuronów. Czas wykonania tego kroku ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia dobrego barwienia przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórek.
  4. Ostrożnie usuń roztwór Triton X-100 i przepłucz studzienki trzy razy przez 5 minut za każdym razem za pomocą PBS. Usuń roztwór PBS.
  5. Dodaj wystarczającą ilość 5% BSA do PBS, aby pokryć komórki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przeciwciał.
  6. Usunąć roztwór blokujący i zastąpić go mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko białku MAP-2 rozcieńczonym w 5% BSA w PBS. Pozostawić pierwszorzędowe przeciwciało na komórkach na noc w temperaturze 4 °C.
  7. Usunąć i zachować przeciwciało pierwszorzędowe do ponownego użycia. Przeciwciało pierwszorzędowe może być użyte ponownie co najmniej dwa razy bez utraty intensywności wykrywania.
  8. Spłucz trzy razy wystarczającą ilością PBS, aby pokryć komórki. Pozostaw PBS na komórkach na 10 minut na płukanie.
  9. Usunąć roztwór PBS i zastąpić go fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim IgG Kozim sprzężonym ze znacznikiem w rozcieńczeniu 1:1000 w 5% BSA w PBS. Inkubować przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej.
  10. Usuń przeciwciało wtórne i zastąp je PBS. Przepłukać studzienki trzy razy PBS przez 10 minut na płukanie. Raz przepłucz studzienki wodą, aby usunąć wszelkie sole.
  11. Zamocować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych zawierających kroplę wodnego środka utrwalającego, który jest odpowiedni dla próbek znakowanych fluorescencyjnie. Preparaty należy przechowywać w temperaturze 4 °C w folderze na slajdy do czasu, aż będą gotowe do obrazowania.

7. Przygotowanie próbki do analizy proteomu za pomocą chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas

  1. Liza wyhodowanych neuronów
    1. Delikatnie usuń wszystkie pożywki hodowlane ze studzienek. Zastąp go zimnym, sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami bez wapnia i magnezu (PBS), o pH 7,4. Szybko wyjmij i zastąp PBS i pozostaw na 5 minut. Ten krok ma na celu usunięcie wszelkich białek obecnych w pożywce hodowlanej.
    2. Ostrożnie usuń wszystkie PBS ze wszystkich studzienek do określonego zabiegu. Powtórz proces jeszcze raz. Utrzymuj płytki nad lodem podczas lizy komórek, aby zminimalizować uszkodzenia neuronów i proteolizę.
    3. Dodać 100 - 150 μL 50 mM wodorowęglanu amonu o pH 7,5 (NH4HCO3) do jednego z dołków i zeskrobać komórki za pomocą sterylnego skrobaka do komórek. Za pomocą mikropipety przenieś płyn i powtórz proces skrobania ze wszystkimi dołkami do określonego zabiegu. Po zeskrobaniu zbadaj studzienki pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek została usunięta.
      1. Przy małej liczbie neuronów użyj ograniczonej objętości do lizy komórek, aby zapewnić wystarczająco wysokie stężenie do analizy proteomicznej.
    4. Zamrozić roztwór w temperaturze -80 °C przez noc, aby wspomóc lizę komórek. Lizaty mogą być przechowywane na tym etapie do momentu, gdy będą gotowe do dalszego przetwarzania.
    5. Po rozmrożeniu próbki przetrzyj przez strzykawkę z igłą 26 G lub 28 G, aby mechanicznie zmodyfikować komórki.
    6. Sonikować próbki w sonikującej łaźni wodnej dwa razy przez 10 minut. Dodaj lód do łaźni wodnej, aby zapobiec przegrzaniu i denaturacji białek. Wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 12 000 x g.
    7. Zmierz stężenie białka. Typowe stężenia białka wahają się od 0,4 - 1 μg/μL
  2. Przygotowanie próbki i trawienie trypsyny do analizy proteomu
    1. Przenieść maksymalnie 60 μl lizatu lub 50 μg białka do probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od DNaz, RNaz i proteaz. Jeśli objętość lizatu jest mniejsza niż 60 μl, dodaj wystarczającą ilość 50 mM wodorowęglanu amonu, aby uzupełnić objętość.
    2. Dodać 25 μl 0,2% kwasowego, labilnego środka powierzchniowo czynnego i wirować. Inkubować probówkę w bloku grzewczym w temperaturze 80 °C przez 15 minut. Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 x g przez 30 s.
    3. Dodać 2,5 μl 100 mM ditiotreitolu i odwirować. To sprawia, że białko jest bardziej dostępne do alkilacji i trawienia. Inkubować probówkę w temperaturze 60 °C w podgrzewaczu blokowym przez 30 minut. Schłodzić do temperatury pokojowej i odwirować.
    4. Dodać 2,5 μl 300 mM jodoacetamidu do próbki i odwirować. Ten krok pomaga alkilować cysteiny i zapobiega ich reformowaniu wiązań dwusiarczkowych. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
    5. Dodać trypsynę klasy spektrometrii mas (0,5 μg/μl) do probówki w stosunku trypsyna do białka 1:10. Próbki należy roztwarzać w temperaturze 37 °C przez noc.
    6. Dodać 10 μl 5% kwasu trifluorooctowego (TFA) i odwirować. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut. Ten krok jest niezbędny do hydrolizy kwasowego, labilnego środka powierzchniowo czynnego, aby zapobiec zakłóceniom podczas spektrometrii mas.
    7. Odwirować próbki w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut i przenieść supernatant do fiolki z przezroczystego szkła z certyfikatem chromatografii z wstępnie naciętymi teflonowo-silikonowymi nasadkami do przegrody. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przed analizą spektrometrii mas.
    8. Fiolki z próbkami należy poddać chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja i utrzymywanie kultur neuronalnych neuronów embrionalnego SCG
Dysocjowane komórki z embrionalnego SCG szczura wysiano na płytkę lub szkiełko podstawowe pokryte poli-D-lizyną i utrzymywano w bezserumowym medium hodowlanym zawierającym b-czynnik wzrostu nerwów. Dysocjowane komórki, stanowiące mieszaninę neuronów i komórek glejowych, po wysianiu mają kształt kolisty (Rycina 1A). W ciągu 24 godzin od wysiania neurony wytwarzają krótkie wypustki aksonalne, natomiast ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano protokoły hodowli neuronów współczulnych z górnych zwojów szyjnych embrionalnych szczeniąt szczurów. Zaletą stosowania tego systemu modelowego jest to, że możliwe jest uzyskanie jednorodnej populacji neuronów zapewniających podobną odpowiedź na czynniki wzrostu, a ponieważ wymagania dotyczące czynników wzrostu dla tych neuronów zostały dobrze scharakteryzowane, możliwe jest hodowanie tych neuronów in vitro w określonych podłożach, w warunkach wolnych od surowicy10. Chociaż proto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundusz Rozwoju Wydziału i grant Letniego Programu Badawczego w Saint Mary's College of California. Autorzy chcieliby również podziękować dr Pameli Lein z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis i dr Anthony'emu Iavarone z UC Berkeley Mass spectrometry facility za ich rady podczas opracowywania tych protokołów. Autorzy chcieliby również podziękować Haley Nelson z Office of College Communications w Saint Mary's College of California za jej pomoc w produkcji i edycji wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2D nanoACQUITYWaters Corporation
Wodorowęglan amonuSigma-Aldrich9830
BMP-7R& D Systems354-BP
Surowica bydlęca AluminiumSigma-Aldrich5470
Skrobak do komórekCorningCLS-3010
KolagenazaWorthington Biochemical4176
Corning Costar lub Nunc Płaskodenne płytki do hodowli komórkowychFisher Scientific07-200, 140675, 142475
Cytozyna- β- D-arabinofuranozydSigma-AldrichC1768
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem D (bez wapnia i magnezu)ATCC30-2200
Dispase IIRoche4942078001
Woda destylowanaThermo Fisher Scientific15230
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
DMEM - Niska glukoza + glutamina, + pirogronian soduThermo Fisher Scientific11885
Bez kwasów tłuszczowych BSACalbiochem12660920 mg / ml zapas DMEM o niskiej stężeniu glukozy
Kleszcze drobnoziarniste Dumont nr 4 i nr 5Ted Pella Inc5621, 5622
Kleszcze i nożyczki do preparacjiTed Pella Inc1328, 1329, 5002
Szklane wargi ochronne - 12mmNeuvitro CorporationGG-12
Kozio-Anty Mysia IgG Alexa 488 sprzężonaThermo Fisher ScientificA32723
Mieszanka składników odżywczych F-12 szynkiThermo Fisher Scientific11765
Zrównoważony roztwór soli Hanka (bez wapnia i magnezu)Thermo Fisher Scientific14185
Insulina-selen-transferyna (100X)Thermo Fisher Scientific41400-045
JodoacetamidSigma-AldrichA3221
L-GlutaminaThermo Fisher Scientific25030
Leibovitz L-15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
Materiały montażowe do szkiełek nakrywkowychThermo Fisher ScientificP36931, P36934
Mysie przeciwciało anty-MAP2 (SMI-52)BioLegendSMI 52
Czynnik wzrostu nerwówEnvigo Bioproducts (dawniej Harlan Bioproducts)BT5017Stock 125 μ g / ml w 0,2% Prionex w DMEM
ParaformaldehyeSpectrum ChemicalsP1010
Penicylina-Streptomycyna (100X)Thermo Fisher Scientific15140
Poli-D-LizynaSigma-AldrichP0899
PrionexMillipore52960010% roztwór, 100 ml
RapiGest SFWaters Corporation1860018615 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass SpectrometryWaters Corporation
Kwas trifluorooctowy - Klasa sekwencjonowaniaThermo Fisher Scientific2890410 X 1 ml
Triton X-100Sigma-AldrichX100
TrypsinPromega lub NEBV511A, P8101S100 μ g lub 5 X 20 mg
Wody Fiolki do całkowitego odzyskuWaters Corporation186000385c

Bibliografia

  1. Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
  2. Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
  3. Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
  4. Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
  5. Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
  6. Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).
  7. Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
  8. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
  9. Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
  10. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
  11. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
  12. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).
  13. Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
  14. Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754(2011).
  15. Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
  16. Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
  17. Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
  18. Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
  19. Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
  20. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
  21. Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
  22. Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
  23. Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
  24. Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
  25. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  26. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82(2016).
  27. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200(2011).
  28. Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
  29. Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
  30. Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
  31. Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
  32. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  33. Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100(2007).
  34. Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5(2014).
  35. Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura neuronówpowlekanie poli-D-lizynątraktowanie Ara-Cbarwienie immunocytochemicznespektrometria masbarwienie MAP-2analiza morfologiczna
Hodowla neuronów współczulnych szczurów z embrionalnych górnych zwojów szyjnych do analizy morfologicznej i proteomicznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.