Artykuł metodologiczny

Ocena śmierci komórki przy użyciu bezkomórkowego supernatantu probiotyków w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych komórek raka jelita grubego

DOI:

10.3791/61285

⸱

13 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Microbiological Analysis Team, Group for Biometrology, Korea Research Institute of Standards and Science (KRISS), 2College of Pharmacy, Chungnam National University (CNU), 3Stem Cell Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), 4Convergent Research Center for Emerging Virus Infection, Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT), 5Department of Bio-Analysis Science, University of Science & Technology (UST)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono metody pozwalające zrozumieć przeciwnowotworowe działanie bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus (LCFS). Linie komórkowe raka jelita grubego wykazują śmierć komórek po leczeniu LCFS w hodowlach 3D. Proces generowania sferoid można zoptymalizować w zależności od rusztowania, a przedstawione metody analizy są przydatne do oceny zaangażowanych szlaków sygnałowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje protokół oceny zgonów komórek rakowych w trójwymiarowych (3D) sferoidach wielokomórkowych typów komórek nowotworowych przy użyciu supernatantów z hodowli komórkowych Lactobacillus fermentum, uważanych za kultury probiotyczne. Wykorzystanie kultur 3D do testowania supernatantu bezkomórkowego Lactobacillus (LCFS) jest lepszą opcją niż testowanie w monowarstwach 2D, zwłaszcza że L. fermentum może wywoływać działanie przeciwnowotworowe w jelitach. Stwierdzono, że supernatant L. fermentum ma zwiększone działanie antyproliferacyjne przeciwko kilku komórkom raka jelita grubego (CRC) w warunkach hodowli 3D. Co ciekawe, efekty te były silnie związane z modelem hodowli, wykazując godną uwagi zdolność L. fermentum do indukowania śmierci komórek rakowych. Stabilne sferoidy wygenerowano z różnych komórek CRC (raka jelita grubego) przy użyciu protokołu przedstawionego poniżej. Ten protokół generowania sferoidy 3D jest oszczędzający czas i opłacalny. System ten został opracowany w celu łatwego badania przeciwnowotworowego działania LCFS w wielu typach sferoid CRC. Zgodnie z oczekiwaniami, sferoidy CRC traktowane LCFS silnie indukowały śmierć komórki podczas eksperymentu i wyrażały specyficzne markery molekularne apoptozy, analizowane za pomocą qRT-PCR, western blotting i analizy FACS. Dlatego metoda ta jest cenna dla badania żywotności komórek i oceny skuteczności leków przeciwnowotworowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Probiotyki to najkorzystniejsze mikroorganizmy w jelitach, które poprawiają homeostazę immunologiczną i metabolizm energetyczny gospodarza1. Probiotyki z Lactobacillus i Bifidobacterium są najbardziej zaawansowanymi tego rodzaju produktami występującymi w jelitach2,3. Wcześniejsze badania wykazały, że Lactobacillus ma działanie hamujące i antyproliferacyjne na kilka nowotworów, w tym raka jelita grubego4. Ponadto probiotyki zapobiegają chorobom zapalnym jelit, chorobie Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącemu zapaleniu jelita grubego5,6. Jednak większość badań z probiotykami przeprowadzono w dwuwymiarowych (2D) monowarstwach, które są hodowane na stałych powierzchniach.

Sztuczne systemy hodowlane nie mają cech środowiskowych, co nie jest naturalne dla komórek rakowych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano trójwymiarowe (3D) systemy hodowli7,8. Komórki nowotworowe w 3D wykazują poprawę pod względem podstawowych mechanizmów biologicznych, takich jak żywotność komórek, proliferacja, morfologia, komunikacja komórka-komórka, wrażliwość na leki i trafność in vivo9,10. Co więcej, sferoidy są zbudowane z wielokomórkowych typów raka jelita grubego i są zależne od interakcji komórka-komórka oraz macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)11. Nasze poprzednie badanie wykazało, że probiotyczny supernatant bezkomórkowy (CFS) wytwarzany przy użyciu Lactobacillus fermentum wykazał działanie przeciwnowotworowe na hodowle 3D komórek raka jelita grubego (CRC)12. Zaproponowaliśmy, że CFS jest odpowiednią alternatywną strategią do testowania wpływu probiotyków na sferoidy 3D12.

Tutaj prezentujemy podejście, które może dostosować się do wielokomórkowych typów 3D raka jelita grubego do analizy efektów terapeutycznych probiotycznego supernatantu bezkomórkowego (CFS) na kilka systemów mimikry 3D raka jelita grubego. Metoda ta zapewnia środki do analizy powiązanych działań probiotycznych i przeciwnowotworowych in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowle komórek bakteryjnych i przygotowanie bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus (LCFS)

UWAGA: Kroki 1.2 - 1.9 są przeprowadzane w komorze beztlenowej.

  1. Przygotuj płytkę agarową MRS i bulion zawierający L-cysteinę i sterylizuj w autoklawie.
  2. Wstępnie inkubować płytkę agarową MRS w komorze beztlenowejH2 utrzymywanej w temperaturze 37 °C z 20 ppm tlenu.
  3. Rozmrozić materiał bakteryjny Lactobacillus i zaszczepić płytkę agarową kulturą bakteryjną (Rysunek 1A (i)).
  4. Inkubować bakterie przez 2 - 3 dni w komorze beztlenowejH2 w temperaturze 37 °C i 20 ppm tlenu, aż do uzyskania pojedynczych kolonii bakteryjnych.
  5. Umyj i osusz probówkę do hodowli beztętnianowej typu Hungate. Autoklawować probówkę hodowlaną w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
  6. Następnie inkubować probówkę w komorze beztlenowejH2 w temperaturze 37 °C i 20 ppm tlenu w celu usunięcia tlenu.
  7. Umieść 2-3 ml bulionu MRS w probówce. Uszczelnij rurkę korkiem z gumy butylowej i zakręć nakrętkę.
  8. Uzyskać pojedynczą kolonię z pętlą i umieścić ją w probówce hodowlanej o pojemności 1,5 ml z 500 μl 1x PBS. (Rysunek 1A (ii)).
  9. Zawiesić kolonię za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (Rysunek 1A (iii)). W tym celu należy umieścić igłę strzykawki o pojemności 1 ml w środku wieczka probówki, zasysać zawieszoną kolonię, a następnie ponownie umieścić ją w pożywce bulionowej MRS. (Rysunek 1A (iv)).
  10. Inkubować pożywkę bulionową MRS w inkubatorze z wytrząsarką przez 2 dni (37 °C, 5% CO2, 200 obr./min).
  11. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) za pomocą spektrofotometru w celu monitorowania krzywych wzrostu bakterii, aż absorbancja przy OD620 osiągnie 2,0.
  12. Oddzielić granulki bakteryjne od kondycjonowanej pożywki przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 15 minut. Umyj zebrane granulki bakteryjne 1x PBS i ponownie zamieszaj w 4 ml RPMI 1640 uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą. Nie należy dodawać żadnych antybiotyków do pożywki.
  13. Utrzymuj granulki bakteryjne w RPMI i inkubuj w inkubatorze z wytrząsarką przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przy prędkości 100 obr./min.
  14. W celu przygotowania supernatantu probiotycznego usunąć osad bakteryjny przez odwirowanie w temperaturze 1000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odzyskany supernatant należy sterylnie przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. Generowanie sferoid

  1. Przygotowanie linii komórkowych raka jelita grubego
    1. Hoduj linie komórkowe DLD-1, HT-29 i WiDr jako monowarstwy do 70-80% zbiegu i inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 (pożywka wzrostowa: RPMI zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny).
    2. W przypadku komórek hodowanych na szalce Petriego o średnicy 100 mm należy dwukrotnie przemyć płytkę 4 ml 1x PBS. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować szalkę Petriego przez 2 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w celu dysocjacji komórek.
    3. Po inkubacji sprawdź dysocjację komórek pod mikroskopem i zneutralizuj trypsynę-EDTA za pomocą 5 ml pożywki wzrostowej.
    4. Przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 3 minuty przy 300 x g.
    5. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić ponownie z 3 ml pożywki wzrostowej.
    6. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego, aby określić żywe komórki za pomocą hemocytometru. (Rysunek 1B (i))
  2. Formacja sferoidalna
    1. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml rozcieńczyć komórki od 2.1.5, aby uzyskać 1 - 2 x 105 komórek/ml (Rysunek 1B (ii))
    2. Dodać końcowe stężenie 0,6% metylocelulozy do zawiesiny komórek i przenieść rozcieńczone komórki do sterylnego zbiornika.
      UWAGA: Dla każdej linii komórkowej należy miareczkować i odpowiednio określać potrzebną ilość metylocelulozy.
    3. Za pomocą pipety wielokanałowej dozuj 200 μl komórek do każdego dołka 96-dołkowej mikropłytki o okrągłym dnie o bardzo niskim nasadce. (Rysunek 1B (iii))
    4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniemCO2 przez 24-36 godzin.
    5. Po 24 - 36 godzinach obserwuj płytkę pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że tworzy się sferoidy.

3. Leczenie komórek 3D raka jelita grubego za pomocą LCFS

  1. Wygeneruj sferoidy zgodnie z opisem w krokach 2 i 3.
  2. Przed wykonaniem zabiegu LCFS należy rozmrozić zamrożony LCFS w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 - 20 minut.
  3. Zaszczepić roztwór podstawowy LCFS w pożywce wzrostowej. Seryjnie rozcieńczyć do 25%, 12,5% i 6% w pożywce wzrostowej (tj. 25% LCFS = 150 μL pożywki wzrostowej + 50 μL LCFS).
  4. Wyjąć z inkubatora płytkę do hodowli komórkowej zawierającą sferoidy i usunąć jak najwięcej pożywki wzrostowej z każdej studzienki za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  5. Dodać pożywkę wzrostową z LCFS na komórki i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 24 - 48 godzin
    UWAGA: Objętość, która ma być użyta, będzie zależeć od rozmiaru płytki w następujący sposób: 2 ml dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych; 200 μl dla 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.

4. Żywotność komórek dla sferoidów

  1. Przygotuj 8 - 10 sferoid raka jelita grubego leczonych LCFS na nieprzezroczystych płytkach wielodołkowych (testy żywotności komórek wykonuje się 48 godzin po leczeniu LCFS).
  2. Rozmrozić odczynnik do żywotności komórek (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Przed użyciem wyrównać odczynnik żywotności komórek do temperatury pokojowej.
  4. Przed wykonaniem testu należy usunąć 50% pożywki wzrostowej ze sferoid.
  5. Dodać 100 μl odczynnika żywotności komórek do każdego dołka.
    UWAGA: Objętość, która ma być użyta, będzie zależeć od rozmiaru płytki w następujący sposób: 100 μl dla 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.
  6. Mieszaj odczynnik energicznie przez 5 minut, aby przyspieszyć lizę komórek.
  7. Inkubować przez 30 min – 2 h w temperaturze 37 °C.
  8. Zapisz luminescencję.

5. Ilościowa analiza łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym dla sferoidów

  1. Dla każdego warunku przygotuj 10 - 15 sferoid w probówce o pojemności 2 ml i odwiruj przez 3 minuty przy 400 x g.
  2. Wyrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć sferoidy w 1 ml lodowatego środka 1x PBS.
    UWAGA: Unikaj wirowania, pozwól sferoidom się uspokoić.
  3. Odessać jak najwięcej 1x PBS i wyizolować RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu.
  4. Zsyntetyzuj cDNA z 1 μg RNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu zgodnie z protokołem producenta.
  5. Przygotować mieszankę wzorcową, aby wszystkie próbki rozprowadzić w trzech egzemplarzach (zob. tabela 1 i tabela 2).
  6. Przeprowadzić amplifikację w 20 μl wzorcowej mieszaniny matrycy do każdej płytki qPCR.
  7. Dobrze wymieszaj reakcje i w razie potrzeby odwiruj.
  8. Uruchom próbki zgodnie z zaleceniami producenta urządzenia (Tabela 3).

6. Western blot ze sferoidów

UWAGA: Podczas zbierania sferoid użyj pipety o pojemności 200 μL i odetnij końcówki końcówek, aby nie naruszyć ich struktury.

  1. Dla każdego warunku przygotuj 30 - 40 sferoid w probówce o pojemności 2 ml.
  2. Umieść probówkę na lodzie i pozwól sferoidom osiąść na dnie probówki o pojemności 2 ml.
  3. Wyrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć sferoidy w 1 ml lodowatego środka 1x PBS
    UWAGA: Unikaj wirowania, pozwól sferoidom się uspokoić.
  4. Odessać jak najwięcej 1x PBS i dodać bufor RIPA z koktajlem inhibitorów proteazy (10 sferoid = 30 μl buforu RIPA).
  5. Poddać komórki lizie przez pipetowanie w górę i w dół i wykonywać sonikację przez 30 sekund z 30 sekundami odpoczynku na lodzie przez 10 cykli.
  6. Odwirować lizaty białkowe przy 15000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Określ stężenie białka dla każdego lizatu komórkowego.
  8. Przed załadowaniem gotować lizat komórkowy w buforze do próbek w temperaturze 100 °C przez 10 minut.
  9. Załaduj równe ilości białka do studzienek żelu SDS-PAGE i uruchom żel przez 1 - 2 godziny pod napięciem 100 V.
  10. Przenieś białko z żelu do membrany PVDF.
  11. Po przeniesieniu zablokować membranę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą buforu blokującego (5% mleka odtłuszczonego + TBS z 0,05% Tween-20).
  12. Inkubować błonę z rozcieńczeniami pierwszorzędowego przeciwciała w stosunku 1:1 000 (Tabela 4) w 1x TBST z 5% buforem BSA w temperaturze 4 °C przez noc.
  13. Umyj membranę trzykrotnie TBST, 15 minut na każde pranie.
  14. Inkubować błonę z rozcieńczeniami przeciwciała drugorzędowego w proporcji 1:2,500 w buforze blokującym w temperaturze pokojowej przez 2 godziny (patrz tabela materiałów).
  15. Umyj membranę trzykrotnie TBST, 15 minut na każde pranie.
  16. Przygotować membranę do detekcji HRP za pomocą podłoża chemiluminescencyjnego.
  17. Pozyskiwanie obrazów chemiluminescencyjnych.

7. Barwienie sferoidów jodkiem propidyny (PI)

  1. Przygotować 5-10 sferoid zgodnie z opisem w kroku 4.1 i umieścić sferoidy w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Rozcieńczyć zapas 1 mg/ml PI 1:100 w 1x PBS.
  3. Usuń 50% pożywki z każdego dołka płytki 96-dołkowej.
  4. Dodać 100 μl roztworu PI do każdej studzienki i umieścić studzienki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 10 - 15 minut.
  5. Przepłukać roztwór PI 1x PBS.
  6. Dodać 200 μl pożywki wzrostowej i wykonać zdjęcie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Przeanalizuj intensywność fluorescencji za pomocą obrazu J, aby uzyskać liczbę żywotności sferoidy.

8. Analiza FACS sferoidów

  1. Wygeneruj sferoidy zgodnie z wcześniejszym opisem.
  2. Dla każdego warunku przygotuj 30 - 40 sferoid w probówce FACS i odwiruj przez 3 minuty przy 400 x g i RT.
  3. Odessać supernatant i przemyć sferoidy w 3 ml 1 PBS, a następnie odwirować przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  4. Odessać supernatant i dodać 200 μl 0,25% trypsyny-EDTA, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 -3 minuty
    UWAGA: Czas inkubacji zależy od wielkości sferoidy i typu komórki.
  5. Dodać 1 ml buforu FACS i delikatnie rozdzielić sferoidy za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  6. Odwirować zdysocjowane komórki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 3 min.
    UWAGA: Bufor FACS = 1x PBS + 2,5% FBS, filtrowany za pomocą górnego filtra 0,22 μm.
  7. Odrzucić supernatant i dodać odczynnik 7-AAD/Aneksyna V (7AAD (5 μl), Aneksyna V (5 μl)/próbkę).
  8. Delikatnie zwirować komórki i inkubować przez 13 - 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Dodać 500 μl buforu FACS i przefiltrować komórki za pomocą stożkowych probówek z polistyrenu w celu usunięcia komórek zbiorczych.
  10. Wirować przy 400 x g i 4 °C przez 3 min.
  11. Dodać 500 μl buforu wiążącego Aneksyna V do każdej probówki i ponownie zawiesić.
  12. Analizuj za pomocą cytometru przepływowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół uzyskiwania sferoidów z różnych linii komórkowych raka jelita grubego. Suplementacja metylocelulozą była wymagana do wytworzenia sferoidów. Przedstawiono również sposób przygotowania LCFS oraz przedstawiono model do badania korelacji pomiędzy probiotykami a rakiem jelita grubego. Protokoły tworzenia sferoidów i przygotowania LCFS są schematycznie zilustrowane w Rysunek 1A,B. Jak pokazano na Rysunek 2A, stężenie metylocelulozy wynoszące 0,6% przek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowisko tkankowe, w tym sąsiednie komórki i macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), ma fundamentalne znaczenie dla wytwarzania tkanek i ma kluczowe znaczenie w kontroli wzrostu komórek i rozwoju tkanek13. Jednak hodowle 2D mają kilka wad, takich jak zakłócenie interakcji komórkowych, a także zmiany w morfologii komórek, środowiskach zewnątrzkomórkowych i zbliżaniu się podziału14. Systemy hodowli komórkowych 3D zostały rygorystycznie przebadane w celu lepszego odtworzenia e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie posiadają żadnych istotnych informacji finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te były wspierane przez programy "Ustanowienie standardów pomiarowych dla chemii i promieniowania", grant numer KRISS-2020-GP2020-0003, oraz "Rozwój standardów pomiarowych i technologii dla biomateriałów i konwergencji medycznej", numer grantu KRISS-2020-GP2020-0004, finansowane przez Koreański Instytut Badań nad Standardami i Nauką. Badania te były również wspierane przez Ministerstwo Nauki i ICT (MSIT), Koreańską Narodową Fundację Badawczą (NRF-2019M3A9F3065868), Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej (MOHW), Koreański Instytut Rozwoju Przemysłu Opieki Zdrowotnej (KHIDI, HI20C0558), Ministerstwo Handlu, Przemysłu i Energii (MOTIE) oraz Koreański Instytut Oceny Technologii Przemysłowej (KEIT, 20009350). Identyfikator ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Numer telefonu: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Dziękujemy Chang Woo Park za pomoc w eksperymentach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze

10% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 15-dołkowe, 15 i mikro; l		Biorad4561036Opakowanie 10
sztuk Applied Biosystems MicroAmp Optyczny klej samoprzylepny ThermoFisher Scientific4311971100 pokryw
10x bufor transferowyIntronIBS-BT031A1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)IntronIBS-BT0141 L
Axygen 2,0 mL MaxyClear Snaplock Mikrowirówka, polipropylen, przezroczysta, niesterylna, 500 probówek/opakowanie, 10 paczek / opakowanieCorningSCT-200-C500 probówek / opakowanie, 10 opakowań / opakowanie
BD Difco Bacto AgarBD214010500 g
BD Difco Lactobacilli MRS BulionBDDF0881-17-5500 g
CellTiter-Glo 3D Test żywotności komórekPromegaG9681100μ l/test w 96-dołkowych płytkach
Kompletny koktajl inhibitorów proteazySigma-Aldrich11697498001fiolka 20 tabletek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Corning, 1X bez wapnia i magnezu, pH 7,4 i plusmn; 0,1Corning21-040-CV500 ml
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Membrany transferowefisher Scientific IPVH00010rolka 26,5 cm x 3,75 m; Wielkość porów: 0,45um
Falcon 5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z zatrzaskowym sitkiem do komórekCorning35223525 / opakowanie, 500 / skrzynka
Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, pochodzenie z USAThermo Fisher Scientific16000044500 ml
iScript Zestaw do syntezy cDNA, 25 x 20 i mikro; l rxns #1708890Biorad170889025 x 20 &mikro; L rxns
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad17251215 x 1 mL
Lactobacillus fermentumKoreańska kolekcja dla kultur typuKCTC 3112
Chlorowodorek L-cysteiny jednowodnySigma-AldrichC6852-25G25 g
Metyloceluloza (3500-5600mPa· s, 2% w wodzie o sile 20° C)TCIM0185500 g
MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym, 0,1 mlApplied Biosystems434690620 płytek
Jednostka filtra strzykawkowego Millex-GS, 0,22 i mikro; m, mieszane estry celulozy, 33 mm, sterylizowane tlenkiem etylenuMilliporeSLGS033SB250
PE Annexin V Zestaw do wykrywania apoptozy z 7-AADBiolegend640934100 testami
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122100 ml
Introgenjodku propidynyP1304MP100 mg
RIPA Bufor do lizy i ekstrakcjiThermo Fisher Scientific89901250 ml
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106250
RPMI-1640Gibco11875-119500 ml
trypsyny-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25200056100 ml
Nazwa materiałów/sprzętu/oprogramowaniaFirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
anti - p-Iκ B&alfa; (B-9)Santa cruzesc-8404200 &mikro; g / ml
anty-BclxL (H-5)Santa cruzesc-8392200 µ g / ml
anty-PARP 1 (C2-10)Santa cruzesc-5364350 µ l wodobrzusze
anty-β-aktyna (C4)Santa cruzesc-47778200 &mikro; g/mL
BD FACSDerseBD BiosciencesSan Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate ReaderCO2 BioTS1LFA
stożkowa 15 mlSPL50015
Probówka stożkowa 50 mlSPL50050
Nasadka Corning Costar Ultra-Low Płytka wielodołkowaSigma-AldrichCLS7007
Corning Costar Ultra-Low Tool Płytka wielodołkowaSigma-AldrichCLS3471
Costar 50 mL Zbiorniki na odczynniki, 5 w worku, sterylneSzkiełka komory4870
Countess ThermofisherC10228
Countess II FL Automatyczny licznik komórekinvitrogen
Czytnik wielomodowy EnSpirePerkin ElmerEnspire 2300
Eppendorf Research Plus Pipeta wielokanałowa, 8-kanałowaEppendorf3122000051
Oprogramowanie FlowJoTreeStarAshland, OR, USA
Kozia IgG Przeciw Myszom (H+L)Jackson immunoresearch115-035-0621,5 ml
Kozia IgG Przeciw Królikowi (H+L)Jackson immunoresearch111-035-1442.0 mL
GraphPad Prism 5GraphPad SoftwareInc., San Diego, CA, USA
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmTokio, Japonia
Wytrząsarka inkubowanaTowarzysz laboratoryjnySIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,FujifilmTokio, Japonia
Spektrofotometry gęstości optycznej (OD)LAMBDA UV/VisPerkin ElmerWaltham, MA, Stany
Zjednoczone Mikroskop z kontrastem fazowymOlympusTokio, Japonia
Probówka mikrowirówkowa SPL 1,5 mlSPL60015
SPL Zbiorniki wielokanałowe, 12-kanałowe, PS, sterylneSPL21012
System PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlusThermo Fisher ScientificWaltham, MA, Stany
Zjednoczone Ultradźwiękowe procesory cieczy Vibra-cellSONICS-vibra cellVC 505500 Watt procesor ultradźwiękowy
Winylowa komora anaerobowaCOY LAB PRODUCTS
Inkubator Thermo fisher HERAcell 150i Rurka do liczenia komórek Costar AMQAF1000

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
  2. Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
  3. Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
  4. Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
  5. Harish, K., Varghese, T. Probiotics in humans-evidence based review. Calicut Medical Journal. 4 (4), 3(2006).
  6. Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  10. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  11. Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  12. Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557(2019).
  13. Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
  14. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
  16. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  17. Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886(2018).
  18. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  19. Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
  20. Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
  21. Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  22. Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
  23. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  24. Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
  25. Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Microbiota and the social brain. Science. 366 (6465), 2016(2019).
  26. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  27. Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
  28. Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711(2019).
  29. Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sferoidy raka jelita grubegonads cz Lactobacillustr jwymiarowa hodowla kom rkowaanaliza mierci kom rekcytometria przep ywowaWestern blottingqRT PCRtraktowanie metylocelulozultra niskie przyleganiemarkery apoptozy

Powiązane artykuły