Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61288

⸱

13 maja 2020

 ,  ,  , 
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology, Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół został opracowany do badania przejścia dimery-dodekameru TmPep1050, aminopeptydazy M42, na poziomie strukturalnym. Jest to prosty proces obejmujący proces od oczyszczania białek po przetwarzanie danych rentgenowskich. Krystalogeneza, indeksacja zbioru danych i wymiana molekularna zostały podkreślone na przykładzie wariantu TmPep1050H60A H307A.

Streszczenie

Aminopeptydazy M42 tworzą funkcjonalnie aktywne kompleksy złożone z 12 podjednostek. Wydaje się, że ich proces składania jest regulowany przez kofaktory jonów metali, które wyzwalają przejście dimer-dodekamer. Po związaniu jonów metalu zachodzi kilka modyfikacji strukturalnych w miejscu aktywnym i na granicy interakcji, kształtując dimery w celu promowania samoorganizacji. Aby zaobserwować takie modyfikacje, stabilne oligomery muszą zostać wyizolowane przed badaniem strukturalnym. Opisano tutaj metodę, która umożliwia oczyszczanie stabilnych dodekamerów i dimerów TmPep1050, aminopeptydazy M42 T. maritima oraz określenie ich struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Dimery otrzymano z dodekamerów poprzez usunięcie jonów metali za pomocą czynnika chelatującego. Bez ich kofaktora dodekamery stawały się mniej stabilne i ulegały całkowitej dysocjacji po podgrzaniu. Struktury oligomeryczne zostały rozwiązane za pomocą prostego podejścia opartego na wymianie molekularnej. Aby zilustrować metodologię, przedstawiono strukturę wariantu TmPep1050, całkowicie upośledzonego w wiązaniu jonów metali, bez dalszego rozkładu dimerów do monomerów.

Wprowadzenie

Oligomeryzacja jest dominującym procesem, który dyktuje biologiczne funkcje wielu białek. Szacuje się, że w Escherichia coli tylko 35% białek jest monomerycznych1. Niektóre białka, zwane morfeinami, mogą nawet przyjmować kilka stanów oligomerycznych z podjednostkami o odrębnej strukturze w każdym stanie oligomerycznym2. Przejście między ich stanami oligomerycznymi jest często środkiem do regulacji aktywności białek, ponieważ każdy stan oligomeryczny może mieć inną specyficzną aktywność lub funkcję. Kilka przykładów morfein zostało dobrze udokumentowanych w literaturze, w szczególności syntaza porfobilinogenu3, kinaza/fosfataza HPr4, Lon proteaza5, dehydrogenaza mleczanowa6, dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanu7, kinaza pirogronianowa8, syntaza cytrynianowa9 i rybonukleaza A10. Niedawno opisaliśmy aminopeptydazę M42 TmPep1050, kolejny przykład enzymu o zachowaniu podobnym do morfeiny, którego aktywność zależy od jego stanów oligomerycznych11. Przejście między stanami oligomerycznymi odbywa się za pośrednictwem kofaktorów metalicznych, które indukują kilka modyfikacji strukturalnych podjednostek.

Rodzina aminopeptydazy M42 należy do klanu MH12,13, i jest szeroko rozpowszechniona wśród bakterii i Archaea14. Aminopeptydazy M42 są prawdziwymi enzymami dwujądrowymi rozkładającymi peptydy o długości do 35 reszt aminokwasowych15. Przyjmują osobliwą strukturę w kształcie czworościanu zbudowaną z 12 podjednostek, których miejsca aktywne są zorientowane w kierunku wewnętrznej jamy. Taki układ jest często opisywany jako nano-kompartmentacja aktywności w celu uniknięcia niekontrolowanej proteolizy. Fizjologiczna funkcja aminopeptydaz M42 może być związana z proteasomem, hydrolizującymi peptydami powstałymi w wyniku degradacji białek16,17. Pyrococcus horikoshii posiada cztery aminopeptydazy M42, z których każda wykazuje odrębną, ale uzupełniającą się specyficzność18,19,20,21. Pojedynczo u P. horikoshii opisano heterokompleksy zbudowane z dwóch różnych typów podjednostek, co sugeruje istnienie kompleksów peptydasomów22,23.

Kilka struktur aminopeptydaz M42 zostało opisanych w literaturze11,16,18,19,20,24,25,26. Podjednostka składa się z dwóch odrębnych domen, domeny katalitycznej i domeny dimeryzacji. Domena katalityczna przyjmuje wspólny fałd α/β zachowany w całym klanie MH, przy czym archetypową domeną katalityczną jest aminopeptydaza Ap1 Vibrio proteolyticus27. Domena dimeryzacji przyjmuje podobną do PDZ klasę fold16 i może mieć, oprócz swojej roli w oligomeryzacji, rolę w kontrolowaniu dostępu substratu i wiązania w wewnętrznej jamie11. Ponieważ podstawowym elementem składowym jest dimer, dodekamer jest często opisywany jako asocjacja sześciu dimerów, z których każdy jest umieszczony na każdej krawędzi czworościanu16. Oligomeryzacja aminopeptydaz M42 opiera się na dostępności jej kofaktorów metali. Jony metali dwuwartościowych, często Zn2+ i Co2+, są katalitycznie zaangażowane w wiązanie i hydrolizę peptydów. Znajdują się one w dwóch różnych miejscach wiązania, a mianowicie w miejscach M1 i M2. Dwa jony metali również napędzają i precyzyjnie dostrajają oligomeryzację, jak pokazano dla PhTET2, PhTET3, PfTET3 i TmPep105011,24,28,29. Gdy kofaktory metali są wyczerpane, dodekamer rozpada się na dimery, jak w PhTET2, PhTET3 i TmPep105011,16,28, a nawet monomery, jak w PhTET2 i PfTET324,29.

Prezentowany tutaj jest protokół używany do badania struktur oligomerów TmPep1050. Protokół ten jest zestawem powszechnych metod, w tym oczyszczania białek, badania przesiewowego aktywności proteolitycznej, krystalizacji, dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego i wymiany molekularnej. Podkreślono subtelności związane z radzeniem sobie z metaloenzymami, oligomeryzacją białek, krystalizacją białek i wymianą molekularną. Przedstawiono również przypadek badania, które pokazuje, czy dodekamery TmPep1050 mogą dalej dysocjować na monomery, czy nie. Aby odpowiedzieć na to pytanie, zbadano wariant TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, którego miejsca wiązania metali są upośledzone przez mutację His-60 (miejsce M2) i His-307 (miejsce M1) do reszt Ala. Protokół ten może być stosowany do badania innych aminopeptydaz M42 lub dowolnych metaloenzymów o zachowaniu podobnym do morfeiny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja i oczyszczanie rekombinowanego TmPep1050

UWAGA: Poniżej opisano procedurę klonowania i oczyszczania dzikiego typu TmPep1050 zaadaptowaną z poprzedniego badania11. Alternatywnie, klonowanie można przeprowadzić przy użyciu syntetycznego genu. Aby wygenerować warianty TmPep1050, mutagenezę ukierunkowaną na miejsce można przeprowadzić na przykład zgodnie z metodą SPRINP (single-starter reactions in parallel protocol)30. Protokół oczyszczania może być stosowany dla wariantów TmPep1050. Należy unikać stosowania His-tag, ponieważ zakłóca on wiązanie jonów metali.

  1. Projektowanie wektorów wyrażeń
    1. Pozyskanie genomowego DNA Thermotoga maritima MSB8 (ATCC 43589) lub TmCD00089984 (Joint Center for Structural Genomics).
    2. Amplifikuj otwartą ramkę odczytu (ORF) TM_1050 użyciu genomowego DNA lub plazmidu matrycowego, polimerazy DNA o wysokiej wierności i następujących starterów: ocej419 (5'- TTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATACCCATGAAGGAACTGATCAGAAAGCTG) i ocej420 (5'- ATCCGCCAAAACAGCTGCTGGAGACCGTGTTTACGCCCCCAGATACCTGATGG). Przeprowadź badanie przesiewowe reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zgodnie z następującym schematem: 5 minut w temperaturze 95 °C, 30 cykli po 3 kroki (30 s w 95 °C, 30 s w 55 °C, 90 s w 72 °C) i 10 minut w temperaturze 72 °C jako etap końcowy.
    3. Sklonuj fragment PCR do odpowiedniego wektora ekspresji (Tabela materiałów) przez rekombinację homologiczną ( Rysunek 1) w E. coli zgodnie z protokołem SLiCE 31. Do 50 ng zlinearyzowanego wektora dodać fragment PCR w stosunku molowym 10:1 fragmentu do wektora, 1 μl ekstraktu szczepu PPY, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP i 10 mM ditiotreitolu (DTT) dla objętości reakcyjnej 10 μL. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    4. Przekształć chemicznie kompetentny niebieski szczep E. coli XL1 (lub dowolny szczep odpowiedni do zaleceńA) za pomocą 1 μl reakcji rekombinacji. Umieść komórki na pożywce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
    5. Zbierz kolonie na świeżych płytkach LB ze 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 8 godzin.
    6. Przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem dodatnich kandydatów metodą PCR kolonii przy użyciu odpowiedniej pary starterów (5'- ATGCCATAGCATTTTTATCC i 5'- ATTTAATCTGTATCAGGC, jeśli stosuje się zalecany wektor wymieniony w tabeli materiałów). Za pomocą końcówki z mikrokońcówką zdrap pobraną kolonię i przenieś komórki do 20 μl mieszanki reakcyjnej zawierającej 0,5 μM każdego startera i 10 μL komercyjnej mieszanki polimerazy DNA Taq.
    7. Przeprowadź badanie przesiewowe PCR zgodnie z następującym schematem: 5 minut w temperaturze 95 °C jako etap denaturacji, 30 cykli po 3 etapy (30 s w 95 °C, 30 s w 55 °C, 90 s w 72 °C) i 10 minut w temperaturze 72 °C jako etap końcowy.
      UWAGA: Reakcje PCR można przechowywać przez noc w maszynie do PCR w temperaturze 12 °C.
    8. Załaduj 10 μl każdej reakcji PCR na 0,8% żel agarozowy przygotowany w buforze tris-octanu-EDTA (TAE). Uruchom elektroforezę na 25 minut przy napięciu 100 V.
      UWAGA: Spodziewany jest amplikon 1,1 kbp.
    9. Ekstrahuj plazmidy od kandydatów za pomocą zestawu komercyjnego (tabela materiałów) i sekwencjonuj je przy użyciu tej samej pary starterów, co w kroku 1.1.6.
  2. Hodowla komórkowa
    UWAGA: Gdy odpowiedni kandydat zostanie zidentyfikowany przez sekwencjonowanie, klon może być bezpośrednio użyty jako wyrażenie w przypadku korzystania z zalecanego wektora (Tabela materiałów). W takim przypadku wyrażenie jest kontrolowane przez indukowany arabinozą promotor PBAD < sup class="xref">32.
    1. Zaszczepić 10 ml pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny z kandydatem i inkubować prekulturę przez noc w temperaturze 37 °C pod wytrząsaniem orbitalnym. Dodać 5 ml kultury wstępnej do 1 l pożywki LB ze 100 μg/ml ampicyliny. Pamiętaj, aby przestrzegać stosunku powietrza do cieczy wynoszącego 3.
    2. Pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 37 °C pod wpływem wytrząsania orbitalnego. Monitorować gęstość optyczną przy 660 nm (OD660).
    3. Gdy OD660 osiągnie 0,5−0,6, szybko schłodzić kulturę przez 5 minut na lodzie i przenieść ją do inkubatora ustawionego na 18 °C.
    4. Dodać 0,2 g/l arabinozy w celu wywołania ekspresji genów i inkubować przez 12−18 godzin w temperaturze 18 °C.
    5. Zebrać komórki, odwirowując kulturę przy 6 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 100 ml 0,9% (w/v) NaCl.
    6. Ponownie odwirować przy 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
      UWAGA: Granulki komórkowe mogą być używane bezpośrednio do ekstrakcji białek lub przechowywane w temperaturze -80 °C.
  3. Oczyszczanie białek
    1. Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 40 ml 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7,2. Dodać 1 μl endonukleazy 25 U/μL DNA/RNA i jedną tabletkę koktajlu inhibitorów proteazy, który nie zawiera EDTA. Sonikować zawiesinę w trybie pulsacyjnym pod chłodzeniem przez 30 min.
    2. Odwirować surowy ekstrakt o stężeniu 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i ogrzewać go w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C przez 10 minut.
    3. Odwirować zdenaturowany ekstrakt komórkowy o sile 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant do oczyszczenia.
    4. Użyj odpowiedniej żywicy anionowymiennej (tabela materiałów) umieszczonej w kolumnie o objętości ~15 ml. Zapoznaj się z zaleceniami producenta dotyczącymi roboczego natężenia przepływu i limitu ciśnienia w kolumnie. Zrównoważyć żywicę za pomocą 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7,2.
    5. Załadować supernatant zebrany z kroku 1.3.3 do kolumny. Monitorować absorbancję eluatu przy długości fali 280 nm. Gdy osiągnie linię bazową, przejdź do elucji.
    6. Zastosuj gradient od 0 do 0,5 M NaCl w 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7,2 dla 5 objętości kolumn (CV). Poczekaj, aż przewodność się ustabilizuje, a absorbancja osiągnie linię podstawową.
    7. Zastosuj końcowy gradient od 0,5 do 1 M NaCl w 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7,2 dla 1 CV.
    8. Przeanalizuj niektóre frakcje (patrz Rysunek 2A dla wskazówek) za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE).
      UWAGA: TmPep1050 pojawia się jako pasmo 36 kDa po barwieniu Coomassie. Alternatywnie, obecność TmPep1050 można potwierdzić za pomocą testu aktywności (patrz punkt 2.1). Na tym etapie frakcje mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc.
    9. Zebrać frakcje zawierające TmPep1050 i dodać drobno zmielony proszek (NH4)2SO4 w celu uzyskania stężenia 1,5 M (NH4)2SO4. Delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę do góry nogami, aż do całkowitego rozpuszczenia.
    10. Użyj hydrofobowej żywicy oddziaływania (tabela materiałów) umieszczonej w kolumnie o objętości ~30 ml. Zapoznaj się z zaleceniami producenta dotyczącymi roboczego natężenia przepływu i limitu ciśnienia w kolumnie. Zrównoważyć żywicę z 50 mM MOPS, 1,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2, pH 7,2.
    11. Załadować próbkę do kolumny i monitorować absorbancję eluatu przy długości fali 280 nm. Gdy absorbancja osiągnie linię podstawową, eluować związane białka, stosując gradient od 1,5 M do 0 M (NH4)2SO4 w 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7,2 dla 5 CV.
    12. Przeanalizuj niektóre ułamki (patrz Rysunek 2B dla wskazówek) przez SDS-PAGE.
      UWAGA: TmPep1050 pojawia się jako pasmo 36 kDa po barwieniu Coomassie. Alternatywnie, obecność TmPep1050 można potwierdzić za pomocą testu aktywności (patrz punkt 2.1). Na tym etapie frakcje mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc.
    13. Połączyć frakcje zawierające TmPep1050 i zagęścić do 2 ml za pomocą jednostek ultrafiltracji z punktem odcięcia 30 kDa (tabela materiałów). Przejść do sekcji 1.4 w celu oznaczenia masy cząsteczkowej.
  4. Chromatografia wykluczania wielkości
    1. Użyj żywicy wykluczającej rozmiar (tabela materiałów) zapakowanej w kolumnę o objętości ~ 120 ml. Zapoznaj się z zaleceniami producenta dotyczącymi roboczego natężenia przepływu i limitu ciśnienia w kolumnie. Zrównoważyć żywicę z 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2, pH 7,2.
    2. Załadować próbkę do kolumny i monitorować absorbancję eluatu przy długości fali 280 nm. Frakcjonować od objętości martwej kolumny (~0,33 CV) do końca elucji (1 CV).
    3. Zmierzyć objętość elucji dla każdego obserwowanego piku.
      UWAGA: Dla wskazówek, dodekameryczny TmPep1050 eluuje w ~ 82 ml ( Rysunek 3A) w obecnych warunkach eksperymentalnych, podczas gdy dimeryczne TmPep1050, takie jak wariant TmPep1050H60A H307A, eluuje w ~ 95 ml (Rysunek 3B). Niektóre TmPep1050 mogą przyjmować obie formy oligomeryczne, takie jak TmPep1050H60A (Rysunek 3C).
    4. Analizuj ułamki odpowiadające maksimom i ogonom obserwowanych pików za pomocą SDS-PAGE.
      UWAGA: TmPep1050 pojawia się jako pasmo 36 kDa po barwieniu Coomassie.
    5. Połączyć frakcje każdego piku i zagęścić za pomocą jednostek ultrafiltracji z punktem odcięcia 30 kDa (tabela materiałów), aby uzyskać stężenie ~300 μM.
    6. Zmierzyć absorbancję przy 280 nm na spektrofotometrze nanoobjętościowym i obliczyć stężenie, stosując współczynnik ekstynkcji molekularnej wynoszący 18,910 M-1 cm-1.
    7. Oczyszczone białko przechowywać w temperaturze -18 °C.
    8. Aby określić masę cząsteczkową, należy skalibrować kolumnę chromatografii wykluczania wielkości (SEC) przy użyciu wzorców masy cząsteczkowej (tabela materiałów). Analizuj wzorce przy użyciu 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2 pH 7,2 jako bufora bieżącego.

2. Test aktywności i przygotowanie apoenzymu

UWAGA: Pierwotnie, apo-enzym został przygotowany przez rozcieńczenie 1 objętości TmPep1050 w 10 objętościach 2,1 M kwasu jabłkowego pH 7,0 i zagęszczenie z powrotem do 1 objętości przed dializą11. Poniżej przedstawiono alternatywną procedurę z wykorzystaniem 1,10-fenantroliny, chelatora jonów metali. Zabieg ten ogranicza utratę białka i daje takie same efekty jak wcześniej opublikowana metoda.

  1. Oznaczenie aktywności
    1. Przygotować roztwór podstawowy 100 mM L-leucyno-p-nitroanilidu (tabela materiałów) w metanolu.
    2. Dodać 25 μl 100 mM L-leucyno-p-nitroanilidu w 965 μL 50 mM MOPS, 250 μM CoCl2, pH 7,2, 10% metanolu. Mieszaninę reakcyjną należy wstępnie inkubować w temperaturze 75 °C w suchej kąpieli.
    3. Rozcieńczyć enzym w 50 mM MOPS o pH 7,2 do stężenia 1 μM. Dodać 10 μl do mieszaniny reakcyjnej, wirować i inkubować w temperaturze 75 °C albo do momentu, aż zmieni kolor na żółtawy, albo przez 1 godzinę.
    4. Zatrzymaj reakcję, dodając 1 ml 20% kwasu octowego. Dobrze odwiruj i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
    5. Przenieść mieszaninę reakcyjną do celi spektrofotometru. Odczytać absorbancję przy 410 nm w stosunku do kontroli ujemnej (inkubowana mieszanina reakcyjna bez enzymu).
  2. Preparat apoenzymatyczny
    1. Przygotować roztwór podstawowy 1 M 1,10-fenantroliny w etanolu. Dodać 10 μl roztworu podstawowego 1,10-fenantroliny do 890 μl 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7,2. Dodać 100 μl oczyszczonego TmPep1050 (stężenie 300 μM−1 mM).
    2. Sprawdzić utratę aktywności za pomocą testu aktywności opisanego w sekcji 2.1 bez dodawania CoCl2 do mieszaniny reakcyjnej.
    3. Przenieść próbkę do rurki dializowej. Dializować w stosunku do 200 ml 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7,2 w 4 °C. Podczas 48-godzinnej dializy należy wymienić trzykrotnie dializat ze świeżym buforem.
    4. Pobrać próbkę z rurki dializacyjnej i zagęścić z powrotem do 100 μl za pomocą urządzeń do ultrafiltracji z odcięciem 30 kDa (tabela materiałów). Sprawdzić stężenie, odczytując absorbancję przy 280 nm za pomocą spektrofotometru nanoobjętościowego.
  3. Przygotowanie ściemniacza
    1. Rozcieńczyć apo enzym do stężenia 1 μM w 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7,2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 75 °C w suchej łaźni, a następnie pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    2. Zagęścić próbkę do stężenia enzymu wynoszącego co najmniej 50 μM. Sprawdzić masę cząsteczkową metodą SEC (patrz sekcja 1.4). Pipik elucji musi przesunąć się z ~82 ml do ~95 ml (w obecnych warunkach eksperymentalnych).

3. Krystalizacja TmPep1050

UWAGA: Krystalizacja białek pozostaje nauką empiryczną, ponieważ jest zjawiskiem wieloczynnikowym33. Podczas gdy niektóre parametry można zidentyfikować i kontrolować (takie jak temperatura, pH, stężenie czynnika strącającego), inne mogą nieuchwytnie wpływać na krystalizację (takie jak czystość białka i chemiczna, proteoliza, historia próbki). Obecnie krystalizacja białek jest rozwiązywana w sposób racjonalny i systematyczny dzięki wielu komercyjnym warunkom przesiewowym krystalizacji i automatyzacji. Optymalizacja warunków krystalizacji opiera się jednak głównie na podejściu prób i błędów. Poniżej opisano plan krystalizacji białek oraz kilka wskazówek dotyczących optymalizacji warunków krystalizacji.

  1. Badanie przesiewowe krystalizacji
    UWAGA: Korzystając z komercyjnych zestawów do krystalizacji, kryształy dodekameryki TmPep1050 uzyskano w 2,2 M kwasu DL-jabłkowego o pH 7,0, 0,1 M Bis-Tris propanu o pH 7,0 i 0,18 M cytrynianu trójamonu, 20% glikolu polietylenowego (PEG) 3350. Kryształy dimerycznego TmPep1050 otrzymano w 0,1 M cytrynianu sodu o pH 5,6, 0,2 M octanie amonu, 30% PEG4000. Kryształy dodekamerów pojawiają się w ciągu tygodnia i osiągają swój pełny rozmiar w ciągu miesiąca. Kryształy dimerów pojawiają się zwykle w ciągu 24 godzin i osiągają pełny rozmiar w ciągu tygodnia.
    1. Zaopatrz się w kilka komercyjnych zestawów do krystalizacji (przykłady znajdują się w Tabeli materiałów).
    2. Ustaw płytki krystalizacyjne (tabela materiałów) dla metody wiszącej kropli. Napełnić studzienki 500 μl każdego roztworu z zestawu do przesiewania krystalizacji.
    3. Dla każdej studzienki ustaw podporę krystalizacji. Na podporze umieść 1 μl kropli oczyszczonego białka (zwykle ~10 mg/mL).
    4. Natychmiast odpipetować 1 μl roztworu krystalizacyjnego ze studzienki. Dodaj go ostrożnie do kropli białka i delikatnie wymieszaj, trzykrotnie pipetując do góry nogami. Kropla musi pozostać półkulista bez pęcherzyków.
    5. Przykręć wspornik do odpowiedniej studni. Powtórz operację dla całego zestawu.
    6. Po ustawieniu płyt obserwuj każdą kroplę przez lornetkę. Zapoznaj się z instrukcją obsługi zestawu do krystalizacji w celu interpretacji (klarowna kropla, separacja faz, osad, igły itp.).
    7. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C. Sprawdzać płytki raz dziennie w pierwszym tygodniu, a następnie raz w tygodniu.
    8. Oceń każdy dołek, korzystając z arkusza wyników i instrukcji obsługi dołączonej do zestawów do krystalizacji.
  2. Optymalizacja krystalizacji
    UWAGA: Początkowe warunki krystalizacji dodekamerycznego TmPep1050 zostały zoptymalizowane do 2,1 M kwasu DL-jabłkowego o pH 6,75 i 0,18 M cytrynianu triamonu o pH 7,5, 40% (w/v) PEG3350 natomiast warunki krystalizacji dimerycznego TmPep1050 zostały przesunięte do 0,1 M cytrynian sodu o pH 6,0, 10% (w/v) PEG3350. Konieczny był jeden cykl wysiewu, aby poprawić krystaliczność. Poniżej opisano, w jaki sposób zoptymalizowano krystalizację wariantu TmPep1050H60A H307A.
    1. Przygotować roztwory podstawowe 0,5 M buforu cytrynianu sodu o różnym pH (4,5, 5,2 i 6,0) oraz 50% (m/v) roztworu PEG3350.
    2. Ustaw płytkę krystalizacyjną jako matrycę pH w stosunku do czynnika strącającego (patrz Rysunek 4A).
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 20 °C. Każdą studzienkę obserwować przez lornetkę raz dziennie w ciągu tygodnia.
    4. Oceń każdy dołek zgodnie z rozmiarem i kształtem kryształu. Wybrać warunek dający kryształy o wielkości co najmniej 50 μm. Przejdź do mikrosiewu.
  3. Mikrosiew
    UWAGA: Mikrosiew to skuteczna metoda poprawy kształtu, rozmiaru i krystaliczności kryształów białek34. Szybszym podejściem do wysiewu jest wysiew smugowy za pomocą kociego wąsa. Zobacz Rysunek 4 jako przykład, jak optymalizacja krystalizacji i mikroziarno poprawiły kształt i rozmiar kryształów dla TmPep1050H60A H307A.
    1. Przygotuj nasiona, korzystając z wybranego dołka w kroku 3.2.4.
    2. Zwiększyć objętość kropli zawierającej kryształy do 10 μl, dodając roztwór krystalizacyjny ze studzienki. Odpipetować kroplę i dodać 90 μl roztworu krystalizacyjnego z dołka. Dokładnie wymieszaj i trzymaj nasiona na lodzie.
    3. Przygotuj kilka rozcieńczeń nasion: 1x, 10x, 25x i 100x. Dobrze wymieszaj nasiona przed pipetowaniem. Roztwory należy przechowywać na lodzie.
    4. Dla każdego rozcieńczenia nasion ustaw płytkę krystalizacyjną jako matrycę pH w stosunku do czynnika strącającego (patrz Rysunek 4B). Użyć roztworów podstawowych przygotowanych w kroku 3.2.1.
    5. Przygotowując kroplę, dodaj 0,2 μl nasion, aby uzyskać kroplę o pojemności 2 μl. Inkubować płytkę w temperaturze 20 °C. Każdą studzienkę obserwować przez lornetkę raz dziennie w ciągu tygodnia.
      UWAGA: Rozkład wielkości i kształt kryształów musi zostać poprawiony, patrz Rysunek 4C jako przykład dla TmPep1050H60A H307A. Do dalszych zastosowań nasiona można przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego

  1. Zbieranie kryształów
    UWAGA: Przygotowanie próbki zależy od źródła promieniowania rentgenowskiego (urządzenie domowe vs. synchrotron). Używać odpowiednio urządzeń do przechowywania (fiolek i koszyka z uchwytem na fiolki). Dodanie krioprotektantu (takiego jak glicerol) może być wymagane w zależności od stężenia soli/środka strącającego. W przypadku kryształów TmPep1050 krioprotektant nie jest konieczny, ponieważ stężenie PEG lub buforu jest wystarczająco wysokie, aby uniknąć kryształów wody.
    1. Przygotować kąpiel wypełnioną ciekłym azotem, zanurzyć wszystkie fiolki lub kosz używane do obchodzenia się z próbką.
    2. Ustaw pętle pobierania próbek o różnych rozmiarach: 100, 150 i 200 μm (tabela materiałów). Wybierz rozmiary zgodnie z rozmiarem kryształu.
    3. Za pomocą lornetki sprawdź kroplę zawierającą kryształy i znajdź izolowane kryształy (najłatwiejsze do wybrania). Za pomocą pętli delikatnie wybierz kryształ od dołu. Natychmiast zanurz pętlę w ciekłym azocie i umieść pętlę w odpowiedniej fiolce.
  2. Gromadzenie danych
    UWAGA: Zbieranie danych może się znacznie różnić w zależności od źródła promieniowania rentgenowskiego (obiekt domowy vs. synchrotron) i czułości detektora. Strategia zbierania może się również znacznie różnić w zależności od próbki, w zależności od rozdzielczości, intensywności plamki, grupy przestrzeni itp. Temat został obszernie sprawdzony przez Dauter35.
    1. Zamontuj pętlę przenoszącą kryształ na głowicy goniometru dyfraktometru.
    2. Dostrój głowicę goniometru wzdłuż osi XYZ, aby wyrównać kryształ ze ścieżką wiązki promieniowania rentgenowskiego.
    3. Ustaw długość fali na 0,98 A i przesuń detektor, aby uzyskać rozdzielczość 2 A.
    4. Rozpocznij krótkie zbieranie danych od uzyskania obrazów w co najmniej dwóch różnych orientacjach kryształów. Zrób 10 zdjęć (1 zdjęcie na 0,1°) pod kątem 0° i 90°.
    5. Sprawdź zebrane obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. ADXV, XDS-Viewer lub Albula Viewer). Określ intensywność plamki i najwyższą rozdzielczość, w której widoczne są plamy. Sprawdź również monokrystaliczność i separację punktową.
    6. Na koniec powtórz kroki 4.2.3−4.2.5, zmieniając pozycję detektora na wyższą lub niższą rozdzielczość oraz czas ekspozycji zgodnie z obserwacją.
    7. Rozpocznij zbieranie danych w zakresie 360° od 1 zdjęcia wykonanego pod kątem 0,1°. Pamiętaj, aby optymalnie ustawić pozycję detektora i czas ekspozycji.

5. Indeksacja, wymiana molekularna i budowanie modelu

  1. Indeksacja
    UWAGA: Indeksacja to metoda pomiaru intensywności plamek dyfrakcyjnych, podając amplitudy czynników strukturalnych36. Do przetwarzania zebranych obrazów powszechnie używane są cztery pakiety oprogramowania: Mosflm37, HKL200038, DIALS39 i XDS40. Ten ostatni został wykorzystany do indeksowania zbiorów danych uzyskanych z dyfrakcji kryształów TmPep1050.
    1. Zainstaluj pakiet XDS i klasę XDSME41. W przypadku przetwarzania plików HDF5 zainstaluj wtyczkę XDS Neggia (dostępną na stronie Dectris). Aby uzyskać więcej informacji, odwiedź stronę internetową XDS wiki https://strucbio.biologie.uni-konstanz.de/xdswiki/index.php/Main_Page i stronę internetową XDSME https://github.com/legrandp/xdsme.
    2. Przed przetworzeniem danych utwórz folder, z którego zostanie uruchomiony program XDS. Znajdź ścieżkę do obrazów.
    3. Aby uruchomić XDSME, wpisz xdsme /path_to_images/image.extension w oknie terminala.
    4. Po zakończeniu zadania przez XDS sprawdź POPRAWNIE. Plik LP. Zwróć uwagę na prawdopodobieństwo wyznaczenia grupy przestrzeni, kompletność danych, najwyższą rozdzielczość, mozaikowatość kryształów i jakość danych. Sprawdź również XDS_pointless.log, aby uzyskać prawdopodobieństwo wystąpienia grup spacji.
      UWAGA: Zobacz Rysunek 5 jako przykład wyjścia.
    5. Uruchom ponownie XDSME z różnymi rozwiązaniami grup przestrzeni zaproponowanymi przez XDS w osobnym folderze, aby uniknąć nadpisania poprzedniego procesu. Wpisz xdsme -s space_group_name -c "unit_cell_parameters" /path_to_images/image.extension (np. xdsme -s P21 -c "43.295 137.812 61.118 90.000 110.716 90.000).
    6. Sprawdź POPRAWNIE. LP i wybierz najlepsze rozwiązanie na podstawie statystyk danych.
    7. Uruchom polecenie XSCALE, wpisując xscale.py XDS_ASCII. HKL. Uruchom polecenie XDSCONV, wpisując xdsconv.py XSCALE. HKL ccp4.
      UWAGA: W niektórych przypadkach XDSME nie identyfikuje grupy przestrzeni lub nie przycina prawidłowo zakresu rozdzielczości lub generuje dziwne statystyki danych. Jeśli napotkasz taki problem, warto uruchomić XDS natywnie. W XDS należy wprowadzić kilka parametrów. Plik inicjujący INP (zobacz stronę wiki XDS). W przypadku korzystania z XDS prawdopodobieństwo wystąpienia możliwych grup przestrzeni można sprawdzić za pomocą Pointless, części pakietu CCP442. Aby zmniejszyć rozdzielczość zestawu danych, Rmierzy < 60%, a I/σ ~2 są powszechnie akceptowane w celu określenia najwyższej rozdzielczości43. Zastąpienie molekularne i udoskonalenie modelu można jednak poprawić, zwiększając rozdzielczość do I/σ ~0,5−1,5 i CC1/2 w dół do 0,2−0,444.
  2. Wymiana molekularna
    UWAGA: Dane eksperymentalne dają dostęp do amplitudy czynników strukturalnych, ale bez znajomości fazy są bezużyteczne. Fazę można wyznaczyć eksperymentalnie różnymi metodami opierającymi się na anomalnym sygnale (na przykład z ciężkiego atomu)45. Zastępowanie molekularne to inna metoda określania fazy bez anomalnego atomu rozpraszającego46,47. Ta metoda wykorzystuje współrzędne pokrewnej cząsteczki do iteracyjnego znajdowania i ulepszania fazy. Używamy Phaser48 w Phenix GUI49 do wymiany molekularnej.
    1. Przygotuj model początkowy do wymiany molekularnej przy użyciu współrzędnych 4P6Y. Z pliku pdb wyekstrahuj monomer A i skróć jego aminokwasy w alaninie za pomocą edytora plików PDB w Phenix (na karcie Narzędzia modelu).
    2. Uruchom Xtriage w Phenix (na karcie Analiza danych) z plikiem odbicia wygenerowanym przez XDSCONV (5.1.9) i sekwencją jako danymi wejściowymi.
    3. Sprawdź plik dziennika z Xtriage. Zwróć uwagę na kompletność, liczbę podjednostek w jednostce asymetrycznej, anizotropię, obecność pierścieni lodowych i występowanie bliźniaków.
    4. Uruchom Phaser-MR w Phenix (w zakładce Wymiana molekularna) w celu wymiany molekularnej, używając pliku odbicia, sekwencji i początkowego modelu 4P6Y obciętego w polialaninie (krok 5.2.1).
    5. Po zakończeniu sprawdź, czy znaleziono model i jaki jest wynik wymiany molekularnej. Współczynnik translacji Z-score (TFZ) wynoszący co najmniej 8 wskazuje, że rozwiązanie jest ostatecznie poprawne.
  3. Model budowlany
    UWAGA: Po wyznaczeniu fazy przez zastąpienie molekularne, model musi zostać zbudowany i dopracowany. Ten protokół używa Phenix GUI49 do automatycznego budowania i iteracyjnych udoskonaleń oraz Coot50 do ręcznego budowania i udoskonalania struktur.
    1. Po zastąpieniu molekularnym przy użyciu Phase-MR w Phenix wybierz opcję Uruchom autokompilację. Wszystkie wymagane pliki zostaną automatycznie dodane. Po prostu naciśnij Uruchom, aby rozpocząć automatyczne budowanie.
    2. Po zakończeniu sprawdź model w Coot. Zbuduj i udoskonal model ręcznie zgodnie z mapą gęstości elektronów w Coot.
    3. Uściślij ręcznie wyselekcjonowany model w Phenix (na karcie Udoskonalenie), używając modelu, sekwencji i danych dyfrakcyjnych jako danych wejściowych. Zapoznaj się z pomocą Phenix, aby wybrać odpowiednią strategię.
      4. Po doprecyzowaniu sprawdź wyniki: pracaR free i R musi się zmniejszyć, wskaźniki Molprobity51 muszą być przestrzegane, a wartości odstające o niskiej korelacji w przestrzeni rzeczywistej muszą być ograniczone.
    5. Powtarzaj kroki 5.3.2−5.3.4, aż zostanie wygenerowany najlepiej dopracowany model.
    6. Uruchom Molprobity na serwerze: http://molprobity.biochem.duke.edu/. Sprawdź wszystkie wartości odstające zidentyfikowane przez Molprobity.
    7. Na koniec powtarzaj kroki 5.3.2−5.3.6, aż do uzyskania najlepiej dopracowanego modelu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać możliwą dysocjację dodekameru na monomery w TmPep1050, kodony His-60 i His-307 zastąpiono kodonem alaniny przy użyciu syntetycznego genu. Gen ten sklonowano następnie w wektorze pBAD w celu ekspresji i oczyszczania odpowiadającego wariantu TmPep1050, nazwanego później TmPep1050H60A H307A. Chromatografia wykluczania (Rysunek 3B) wykazała, że oczyszczone białko miało pozorną masę cząsteczkową 56 kDa (masa cząsteczkowa monomeru wynosi 36,0 kDa). Podobna pozorna masa cząste...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany w niniejszym dokumencie protokół pozwala zrozumieć przejście dimer-dodekamer TmPep1050 na poziomie strukturalnym. Metodologia ta była wcześniej stosowana do określania struktury obu oligomerów TmPep105011. Najtrudniejszym krokiem było znalezienie warunków sprzyjających dysocjacji dodekamerów na stabilne dimery. Takie warunki musiały być na tyle łagodne, aby umożliwić ponowną asocjację dimerów w dodekamery po dodaniu kofaktora jonów metali. Separacja oligomerów była również krytycznym kroki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Martine Roovers za korektę tego artykułu i konstruktywne komentarze. Dostęp do linii badawczej Proxima 2 (synchrotron SOLEIL) odbywał się w ramach Grup Alokacji Bloków 20151139.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,10-fenantrolinaSigma-Aldrich13, 137-7
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 0,5 ml Ultracel 30KMerck MilliporeUFC503096
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 15 Ultracel 30KMerck MilliporeUFC903024
Nukleaza benzonazyMerck Millipore70664-3
CCP4Nie dotyczyodwiedź http://www.ccp4.ac.uk/
Całkowicie wolny od EDTARoche5056489001
CootN/Aodwiedź https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen IHampton ResearchHR2-110
Crystal Screen IIHampton ResearchHR2-112
DreamTaq Green PCR Master MixThermoFisher Naukowe
NeXtal132007
Escherichia coli Szczep PPYN/Apatrz odniesienie 31
Escherichia coli XL1 niebieski szczepAgilent200249
Zestaw do kalibracji filtracji żelowej HMWGE Healthcare Life Sciences28-4038-42
Zestaw do kalibracji filtracji żelowej LMWGE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze28-4038-41
Standard filtracji żelowejBiorad1511901
GeneJET Zestaw minipreparacyjny plazmiduThermoFisher ScientificK0503
IndeksHampton ResearchHR2-144
Litholoopsmolekularne
L-leucyna-p-nitroanilidBachem AG
Natrix 1Hampton ResearchHR2-116
Natrix 2Hampton ResearchHR2-117
Wtyczka NeggiaDectrisN/Aodwiedź https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite INeXtal130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IINeXtal130725
NeXtal Tube JCSG Core Suite IIINeXtal130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IVNeXtal130727
pBAD-TOPOWizyta w ThermoFisher ScientificK430001
PhenixN/Ahttps://www.phenix-online.org/
Phusion Polimeraza DNA High-FidelitySól ThermoFisher ScientificF-530L
RX 1Hampton ResearchHR2-107
Sól RX 2Hampton ResearchHR2-109
Rurka do dializy SnakeSkin, 3,5K MWCOThermoFisher Scientific88242
Źródło 15PheGE Healthcare Life Sciences17014702
Źródło 15QGE Healthcare Life Sciences17094705
Klasa przygotowawcza Superdex 200GE Healthcare Life Sciences17104301
Thermotoga maritima MSB8 szczepAmerican Type Culture CollectionATCC 43589
TmCD00089984Repozytorium plazmidów DNASUNie
XDSOdwiedź http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsmeNie dotyczyOdwiedź https://github.com/legrandp/xdsme
15-dołkowe narzędzie EasyXtal Wymiary 40010720025 dotyczy

Bibliografia

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639(2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059(2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876(2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601(2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61(2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55(2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227(2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , Jan 26, 2018. Zenodo (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie dodekameruprzygotowanie dimeruchromatografia żelowazamiana molekularnaudoskonalanie w programie Phenixnatywna spektrometria mas
Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.