Artykuł metodologiczny

Testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61289

⸱

6 sierpnia 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Inhibitory acetylotransferaz histonowych (HAT, znane również jako acetylotransferazy lizyny), takie jak CBP/p300, są potencjalnymi terapiami w leczeniu raka. Potrzebne są jednak rygorystyczne metody walidacji tych inhibitorów. Trzy metody walidacji in vitro obejmują testy HAT z rekombinowanymi acetylotransferazami, immunoblotting acetylacji histonów w hodowli komórkowej oraz ChIP-qPCR.

Streszczenie

Acetylotransferazy lizyny (KAT) katalizują acetylację reszt lizyny na histonach i innych białkach, regulując dynamikę chromatyny i ekspresję genów. KAT, takie jak CBP/p300, są intensywnie badane jako cele terapeutyczne ze względu na ich kluczową rolę w nowotworzeniu różnych nowotworów. Opracowanie nowych małocząsteczkowych inhibitorów ukierunkowanych na funkcję acetylotransferazy histonowej (HAT) w KAT jest wyzwaniem i wymaga solidnych testów, które mogą potwierdzić swoistość i siłę działania potencjalnych inhibitorów.

Ten artykuł przedstawia linię trzech metod, które zapewniają rygorystyczną walidację in vitro dla nowych inhibitorów HAT (HATi). Metody te obejmują test HAT w probówce, test hamowania hiperacetylacji chromatyny (ChHAI) i ilościowy PCR immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-qPCR). W teście HAT rekombinowane HAT są inkubowane z histonami w reakcji probówkowej, co pozwala na acetylację określonych reszt lizyny na ogonach histonów. Reakcja ta może być zablokowana przez HATi, a względne poziomy acetylacji histonów specyficznej dla miejsca można zmierzyć za pomocą immunoblottingu. Inhibitory zidentyfikowane w teście HAT muszą zostać potwierdzone w środowisku komórkowym.

Test ChHAI wykorzystuje immunoblotting do badania przesiewowego w poszukiwaniu nowego HATi, który tłumi silną hiperacetylację histonów indukowaną przez inhibitor deacetylazy histonowej (HDACi). Dodanie HDACi jest pomocne, ponieważ podstawowe poziomy acetylacji histonów mogą być trudne do wykrycia za pomocą immunoblottingu.

Testy HAT i ChHAI mierzą globalne zmiany w acetylacji histonów, ale nie dostarczają informacji na temat acetylacji w określonych regionach genomu. Dlatego ChIP-qPCR stosuje się do badania wpływu HATi na poziomy acetylacji histonów w elementach regulatorowych genów. Osiąga się to poprzez selektywną immunoprecypitację kompleksów histon-DNA i analizę oczyszczonego DNA za pomocą qPCR. Łącznie te trzy testy pozwalają na staranną walidację specyficzności, siły działania i mechanizmu działania nowego HATi.

Wprowadzenie

Acetylotransferazy lizyny (KATs) katalizują acetylację reszt lizyny zarówno na białkach histonowych, jak i niehistonowych1,2,3,4. Ostatnie badania pokazują, że KAT i ich funkcja acetylotransferazy mogą sprzyjać wzrostowi guzów litych4,5,6,7,8,9. Na przykład białko wiążące CREB (CBP)/p300 to dwa paralogiczne KAT, które regulują liczne szlaki sygnałowe w raku2,3. CBP/p300 mają dobrze scharakteryzowaną funkcję acetylotransferazy histonowej (HAT) i katalizują acetylację histonu 3 lizyny 27 (H3K27ac)2,4,5,10,11, ważny marker dla aktywnych wzmacniaczy, regionów promotora i aktywnej transkrypcji genów12,13,14. CBP/p300 służą jako krytyczne koaktywatory dla pro-wzrostowych szlaków sygnałowych w guzach litych poprzez aktywację transkrypcji onkogenów poprzez acetylację histonów i innych czynników transkrypcyjnych4,9,15,16,17,18. Ze względu na ich rolę w progresji nowotworu, CBP/p300 i inne KAT są badane pod kątem opracowania nowych inhibitorów, które blokują ich funkcję onkogenną4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 i GNE-049 reprezentują dwie udane próby opracowania silnych i specyficznych inhibitorów dla CBP/p3004,9. Dodatkowe inhibitory są obecnie badane dla CBP/p300 i innych KAT.

Jakość wcześniej opisanych inhibitorów KAT (KATi) jest kwestionowana, a wiele inhibitorów wykazuje docelowe efekty i słabą charakterystykę21. W związku z tym rygorystyczna charakterystyka i walidacja nowych kandydatów na leki ma zasadnicze znaczenie dla opracowania wysokiej jakości sond chemicznych. Przedstawiono tutaj trzy protokoły, które tworzą linię do badań przesiewowych i rygorystycznej walidacji siły i swoistości nowego KATi, ze szczególnym naciskiem na hamowanie funkcji HAT (HATi) KAT. CBP/p300 i ich inhibitory są używane jako przykłady, ale te protokoły można dostosować do innych KAT, które mają funkcję HAT7.

Pierwszy protokół to test in vitro na acetylotransferazę histonów (HAT), który wykorzystuje oczyszczony rekombinowany p300 i histony w kontrolowanej reakcji w probówce. Test ten jest prosty do wykonania, opłacalny, może być stosowany do badań przesiewowych związków w warunkach niskiej przepustowości i nie wymaga materiałów radioaktywnych. W tym protokole rekombinowany p300 katalizuje acetylację lizyny na ogonach histonów podczas krótkiego okresu inkubacji, a poziomy acetylacji histonów są mierzone przy użyciu standardowych procedur immunoblottingu. Reakcja enzymatyczna może być przeprowadzana w obecności lub bez inhibitorów CBP/p300 w celu wykrycia związków zmniejszających acetylację histonów. Ponadto test HAT można wykorzystać do sprawdzenia, czy nowe związki są selektywne dla CBP/p300, oceniając ich aktywność w stosunku do innych oczyszczonych KAT, takich jak PCAF. Test HAT jest doskonałym punktem wyjścia do badania nowych inhibitorów ze względu na swoją prostotę, niski koszt i możliwość określenia siły/selektywności inhibitora. Rzeczywiście, protokół ten jest często używany w literaturze jako badanie przesiewowe in vitro5,10. Jednak inhibitory zidentyfikowane w teście HAT nie zawsze są skuteczne w hodowli komórkowej, ponieważ reakcja w probówce jest znacznie prostsza niż w przypadku żywego systemu komórkowego. Dlatego tak ważne jest dalsze scharakteryzowanie inhibitorów w eksperymentach z hodowlami komórkowymi22,23.

Drugim protokołem w przygotowaniu jest test hamowania hiperacetylacji chromatyny (ChHAI). Ten test oparty na komórkach wykorzystuje inhibitory deacetylazy histonowej (HDACi) jako narzędzie do hiperacetylacji histonów w chromatynie przed jednoczesną inkubacją z klasą HATi24. Podstawowa acetylacja histonów może być niska w hodowli komórkowej, co utrudnia sondowanie za pomocą immunoblottingu bez dodatku HDACi w celu zwiększenia acetylacji. Celem testu ChHAI jest zidentyfikowanie nowego HATi, który może osłabić wzrost acetylacji histonów spowodowany hamowaniem HDAC. Zalety tego testu obejmują jego niski koszt, względną łatwość wykonania oraz wykorzystanie komórek w hodowli, co zapewnia większe znaczenie fizjologiczne niż test HAT w probówce. Podobnie jak w przypadku testu HAT, protokół ten wykorzystuje standardowe immunoblotting do zbierania danych.

Testy HAT i ChHAI dostarczają danych na temat siły nowych związków hamujących globalną acetylację histonów, ale nie dostarczają wglądu w to, jak te związki wpływają na modyfikacje w określonych regionach genomu. Dlatego końcowy protokół, Chromatyna immunoprecypitacyjna-ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (ChIP-qPCR), jest eksperymentem z hodowlą komórkową, który bada interakcje DNA-białko w określonych regionach genomu. W protokole ChIP chromatyna jest usieciowana w celu zachowania interakcji DNA-białko. Chromatyna jest następnie ekstrahowana z komórek, a kompleks DNA-białko jest poddawany selektywnej immunoprecypitacji dla białka będącego przedmiotem zainteresowania (np. przy użyciu przeciwciała specyficznego dla H3K27ac). DNA jest następnie oczyszczane i analizowane za pomocą qPCR. Na przykład ChIP-qPCR można wykorzystać do określenia, czy nowy HATi obniża acetylację histonów w poszczególnych onkogenach, takich jak Cyclin D125. Chociaż ChIP-qPCR jest powszechną techniką stosowaną w terenie, jej optymalizacja może być trudna4,10,26. Protokół ten zawiera wskazówki dotyczące unikania potencjalnych pułapek, które mogą wystąpić podczas wykonywania procedury ChIP-qPCR, i obejmuje kontrole jakości, które należy przeprowadzić na danych.

Używane razem, te trzy protokoły pozwalają na rygorystyczną charakterystykę i walidację nowego HATi. Ponadto metody te mają wiele zalet, ponieważ są łatwe do wykonania, stosunkowo tanie i dostarczają danych na temat globalnej, jak i regionalnej acetylacji histonów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Test HAT in vitro

  1. Przygotowanie buforu
    UWAGA: Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z recepturami.
    1. Przygotować 5 razy bufor do oznaczania i 6 razy dodecylosiarczan sodu (SDS) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Podwielokrotność SDS w 1 ml podwielokrotności.
    2. Przygotuj 10x SDS żelowy bufor do biegania i 10x TBST i przechowuj w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować 1x bufor transferowy i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Sprawdź kartę charakterystyki dla wszystkich substancji chemicznych użytych w tym protokole. SDS, DTT i błękit bromofenolowy są toksyczne i nie powinny być spożywane, wdychane ani narażone na kontakt ze skórą lub oczami. Proszę zapoznać się z kartą charakterystyki, aby uzyskać informacje na temat prawidłowych procedur obsługi. Do obchodzenia się z niebezpiecznymi chemikaliami należy używać okapu wyciągowego.
  2. Reakcja KAPELUSZA
    UWAGA: Kwas anakardowy jest znanym inhibitorem p3003 i jest używany jako przykład do pokazania, w jaki sposób test HAT może zidentyfikować nowe inhibitory p300. Patrz Protokół uzupełniający (Schemat 1) w celu zapoznania się ze schematem kroku 1.2.1.
    1. Przygotować następującą reakcję enzymatyczną w probówce do PCR o pojemności 0,2 ml: 2 μl 5x buforu do oznaczania, 1 μl oczyszczonego p300 (0,19 μg/μL), 1 μl kwasu anakardowego (HATi) lub kontroli DMSO rozcieńczonej w 1x buforze do oznaczania i 2 μL autoklawizowanego ddH2O. Wstępnie inkubować tę mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodać do reakcji 3 μl 100 μM acetylo-CoA i 1 μl oczyszczonego H3.1 (0,2 μg/μL).
    2. Inkubować kompletną mieszaninę reakcyjną w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę w termocyklerze PCR.
    3. Dodać 2-merkaptoetanol w stosunku 1:10 do 6-krotnego buforu próbki SDS.
    4. Usunąć próbki z termocyklera PCR i dodać 2 μl 6x SDS (z dodatkiem 2-merkaptoetanolu) do mieszaniny reakcyjnej.
      UWAGA: 2-merkaptoetanol jest toksyczny i powinien być stosowany wewnątrz dygestoriów chemicznych. Proszę zapoznać się z kartą charakterystyki, aby uzyskać informacje na temat prawidłowego obchodzenia się z produktem.
    5. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut na bloku grzewczym i schłodzić na lodzie. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 lub -80 °C lub przeprowadzić elektroforezę żelową i immunoblotting, jak opisano poniżej.
  3. Elektroforeza żelowa i immunoblotting<br /> UWAGA: Jeśli nie jesteś zaznajomiony z elektroforezą żelową i immunoblottingiem, zapoznaj się z tą standardową procedurą27, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat wykonywania kroków 1.3.1-1.3.17. Dodatkowe informacje można znaleźć tutaj28,29,30,31,32,33.
    1. Pobrać pipetą 10 μl próbek (z kroku 1.2.5) do studzienek żelu poliakrylamidowego o gradiacji 4-20%. Odpipetować 5 μl drabinki białkowej do jednego z dołków jako odniesienie do masy cząsteczkowej. Uruchom żel pod napięciem 120 V przez 90 minut za pomocą zbiornika na żel.
    2. Przenieść żel do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) pod napięciem 100 V przez 70 minut za pomocą zbiornika transferowego.
    3. Zdjąć membranę z aparatu transferowego i umieścić ją w plastikowym pojemniku. Zablokuj membranę, dodając 1x TBST (zawierający 5% mleka) do pojemnika i delikatnie wstrząsaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Usuń 1x TBST z kroku 1.3.3. Inkubować błonę przez noc z wybranymi miejscowo specyficznymi przeciwciałami acetylowymi (np. przeciwciałami pierwszorzędowymi H3K18ac lub H3K27ac w rozcieńczeniu 1:5 000 w 1x TBST zawierającym 5% mleka) w temperaturze 4 °C z delikatnym wstrząsaniem.
    5. Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała. Umyj membranę 2x z 1x TBST (bez mleka) w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem przez 15 min każde pranie.
    6. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:20 000 w 1x TBST (zawierającym 5% mleka) i inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
    7. Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała. Umyj membranę 2x z 1x TBST (bez mleka) w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem przez 15 min każde pranie.
    8. Opróżnij 1x TBST z membrany. Zmieszać roztwór nadtlenku substratu HRP i roztwór luminolu substratu HRP w stosunku 1:1 (po 1 ml każdy) i odpipetować 2 ml połączonego roztworu na powierzchnię membrany.
    9. Inkubować roztwór z membraną przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    10. Nadmiar podłoża chemiluminescencyjnego z membrany należy przelać na ręcznik papierowy i umieścić membranę w folii w plastikowej owijce w uchwycie kasety rentgenowskiej.
    11. Przenieś się do ciemni przeznaczonej do obróbki klisz rentgenowskich. Wystaw membranę na działanie filmu rentgenowskiego, umieszczając film na membranie i zamykając kasetę na 30 s.
      UWAGA: Czas kontaktu folii z membraną musi być określony doświadczalnie. Silne sygnały będą wymagały krótkich ekspozycji (sekund), a słabsze sygnały mogą wymagać dłuższych ekspozycji.
    12. Wyjmij kliszę rentgenowską z kasety i przetrzyj film, przepuszczając go przez procesor kliszy rentgenowskiej. Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące obróbki kliszy rentgenowskiej.
    13. Zdjąć membranę z folii i myć ją ddH2O przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    14. Inkubować błonę z 0,2 M NaOH przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    15. Płukać membranę za pomocą ddH2O przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    16. Zablokuj membranę, dodając 1x TBST (zawierający 5% mleka) do pojemnika i delikatnie wstrząsaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    17. Dodać następne rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego (np. sondę na obecność H3K27ac, jeśli pierwszym użytym przeciwciałem był H3K18ac) i wstrząsać przez noc w temperaturze 4 °C. Powtarzać kroki 1.3.4-1.3.17, aż wszystkie sondy przeciwciał zostaną zakończone.

2. Test ChHAI

  1. Leczenie farmakologiczne in vitro i analiza acetylowanych histonów
    UWAGA: A-485 to silny i dobrze scharakteryzowany p300 HATi2,4 . Inhibitor ten zostanie wykorzystany w pozostałych testach ze względu na jego skuteczność i swoistość w hodowli komórkowej. MS-275 (Entinostat)24 to HDACi, który znacznie zwiększa poziom acetylacji histonów i jest używany w celu ułatwienia wykrywania sond acetylacyjnych za pomocą standardowego immunoblottingu. Patrz Protokół Uzupełniający (Schemat 2) w celu zapoznania się ze schematem rozcieńczeń leku stosowanych w kroku 2.1.
    1. Zasiej 100 000 komórek MCF-7 na 12-dołkowej płytce i pozwól komórkom rosnąć do 80-90% zbiegu w 1 ml pożywki do hodowli komórkowych. Oznaczyć studzienki dla następującego projektu eksperymentalnego: studzienka 1: kontrola DMSO (punkt odniesienia); studzienka 2: A-485 (3 μM); studzienka 3: A-485 (10 μM); studzienka 4: MS-275 (3 μM); studzienka 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); studzienka 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      UWAGA: Do hodowli komórek MCF-7 należy użyć kompletnych pożywek DMEM i pozwolić komórkom rosnąć w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zobacz Tabelę 1, aby zapoznać się z pełną recepturą DMEM.
    2. Po 24 godzinach od wysiewu odpipetować 4 ml kompletnej pożywki DMEM do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odpipetować 2 μl MS-275 (6 mM w DMSO) do 4 ml pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 3 μM MS-275.
    3. Odpipetować 2 μl DMSO do 4 ml pożywki w oddzielnej sterylnej probówce stożkowej o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Proszę sprawdzić kartę charakterystyki pod kątem prawidłowego obchodzenia się z DMSO. Niektóre typy rękawic nie są przystosowane do pracy z DMSO.
    4. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej z dołków 4-6 i odpipetować 1 ml 3 μM MS-275 w pożywce (krok 2.1.2) do każdej studzienki. Wyrzuć niewykorzystany rozcieńczony MS-275.
    5. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej z dołków 1-3 i odpipetować 1 ml rozcieńczonego DMSO (krok 2.1.3) do każdego dołka. Wyrzuć niewykorzystany rozcieńczony DMSO.
    6. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i inkubuj przez 4 godziny, aby umożliwić akumulację acetylowanych histonów w komórkach wystawionych na działanie MS-275 (studzienki 4-6).
      UWAGA: MS-275 jest HDACi i powoduje hiperacetylację histonów24. Ta 4-godzinna wstępna inkubacja jest konieczna, aby umożliwić MS-275 indukcję hiperacetylacji przed dodaniem A-485, co zmniejsza acetylację histonów2,4.
    7. Po 4 godzinach inkubacji z MS-275 przygotować następujące roztwory w oddzielnych sterylnych probówkach o pojemności 1,5 ml przez pipetowanie: 1,0 μl DMSO do 1 ml pożywki DMEM; 0,5 μl DMSO i 0,5 μl A-485 (6 mM) do 1 ml pożywki DMEM; 0,5 μl DMSO i 0,5 μl A-485 (20 mM) do 1 ml pożywki DMEM; 0,5 μl DMSO i 0,5 μl pożywki DMEM; 0,5 μl DMSO i 0,5 μ L MS-275 (6 mM) do 1 ml pożywki DMEM; 0,5 μl A-485 (6 mM) i 0,5 μl MS-275 (6 mM) do 1 ml pożywki DMEM; 0,5 μl A-485 (20 mM) i 0,5 μl MS-275 (6 mM) do 1 ml pożywki DMEM.
    8. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z dołków 1-6 i pipetą 1 ml rozcieńczenia 1 do dołka 1, rozcieńczenia 2 do dołka 2, rozcieńczenia 3 do dołka 3, rozcieńczenia 4 do dołka 4, rozcieńczenia 5 do dołka 5 i rozcieńczenia 6 do dołka 6,
      UWAGA: Ogólną zasadą jest zrównoważenie zawartości DMSO (rozpuszczalnika) między grupami eksperymentalnymi i nie przekraczanie 0,1% zawartości DMSO w hodowli komórkowej, aby uniknąć toksyczności komórkowej i zmian w proliferacji.
    9. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze i hodować je przez 20 godzin.
    10. Po 20 godzinach odessać pożywkę do hodowli komórkowych z dołków 1-6.
    11. Przemyć komórki, pipetując 1 ml PBS do studzienek 1-6. Zassać PBS.
    12. Dodaj 100 μl 1x pasywnego buforu do lizy (patrz Tabela 1) do studzienek 1-6. Przechowywać płytkę do hodowli komórkowej (z próbkami w pasywnym buforze do lizy) w temperaturze -80 °C przez noc w celu zamrożenia-rozmrożenia i lizy komórek.
      UWAGA: Przed wykonaniem należy sprawdzić kartę charakterystyki dla wszystkich chemikaliów. CDTA może powodować poważne uszkodzenie oczu i podrażnienie.
    13. Rozmrażać próbki w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez 10 minut. Próbki należy przenieść do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml i natychmiast umieścić na lodzie.
    14. Zmierzyć stężenie białka w każdej próbce. Stężenie białka można określić za pomocą kilku dobrze znanych protokołów34.
    15. Zrównoważyć stężenie białka między próbkami 1-6 (w równej objętości) za pomocą 1x pasywnego buforu do lizy w celu rozcieńczenia, jeśli to konieczne.
    16. Dodać 2-merkaptoetanol w stosunku 1:10 do 6-krotnego buforu próbki SDS.
    17. Dodać 6x bufor do próbki SDS z 2-merkaptoetanolem do próbek 1-6 do końcowego stężenia 1x bufor próbki SDS.
    18. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut na bloku grzewczym i schłodzić na lodzie. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C do etapu 2.1.19.
    19. Odpipetować objętość zawierającą 30 μg białka dla próbek 1-6 do studzienek w żelu poliakrylamidowym o gradiencie 4-20%. Przeprowadzić procedurę immunoblottingu zgodnie z protokołem opisanym w Protokole 1.

3. ChIP-qPCR

UWAGA: Poniższy protokół jest opisany dla inhibitorów p300 jako przykład.

  1. Przygotowanie buforu
    UWAGA: Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z recepturami. Poniższe ogólne kroki protokołu ChIP (np. receptury, czasy mycia i czasy wirowania) są modyfikowane i dostosowywane na podstawie zaleceń producenta dostępnego na rynku zestawu (patrz Tabela materiałów) oraz z literatury35,36.
    1. Przygotować bufor rozcieńczający ChIP, bufor pęczniejący jąder, bufor do płukania o niskiej zawartości soli, bufor do płukania o wysokiej zawartości soli, bufor do płukania LiCl i bufor TE. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować bufor do lizy SDS, 10x bufor glicynowy i bufor elucyjny ChIP. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Przed wykonaniem należy sprawdzić kartę charakterystyki dla wszystkich chemikaliów, aby zapewnić prawidłowe obchodzenie się z nimi.
  2. Leczenie uzależnień od narkotyków
    UWAGA: Patrz Protokół Uzupełniający (Schemat 3) w celu zapoznania się ze schematem rozcieńczeń leku stosowanych w kroku 3.2.
    1. Wysiewaj komórki MCF-7 w dwóch 15 cm szalkach hodowlanych i hoduj komórki do 90% zbiegu w 12 ml kompletnej pożywki DMEM. Oznacz naczynia według następującego projektu eksperymentalnego: Daza 1: Kontrola DMSO (punkt odniesienia); Talerz 2: A-485 (3 μM).
      UWAGA: Do hodowli komórek MCF-7 należy użyć kompletnych pożywek DMEM i uprawiać w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zobacz Tabelę 1, aby zapoznać się z pełną recepturą DMEM.
    2. W sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml odpipetować 12 ml pożywki DMEM i odpipetować 6 μl DMSO. Dobrze wymieszaj.
    3. W oddzielnej sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml odpipetuj 12 ml pożywki DMEM i odpipetuj 6 μl A-485 (6 mM w DMSO), aby uzyskać końcowe stężenie 3 μM A-485. Dobrze wymieszaj.
    4. Odessać pożywkę z talerza 1 i 2.
    5. Dodaj 12 ml rozcieńczonego DMSO w DMEM (krok 3.2.2.) do naczynia 1.
    6. Dodaj 12 ml 3 μM A-485 w DMEM (krok 3.2.3.) do naczynia 2.
    7. Włożyć szalki z kultur komórkowych do inkubatora i inkubować przez 24 godziny.
  3. Utrwalanie komórek
    1. Odpipetować 330 μl (27,5 μl na ml) 37% formaldehydu do całego podłoża i delikatnie zamieszać płytkę, aby wymieszać.
      UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny. Proszę zapoznać się z kartą charakterystyki, aby uzyskać informacje na temat prawidłowych procedur obsługi.
    2. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odpipetować pipetą 2 ml 10x glicyny na płytkę i zamieszać do wymieszania.
    4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Po inkubacji umieść naczynia na lodzie i rozmrozić porcję koktajlu inhibitorów proteazy.
    6. Przygotować następujące roztwory zarówno dla próbek DMSO, jak i A-485, używając przygotowanych w kroku 3.1.
      1. 2 ml PBS z koktajlem inhibitorów proteazy w rozcieńczeniu 1:1 000
      2. 1 ml buforu pęczniejącego jąder z koktajlem inhibitorów proteazy w stosunku 1:1 000
      3. 0,5 ml buforu do lizy SDS z koktajlem inhibitorów proteazy w stosunku 1:1 000
    7. Odessać pożywkę z naczyń do hodowli komórkowych i dwukrotnie umyć komórki 15 ml zimnego PBS.
    8. Odpipetować 2 ml PBS z koktajlem inhibitorów proteazy (krok 3.3.6.1) do szalek do hodowli komórkowych. Podnieś komórki do roztworu za pomocą skrobaka do komórek.
    9. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki mikrowirówkowej. W razie potrzeby zebrać pozostałe komórki za pomocą dodatkowego PBS.
    10. Wirować probówki o wymiarach 800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby granulować komórki.
    11. Odessać supernatant i odpipetować 1 ml buforu pęczniejącego jąder za pomocą koktajlu inhibitorów proteazy (etap 3.3.6.2) do osadu. Zawiesić osad i inkubować na lodzie przez 10 minut.
    12. Odwirować probówki o stężeniu 2 700 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu uzyskania osadzania jąder.
    13. Odessać supernatant i odpipetować 0,5 ml buforu do lizy SDS z koktajlem inhibitorów proteazy (etap 3.3.6.3) do osadu. Zawiesić osad i inkubować na lodzie przez 10 minut.
    14. Przechowywać próbki chromatyny w temperaturze -80 °C do kroku 3.4.1 lub natychmiast przejść do kroku 3.4.
  4. Sonikacja DNA
    1. Przenieść 130 μl chromatyny z próbki DMSO (krok 3.3.14) do dwóch probówek sonicznych DNA za pomocą pipety (po 130 μl każda).
    2. Przenieść 130 μl chromatyny z próbki A-485 (krok 3.3.14) do dwóch probówek do sonikacji DNA za pomocą pipety (130 μl każda).
    3. Poddaj sonifikację DNA do około 150-200 fragmentów par zasad przy użyciu następujących ustawień sonikatora: Szczytowa moc padająca (W) 175, współczynnik wypełnienia 10%, 200 cykli na impuls i czas leczenia 430 s.
      UWAGA: Ustawienia sonikacji mogą się różnić w zależności od modelu, a ustawienia mogą wymagać dostosowania w celu uzyskania odpowiedniego rozmiaru fragmentu dla różnych linii komórkowych.
    4. Próbki po sonikacji należy przechowywać na lodzie.
    5. Przenieść sonikowaną chromatynę do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety i odwirować przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut do osadzania resztek.
    6. Odpipetować supernatant (zawiera sonikowaną chromatynę) do nowej probówki i wyrzucić resztki. Chromatyna sonikowana może być przechowywana w temperaturze -80 °C.
  5. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)
    UWAGA: Patrz Protokół uzupełniający (schemat 3) w celu uzyskania schematu grup IP w kroku 3.5.
    1. Zmierzyć zawartość białka w chromatynie poddanej sonikacji dla próbek DMSO i A-485 z kroku 3.4.6. Zawartość białka można mierzyć za pomocą sprawdzonych protokołów34.
      UWAGA: Dla uproszczenia, protokół ten zakłada, że zawartość białka jest równa i zostanie użyte 100 μl sonikowanej chromatyny. W przeciwnym razie zawartość białka będzie musiała być zrównoważona między wszystkimi próbkami w równej objętości.
    2. Odpipetować 100 μL chromatyny ultradźwiękowej DMSO do dwóch probówek o pojemności 1,5 ml (po 100 μl każda). Odpipetować 400 μl buforu rozcieńczającego ChIP (zawierającego koktajl inhibitorów proteazy w rozcieńczeniu 1:1 000) do każdej probówki, aby uzyskać całkowitą objętość do 500 μl. Usunąć 5 μl roztworu z jednej z probówek i przechowywać w temperaturze -20 °C jako wejście DMSO.
    3. Odpipetować 100 μl chromatyny sonikowanej A-485 do dwóch probówek o pojemności 1,5 ml (każda po 100 μl). Odpipetować 400 μl buforu rozcieńczającego ChIP (zawierającego koktajl inhibitorów proteazy w rozcieńczeniu 1:1000) do każdej probówki, aby uzyskać całkowitą objętość do 500 μl. Usunąć 5 μl roztworu z jednej z probówek i przechowywać w temperaturze -20 °C jako A-485 Input.
    4. Za pomocą pipety dodać przeciwciało immunoprecypitacyjne (IP) (np. nieswoiste przeciwciało kontrolne IgG lub przeciwciało specyficzne dla H3K27ac) do odpowiednich probówek dla próbek DMSO i A-485: chromatyna IP #1 DMSO z przeciwciałem IgG (5-10 μg); IP #2 chromatyna DMSO z przeciwciałem H3K27ac (5-10 μg); IP #3 Chromatyna A-485 z przeciwciałem IgG (5-10 μg); IP #4 A-485 chromatyna z przeciwciałem H3K27ac (5-10 μg).
    5. Dodaj 20 μl kulek magnetycznych z białkiem A do każdej probówki. Upewnij się, że koraliki są dobrze zawieszone.
    6. Próbki należy obracać przez noc w temperaturze 4 °C.
    7. Granulki magnetyczne białka A osadzić za pomocą separatora magnetycznego i usunąć supernatant. Nie przeszkadzaj koralikom.
    8. Przemyć kulki 500 μl do 1 ml buforu do płukania o niskiej zawartości soli i obracać przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wykonać szybkie odwirowanie, granulować kulki za pomocą separatora magnetycznego i usunąć supernatant.
    9. Przemyć kulki 500 μl do 1 ml buforu do płukania o wysokiej zawartości soli i obracać przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wykonać szybkie odwirowanie, granulować kulki za pomocą separatora magnetycznego i usunąć supernatant.
    10. Przemyć kulki 500 μl do 1 ml buforu płuczącego LiCl i obracać przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wykonać szybkie odwirowanie, granulować kulki za pomocą separatora magnetycznego i usunąć supernatant.
    11. Przemyć kulki 500 μl do 1 ml buforu TE i obracać przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wykonaj szybkie odwirowanie. Przechowuj koraliki w buforze TE do kroku 3.5.14.
    12. Wyjmij próbki wejściowe (z kroków 3.5.2 i 3.5.3) z zamrażarki i trzymaj na lodzie.
    13. Rozmrozić podwielokrotność proteinazy K.
    14. Zmiksuj kulki za pomocą separatora magnetycznego i usuń bufor TE z kulek (od kroku 3.5.11).
    15. Dodać 100 μl buforu elucyjnego ChIP + 1 μl proteinazy K do każdej próbki, w tym do próbek wejściowych. Inkubować próbki, wytrząsając je w temperaturze 62 °C przez 2 godziny przy użyciu termocyklera.
    16. Po 2 godzinach podgrzewać próbki do temperatury 95 °C przez 10 minut za pomocą termocyklera.
    17. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej.
    18. Granulki magnetyczne granulować za pomocą separatora magnetycznego i przenieść supernatant (zawiera interesujące DNA) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    19. Oczyść DNA za pomocą standardowego zestawu do czyszczenia PCR.
    20. Oczyszczone DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C i może być używane jako matryce w standardowych protokołach qPCR. Postępuj zgodnie z protokołami producenta do uruchamiania qPCR.
  6. Analiza danych ChIP-qPCR
    UWAGA: Dwie popularne metody analizy wyników ChIP-qPCR to wzbogacenie w fałd przeciwciała IgG i metoda 1% Input. Doskonały szablon dla obu metod analizy jest dostarczany przez komercyjne źródło, które można wykorzystać do szybkiego obliczenia wzbogacenia fałdowania dla każdego przeciwciała IP/celu będącego przedmiotem zainteresowania37.
    1. Aby obliczyć wzbogacenie fałdowania i % wejść, skopiuj i wklej wartości ΔCt z danych qPCR uzyskanych dla każdego przeciwciała (nieswoiste IgG, przeciwciało IP H3K27ac i 1% Input) do odpowiedniego regionu w szablonie analizy, a dane wejściowe Fold Enrichment and Yield % zostaną automatycznie wypełnione.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test in vitro aktywności acetylotransferazy histonowej (HAT) może być wykorzystany do poszukiwania związków hamujących aktywność HAT białka p30 wobec substratu histonowego. Rycina 1A przedstawia schemat doświadczalny testu HAT. W analizie tej zastosowano kwas anakardowy, znany inhibitor HATi3,38, w zakresie stężeń od 12,5-10 µM. Przy stężeniu 10 µM kwas anakardowy obniża katalizowaną przez p300 acetylację histonów w obrębie lizyn 9 i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Acetylotransferazy lizyny (KAT) acetylują kilka reszt lizyny na ogonach histonów i czynnikach transkrypcyjnych w celu regulacji transkrypcji genów 2,3. Prace przeprowadzone w ciągu ostatnich dwóch dekad wykazały, że KAT, takie jak CBP/p300, PCAF i GCN5, oddziałują z onkogennymi czynnikami transkrypcyjnymi i pomagają napędzać wzrost guza w kilku typach guzów litych 4,5,9,15,16,17,18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów ani ujawnień.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z James and Esther King Biomedical Research Program (6JK03 i 20K07) oraz Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 i 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation i UF Health Cancer Center. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować dr Zachary'emu Oskingowi i dr Andrei Lin za ich wsparcie podczas procesu publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tubka 1,5 mlFisher Scientific05-408-129Do wszystkich metod
Naczynie 10 cmSarstedt AG & Co.83.3902Do hodowli komórkowej komórek MCF-7
10 końcówek ulFisher Scientific02-707-454Dla wszystkich metod
1000 końcówek ulCorning4846Dla wszystkich metod
10X Bufordla metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
10X uruchomionydla metod 1 i 2. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
10X TBSTdla metod 1 i 2. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
Płytka 12-dołkowaCorning3513do metody 2
15 cm naczynieSarstedt AG & Co.83.3903Dla metody 3
15 ml probówka stożkowaSanta Cruz Biotechnologysc-200249Dla metod 2 i 3
1X TBST z 5% mlekiem i 0,02% azydkiemDla metod 1 i 2. Może być stosowany do rozcieńczania przeciwciał pierwotnych, które będą używane więcej niż raz. Pozwala na krótkotrwałe przechowywanie rozcieńczeń przeciwciał pierwotnych. Nie stosować do rozcieńczania przeciwciał wtórnych. UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny.
1X TBST z 5% mlekiemDo metod 1 i 2. Służy do blokowania błony PVDF i do dylatacji przeciwciał. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
200 ul końcówkiCorning4844Dla wszystkich metod
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148do przygotowania buforu próbki SDS
4-20% żel poliakryloamidowyThermo Fisher: InvitrogenXP04205BOXDla metod 1 i 2
5X Bufor testowydla metody 1. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
5X Pasywny bufor do lizydla metody 2. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
6X Dodecylosiarczan sodu (SDS)Dla metod 1 i 2. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300 Inhbitor do stosowania w metodach 2 i 3. Rozpuszczony w DMSO.
Przeciwciało acetylo-CBP (K1535) / p300 (K1499)Technologia sygnalizacji komórkowej4771Do metody 1
Acetylo-CoASigma-AldrichA2056do stosowania w metodzie 1
Przeciwciało acetylo-histonowe H3 (Lys 27) (H3K27ac)Technologia sygnalizacji komórkowejCST 8173antoibodies dla H3K27ac dla immunoblotów i ChIP
Przeciwciało acetylo-histonowe H3 (Lys18) (H3K18ac)Technologia sygnalizacji komórkowejPrzeciwciała CST 9675dla H3K18ac dla immunoblotów i
przeciwciała alfa-tubulinyChIP Millipore SigmaT5168dla metody 2. Rozcieńczyć 1:20 000
Kwas anakardowyCayman Chemical13144Dla metody 1
anty-mysi IgG HRP sprzężonej z wtórnym przeciwciałemTechnologia sygnalizacji komórkowej7076Dla metod 1 i 2. Rozcieńczyć 1:10 000
przeciwciała drugorzędowe anty-królicze IgGJackson ImmunoResearch711-035-152dla metod 1 i 2. Rozcieńczyć 1:10 000 do 1:20 000
Film autoradiograficznyMIDSCIBX810Dla metod 1 i 2
Tancerka brzucha Platforma obrotowaStovall Life Science IncorporatedniedostępnaDla metod 1 i 2
Surowica cielęca bydlęca (BCS)HyCloneSH30072.03pożywka do hodowli komórkowych
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153do przygotowania buforu
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126do przygotowania buforu próbki SDS
CDTASpectrum Chemical125572-95-4Do przygotowania buforu
skrobak do komórekMillipore SigmaCLS3010Do metody 3
BuforDo metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
elucyjny ChIPdla metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
Kompletny DMEM dla komórekdla metod 2 i 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
Covaris 130 & mikro; l microTUBECovaris520045Probówka sonicyjna do stosowania z Covaris S220 w metodzie 3
Covaris S220 Focused ultrasonicCovarisS220Sonikator DNA do stosowania w metodzie 3
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich41639do rozcieńczania leków i leczenia kontrolnego nośnika
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815do buforu próbki SDS przygotowanie
DMEMCorning10-013-CVpożywka do hodowli komórkowych
EDTAFisher ScientificBP120-1do przygotowania buforu
Przykładowy zbiornik transferowy i aparatura transferowaBio-rad1704070Dla metod 1 i 2
EZ-Magna ChIP A/G Zestaw do immunoprecypitacji chromatynyMillipore Sigma17-10086Do metody 3
FK228 ( Romidepsin)Cayman Chemical128517-07-7Inhibitor HDAC do stosowania w metodzie 2
Roztwór formaldehyduSigma-AldrichF8775do wiązania komórek
glicerolFisher ScientificBP229-1Do przygotowania buforu
glicynaSigma-AldrichG7126do przygotowania
buforu HEPESSigma-Aldrich54457dla przygotowanie buforu
o wysokiej zawartości solido metody 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021do przygotowania buforu
Immobilon Chemiluminescencyjny substrat HRPMillipore SigmaWBKLS0500do metod 1 i 2
KClFisher ScientificBP366-500do przygotowania buforu
LiClSigma-AldrichL9650Do przygotowania buforu
BuforDo metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
do płukania o niskiej zawartości solidla metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
Separator magnetycznyPromegaZ5341Do stosowania w metodzie 3
MetanolSigma-Aldrich494437Do przygotowania buforu
Mini zbiornik żelowyInvitrogenA25977Do metod 1 i 2
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2Inhibitor HDAC do stosowania w metodzie 2. Rozpuszczony w DMSO.
NaClFisher Scientific7647-14-5do przygotowania buforu
NaOHFisher ScientificS318-100do przygotowania buforu w metodach 1 i 2
Normal Rabbit IgGBethyl LaboratoriesP120-101Kontrolne przeciwciało królicze do stosowania w metodzie 3
Bufordo metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
Zestaw do czyszczenia PCRQiagen28104Do stosowania w metodzie 3
Penicylina/Streptomycyna 100XPożywka do hodowli komórkowychCorning30-002-CI
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Corning21-040-CVDo metod 2 i 3
RURYSigma-Aldrich80635do przygotowania
buforu mleko w proszkuGoździkNestle Dla Metody 1 i 2
Power Pac 200 do przenoszenia western blotBio-radDo metod 1 i 2
Power Pac 3000 do żelu SDS zBio-radDo metod 1 i 2
Prestained Protein LadderThermo Fisher26616Do metod 1 i 2
Koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichPI8340do stosowania w metodzie 3
Białko A Magentic BeadsNew England BioLabsS1425SDo stosowania w metodzie 3
Proteinaza KNew England BioLabsP8107SDo stosowania w metodzie 3
PTC-100 Programowalny regulator termicznyMJ Research Inc.PTC-100Do metody 1
Membrana transferowa PVDFMillipore Sigma IEVH00005Do metod 1 i 2
Rekombinowany H3.1New England BioLabsM2503Sdo stosowania w metodzie 1
Rekombinowany p300ENZO Life SciencesBML-SE451-0100do stosowania w metodzie 1
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9Inhibitor HDAC do stosowania w metodzie 2
do lizy SDSdla metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
Azydek soduFisher Scientific26628-22-8Dla metod 1 i 2. UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny. Zobacz kartę charakterystyki, aby uzyskać informacje na temat prawidłowej obsługi.
Wodorowęglan soduFisher ScientificS233-500do przygotowania buforu
Deoksycholan soduSigma-AldrichD6750do przygotowania buforu
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-Aldrich71725do przygotowania buforu próbki SDS
Standardowy blok grzewczyVWR Scientific ProductsMPN: 949030Dla metod 1 i 2
Blat stołu wirówkaEppendorf5417RDla wszystkich metod
BuforDla metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
Bufor transferudla metod 1 i 2. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.
Trichostatyna ACayman Chemical58880-19-6Inhibitor HDAC do stosowania w metodzie 2
TrisFisher ScientificBP152-5do przygotowania buforu
Triton X-100Sigma-AldrichT8787do przygotowania buforu
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5do przygotowania buforu w metodach 1 i 2
Procesorfilmów rentgenowskichKonica Minolta Medical & Grafika, Inc.SRX-101Adla metod 1 i 2
glicynowy bufor sodu do rozcieńczania ChIP Bufor MCF-7 Bufor do płukania LiCl Bufor pęczniejący jąder Bufor TE

Bibliografia

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539(2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47(2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527(2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702(2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047(2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test HATTest ChHAIChIP qPCRacetylacja histon wimmunoblottingproteinaza Kkuleczki magnetyczneanaliza qPCRregulacja epigenetyczna

Powiązane artykuły