Method Article

Wstępna koncentracja i izolacja mikropęcherzyków i egzosomów na podstawie papieru

DOI:

10.3791/61292

⸱

April 29th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany jest protokół do produkcji papierowego urządzenia do skutecznego wzbogacania i izolowania mikropęcherzyków i egzosomów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropęcherzyki i egzosomy to małe błoniaste pęcherzyki uwalniane do środowiska zewnątrzkomórkowego i krążące po całym ciele. Ponieważ zawierają różne biomolekuły pochodzące z komórek rodzicielskich, takie jak DNA, mRNA, miRNA, białka i lipidy, ich wzbogacenie i izolacja są kluczowymi etapami ich wykorzystania jako potencjalnych biomarkerów do zastosowań klinicznych. Jednak konwencjonalne metody izolacji (np. ultrawirowanie) powodują znaczne straty i uszkodzenia mikropęcherzyków i egzosomów. Metody te wymagają również wielu powtarzających się etapów ultrawirowania, ładowania i marnowania odczynników. W artykule opisano szczegółową metodę wytwarzania urządzenia na bazie papieru origami (Exo-PAD) przeznaczonego do skutecznego wzbogacania i izolowania mikropęcherzyków i egzosomów w prosty sposób. Unikalna konstrukcja Exo-PAD, składająca się z wielowarstwowych warstw przypominających harmonijkę ze zbieżnymi obszarami próbki, jest zintegrowana z techniką polaryzacji stężenia jonów, umożliwiając w ten sposób pięciokrotne wzbogacenie mikropęcherzyków i egzosomów na określonych warstwach. Ponadto wzbogacone mikropęcherzyki i egzosomy są izolowane po prostu przez rozłożenie Exo-PAD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropęcherzyki i egzosomy to małe pęcherzyki błonowe o wymiarach odpowiednio 0,2−1 μm i 30−200 nm. Są one wydzielane do środowiska zewnątrzkomórkowego przez kilka różnych typów komórek1,2,3,4,5. Zawierają one informacje o komórkach rodzicielskich w postaci podzbiorów DNA, mRNA, miRNA, białek i lipidów i krążą w całym organizmie za pośrednictwem różnych płynów ustrojowych, takich jak surowica, osocze, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn owodniowy i ślina6,7,8,9. W związku z tym techniki skutecznej izolacji mikropęcherzyków i egzosomów z płynów biologicznych mogą zapewnić szerokie możliwości w dziedzinie diagnozowania, prognozowania i monitorowania chorób w czasie rzeczywistym, a także w opracowywaniu nowych środków terapeutycznych.

Jednak konwencjonalna metoda izolacji mikropęcherzyków i egzosomów oparta na ultrawirowaniu jest niezwykle czasochłonna i powoduje znaczne straty i zanieczyszczenie próbki. Dzieje się tak, ponieważ wiąże się to z kilkoma kłopotliwymi etapami pipetowania i ładowania oraz odrzucaniem różnych odczynników przy wielokrotnym ultrawirowaniu5,6,10,11,12. Co więcej, wysokie naprężenie ścinające wywołane ultrawirowaniem (~100 000 x g) może powodować fizyczną lizę mikropęcherzyków i egzosomów, co skutkuje słabymi wskaźnikami odzysku (5−23%)6,13,14. Dlatego należy opracować wysoce wydajną, dyskretną technikę izolacji mikropęcherzyków i egzosomów, aby zmniejszyć uszkodzenia i straty, osiągając w ten sposób wyższe wskaźniki odzysku.

Urządzenie oparte na papierze origami (Exo-PAD) zostało opracowane do prostszej, łagodniejszej i wysoce efektywnej izolacji mikropęcherzyków i egzosomów6. Konstrukcja Exo-PAD to wielokrotnie składany papier z szeregowo połączonymi obszarami próbki, które stopniowo zmniejszają swoją średnicę. Technika polaryzacji stężenia jonów (ICP), która jest zjawiskiem nanoelektrokinetycznym, które wstępnie koncentruje naładowane biomolekuły, została zintegrowana z tym unikalnym projektem. Zastosowanie Exo-PAD skutkowało pięciokrotnym wzbogaceniem mikropęcherzyków i egzosomów w określone warstwy oraz ich izolacją poprzez proste rozłożenie urządzenia. Ten artykuł szczegółowo opisuje Exo-PAD, od ogólnej produkcji i działania urządzenia po analizę jego użycia, aby zilustrować metodę i pokazać reprezentatywne wyniki6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzeń

  1. Zdefiniuj obszar do wydrukowania na papierze za pomocą oprogramowania drukarki (Tabela materiałów).
    UWAGA: Wzór składa się z 12 warstw z wzorem woskowym, w których średnice okrągłych obszarów próbki stopniowo zmniejszają się od 5 mm do 2 mm (Rysunek 1A).
  2. Wydrukuj wosk hydrofobowy na wyznaczonych obszarach po obu stronach papieru celulozowego (Tabela materiałów) za pomocą komercyjnej drukarki woskowej (Tabela materiałów) (Rysunek 1B).
  3. Umieść papier zadrukowany woskiem w piecu laboratoryjnym na 80 s w temperaturze 120 °C.
    UWAGA: Ten krok umożliwia woskowi dotarcie do wnętrza papieru poprzez uzyskanie termicznego rozpływu zadrukowanego wosku. Dzięki temu protokołowi inkubacji rozdzielczość wzoru wynosi ~2 mm. Dlatego należy uważać, aby nie drukować wzorów mniejszych niż 2 mm. W przeciwnym razie wzory zostaną zablokowane przez wosk.
  4. Wytnij papier zadrukowany woskiem za pomocą noża, aby wykonać indywidualne urządzenia (Rysunek 1C).
  5. Upuść 5 μl i 2 μl membrany permselektywnej (np. Nafion; Tabela materiałów) na obszarach próbki w warstwach skrajnych po lewej i prawej stronie (Rysunek 1D).
  6. Warstwy pokryte membraną permselektywną umieścić na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C na 30 minut w celu odparowania rozpuszczalnika membrany permselektywnej.
  7. Uszczelnij najbardziej zewnętrzną powierzchnię powlekanej warstwy skierowaną w stronę roztworu buforowego taśmą samoprzylepną, pozostawiając mały otwór.
  8. Złóż wydrukowane pojedyncze urządzenie (np. Exo-PAD) w przód iw tył wzdłuż białych linii.
    UWAGA: Po złożeniu urządzenia wszystkie obszary próbki stają się zbieżnie połączone (Rysunek 1E). Ta konwergentna konstrukcja skupia linie pola elektrycznego, gdy napięcie jest przykładane do ICP, osiągając bardziej intensywną koncentrację wstępną mikropęcherzyków i egzosomów.

2. Wzbogacanie i ogniskowanie przestrzenne mikropęcherzyków i egzosomów poprzez polaryzację stężenia jonów

  1. Załaduj 15 μl próbki mikropęcherzyków i egzosomu (~3 x 1011 cząstek/ml w 0,1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem [PBS] z 0,05% Tween 20) do zbieżnych obszarów próbki przez pipetowanie i odczekaj kilka sekund, aby zapewnić całkowite zwilżenie wszystkich obszarów próbki (Rysunek 1F).
  2. Umieść dwie akrylowe komory na obu końcach Exo-PAD i zaciśnij Exo-PAD bezpiecznie za pomocą małych klipsów do segregatora, aby zapobiec rozkładaniu się (Rysunek 1G).
  3. Napełnij komory 110 μL 0,1x PBS i włóż dwie elektrody Ag/AgCl (Rysunek 1H).
  4. Przyłożyć 30 V do elektrod przez 20 minut za pomocą systemu pomiaru źródła prądu i napięcia (tabela materiałów).
    UWAGA: Przyłożone napięcie generuje zjawisko ICP, a tym samym wstępnie koncentruje mikropęcherzyki i egzosomy na warstwach 8 i 9 Exo-PAD.

3. Izolacja wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów

  1. Oddziel złożony Exo-PAD od komór akrylowych i rozłóż urządzenie, aby wyizolować wzbogacone mikropęcherzyki i egzosomy od pozostałych warstw (Rysunek 1I).
  2. Wyciąć obszary próbki w warstwach 8 i 9, gdzie mikropęcherzyki i egzosomy są wzbogacone, do dalszej analizy (Rysunek 1J).

4. Analiza skaningowej mikroskopii elektronowej

  1. Utrwalić wzbogacone mikropęcherzyki i egzosomy, zanurzając wybite obszary w 2,5% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze kakodylanu sodu na 1 godzinę i w 1% tetratlenku osmu w 0,1 M kakodylanu sodu na 1 godzinę
    UWAGA: Tetratlenek osmu jest silnie trującą i niebezpieczną substancją chemiczną. Ponieważ tetratlenek osmu może przenikać do tworzyw sztucznych, musi być przechowywany w szkle. Wszelkie obchodzenie się z tetratlenkiem osmu musi odbywać się w okapie oparów chemicznych z podwójnymi rękawicami nitrylowymi.
  2. Odwodnić utrwalone mikropęcherzyki i egzosomy rosnącymi stopniami 200-procentowego etanolu (tj. 50%, 70%, 90% i 100%) przez 30 minut każdy.
  3. Wysuszyć chemicznie próbkę, zanurzając ją w heksametylodilazanie w eksykatorze na 30 min.
    UWAGA: Heksetylodilazan jest łatwopalną i wrażliwą na wilgoć substancją chemiczną. Musi być przechowywany w suchym i dobrze wentylowanym miejscu, z dala od źródeł zapłonu.
  4. Pokryj całkowicie wysuszone mikropęcherzyki i egzosomy złotem/palladem (~20 nm) za pomocą rozpylania i przechwytywania obrazów ze skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).

5. Analiza śledzenia nanocząstek

  1. Wyciąć obszary próbki w warstwach 6, 8 i 10 za pomocą stempla biopsyjnego po 20 minutach pracy urządzenia.
  2. Zanurz każdy wycięty obszar w roztworze buforowym (0,1x PBS z 0,01% Tween 20).
  3. Wirować przez 10 minut i wirować przez 30 s przy 6,000 obr./min w celu ponownego zawieszenia wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów.
  4. Usuń wycięte obszary z roztworu i zmierz stężenie mikropęcherzyków i egzosomów za pomocą przyrządu do analizy śledzenia nanocząstek (NTA) (tabela materiałów).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czas operacji musi być zoptymalizowany, aby osiągnąć maksymalną wydajność odzyskiwania wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów. Niewystarczający czas nie pozwala na wystarczającą migrację mikropęcherzyków i egzosomów, co zmniejsza wzbogacenie, podczas gdy nadmiar czasu pogarsza ogniskowanie przestrzenne, a tym samym rozprasza mikropęcherzyki i egzosomy. W ten sposób, dzięki etapowi optymalizacji czasu, można zidentyfikować maksymalny współczynnik wstępnego stężenia mikropęcherzyków i egzosomów oraz końcowe miejsce, w k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż Exo-PAD był z powodzeniem stosowany do wzbogacania i izolacji mikropęcherzyków i egzosomów, należy dokładnie rozważyć kilka krytycznych punktów: 1) czas inkubacji w piecu i temperaturę podczas przygotowywania urządzenia, 2) czas przetwarzania, 3) zastosowanie napięcia o różnych numerach warstw i średnicach powierzchni próbki oraz 4) możliwość zastosowania do próbek klinicznych.

Czas inkubacji i temperatura podane w protokole są optymalnymi warunkami do wytworzenia niezawodnego urządzen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee otrzymał grant badawczy z Uniwersytetu Kwangwoon w 2019 roku. Hyerin Kim była wspierana przez "Program Rozwoju Kompetencji dla Specjalistów Branżowych" Koreańskiego Ministerstwa Handlu, Przemysłu i Energii (MOTIE), prowadzony przez Koreański Instytut Rozwoju Technologii (KIAT) (nr P0002397, program HRD dla przemysłowej konwergencji inteligentnych urządzeń do noszenia).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Elektrody Ag/AgClA-M Systems, Inc.531500Albumina o średnicy 0,15"
z surowicy bydlęcej (BSA), koniugat Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA13101BSA sprzężony z Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Bufor węglanowo-wodorowęglanowySigma-AldrichC3041-50CAPBufor węglanowy
Oprogramowanie CorelDraw (Coral Co., Kanada)Oprogramowanie drukarki Corel Corporationdo definiowania druku woskiem region
ColorQube 8870Xerox CorporationDrukarka woskowa
Bibuła chromatograficzna klasa 1Whatman3001-861Papier celulozowy, wymiar: 20 * 20 cm
Wzorce egzosomów znakowane fluorescencyjnieHansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100Egzosom oznaczony FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Miernik źródła prądu/napięcia Keithley 2410Keithley Instruments, Inc.Bieżący– system pomiaru źródła napięcia
Roztwór żywicy perfluorowanej NafionSigma-Aldrich31175-20-9Membrana permselektywna, 20% wag. % w mieszaninie niższych alkoholi alifatycznych i wody; zawiera 34% wody
NanoSight LM10NanoSightMaszyna do analizy śledzenia nanocząstek (NTA)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,4)Thermo Fisher Scientific10010001
Technologia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175(2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Paper Based DeviceMicrovesicle IsolationExosome EnrichmentIon Concentration PolarizationWax Patterned LayersPerm Selective MembraneElectrokinetic PreconcentrationFluorescence QuantificationSEM AnalysisProtein Rich Samples

Related Articles