Method Article

Wstępna koncentracja i izolacja mikropęcherzyków i egzosomów na podstawie papieru

DOI:

10.3791/61292

⸱

April 29th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany jest protokół do produkcji papierowego urządzenia do skutecznego wzbogacania i izolowania mikropęcherzyków i egzosomów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropęcherzyki i egzosomy to małe błoniaste pęcherzyki uwalniane do środowiska zewnątrzkomórkowego i krążące po całym ciele. Ponieważ zawierają różne biomolekuły pochodzące z komórek rodzicielskich, takie jak DNA, mRNA, miRNA, białka i lipidy, ich wzbogacenie i izolacja są kluczowymi etapami ich wykorzystania jako potencjalnych biomarkerów do zastosowań klinicznych. Jednak konwencjonalne metody izolacji (np. ultrawirowanie) powodują znaczne straty i uszkodzenia mikropęcherzyków i egzosomów. Metody te wymagają również wielu powtarzających się etapów ultrawirowania, ładowania i marnowania odczynników. W artykule opisano szczegółową metodę wytwarzania urządzenia na bazie papieru origami (Exo-PAD) przeznaczonego do skutecznego wzbogacania i izolowania mikropęcherzyków i egzosomów w prosty sposób. Unikalna konstrukcja Exo-PAD, składająca się z wielowarstwowych warstw przypominających harmonijkę ze zbieżnymi obszarami próbki, jest zintegrowana z techniką polaryzacji stężenia jonów, umożliwiając w ten sposób pięciokrotne wzbogacenie mikropęcherzyków i egzosomów na określonych warstwach. Ponadto wzbogacone mikropęcherzyki i egzosomy są izolowane po prostu przez rozłożenie Exo-PAD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropęcherzyki i egzosomy to małe pęcherzyki błonowe o wymiarach odpowiednio 0,2−1 μm i 30−200 nm. Są one wydzielane do środowiska zewnątrzkomórkowego przez kilka różnych typów komórek1,2,3,4,5. Zawierają one informacje o komórkach rodzicielskich w postaci podzbiorów DNA, mRNA, miRNA, białek i lipidów i krążą w całym organizmie za pośrednictwem różnych płynów ustrojowych, takich jak surowica, osocze, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn owodniowy i ślina6,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzeń

  1. Zdefiniuj obszar do wydrukowania na papierze za pomocą oprogramowania drukarki (Tabela materiałów).
    UWAGA: Wzór składa się z 12 warstw z wzorem woskowym, w których średnice okrągłych obszarów próbki stopniowo zmniejszają się od 5 mm do 2 mm (Rysunek 1A).
  2. Wydrukuj wosk hydrofobowy na wyznaczonych obszarach po obu stronach papieru celulozowego (Tabela materiałów) za pomocą komercyjnej drukarki woskowej (Tabela materiałów) (Rysunek 1B).
  3. Umieść papier zadrukowany woskiem w piecu laboratoryjnym na 80 s....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czas operacji musi być zoptymalizowany, aby osiągnąć maksymalną wydajność odzyskiwania wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów. Niewystarczający czas nie pozwala na wystarczającą migrację mikropęcherzyków i egzosomów, co zmniejsza wzbogacenie, podczas gdy nadmiar czasu pogarsza ogniskowanie przestrzenne, a tym samym rozprasza mikropęcherzyki i egzosomy. W ten sposób, dzięki etapowi optymalizacji czasu, można zidentyfikować maksymalny współczynnik wstępnego stężenia mikropęcherzyków i egzosomów oraz końcowe miejsce, w k.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż Exo-PAD był z powodzeniem stosowany do wzbogacania i izolacji mikropęcherzyków i egzosomów, należy dokładnie rozważyć kilka krytycznych punktów: 1) czas inkubacji w piecu i temperaturę podczas przygotowywania urządzenia, 2) czas przetwarzania, 3) zastosowanie napięcia o różnych numerach warstw i średnicach powierzchni próbki oraz 4) możliwość zastosowania do próbek klinicznych.

Czas inkubacji i temperatura podane w protokole są optymalnymi warunkami do wytworzenia niezawodnego urządzen.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee otrzymał grant badawczy z Uniwersytetu Kwangwoon w 2019 roku. Hyerin Kim była wspierana przez "Program Rozwoju Kompetencji dla Specjalistów Branżowych" Koreańskiego Ministerstwa Handlu, Przemysłu i Energii (MOTIE), prowadzony przez Koreański Instytut Rozwoju Technologii (KIAT) (nr P0002397, program HRD dla przemysłowej konwergencji inteligentnych urządzeń do noszenia).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Elektrody Ag/AgClA-M Systems, Inc.531500Albumina o średnicy 0,15"
z surowicy bydlęcej (BSA), koniugat Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA13101BSA sprzężony z Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Bufor węglanowo-wodorowęglanowySigma-AldrichC3041-50CAPBufor węglanowy
Oprogramowanie CorelDraw (Coral Co., Kanada)Oprogramowanie drukarki Corel Corporationdo definiowania druku woskiem region
ColorQube 8870Xerox CorporationDrukarka woskowa
Bibuła chromatograficzna klasa 1Whatman3001-861Papier celulozowy, wymiar: 20 * 20 cm
Wzorce egzosomów znakowane fluorescencyjnieHansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100Egzosom oznaczony FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Miernik źródła prądu/napięcia Keithley 2410Keithley Instruments, Inc.Bieżący– system pomiaru źródła napięcia
Roztwór żywicy perfluorowanej NafionSigma-Aldrich31175-20-9Membrana permselektywna, 20% wag. % w mieszaninie niższych alkoholi alifatycznych i wody; zawiera 34% wody
NanoSight LM10NanoSightMaszyna do analizy śledzenia nanocząstek (NTA)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,4)Thermo Fisher Scientific10010001
Technologia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Paper Based DeviceMicrovesicle IsolationExosome EnrichmentIon Concentration PolarizationWax Patterned LayersPerm Selective MembraneElectrokinetic PreconcentrationFluorescence QuantificationSEM AnalysisProtein Rich Samples

Related Articles