Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych w żywych zarodkach Drosophila poddanych stresowi cieplnemu

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61297

⸱

15 maja 2020

 ,  , 
1Integrative Molecular and Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine, 2Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest wstrzyknięcie globularnej aktyny sprzężonej z rodaminą do zarodków Drosophila i zobrazowanie wewnątrzjądrowego montażu pręcików aktyny po stresie cieplnym.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest wizualizacja wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych, które gromadzą się w żywych zarodkach Drosophila melanogaster po stresie cieplnym. Pręciki aktynowe są cechą charakterystyczną konserwatywnej, indukowalnej odpowiedzi na stres aktynowy (ASR), która towarzyszy ludzkim patologiom, w tym chorobom neurodegeneracyjnym. Wcześniej wykazaliśmy, że ASR przyczynia się do niepowodzeń morfogenezy i zmniejszonej żywotności rozwijających się zarodków. Protokół ten pozwala na kontynuowanie badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw składania pręcików aktynowych i ASR w systemie modelowym, który jest wysoce podatny na obrazowanie, genetykę i biochemię. Zarodki są pobierane i umieszczane na szkiełku nakrywkowym w celu przygotowania ich do wstrzyknięcia. Aktyna globularna sprzężona z rodaminą (G-aktynaczerwona) jest rozcieńczana i ładowana do mikroigły. Pojedyncze wstrzyknięcie wykonuje się w środek każdego zarodka. Po wstrzyknięciu zarodki są inkubowane w podwyższonej temperaturze, a następnie wewnątrzjądrowe pręciki aktynowe są wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Odzyskiwanie fluorescencji po eksperymentach z fotowybielaniem (FRAP) można przeprowadzić na pręcikach aktynowych; i inne struktury bogate w aktynę w cytoplazmie mogą być również obrazowane. Okazuje się, że G-aktynaczerwona polimeryzuje jak endogenna G-aktyna i sama w sobie nie zakłóca normalnego rozwoju zarodka. Jednym z ograniczeń tego protokołu jest to, że należy zachować ostrożność podczas wstrzykiwania, aby uniknąć poważnego uszkodzenia zarodka. Jednak przy odrobinie wprawy wstrzykiwanieczerwieni G-aktyny do zarodków Drosophila jest szybkim i niezawodnym sposobem wizualizacji pałeczek aktynowych i może być łatwo stosowane u much o dowolnym genotypie lub przy wprowadzaniu innych stresów komórkowych, w tym niedotlenienia i stresu oksydacyjnego.

Wprowadzenie

Ten protokół opisuje, jak wstrzyknąćczerwień G-aktyny, aby zobrazować montaż wewnątrzjądrowych pręcików aktyny w zarodkach narażonych na stres cieplny, które przechodzą indukowalną reakcję na stres aktynowy (ASR)1. Opracowaliśmy ten protokół, aby wspomóc badania nad ASR, który w zarodkach prowadzi do zaburzenia morfogenezy i zmniejszonej żywotności, a w typach komórek dorosłych ludzi jest związany z patologiami, w tym niewydolnością nerek2, miopatiami mięśni3, oraz chorobą Alzheimera i Huntingtona4,5,6,7,8. Ten ASR jest wywoływany przez liczne stresy komórkowe, w tym szok cieplny9,10,11, stres oksydacyjny4,6, zmniejszona synteza ATP12, oraz nieprawidłowa huntingtyna lub oligomeryzacja β-amyloidu4,5,6,7,9,13,14,15,16. Cechą charakterystyczną ASR jest gromadzenie się nieprawidłowych pręcików aktyny w cytoplazmie lub jądrze dotkniętych komórek, które jest napędzane przez wywołaną stresem hiperaktywację białka oddziałującego z aktyną, Cofilin1,5,6,10. Niestety, nadal istnieją kluczowe luki w wiedzy na temat ASR. Na przykład funkcja pałeczek aktynowych nie jest znana. Nie rozumiemy, dlaczego pręciki tworzą się w cytoplazmie niektórych typów komórek, ale w jądrze innych. Nie jest też jasne, czy ASR działa ochronnie, czy nieprzystosowawczo na komórki lub zarodki poddawane stresowi. Wreszcie, nadal nie znamy szczegółowych mechanizmów leżących u podstaw hiperaktywacji kofiliny lub składania pręcików aktyny. W ten sposób protokół ten zapewnia szybki i wszechstronny test do badania ASR poprzez wizualizację tworzenia i dynamiki pręcików aktynowych w wysoce elastycznym systemie eksperymentalnym żywego zarodka muszki owocowej.

Protokół mikrowstrzykiwaniaczerwieni G-aktyny do żywych zarodków Drosophila został początkowo opracowany w celu zbadania dynamiki normalnych cytoplazmatycznych struktur aktynowych17 podczas wydarzeń związanych z budową tkanki. W tych badaniach stwierdziliśmy, że wstrzyknięcieczerwieni G-aktyny nie wpłynęło negatywnie na wczesne procesy rozwojowe zarodka, w tym cytokinezę lub gastrulację17,18. Następnie zmodyfikowaliśmy protokół, dostosowując obchodzenie się z zarodkiem i wstrzyknięcieczerwieni G-aktyny, aby umożliwić obrazowanie pałeczek aktynowych w zarodkach poddanych stresowi cieplnemu poddawanych ASR1. Inne metody oprócz wstrzyknięciaczerwieni G-aktyny mogą być stosowane do wizualizacji aktyny w zarodkach. Metody te opierają się na ekspresji białek fluorescencyjnych (FP) oznaczonych aktyną lub domenami białek wiążących aktynę, takich jak Utropin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP i Moesin-GFP (recenzja w19). Jednak korzystanie z tych sond FP wymaga ostrożności, ponieważ mogą one stabilizować lub zakłócać niektóre struktury aktyny, nie oznaczaj jednakowo wszystkich struktur aktyny20, a w przypadku aktyny-GFP są silnie nadeksprymowane – problematyczne dla analizy montażu prętów, który jest nie tylko zależny od naprężenia, ale także od stężenia aktyny1. Tak więcczerwień G-aktyna jest preferowaną sondą do badań pręcików na zarodkach much, a duży rozmiar zarodka pozwala na jej łatwe wstrzyknięcie.

Przebieg pracy tego protokołu jest podobny do innych dobrze znanych technik mikroiniekcji, które były używane do wstrzykiwania białek, kwasów nukleinowych, leków i wskaźników fluorescencyjnych do zarodków Drosophila21,22,23,24,25,26,27. Jednak po mikroiniekcjiG-actin Red zarodki są poddawane łagodnemu stresowi cieplnemu w celu wywołania ASR i wewnątrzjądrowego zespołu pręcików aktyny. W przypadku laboratoriów z dostępem do much i urządzenia do iniekcji, metoda ta powinna być łatwa do wdrożenia i dostosowana do określonych kierunków badań w odniesieniu do ASR, w tym jego indukcji przez różne stresy lub modulację w różnych tłach genetycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj kubki do pobierania zarodków i talerze z agarem na sok jabłkowy

  1. Pięć dni przed eksperymentem z iniekcją construct28 lub zaopatrz się w co najmniej dwa małe kubki do pobierania zarodków. Przygotuj świeże talerze agarowe z sokiem jabłkowym o średnicy 60 mm do użycia z małymi kubkami do zbierania28. Przechowuj talerze w plastikowych pudełkach przykrytych wilgotnymi ręcznikami papierowymi w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Małe kubki do pobierania zarodków, wypełnione numerami much, jak opisano w kroku 1.3, zapewnią wystarczającą liczbę zarodków na eksperyment, zapewniając jednocześnie, że obchodzenie się z zarodkiem i wstrzyknięcie go będzie można wykonać w wystarczająco krótkim czasie, aby umożliwić obrazowanie wczesnych stadiów rozwojowych.
  2. Podgrzej talerze z sokiem jabłkowym do 18 °C i dodaj odrobinę pasty drożdżowej na środek talerza. Pasta drożdżowa to prosta pasta z aktywnych drożdży i wody destylowanej.
  3. Aby promować najbardziej obfite składanie jaj, ustaw kubki do zbierania z muchami na 2 dni przed eksperymentem. Dodaj co najmniej 100 samic i 50 samców much do kubków zbiorczych i przykryj przygotowanym talerzem soku jabłkowego (Rysunek 1, krok 1). W dniach poprzedzających eksperyment z iniekcją zmieniaj talerze z sokiem jabłkowym co najmniej dwa razy dziennie, raz rano i raz wieczorem.
    UWAGA: Najlepsze wyniki iniekcji i obrazowania uzyskuje się, gdy kubki do pobierania zarodków są przechowywane w temperaturze 18 °C z 12-godzinnym cyklem włączania/wyłączania światła.

2. Przygotuj działający roztwórpodstawowy G-actin Red do mikroiniekcji

UWAGA: Ten preparat wytwarza tylko 2 μL 5 mg/mlzapasu roboczego G-actin Red, więc jeśli użytkownicy nie są przyzwyczajeni do techniki mikroiniekcji, korzystne jest przejście do kroku 3 i ćwiczenie mikroiniekcji z buforem o neutralnym pH, aby zachować cenny zapas roboczy. Zapas 10 μgG-actin Red od sprzedawcy można przechowywać w oryginalnym opakowaniu w zakręcanym słoiku o pojemności 16 uncji z ~500 g środka osuszającego w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.

  1. Przygotuj wcześniej roztwór podstawowy buforu G: 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, pH 8,0. Przefiltruj i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  2. W dniu wstrzyknięcia przygotować 1 ml roztworu roboczego buforu G w świeżej probówce wirówkowej z zatrzaskową nasadką na lodzie, używając zapasu bufora G z kroku 2.1, uzupełnionego następującymi roztworami we wskazanych stężeniach końcowych: 1 mM ditiotreitol (DTT) i 0,2 mM ATP, pH 8,0,
    UWAGA: 1 ml objętości roztworu roboczego buforu G jest większa niż potrzebna do eksperymentu, ale upraszcza przygotowanie. Nadmiar można odrzucić po eksperymencie lub użytkownicy mogą skalować w dół zgodnie z własnymi preferencjami.
    1. Trzymając 10 μgczerwonej G-aktyny na lodzie, najpierw dodaj 1 μl przefiltrowanej, destylowanej wody do różowej kropliczerwieni G-aktyny wewnątrz probówki.
    2. Następnie dodaj 1 μl zimnego, świeżo przygotowanego roztworu roboczego buforu G z kroku 2.2. Pipetować w górę i w dół ~20 razy, aby dobrze wymieszać z objętością pipety ustawioną na 1 μl. Zapas G-aktynyczerwonej będzie teraz w końcowym rozcieńczeniu 5 mg/ml.
  3. Inkubuj przygotowaną G-aktynęczerwoną przez 30 minut na lodzie bez przeszkód.
  4. Odwirować przygotowanączerwień G-aktynową w temperaturze 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w mikrowirówce w celu usunięcia osadu.
  5. Ostrożnie odpipetować 1,5 μl supernatantu do świeżej probówki wirówkowej z zatrzaskiem na lodzie, unikając ciemnoróżowych osadów.
  6. Przygotowany supernatantczerwieni G-aktyny należy przechowywać na lodzie do 6 godzin, aż będzie gotowy do załadowania do mikroigły.
    UWAGA: Mikroigły można wcześniej wyciągnąć z probówek kapilarnych za pomocą ściągacza do mikropipet, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej na pasku plasteliny na szalce Petriego o wymiarach 100 x 20 mm. Sugerowane parametry do wyciągania mikroigieł można znaleźć w Książce kucharskiej pipet29.

3. Zbieraj zarodki i montuj do iniekcji

  1. Pozwól muszkom złożyć zarodki przez 30 minut na talerzach z sokiem jabłkowym z pastą drożdżową w temperaturze 18 °C.
  2. Podczas składania much podgrzej do temperatury pokojowej talerz z sokiem jabłkowym bez pasty drożdżowej, wytnij żyletką prostokątny kawałek agaru z sokiem jabłkowym o wymiarach 4 cm x 1 cm i umieść na szkiełku podstawowym o wymiarach 25 mm x 75 mm.
    1. Zbierz płytkę z 30-minutowego zbioru i zdechorionuj zarodki, wlewając na płytkę świeży wybielacz, rozcieńczony w stosunku 1:1 wodą destylowaną, i obracając płytkę przez 1 minutę, zgodnie z opisem w28 (Rysunek 1, krok 2).
      UWAGA: Różne marki wybielaczy są sprzedawane w różnych stężeniach. Stosowany tutaj wybielacz to 6% podchlorynu sodu z butelki i jest rozcieńczany do końcowego stężenia 3% podchlorynu sodu. Równie dobrze sprawdzą się inne marki wybielaczy w nieco niższych stężeniach.
    2. Wlej wybielacz i zdekorionowane zarodki do koszyka do pobierania komórek (sitko do komórek 70 μm) i dwukrotnie przepłucz płytkę wodą destylowaną z butelki ze spryskaczem, dodając te popłuczyny do kosza zbiorczego.
    3. Energicznie opłucz zdechorionowane zarodki w koszu zbiorczym wodą destylowaną, aż nie będą widoczne grudki drożdży, a kosz nie pozostawi różowych śladów nadmiaru wybielacza po osuszeniu na ręczniku papierowym.
  3. Za pomocą pędzla z włosiem zwilżonym wodą destylowaną przenieś zdechorionowane i umyte zarodki z kosza zbiorczego na przygotowany klin agaru z soku jabłkowego na szkiełku
    4. podstawowym.
  4. Użyj pęsety z cienką końcówką lub igły do preparowania, aby ułożyć dziesięć zarodków w linii prostej wzdłuż długiej osi prostokątnego klina agarowego (Rysunek 1, krok 3). Ułóż zarodki od głowy do ogona tak, aby ich przedni biegun był skierowany w prawo, a strona grzbietowa była skierowana w stronę badacza (Rysunek 1, krok 3, powiększony).
  5. Odetnij żyletką 0,5 cm końcówki pipety P200 i zanurz w "kleju zarodkowym" (opisanym w28). Obficie pokryj obszar o szerokości 5 mm (Rysunek 1, krok 4) wzdłuż długiej krawędzi prostokątnego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 50 mm i pozostaw do wyschnięcia, przyklej stroną do góry. Suszenie zajmie ~30 s i jest zakończone, gdy cały obszar pokryty klejem wydaje się matowy, a nie mokry lub błyszczący.
    UWAGA: Przygotuj "klej do zarodków" co najmniej 48 godzin wcześniej. Dodaj n-heptan do pasków taśmy dwustronnej w fiolce scyntylacyjnej zgodnie z opisem w28.
  6. Po wyschnięciu "kleju do zarodków" delikatnie umieść klej do szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na wierzchu rzędu wyrównanych zarodków na agarze pozostawiając 2-3 mm wolnej przestrzeni między krawędzią szkiełka nakrywkowego a rzędem zarodków.
    UWAGA: Przyklejenie zarodków zbyt blisko krawędzi szkiełka nakrywkowego może prowadzić do nadmiernego wysuszenia zarodków w trakcie trwania eksperymentu.
  7. Odwróć szkiełko nakrywkowe tak, aby zarodki były teraz skierowane do góry. Powinny być one utknięte w linii wzdłuż jednej z dłuższych krawędzi szkiełka nakrywkowego, a ich obszar brzuszny powinien być skierowany w stronę najbliższej krawędzi szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1, krok 4, w powiększeniu).
  8. Osusz zarodki, delikatnie umieszczając szkiełko nakrywkowe z zarodkami na wierzchu 150 g świeżego niebieskiego środka osuszającego przechowywanego w zakręcanym słoiku o pojemności 16 uncji. Mocno przykręć pokrywkę i inkubuj przez 8-10 minut (Rysunek 1, krok 5).
  9. Po wysuszeniu wyjmij szkiełko nakrywkowe ze słoika ze środkiem osuszającym i przyklej każdy krótszy bok szkiełka nakrywkowego do szkiełka mikroskopowego, zarodkiem do góry, dwoma 4 cm2 kawałkami taśmy dwustronnej, tak aby szkiełko nakrywkowe zarodka zmieściło się na etapie wstrzyknięcia (Rysunek 1, krok 6).
  10. Dodaj 2-3 krople oleju Halocarbon 27 za pomocą pipety Pasteura, aby przykryć wyrównane zarodki i chronić je przed dalszym odwodnieniem (Rysunek 1, krok 6).

4. Wstrzykiwanie i podgrzewanie zarodków stresujących w celu pobudzenia pręcików aktynowych

UWAGA: Wszystkie zastrzyki są wykonywane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze 18 °C.

  1. Przygotować wilgotne komory inkubacyjne ze szklanej szalki Petriego o wymiarach co najmniej 100 mm x 20 mm i wyłożyć komorę skrętami wycieraczek laboratoryjnych zwilżonych wodą destylowaną (Rysunek 1, krok 8). Przed wstrzyknięciem zarodków należy wstępnie ogrzać komory inkubacyjne w temperaturze 32 °C lub do żądanej temperatury inkubacji.
  2. Otwórz zawór przepływu powietrza dla mikrowtryskiwacza i włącz mikrowtryskiwacz (odpowiednie jest sprężone powietrze lub powietrze domowe o ciśnieniu co najmniej 90 psi).
  3. Podczas wysuszania zarodków należy ponownie załadować wcześniej przygotowany supernatantG-actin Red do mikroigły za pomocą końcówki do mikroładowania. Ustawić pipetę tak, aby pobierała 1-1,5 μL.
    UWAGA: Ze względu na lepkość aktyny, objętości ładowania mogą nie być dokładne i może pozostać wystarczająca ilość aktyny, aby załadować co najmniej jedną do dwóch dodatkowych mikroigieł. Na jedną załadowaną mikroigłę można wstrzyknąć do 60 zarodków, jeśli mikroigła jest prawidłowo skalibrowana i nie zapycha się w trakcie eksperymentu.
  4. Przymocuj mikroigłę do uchwytu igły i dokręć. Podłącz rurkę powietrzną do mikrowtryskiwacza i upewnij się, że ciśnienie zwrotne na mikroigle równoważy się do 30 hPa.
  5. Skalibruj ustawienia mikrowtryskiwacza, aby usunąć pęcherzykczerwieni G-aktyny o średnicy 100 μm (~500 pL) na mikrometrze szkiełkowym. Obróć pokrętło ciśnienia (500-1500 hPa) i pokrętło czasu impulsu wtrysku (0,1-0,5 s) na mikrowtryskiwaczu, aby uzyskać odpowiedni rozmiar pęcherzyka. Dostosuj te ustawienia za każdym razem, gdy ładowana jest nowa mikroigła, aby uwzględnić zmienność lepkości aktyny i rozmiaru końcówki mikroigły.
    UWAGA: Przygotowanaczerwień G-aktyna jest lepka, a w końcówce mikroigły może znajdować się powietrze, które należy usunąć przed wstrzyknięciem zarodków. Jeśliczerwień G-aktyny nie wydostaje się łatwo z końcówki mikroigły, delikatnie złamij końcówkę mikroigły o krawędź szkiełka mikroskopowego.
  6. Umieścić szkiełko z zamontowanymi zarodkami na stoliku mikroskopowym.
    UWAGA: Każda konfiguracja iniekcji będzie inna, więc badacze będą musieli odpowiednio dostosować swoją metodę wstrzykiwania. Tutaj zarodki są przenoszone względem nieruchomej mikroigły, wstrzykując każdy zarodek poprzez wprowadzenie zarodka do mikroigły.
  7. Dostosuj stopień mikromanipulatora i ostrość obiektywu 10x na mikroskopie świetlnym tak, aby zarodki były widoczne. Zarodki znajdują się we właściwej płaszczyźnie ogniskowej, gdy kontury błony witelinowej są najostrzejsze, a zarodek wydaje się największy. Wybierz zarodki do wstrzyknięcia, które są w prawidłowym stadium rozwoju, tak aby do czasu zakończenia inkubacji po wstrzyknięciu większość lęgu osiągnęła pożądany etap rozwoju (np. wstrzyknąć zarodki w stadium Bownesa 2-330 w celu obserwacji pręcików podczas cellaryzacji po stresie cieplnym w temperaturze 32 °C).
  8. Użyj kontrolek mikroigłowych, aby ustawić igłę w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co zarodki.
    UWAGA: Jeśli mikroigła zaczepi się o szkiełko nakrywkowe podczas przesuwania stolika lub mikroigły, oznacza to, że mikroigła znajduje się zbyt blisko szkiełka i nie znajduje się we właściwej płaszczyźnie ogniskowej. Mikroigła powinna być równoległa do szkiełka nakrywkowego, a nie pod znacznym kątem (Rysunek 1, krok 7).
  9. Włóż mikroigłę do zarodka tak, aby uderzyła w zarodek w środku jego brzusznej części, na "równiku" zarodka. Uruchom wstrzyknięcie za pomocą pedału nożnego lub przycisku "wstrzyknij", gdy końcówka mikroigły jest widoczna wewnątrz środka zarodka (Rysunek 1, krok 7).
  10. Wstrzyknij raz G-actinRed i powoli usuń mikroigłę. Przesunąć etap i powtórzyć dla każdego zarodka w odpowiednim stadium rozwojowym.
    UWAGA: Ekspansja zarodka jest normalna, ponieważ wstrzykuje sięczerwień G-aktyny i trochę cytoplazmy może wyciekać z zarodka.
  11. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków umieść szkiełko z zarodkami w przygotowanej wilgotnej komorze inkubacyjnej i zamknij pokrywę (Rysunek 1, krok 8). W przypadku próby uzyskania zarodków, które osiągają celularyzację, należy poddać je stresowi termicznemu w temperaturze 32 °C przez 60-75 minut w wilgotnej komorze inkubacyjnej.
    UWAGA: Podano czasy inkubacji, które umożliwiają wizualizację pręcików w komórkowaniu zarodków zestresowanych ciepłem. Czas inkubacji będzie dłuższy w przypadku zarodków bez kontroli stresu cieplnego, ponieważ rozwój będzie wolniejszy w niższej temperaturze31. Te zarodki kontrolne mogą być inkubowane w wilgotnych komorach w temperaturach takich jak 18 °C lub 25 °C, w zależności od projektu konkretnego eksperymentu i pytania, które należy zadać. Minimalny czas inkubacji niezbędny do dyfuzjiczerwieni G-aktyny w zarodku wynosi 30 minut.

5. Obraz pręcików aktynowych w zarodkach narażonych na stres cieplny za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Podczas gdy zarodki są poddawane stresowi cieplnemu, włącz mikroskop konfokalny i wybierz kanał laserowy 561 nm.
  2. Przesuń soczewkę obiektywu (zalecane 25x, 40x lub 63x) do pozycji roboczej.
  3. W przypadku obrazowania zarodków zestresowanych ciepłem, należy ustawić inkubator z podgrzewanym stopniem tak, aby osiągnął temperaturę wewnętrzną 32 °C. Termometr typu "wskaż i strzelaj" lub termometr na podczerwień może być używany do sprawdzania temperatury na obiektywie lub w jego pobliżu.
  4. Po zakończeniu inkubacji wyjąć szkiełko z wstrzykniętymi zarodkami z wilgotnej komory inkubacyjnej (Rysunek 1, krok 9).
  5. Pracując szybko, delikatnie podważ dwustronne kawałki taśmy, które zostały użyte do przyklejenia szkiełka nakrywkowego z zamontowanymi zarodkami do szkiełka (Rysunek 1, krok 9).
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas tych czynności, ponieważ szkiełka nakrywkowe mogą łatwo pęknąć, jeśli zostanie przyłożona zbyt duża siła.
  6. Sklej ze sobą dwa kawałki dwustronnej taśmy o długości 2,5 cm i przetnij taśmę wzdłuż na pół, aby utworzyć dwa paski o długości 2,5 x 0,5 cm (Rysunek 1, krok 10).
  7. Przyklej dwie trzecie długości każdego paska taśmy na pierwszym szkiełku nakrywkowym, otaczając każdą stronę zarodków olejem Halocarbon 27 (Rysunek 1, krok 10, pomarańczowy), pozostawiając jedną trzecią pasków taśmy zwisających z krawędzi pierwszego szkiełka nakrywkowego, w którym utknęły zarodki. Używaj rąk w rękawiczkach i uważaj, aby nie dotykać zarodków podczas tego etapu.
  8. Delikatnie umieść drugie prostokątne szkiełko nakrywkowe na paskach taśmy, aby umieścić zarodki między szkiełkami nakrywkowymi (Rysunek 1, krok 10, niebieski). Wyrównaj krawędzie 25 mm, ale krawędzie 50 mm powinny być przesunięte względem siebie o 1 cm szerokości.
    UWAGA: Pełna powierzchnia tego drugiego szkiełka nakrywkowego stanie się nową powierzchnią obrazowania, która będzie skierowana w stronę soczewki obiektywu, więc uważaj, aby na tej drugiej powierzchni szkiełka nakrywkowego nie dostały się odciski palców ani olej Halocarbon 27. Przesunięcie jest konieczne, aby można było dodać dodatkowy olej Halocarbon 27, aby równomiernie zanurzyć zarodki. W razie potrzeby dodaj olej Halocarbon 27 w miejscu, w którym spotykają się dwa szkiełka nakrywkowe na górze kanapki, a pokryje on zarodki przez działanie kapilarne (patrz linie przerywane w Rysunek 1, krok 10).
  9. Delikatnie postukaj stroną żyletki w obszary szkiełka nakrywkowego, które znajdują się bezpośrednio na paskach taśmy, aby szkiełko nakrywkowe przylegało do taśmy.
  10. Odwróć kanapkę z szkiełkiem nakrywkowym i umieść ją na laboratoryjnej wycieraczce do tkanek, aby powierzchnia obrazowania była czysta i przenieś do mikroskopu konfokalnego (Rysunek 1, krok 11). Upewnij się, że taśma jest całkowicie przyklejona do obu szkiełek nakrywkowych przed obrazowaniem.
  11. Upewnij się, że podgrzewany stage ma temperaturę i jeśli używasz odwróconego mikroskopu, dodaj płyn zanurzeniowy na wybraną soczewkę obiektywu.
    12. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na stoliku, aby upewnić się, że nowa powierzchnia obrazowania (2. szkiełko nakrywkowe) dotyka cieczy zanurzeniowej (Rysunek 1, krok 11).
  12. UWAGA: W razie potrzeby przyklej szkiełko nakrywkowe do stolika za pomocą dwóch małych kawałków taśmy dwustronnej, aby zapobiec niepotrzebnym ruchom podczas obrazowania, jeśli szkiełka nakrywkowe nie pasują dobrze do podgrzewanej sceny.
  13. Skoncentruj się na zarodku, który znajduje się w cellaryzacji (stadium Bownesa 4a30) lub pożądanym etapie rozwoju przy użyciu światła przechodzącego lub fluorescencji.
  14. Po ustawieniu ostrości zarodka przełącz się na tryb akwizycji laserowej w mikroskopie konfokalnym i dostosuj moc i wzmocnienie lasera, rozmiar ramki, kafelki i ustawienia projekcji zgodnie z potrzebami.
  15. Wykonaj zdjęcia powierzchni przez płaszczyzny ogniskowe jąder zarodka, aby znaleźć wewnątrzjądrowe pręciki aktynowe. Pręciki powinny pojawiać się w wielu orientacjach jako jasne smugi lub kropki wewnątrz stosunkowo ciemnych jąder (Rysunek 2A, 2C).

6. Alternatywne eksperymenty obrazowania

  1. Wykonaj FRAP, aby zbadać obrót aktyny na całej długości wewnątrzjądrowych pręcików aktyny lub w cytoplazmatycznych strukturach aktyny, takich jak końce bruzd błony plazmatycznej podczas celularyzacji.
  2. W oprogramowaniu do obrazowania wybierz prostokątny obszar wokół końcówek bruzd lub prętów aktynowych, w których chcesz przeprowadzić eksperyment.
  3. Wybierz mały kwadratowy obszar środka pręta aktynowego w prostokątnym obszarze akwizycji do wybielenia. Upewnij się, że końcówki pręcika aktynowego są widoczne i nie wybielają się w trakcie eksperymentu, aby umożliwić dokładne śledzenie pręcika wewnątrz jądra.
  4. Ustaw laser wybielający na iterację 50x i ustaw moc lasera wybielacza na maksimum.
  5. Wybierz przebieg czasu, aby rejestrować obrazy co sekundę przez łączną długość do 120 s przy maksymalnej szybkości zatrzymywania pikseli i ustaw laser na wybielanie po pierwszych dwóch sekundach akwizycji obrazu.
  6. Określ ilościowo dane, aby określić czas połowicznego zaniku fluorescencji1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schematyczny przebieg procesu manipulacji zarodkami przedstawiono na Rycina 1, a harmonogram typowego eksperymentu przedstawiono w Tabela 1Przyjmuje się, że dobrym wynikiem eksperymentalnym jest sytuacja, w której dla każdych 10 wstrzykniętych embrionów co najmniej połowa obserwowanych embrionów znajduje się we właściwym stadium rozwoju, nie jest uszkodzona i wykazuje silną reakcję szoku cieplnego (ASR) przy temperaturze 32 °CTę odpowiedź na stres stresowy (ASR) potwierdzi p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Znaczenie tej metody polega na tym, że wykorzystuje ona dobrze znany protokół mikroiniekcji w zarodkach Drosophila 21,22,23,24,25,26,27, aby umożliwić nowe badania dotyczące ASR i towarzyszącego mu zespołu pręcików aktynowych. Główną zaletą wstrzykiwaniaczerwieni G-aktyny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują za pracę Liuliu Zheng i Zenghui Xue, którzy pomogli zapoczątkować tę technikę w laboratorium Sokac, a także Hasana Seede, który pomógł w analizie. Prace w ramach tego badania są finansowane z grantu NIH (R01 GM115111).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Adenozynotrifosforan (ATP)Millipore-SigmaA23835GSkładnik buforu G
Sok jabłkowy, Mott's, 64 fl ozMott's014800000344Składnik talerzy z sokiem jabłkowym
Bacto AgarBD214010Składnik talerzy z sokiem jabłkowym
Wybielacz, PureBright Bakteriobójczy, 6,0% podchloryn soduKIK International059647210020Do dekorionacji zarodków
Chlorek wapniaMillipore-SigmaC1016500GSkładnik buforu G
Sitko do komórek, 70 μ mFalcon352350Do pobierania zarodków z odziarniową naczyniówką
Mikroskop konfokalny, LSM 880 34-kanałowy z AiryscanZeiss0000001994956Do obrazowania wewnątrzjądrowych prętów aktynowych
Środek osuszającyDrierite24001Do suszenia zarodków
Mikroskop preparacyjny, Stemi 508 Stereoskop z zoomem 8:1Zeiss4350649000000Do układania zarodków na klinie agarowym
Igła preparacyjna, 5 caliFisher Scientific08965ADo układania zarodków na klinie agarowym
Ditiothreitol (DTT)Fisher ScientificBP1725Składnik bufora G
Taśma dwustronna, Scotch Permanent, 0,5 cala x 250 cala3M021200010323Do produkcji kleju do zarodków
Klatka do pobierania zarodkówGenessee Scientific59100Do trzymania dorosłych much i pobierania zarodków
Pęseta z cienką końcówką, Pęseta Dumont, Styl 5Mikroskopia elektronowa Nauki72701DDo układania zarodków na klinie agaru
Kapilary szklane, szkło borokrzemianowe, cienkie 1 mm x 0,75 mmWorld Precision Instruments, Inc.TW1004Do mikroigieł
Olej halowęglowy 27Millipore-SigmaH8773100MLDo nawodnienia zarodków
Inkubator z podgrzewanym stopniemZeiss4118579020000, 4118609020000, 4118609010000Do obrazowania konfokalnego
Wycieraczki laboratoryjne, KimWipesKimberly-Clark34155Wycieraczki laboratoryjne
Mikroskop świetlny, Invertoskop 40C Kontrast odwróconej fazy mikroskop, odnowionyZeissWycofany z produkcjiMikroskop iniekcyjny
Metylo-4-hydroksybenzoesanMillipore-SigmaH36471KGSkładnik talerzy z sokiem jabłkowym
Mikrowtryskiwacz, FemtoJet4xEppendorf5253000025Mikrowtryskiwacz
Końcówki do mikroładowania, epT.I.P.S. 20 μ LEppendorf5242956003Do ładowania mikroigieł
Mikromanipulator i stolik iniekcyjny z pokrętłami x,y,z do regulacji igłyBernard Instruments, Inc (Houston, TX)NiestandardoweDo wykonywania mikroiniekcji
Ściągacz do mikropipet, model P-97, płonący/brązowySutter InstrumentsP97Do wyciągania rurek kapilarnych do wytwarzania mikroigieł
Szklana osłona mikroskopu 24x50-1,5Fisher Scientific12544EDo montażu zarodków
Szkiełka mikroskopowe, Lilac Colorfrost, Wstępnie oczyszczone, 25 x 75 x 1mmFisher Scientific22037081Do mocowania zarodków do wstrzykiwań
n-heptanFisher ScientificH3601Składnik kleju do zarodków
Obiektyw, 10xZeisswycofany10x obiektyw do mikroskopu
iniekcyjnegoObiektyw, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCSZeiss 421767997171140-krotny obiektyw wodny do obiektywu konfokalnego
, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 do zanurzania w oleju, wodzie, oleju silikonowym lub glicerynie (D=0,17mm) (WD=0,57mm przy D=0,17mm)Zeiss420852987100025-krotny obiektyw zanurzeniowy do obiektywu konfokalnego
, Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Oil DIC f/ELYRAZeiss420782990079963x do konfokalnego
Pędzel, Robert Simmons Expression E85 spiczasty okrągły rozmiar 2Daler-Rowney038372016954Do transferu zarodków
Ręczniki papierowe, ręczniki papierowe Kleenex C-fold, białeKimberly-Clark884266344845Do sitka do komórek klombowych
Pipeta Pasteura, 5 3/4 calaFisher Scientific1367820ADo pokrywania zarodków olejem
szalka Petriego, szkło, 100 x 20 mmCorning3160102Do wilgotnej komory inkubacyjnej
Szalka Petriego, tworzywo sztuczne, 60 x 15 mmVWR25384092Do talerzy z sokiem jabłkowym
Pipeta, Eppendorf Reference 0,5-10 μ LEppendorf2231000604Do ładowania końcówki do pipet mikroigłowych
, xTIP4 250 μ LBiotix63300006Do dodawania kleju z zarodków do szkiełka nakrywkowego
ŻyletkaVWR55411050Do cięcia klina agarowego, taśmy, końcówek pipet
Aktyna globularna sprzężona z rodaminą, ludzka płytka krwi (bez mięśni; 4x10 μ g)Cytoszkielet, Inc.APHR-AG-aktyna^Czerwona
fiolka scyntylacyjna, 20 ml Szklany borokrzemian z wkładką polietylenową i nakrętkami mocznikowymiFisher Scientific033377Do wytwarzania kleju do zarodków
Zakręcany słoik, 16 uncjiNalgene000194414195Do suszenia zarodków
Mikrometr etapowyMikroskopia elektronowa Sciences602104PGDo kalibracji objętości wstrzyknięcia G-aktyny
SacharozaMillipore-Sigma840971KGSkładnik talerzy z sokiem jabłkowym
Baza TrizmaMillipore-SigmaT15031KGSkładnik drożdży buforowych G
, drożdży Lesaffre Yeast Corporation, Red Star Active Dry, 32 ozLesaffre Yeast Corporation117929157002Składnik pasty drożdżowej
Obiektyw olejowy

Bibliografia

  1. Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
  2. Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
  3. Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
  4. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
  5. Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
  6. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  7. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
  8. Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
  9. Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
  10. Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
  11. Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
  12. Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
  13. Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
  14. Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
  15. Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
  16. Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
  17. Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
  18. Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
  19. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
  20. Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
  21. Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).
  22. Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).
  23. Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).
  24. Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).
  25. Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).
  26. Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
  27. Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
  28. Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).
  29. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
  30. Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
  31. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
  32. Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

stres cieplnytechnika mikrowstrzykiwaniamikroskopia konfokalnaeksperymenty FRAPG-aktyna czerwonaodpowiedź stresowa aktynymontowanie zarodkówpowrót fluorescencji
Obrazowanie wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych w żywych zarodkach Drosophila poddanych stresowi cieplnemu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.