Artykuł metodologiczny

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

DOI:

10.3791/61298

⸱

16 lipca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko w systemach błon komórkowych odgrywają kluczową rolę w szerokim zakresie procesów biologicznych - od interakcji między komórkami po transdukcję sygnałów; od wykrywania sygnałów środowiskowych do odpowiedzi biologicznej; od regulacji metabolicznej do kontroli rozwoju. Dokładne informacje strukturalne dotyczące interakcji białko-białko mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów molekularnych kompleksów białek błonowych oraz dla projektowania wysoce specyficznych cząsteczek do modulowania tych białek. Opracowano wiele podejść in vivo i in vitro do wykrywania i analizy interakcji białko-białko. Wśród nich podejście oparte na biologii strukturalnej jest wyjątkowe, ponieważ może dostarczyć bezpośrednich informacji strukturalnych o interakcjach białko-białko na poziomie atomowym. Jednak obecna biologia strukturalna białek błonowych jest nadal w dużej mierze ograniczona do metod opartych na detergentach. Główną wadą metod opartych na detergentach jest to, że często dysocjują lub denaturują kompleksy białek błonowych po usunięciu ich natywnego środowiska dwuwarstwowego lipidów przez cząsteczki detergentu. Opracowujemy natywny system nanocząstek błony komórkowej do biologii strukturalnej białek błonowych. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie tego systemu w analizie oddziaływań białko-białko na błonie komórkowej na przykładzie stanu oligomerycznego AcrB.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko (PPI) odgrywają kluczową rolę w biologii, od utrzymania struktury i funkcji białek po regulację całych systemów. IPP występują w wielu różnych formach i można je kategoryzować na podstawie typów interakcji, które tworzą. Jedną z takich kategoryzacji jest homooligomeryczna lub heterooligomeryczna, w zależności od tego, czy interakcje zachodzą między identycznymi podjednostkami, czy różnymi białkami działającymi jako podjednostki. Inna kategoryzacja opiera się na sile oddziaływania, jeśli oddziaływania prowadzą do powstania stabilnych kompleksów lub przejściowych stanów kompleksów. Informacje strukturalne na temat IPP między białkami mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmu, za pomocą którego białka pełnią swoją funkcję. Szacuje się, że ponad 80% białek opiera się na tworzeniu kompleksów w celu realizacji swoich ról funkcjonalnych1. Biorąc pod uwagę odsetek białek, w przypadku których zaobserwowano zależność od IPP w celu prawidłowego funkcjonowania wrodzonego, ich znaczenie w biologii jest łatwo widoczne, jednak możliwość prawidłowego zbadania białek, które angażują się w te interakcje, pozostała wyzwaniem ze względu na ograniczenia w dostępnych technikach eksperymentalnej obserwacji, kiedy białka tworzą IPP.

Istnieje duży stopień rozbieżności między wynikami dla wielu eksperymentalnie określonych PPI ze względu na dużą ilość szumów, fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych, które pochodzą z wielu obecnie dostępnych technik określania PPI. Dotyczy to w szczególności drożdżowego układu dwuhybrydowego (Y2H), tandemowego oczyszczania powinowactwa i spektrometrii mas (TAP-MS) oraz transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET), które reprezentują trzy z najczęściej stosowanych metod oznaczania PPI2,3,4,5,6,7. Dla porównania, techniki biologii strukturalnej białek, takie jak magnetyczny rezonans jądrowy (NMR), krystalografia rentgenowska i mikroskopia elektronowa (EM), mogą być wykorzystywane do uzyskiwania informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości na temat interakcji białko-białko aż do poziomu atomowego i pozwalają na bezpośrednie wizualne potwierdzenie interakcji zachodzących w docelowym białku będącym przedmiotem zainteresowania. Wszystkie obecnie dostępne techniki badawcze określające PPI bez struktury (np. Y2H, TAP-MS i FRET) nie mają tej zdolności i dodatkowo mają trudności z identyfikacją słabych i przejściowych interakcji między białkami5. Niedociągnięcia te są dodatkowo potęgowane podczas badania białek błonowych ze względu na dodatkową złożoność spowodowaną dodatkową zmienną środowiska lipidowego, która wpływa na tworzenie prawidłowej struktury czwartorzędowej i składania kompleksów heteromerycznych.

Białka błonowe stanowią dużą część proteomu i są znane z tego, że odgrywają wiele kluczowych ról w prawidłowym funkcjonowaniu komórek we wszystkich żywych organizmach. Pomimo faktu, że szacuje się, że białka błonowe stanowią 27% ludzkiego genomu i stanowią ~60% wszystkich obecnych celów leków, istnieje poważna anomalia w liczbie rozwiązanych modeli białek błonowych, które stanowią tylko ~2,2% wszystkich opublikowanych struktur białkowych8,9,10. Główną przyczyną rozbieżności w dostępności informacji strukturalnych są wewnętrzne właściwości samych białek błonowych. Ze względu na ich słabą rozpuszczalność, zależność od interakcji ze środowiskiem lipidowym w celu utrzymania natywnej struktury i funkcji oraz różne właściwości fizykochemiczne samej błony lipidowej, białka błonowe nadal stanowią poważny problem przy wdrażaniu technik biologii strukturalnej do ich badania. Spośród tych wewnętrznych właściwości najważniejszą dla uzyskania dokładnych informacji strukturalnych jest wymóg interakcji z ich naturalnym środowiskiem lipidowym, aby mogły one zachować swoją naturalną strukturę i funkcję. Środowisko lipidowe jest tak integralną częścią struktury i funkcji białek błonowych, że zaproponowano koncepcję memteiny (połączenie słów błona i białko) jako podstawowej jednostki struktury i funkcji błony komórkowej białka11. Pomimo znaczenia interakcji lipid-białko, obecnie dostępne techniki oznaczania IPP oparte na strukturze często wymagają, aby badane białka były rozpuszczalne lub rozpuszczone w detergentach. Narażenie na ostre detergenty może denaturować białka lub powodować wyniki fałszywie dodatnie i ujemne z powodu delipidacji, co może wywołać agregację, denaturację białka, dysocjację oddziaływań niekowalencyjnych i tworzenie sztucznych stanów oligomerycznych. Ze względu na konieczność utrzymania naturalnego środowiska lipidowego dla dokładnego określenia natywnego stanu oligomerycznego białek błonowych, opracowaliśmy system Native Cell Membrane Nanoparticles (NCMNs)12 w oparciu o wcześniej opisaną metodę Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13.

SMALP używa kopolimeru kwasu maleinowego styrenu jako aktywnego polimeru membranowego do ekstrakcji i solubilizacji białek błonowych. Poli(kwas styrenowo-kumareinowy) (SMA) jest unikalnym polimerem amfifilowym ze względu na hydrofobową cząstkę styrenową i diametralnie przeciwstawną hydrofilową cząstkę kwasu maleinowego. Tworzy nanocząstki poprzez adsorpcję, destabilizację i rozrywanie błony komórkowej w mechanizmie zależnym od pH14. Ta funkcjonalna aktywność SMA pozwala na wykorzystanie go jako bezdetergentowego systemu do ekstrakcji i solubilizacji białek błonowych. System NCMN różni się od systemu SMALP pod kilkoma względami. Najbardziej unikalną cechą systemu NCMN jest to, że posiada on membranową bibliotekę aktywnych polimerów z wieloma polimerami, które mają unikalne właściwości, które sprawiają, że nadają się do izolacji wielu różnych białek błonowych, które wymagają różnych warunków dla stabilności i natywnego funkcjonowania. System NCMN ma również inne protokoły w porównaniu z metodą SMALP, jeśli chodzi o przygotowanie nanocząstek. Jednym z takich przykładów jest to, że NCMN wykorzystują jednoetapowe oczyszczanie kolumny powinowactwa do niklu do określania struktury w wysokiej rozdzielczości; Efekt tych różnych protokołów można zaobserwować, porównując protokół NCMNs, który wygenerował struktury AcrB 3,2 i 3,0 A cryo-EM, z podobnym badaniem przy użyciu metody SMALP, w wyniku którego uzyskano strukturę cryo-EM AcrB o rozdzielczości 8,8 A12,15. Te unikalne cechy systemu NCMN są ulepszeniami wprowadzonymi do wcześniej ustalonej metody SMALP i czynią go idealnym kandydatem do badania IPP.

Wielolekowy transporter wypływu AcrB istnieje jako funkcjonalny homotrimer w E. coli12. Analiza mutagenna sugerowała, że pojedyncza mutacja punktowa P223G, zlokalizowana na pętli odpowiedzialnej za stabilność trimera AcrB, destabilizuje stan trimera i daje monomer AcrB po przygotowaniu z detergentem DDM, który można wykryć za pomocą natywnej elektroforezy z niebieskim żelem16. Jednak analiza FRET mutanta AcrB-P223G sugerowała, że w natywnym środowisku dwuwarstwy lipidowej błony komórkowej większość zmutowanego AcrB-P223G nadal istniała jako trimer i że poziomy ekspresji zarówno dla dzikiego typu AcrB, jak i AcrB-P223G są podobne. Jednak pomimo wyników analizy FRET, test aktywności zmutowanego transportera wykazał, że aktywność dramatycznie spadła w porównaniu z dzikim typem 16. Chociaż technologia FRET jest powszechnie stosowana do analizy interakcji białko-białko, badania wykazały, że często może dawać fałszywe alarmy17,18,19,20.

Ostatnio określono struktury krio-EM o wysokiej rozdzielczości trimera AcrB, które wykazały interakcję AcrB z powiązaną z nim natywną dwuwarstwą lipidową błony komórkowej za pomocą NCMNs12. Zasadniczo NCMN mogą być łatwo wykorzystane do analizy interakcji białko-białko występujących na natywnej błonie komórkowej. W ramach testu tego systemu przeprowadzono eksperymenty mające na celu bezpośrednią obserwację stanu oligomerycznego AcrB-P223G z wykorzystaniem natywnych nanocząstek błony komórkowej i mikroskopii elektronowej z ujemnym barwieniem. W celu porównania z dzikimi nanocząstkami AcrB użyliśmy tego samego aktywnego polimeru membranowego (SMA2000 wyprodukowanego w naszym laboratorium, który jest indeksowany jako NCMNP1-1 w bibliotece NCMN) używanego do określania struktury krio-EM w wysokiej rozdzielczości AcrB i alternatywnych polimerów znajdujących się w bibliotece NCMNs12. Na podstawie wcześniej zgłoszonych wyników spodziewano się, że większość mutanta AcrB-P223G będzie istniała w postaci trimerycznych natywnych nanocząstek błony komórkowej21. Jednak w próbce nie znaleziono żadnych trimerów AcrB, takich jak te, które zaobserwowano w przypadku dzikiego typu AcrB. Sugeruje to, że większość AcrB-P223G nie tworzy trimerów na natywnej błonie komórkowej, jak wcześniej sugerowano.

Tutaj przedstawiamy szczegółową analizę zmutowanego E. coli AcrB-P223G w porównaniu z dzikim typem E. coli AcrB za pomocą NCMNs. To studium przypadku AcrB sugeruje, że NCMNs jest dobrym systemem do analizy interakcji białko-białko.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspresja białka

  1. Zaszczepić 15 ml pożywki Terrific Broth (TB) antybiotykami specyficznymi dla plazmidów komórkami BL21(DE3) pLysS zawierającymi plazmidy eksprymujące AcrB w probówkach o pojemności 50 ml przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
  2. Sprawdź gęstość optyczną nocnej hodowli przy 600 nm (OD600) i upewnij się, że przekracza 2,0.
  3. Rozcieńczyć 5 ml hodowli komórkowej w 1 l pożywki przeciwgruźliczej zawierającej antybiotyki specyficzne dla plazmidów i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem do OD600 = 0,8, a następnie indukować IPTG o końcowym stężeniu 1 mM.
  4. Przeprowadzić indukcję w temperaturze 20 °C z wytrząsaniem przez 20 godzin.
  5. Granulować komórki za pomocą wirowania przez 15 minut w temperaturze 4 °C i 4 000 x g.

2. Liza komórek i izolacja błony

  1. Zawiesić osad komórkowy w buforze A (Tabela 1, użyć buforu A DDM lub buforu A NCMNs, w zależności od schematu oczyszczania, który ma nastąpić), używając 80 ml na każde 20 g osadu komórkowego.
  2. Homogenizować zawieszone granulki komórkowe za pomocą szklanego homogenizatora Dounce w temperaturze 4 °C lub, jeśli mają temperaturę pokojową, należy natychmiast po tym umieścić je na lodzie.
  3. Przenieść próbkę do metalowej zlewki na lodzie i poddać komórki lizie, ładując je do homogenizatora wysokociśnieniowego w temperaturze 4 °C i ciśnieniu 1 500 barów.
    1. Powtórz proces ładowania komórek do homogenizatora i pozwalania im przejść przez homogenizator przez 3-4 cykle lub do momentu, gdy lizat zacznie się klarować.
  4. Odwirować lizat przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zebrać supernatant i załadować do probówek ultrawirówek i wirować przy 215 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  6. Odrzucić supernatant i zebrać granulki membrany z probówek ultrawirówek. Nadmiar granulek membrany należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie natywnych nanocząstek błony komórkowej

  1. Zawiesić 1 g osadu membranowego w 10 ml buforu A NCMNs (Tabela 1).
  2. Zawiesinę zawiesiny próbki błony komórkowej należy homogenizować za pomocą homogenizatora szklanego Dounce w temperaturze 20 °C.
  3. Przenieść zawieszoną próbkę membrany do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml i dodać roztwór podstawowy polimerów aktywnych z membrany oraz dodatkowy bufor A NCMNs, aby doprowadzić próbkę do końcowego stężenia 2,5% (w/v) aktywnego polimeru membranowego (NCMNP1-1 lub NCMNP5-2).
    UWAGA: Roztwory podstawowe membranowych polimerów aktywnych powinny być sporządzane w wodzie podwójnie destylowanej i mogą być przechowywane w różnych stężeniach, ale zwykle 10% (w/v).
  4. Wstrząsać próbką przez 2 godziny w temperaturze 20 °C.
  5. Załadować próbkę do ultrawirówki i wirować w temperaturze 150 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C.
  6. Podczas gdy próbka jest ultrawirowana, zacznij równoważyć 5 ml kolumny Ni-NTA z 25 ml buforu A NCMN.
  7. Zebrać supernatant po zakończeniu ultrawirowania i załadować go do 5 ml kolumny Ni-NTA w temperaturze pokojowej o natężeniu przepływu 0,5 ml/min za pomocą pompy strzykawkowej.
  8. Przemyć linie szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) wystarczającą ilością buforu B NCMN (Tabela 1), aby całkowicie przepłukać system, a następnie podłączyć kolumnę do maszyny FPLC.
  9. Przemyć kolumnę 30 ml buforu B NCMN o natężeniu przepływu 1 ml/min i zebrać przepływ.
  10. Przepłukać kolumnę 30 ml buforu C NCMNs (tabela 1) o natężeniu przepływu 1 ml/min i zebrać przepływ.
  11. Eluować białko za pomocą 20 ml buforu D NCMNs (Tabela 1) przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min i zebrać próbkę za pomocą kolektora frakcji, a frakcje każda z nich jest ustawiona na 1,0 ml.
  12. Próbki białka należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
  13. Uruchomić test elektroforezy żelowej SDS-PAGE w celu sprawdzenia próbek, które odpowiadają pikom obserwowanym na wykresie elucji FPLC.

4. Elektroforeza żelowa SDS-PAGE

  1. Przygotuj komorę odlewniczą, clampując szkło do aparatu odlewniczego.
  2. Przygotować 12% żel separacyjny zgodnie z recepturą podaną w tabeli 1.
    UWAGA: Po dodaniu TEMED żel szybko polimeryzuje, więc dodaj go tylko wtedy, gdy będzie gotowy do nalania żelu.
  3. Wlej żel, pozostawiając 2 cm poniżej dna grzebienia na żel do układania.
  4. Usuń wszelkie pęcherzyki, nakładając na wierzch żelu warstwę 100% izopropanolu i poczekaj, aż żel separacyjny zacznie polimeryzować.
  5. Usuń izopropanol i wypłucz wszelkie ślady izopropanolu wodą destylowaną.
  6. Przygotować żel do układania zgodnie z przepisem podanym w tabeli 1.
    UWAGA: Po dodaniu TEMED żel szybko polimeryzuje, więc dodaj go tylko wtedy, gdy będzie gotowy do nalania żelu.
  7. Wlej żel do układania na wierzch żelu separacyjnego.
  8. Dodaj grzebień do komory, aby uformować dołki i poczekaj, aż żel do układania w stos całkowicie spolimeryzuje.
  9. Umieścić 1 μl 1 M DTT w probówce mikrowirówki dla każdej próbki frakcji, która ma być przeprowadzona na żelu.
  10. Dodaj 7 μl bufora ładującego 4x do każdej probówki.
  11. Dodać 20 μl próbki z frakcji, które należy uruchomić na żelu, do każdej probówki do mikrowirówki.
  12. Zwirować probówki zawierające próbki.
  13. Wiruj probówki z próbkami za pomocą mikrowirówki stołowej przez 3 sekundy i upewnij się, że cała próbka wróciła na dno probówek.
  14. Przygotować żelowe ogniwo do elektroforezy, zabezpieczając kasetę z 12% żelem poliakrylamidowym na miejscu i wypełniając wewnętrzną i zewnętrzną komorę ogniwa buforem tris-octanu-EDTA (TAE) (Tabela 1).
  15. Załadować marker masy cząsteczkowej do pierwszego pasa żelu o odpowiedniej objętości wymaganej przez jego instrukcje.
  16. Załadować 28 μl próbki z każdej probówki zmieszanej z naziemną telewizją cyfrową i buforem ładującym.
  17. Umieść pokrywę ogniwa elektroforetycznego na górze pudełka i podłącz pokrywę do zasilania.
  18. Włącz zasilanie i ustaw je na 100 V i pozwól mu pracować przez 20 minut.
  19. Po 20 minutach zwiększ prąd zasilania do 140 V i kontynuuj jego pracę przez kolejne 30-40 minut lub do momentu, gdy pasmo obciążającego barwnika buforowego dotrze do dna kasety żelowej.
  20. Po zakończeniu elektroforezy należy wybarwić i odbarwić żel, aby uwidocznić prążki białkowe zawarte w żelu.

5. Oczyszczanie białek za pomocą DDM

UWAGA: Celem przeprowadzenia tego procesu oczyszczania jest służenie jako kontrola dla eksperymentów wykorzystujących aktywne polimery membranowe.

  1. Zawiesić 6-10 g osadu membranowego, z kroku 2.6, w buforze A DDM (Tabela 1) przy użyciu 5 ml/g osadu membranowego.
  2. Zawiesinę zawiesić za pomocą szklanego homogenizatora Dounce w temperaturze 4 °C lub, jeśli jest w temperaturze pokojowej, należy natychmiast umieścić ją na lodzie.
  3. Przenieść próbkę do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml i dodać DDM oraz dodatkowy bufor A DDM, aby doprowadzić próbkę do końcowego stężenia 2% DDM.
  4. Wstrząsać próbką przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  5. Załadować próbkę do probówek ultrawirówek i wirować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i 150 000 x g.
  6. Podczas ultrawirowania próbki należy przygotować 5 ml kolumny Ni-NTA, przemłukując ją 25 ml buforu A DDM (Tabela 1).
  7. Po zakończeniu ultrawirowania zebrać supernatant i załadować go do kolumny Ni-NTA o pojemności 5 ml w temperaturze 4 °C i natężeniu przepływu 0,5 ml/min za pomocą pompy strzykawkowej.
  8. Umyj linie FPLC wystarczającą ilością bufora DDM B + 0,05% DDM (tabela 1), aby całkowicie przepłukać system, a następnie podłącz kolumnę do maszyny FPLC.
  9. Przemyć kolumnę 30 ml buforu DDM B + 0,05% DDM o natężeniu przepływu 1 ml/min i zebrać przepływ.
  10. Przemyć kolumnę 30 ml buforu DDM C + 0,05% DDM (Tabela 1) o natężeniu przepływu 1 ml/min i zebrać przepływ.
  11. Eluować białko za pomocą 20 ml buforu DDM D + 0,05% DDM (Tabela 1) przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min i zebrać przepływ za pomocą kolektora frakcji, a frakcje każda jest ustawiona na 1,0 ml.
  12. Frakcje zawierające pik elucji wybrać do łączenia i zagęszczania za pomocą koncentratora odśrodkowego i odwirowywać w temperaturze 4 000 x g i 4 °C aż do osiągnięcia 500 μl.
  13. Za pomocą pętli o pojemności 500 μl załadować próbkę do maszyny FPLC, a następnie do kolumny wykluczającej o wielkości 25 ml w temperaturze 4 °C. Eluować za pomocą 30 ml buforu DDM E + 0,05% DDM (tabela 1) przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min i zebrać jako frakcje o wielkości frakcji ustawionej na 0,5 ml na frakcję.
  14. Weź frakcje i zmierz stężenie białka przy użyciu absorbancji 280 nm, aby potwierdzić krzywą UV-Vis z wykresu elucji FPLC.
  15. Zebrać 20 μl z każdej frakcji próbki, która odpowiada pikom zaobserwowanym na wykresie elucji FPLC i których dokładność została potwierdzona w teście absorbancji.
  16. Pozostałe frakcje próbki należy zamrozić przy użyciu ciekłego azotu lub suchego lodu w żądanych podwielokrotnościach i przechowywać próbki białka w temperaturze -80 °C.
  17. Uruchom test elektroforezy żelowej SDS-PAGE zgodnie z wcześniejszym opisem, aby sprawdzić próbki, które odpowiadają pikom obserwowanym na wykresie elucji FPLC.

6. Przygotowanie siatki do barwienia ujemnego

  1. Umieść siatki, które mają być używane do przygotowania próbki, na szkiełku owiniętym w bibułę filtracyjną stroną węglową skierowaną do góry.
  2. Umieść szklane szkiełko z siatkami mikroskopu elektronowego w komorze wyładowania jarzeniowego między dwiema elektrodami i załóż szklaną pokrywę, upewniając się, że jest wyśrodkowana i dobrze uszczelniona.
  3. Uruchom maszynę do rozładowywania jarzeniowego i upewnij się, że fioletowe światło generowane przez plazmę jest widoczne.
  4. Gdy maszyna zakończy pracę, poczekaj, aż komora osiągnie ciśnienie atmosferyczne, aby zdjąć szklaną pokrywę, a następnie zwróć szkiełko z kratkami na stół, na który zostaną załadowane próbki.
  5. Dostosować stężenie oczyszczonych próbek białka do około 0,1 mg/ml poprzez rozcieńczenie próbki odpowiednim buforem lub zagęszczenie za pomocą koncentratora odśrodkowego.
  6. Załaduj 3,5 μl próbki białka na siatkę węglową o grubości 10 nm i odczekaj 1 minutę.
  7. Usuń ciecz z powierzchni siatki EM za pomocą bibuły filtracyjnej.
  8. Umyj powierzchnię kratki 3 razy, zbierając 3 μl kropelek wody za pomocą kratki i usuwając wodę z kratki za pomocą bibuły filtracyjnej pomiędzy zbieraniem każdej kropli.
  9. Umyj powierzchnię siatki 2x, zbierając 3 μl kropelek świeżego, przefiltrowanego 2% octanu uranu i usuń roztwory myjące z kratki bibułą filtracyjną pomiędzy zbieraniem każdej kropli.
  10. Zabarwić siatkę 3 μl kroplą świeżego, przefiltrowanego 2% octanu uranu przez 1 minutę.
  11. Usunąć roztwór octanu uranu z powierzchni siatki EM za pomocą bibuły filtracyjnej i wysuszyć siatkę na powietrzu przez co najmniej 1 minutę.
  12. Przechowuj siatkę w pudełku z siatką do późniejszego wykorzystania.

7. Obrazowanie EM

  1. Załaduj przygotowaną siatkę do uchwytu siatki na bezpiecznym stole warsztatowym.
  2. Przygotuj mikroskop, umieszczając mikroskopy dewara w styropianowym pudełku i napełnij dewara 3/4 ciekłym azotem.
  3. Upewnij się, że gumowa osłona okienka mikroskopu zakrywa je, a następnie załaduj dewara do mikroskopu, umieszczając miedziane druty w dewarze, aż zmieści się na platformie.
  4. Napełnij pozostałą część dewara ciekłym azotem i umieść nakrętkę na wierzchu dewara, aby ją przykryć.
  5. Włącz wysokie napięcie, kondycjonuj mikroskop i poczekaj, aż mikroskop się rozgrzeje i ustali bezpieczny poziom podciśnienia do użycia.
  6. Gdy mikroskop będzie gotowy, otwórz zawór kolumny i potwierdź, że wiązka jest obecna, zdejmując gumową osłonę z okienka mikroskopu.
  7. Sprawdź stygmatyzację wiązki, rozchodząc się do wewnątrz i na zewnątrz, regulując intensywność wiązki. Jeśli występuje astygmatyzm, wiązka będzie miała kształt eliptyczny w miarę oddalania się od skrzyżowania, a wiązka powinna mieć ten sam owalny kształt po obu stronach.
  8. Ustaw lornetkę mikroskopu tak, aby znajdowała się na odpowiedniej wysokości i odległości zgodnie z oczami obserwatora.
  9. Sprawdź położenie wiązki w trybach wyszukiwania, ostrości i ekspozycji, przechodząc przez wszystkie trzy tryby, aż wiązka znajdzie się w środku w każdym z nich.
  10. Zamknij zawór kolumny i przystąp do ładowania uchwytu siatki do mikroskopu elektronowego.
  11. Dostosuj mikroskop do wysokości eucentrycznej, korzystając z funkcji woblera mikroskopu i regulując ruch stolika za pomocą osi Z, aż nie będzie ruchu próbki na boki w środku.
  12. Korzystając z trybu wyszukiwania niskiej dawki w mikroskopie, przeszukaj siatkę w poszukiwaniu pożądanego obszaru o rozsądnym kontraście z obecnymi cząsteczkami próbki, aby skupić się na próbce.
  13. Skoncentruj się na próbce w trybie koncentracji, używając dużego rozmiaru kroku, aż próbka zostanie zauważona, a następnie zmniejsz kroki, aby znaleźć właściwy poziom ostrości.
  14. Wyzeruj i wyłącz wiązkę, a następnie upewnij się, że gumowa podkładka zakrywa okienko mikroskopu.
  15. Korzystając z trybu ekspozycji, wykonaj zdjęcie żądanego obszaru siatki dla ekspozycji 1 s przy powiększeniu 62 000x i sprawdź uzyskany obraz.
  16. Po zakończeniu obrazowania siatki zamknij zawory kolumny i wyjmij uchwyt siatki z kolumny.
  17. Po zakończeniu obrazowania wszystkie interesujące nas siatki wyłącz mikroskop, wyłączając zasilanie żarnika i usuwając ciekły azot Dewara z mikroskopu.
  18. Umieść coś, co wchłonie wilgoć na stojaku, na którym siedział dewar, aby złapać kondensację z miedzianych cewek mikroskopu.
  19. Aktywuj tryb Cryo Cycle i upewnij się, że pompa turbo jest wyłączona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z przedstawionych tutaj procedur, próbki E. coli AcrB wild type i E. coli mutant AcrB-P223G zostały oczyszczone. Próbki zostały następnie zaadsorbowane na siatkach mikroskopii elektronowej z ujemnym wynikiem emisji dwutlenku węgla i wybarwione przy użyciu octanu uranylu metodą blottingu bocznego22. Obrazy barwienia negatywowego zebrano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Obraz barwienia ujemnego dla próbki typu dzikiego AcrB oczyszczonej DDM ujawnia jedn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko są ważne dla integralności struktury i funkcji białek błonowych. Opracowano wiele podejść do badania interakcji białko-białko. W porównaniu z białkami rozpuszczalnymi, białka błonowe i ich IPP są trudniejsze do zbadania ze względu na unikalne wewnętrzne właściwości białek błonowych. Trudność ta wynika głównie z wymogu, aby białka błonowe były osadzone w natywnym środowisku dwuwarstwowym lipidów w celu zapewnienia stabilności strukturalnej i funkcjonalności. Staje się to problematyczne, ponieważ w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y.G jest wymieniony jako wynalazca aktywnego polimeru membranowego NCMNP5-2 i systemu NCMN.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez fundusz startowy VCU (dla Y.G.) oraz National Institute Of General Medical Sciences of the National Institutes of Health pod numerem nagrody R01GM132329 (dla Y.G.) Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Dziękujemy Montserrat Samso i Kevinowi McRobertsowi za ich hojne wsparcie w zakresie nagrywania wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
30% Akrylamid/BIS SOL (37,5:1)Bio-Rad161-0158
4x Bufor do próbek Laemmli (bufor ładujący)Bio-Rad1610747
Kwas octowy LodowatyThermoFisher ScientificA38S-212
Nadsiarczan amonu (APS)Bio-Rad161-0700
ChloramfenikolGoldbioC-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 barwnik białkowy w proszkuBio-Rad161-0400
DTT (ditiotreitol) (> 99% czystości) Bez proteazyGoldbioDTT10
GlicerolThermoFisher ScientificG33-4
HEPESThermoFisher ScientificBP310-1
ImidazolAffymetrix17525 1 KG
IPTGGoldbioI2481C100
KanamycynaGoldbioK-120-25
Sześciowodny chlorek magnezuThermoFisher ScientificAA3622636
MetanolThermoFisherScientific A412-4
N,N-dimetyloetylenodiamina (EDTA)Merck8.03779.0100
NCMNS-P5-2Jeszcze niedostępny w handluWyślij prośbę o uzyskanie do autora
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray ValleyWyślij prośbę o uzyskanie do autora
Chlorek soduThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Terrific Bulion MediaAffymetrix75856 1 KG
Tris BaseBio-Rad161-0719
Octan uranyluAmbinterAmb22348393
Sprzęt
Avanti J-26S XPIBeckman CoulterB14538
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Siatki mikroskopu elektronowego węglowego (10 nm)Mikroskopia elektronowaCF300-Cu-TH
Homogenizator tkankowy Con-TorqueEberbachE7265
Mini mikrowirówka Corning LSEThermoFisher Scientific07-203-954
EmulsiFlex-C3Kolektor frakcji Avestin
F9-RGE Healthcare Nauki przyrodnicze29003875
Pionowa komórka do elektroforezy Mini-PROTEAN TetraBio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 SpektrofotometrThermoFisher ScientificND-2000
Optima L-90K UltrawirówkaBeckman CoulterPN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Glow Discharge Discharge Cleaning SystemTed Pella91000S-230
Potter-Elvehjem Bezpieczny młynek do tkanekWheaton358013
PowerPac Podstawowy zasilaczBio-Rad164-5050
Razel R99-E Pompa strzykawkowa o zmiennej prędkościRazel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Nauki przyrodnicze28990944
Tecnai F20 200kVFEI
Type 70 Ti Rotor o stałym kącieRedlica
General Materials
1,5 ml Probówki do mikrowirówekThermoFisher Scientific05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDaMillipore SigmaUFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLCGE Healthcare Nauki Przyrodnicze29018225
BL21(DE3)pLysS OgniwaThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 ml Stożkowa probówka wirówkowaThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 ml Kolumna GEHealthcare Nauki przyrodnicze17524802
pET-24aEMD Biosciences69749-3
korespondencyjnego korespondencyjnego Beckman

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
  3. Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
  4. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
  5. Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
  6. Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
  7. Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
  8. Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50(2009).
  9. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  10. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  11. Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
  12. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  13. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  14. Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
  15. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
  16. Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390(2011).
  17. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
  18. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  19. Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
  20. Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
  21. Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
  22. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199(2018).
  23. Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
  24. Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
  25. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).
  26. Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
  27. Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
  28. Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Membrane Protein InteractionsElectron Microscopy AnalysisOligomeric State DeterminationMembrane Active PolymerNickel NTA ChromatographyNegative Stain GridsSize Exclusion ChromatographySDS PAGE AnalysisCryo Electron Microscopy

Powiązane artykuły