Badania biotribologiczne i analiza chrząstki stawowej ślizgającej się po metalu pod implanty

Podsumowanie

Ten protokół opisuje przygotowanie, badania biotribologiczne i analizę cylindrów kostno-chrzęstnych ślizgających się po metalowym materiale implantu. Miarami wyników zawartymi w tym protokole są aktywność metaboliczna, ekspresja genów i histologia.

Streszczenie

Wady kostno-chrzęstne u pacjentów w średnim wieku mogą być leczone za pomocą ogniskowych implantów metalowych. Implanty, które po raz pierwszy zostały opracowane z myślą o wadach stawu kolanowego, są obecnie dostępne dla barku, biodra, stawu skokowego i pierwszego stawu śródstopia-kości krzyżowej. Zapewniając zmniejszenie bólu i poprawę kliniczną, u wielu pacjentów obserwuje się postępujące zmiany zwyrodnieniowe przeciwstawnej chrząstki. Mechanizmy prowadzące do tego uszkodzenia nie są w pełni poznane. Protokół ten opisuje eksperyment trybologiczny mający na celu symulację parowania metalu na chrząstce i kompleksową analizę chrząstki stawowej. Metalowy materiał implantu jest testowany w porównaniu z bydlęcymi cylindrami kostno-chrzęstnymi jako model ludzkiej chrząstki stawowej. Stosując różne obciążenia i prędkości poślizgu, można naśladować fizjologiczne warunki obciążenia. Aby zapewnić kompleksową analizę wpływu na chrząstkę stawową, w niniejszym protokole opisano histologię, aktywność metaboliczną i analizę ekspresji genów. Główną zaletą badań tribologicznych jest to, że parametry obciążenia można dowolnie dostosowywać w celu symulacji warunków in vivo. Ponadto można zastosować różne rozwiązania testowe w celu zbadania wpływu środków smarnych lub prozapalnych. Za pomocą analizy ekspresji genów specyficznych dla chrząstki i genów katabolicznych można wykryć wczesne zmiany w metabolizmie chondrocytów stawowych w odpowiedzi na obciążenie mechaniczne.

Wprowadzenie

Leczenie wad kostno-chrzęstnych jest wymagające i w wielu przypadkach wymaga operacji. W przypadku ogniskowych zmian kostno-chrzęstnych u pacjentów w średnim wieku ogniskowe implanty metalowe są realną opcją, zwłaszcza po niepowodzeniu podstawowego leczenia, takiego jak stymulacja szpiku kostnego (BMS) lub autologiczna implantacja chondrocytów (ACI)¹. Częściowa wymiana powierzchni może być uważana za procedury ratunkowe, które mogą zmniejszyć ból i poprawić zakres ruchu². Implanty te są zazwyczaj wykonane ze stopu CoCrMo i są dostępne w różnych rozmiarach i konfiguracjach offsetowych, aby dopasować się do normalnej anatomii³. Chociaż początkowo opracowano je z myślą o wadach przyśrodkowego kłykcia kości udowej w kolanie, takie implanty są obecnie dostępne i stosowane w biodrze, kostce, barku i łokciu^4,5,6. Aby uzyskać zadowalający wynik, kluczowa jest ocena mechanicznego ustawienia stawu i stanu przeciwstawnej chrząstki. Ponadto wykazano, że prawidłowa implantacja bez wystającego implantu ma fundamentalne znaczenie⁷.

Badania kliniczne wykazały doskonałe krótkoterminowe wyniki w zakresie redukcji bólu i poprawy funkcji u pacjentów w średnim wieku w różnych lokalizacjach^5,6,8. W porównaniu z implantacją przeszczepu allogenicznego, ogniskowe implanty metalowe umożliwiają wczesne przenoszenie ciężaru. Jednak przeciwległa chrząstka stawowa wykazywała przyspieszone zużycie u znacznej liczby pacjentów^9,10. W związku z tym, nawet przy prawidłowym umieszczeniu, w wielu przypadkach zwyrodnienie rodzimej chrząstki wydaje się nieuniknione, podczas gdy mechanizmy leżące u podstaw pozostają niejasne. Podobne zmiany zwyrodnieniowe zaobserwowano po dwubiegunowej hemiartroplastyce stawu biodrowego¹¹ i nasilają się wraz z aktywnością i obciążeniem¹².

Eksperymenty trybologiczne dają możliwość badania takich par in vitro i symulowania różnych sytuacji obciążenia występujących w warunkach fizjologicznych¹³. Zastosowanie szpilek kostno-chrzęstnych oferuje prosty model geometryczny do zbadania trybologii ślizgania się chrząstki stawowej po chrząstce natywnej lub dowolnym materiale implantu¹⁴ i może być dalej stosowany w całych modelach symulacyjnych stawów¹⁵. Pary metal-chrząstka wykazują przyspieszone zużycie chrząstki, rozerwanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zmniejszoną żywotność komórek w strefie powierzchownej w porównaniu z parowaniem chrząstka-chrząstka¹⁶. Uszkodzenie chrząstki występowało głównie w postaci rozwarstwienia między strefą powierzchowną a środkową¹⁷. Jednak mechanizmy prowadzące do zwyrodnienia chrząstki nie są do końca poznane. Protokół ten zapewnia kompleksową analizę aktywności biosyntetycznej chrząstki stawowej. Poprzez określenie aktywności metabolicznej i poziomów ekspresji genów katabolicznych można zidentyfikować wczesne oznaki rozpadu chrząstki. Zaletą eksperymentów tribologicznych in vitro jest to, że parametry obciążenia można dostosować tak, aby imitowały różne warunki obciążenia.

Stąd, poniższy protokół jest odpowiedni do symulacji pary metal-chrząstka, reprezentując eksperymentalny model hemiartroplastyki.

Protokół

1. Przygotowanie metalowych cylindrów

1. Analiza cylindrycznych prętów kobaltowo-chromowo-molibdenowych (CoCrMo) spełniających standardowe specyfikacje dla implantów chirurgicznych pod względem ich składu chemicznego przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) ze spektroskopią rentgenowską z dyspersją energii zgodnie z protokołem producenta w celu potwierdzenia podanych wartości.
   UWAGA: Skład pierwiastkowy stopu CoCrMo użytego w tym eksperymencie to 65% Co, 28% Cr, 5% Mo i 2% inne.
2. Próbki należy zmielić na mokro papierem szlifierskim z węglika krzemu, zaczynając od wielkości ziarna 500. Używaj papieru szlifierskiego w kolejności rosnącej do wielkości ziarna 4000.
3. Wypoleruj cylinder pastą 3 μm i 1 μm, aby uzyskać chropowatość powierzchni mieszczącą się w zakresie tolerancji wymagań dotyczących wykończenia powierzchni dla metalowych implantów chirurgicznych (ISO 5832-12:2019) oraz implantów do całkowitej i częściowej wymiany stawu (ISO 21534:2007).
   UWAGA: Średnią chropowatość powierzchni określa się za pomocą mikroskopu konfokalnego.
4. Przyciąć pręty CoCrMo (Ø 6 mm) na cylindry o długości 10 mm.

2. Pobieranie cylindrów kostno-chrzęstnych

1. U dojrzałych szkieletów bydła (w wieku 18-24 miesięcy w momencie uśmiercenia) należy użyć stawów kolanowych bydła i przechowywać je w zamknięciu i schłodzić do czasu rozbioru w ciągu 24 godzin po uśmierceniu.
   UWAGA: Jointy kupuje się u lokalnego rzeźnika. Staw pozostaje zamknięty do momentu rozwarstwienia.
2. Aby pobrać cylindryczne czopy kostno-chrzęstne w warunkach aseptycznych, należy zdezynfekować kolano i wykonać artrotomię oraz odsłonić kłykieć przyśrodkowy kości udowej.
   UWAGA: Sekcję należy wykonać z zachowaniem ostrożności, aby nie uszkodzić powierzchni stawowej.
3. Sprawdź powierzchnię stawową pod kątem uszkodzeń makroskopowych.
   UWAGA: Próbkę należy wyrzucić, jeśli chrząstka nie ma białawego, gładkiego i błyszczącego wyglądu lub jeśli występują pęcherze, szczeliny lub większe wady.
4. Ustaw rurkę tnącą prostopadle do powierzchni stawowej obszaru nośnego i wbij urządzenie w chrząstkę i kość podchrzęstną za pomocą mocnych uderzeń młotkiem. Przy głębokości penetracji 15 mm przekręć urządzenie nagłym ruchem zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
5. Wyjmij urządzenie, włóż białe pokrętło i wkręć je, aż dolny koniec korka kostno-chrzęstnego będzie widoczny.
6. Oznacz przednio-tylne ułożenie próbek sterylnym markerem w celu odpowiedniego rozmieszczenia cylindra kostno-chrzęstnego podczas badania.
   UWAGA: Trójwymiarowa sieć kolagenowa i jej złożona architektura ułatwiają uzyskanie unikalnych właściwości mechanicznych chrząstki stawowej i powinny być brane pod uwagę przy orientacji próbek.
7. Przepłukać próbkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu zmycia krwi i tkanki tłuszczowej.
8. Powtórz powyższe kroki, aby zebrać żądaną liczbę czopów kostno-chrzęstnych (średnica 8 mm, długość 15 mm).
   UWAGA: Zazwyczaj od 9 do 12 cylindrów kostno-chrzęstnych można pobrać z obszaru nośnego na przyśrodkowym kłykciu kości udowej.
9. Umieścić próbki w zmodyfikowanej pożywce Eagle's firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, uzupełnionej antybiotykami (penicylina 200 j./ml; streptomycyna 0,2 mg/ml) i amfoterycyna B 2,5 μg/ml i przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia testów w celu utrzymania żywotności.
10. Analizuj kontrolne czopki kostno-chrzęstne natychmiast po zbiorze w celu ustalenia wartości wyjściowych (patrz sekcja analiza).

3. Badania trybologiczne

1. Wykonaj eksperymenty przy użyciu dostępnego na rynku tribometru posuwisto-zwrotnego z konfiguracją cylinder na płycie. Wymagania dotyczące urządzenia to obciążenie pionowe oraz regulowane obciążenie i prędkość ślizgu. Ponadto kuweta cieczowa umożliwia wykonywanie testów w roztworze smarującym.
2. Określić ciśnienie kontaktowe w systemie CoCrMo-on-chrząstka za pomocą folii do pomiaru ciśnienia. Umieść folię do pomiaru ciśnienia na granicy faz i przyłóż obciążenie statyczne przez 30 s, aby określić początkowy nacisk kontaktowy, rozmiar i kształt styku. Ze względu na wypukłość metalowego cylindra i chrząstki stawowej, początkowa powierzchnia styku ma w tej konfiguracji kształt eliptyczny.
   UWAGA: Folia do pomiaru ciśnienia reaguje na przyłożone ciśnienie, pokazując czerwone przebarwienia stref, w których ciśnienie progowe zostało osiągnięte lub przekroczone. Dla 1 N obciążenia nacisk docisku określono na około 2 MPa poprzez wizualne porównanie ze zdefiniowanymi dociskami dotycznymi.
3. Zamocuj cylindry kostno-chrzęstne na dolnym uchwycie próbki z oznaczeniem wyrównanym z kierunkiem przesuwania i zamontuj butle CoCrMo na górnym ogniwie obciążnikowym.
4. Dodać roztwór testowy (PBS z kwasem hialuronowym 3 g/l) do płynnej komórki, co powoduje zanurzenie cylindra kostno-chrzęstnego i pokrycie ślizgowej granicy metalowo-chrzęstnej.
5. Ustaw parametry testowe (zalecana siła normalna, skok i prędkość poślizgu), które są następnie stosowane i utrzymywane przez cały czas trwania testu.
   UWAGA: Długość skoku ruchu posuwisto-zwrotnego musi być ustawiona zgodnie z obszarem kontaktu, aby utworzyć migrujący obszar kontaktu (MCA). W przypadku zatyczek o średnicy 8 mm, skok 2 mm umożliwia odpowiednie nawodnienie chrząstki.
6. Rozpocznij posuwisto-zwrotne przesuwanie cylindra CoCrMo po chrząstce stawowej zanurzonej w roztworze smarującym o ustawionych parametrach obciążenia.
7. Monitoruj współczynnik tarcia (COF) podczas eksperymentów.
   UWAGA: COF jest oceniany automatycznie, ale można go obliczyć za pomocą równania μ=F/W (μ - współczynnik tarcia; F - siła tarcia; W - normalne obciążenie przyłożone przez system).
8. Zakończ eksperyment po żądanym okresie testowania.
9. Wyjąć czop kostno-chrzęstny z uchwytu na próbkę, przepłukać go PBS i przechowywać w pożywce do czasu dalszej analizy biologicznej (patrz poniżej).
10. Zanurzyć próbki kontrolne w roztworze testowym w temperaturze pokojowej na czas trwania badania i analizować razem z próbkami, które zostały poddane obciążeniu mechanicznemu.

4. Analiza

UWAGA: Cylinder kostno-chrzęstny jest analizowany pod kątem aktywności metabolicznej i ekspresji genów w celu zbadania aktywności biologicznej; histologia jest wykonywana w celu zbadania integralności powierzchni chrząstki i leżącej pod nią matrycy.

1. histologia
   1. W celu analizy histologicznej zanurzyć czopki kostno-chrzęstne w 4% buforowanym roztworze formaldehydu w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania.
   2. Przepłukać próbki PBS i umieścić je w plastikowym naczyniu.
   3. Dodać nadmiar gotowego do użycia roztworu odkamieniającego, tak aby wszystkie próbki były pokryte.
   4. Stosuj ciągłe mieszanie przez 4 tygodnie, aby całkowicie odwapnić.
   5. Po odwapnieniu zanurzyć próbki w rozpuszczalnych w wodzie glikolach i żywicach i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
   6. Uzyskać przekroje 6 μm przez kriosekcję poprzeczną do obszaru kontaktu.
   7. Następnie należy przygotować próbki do barwienia Safraniną O i barwienia przeciwstawnego Fastgreen zgodnie z protokołem producenta.
   8. Przechwytywanie obrazów histologicznych za pomocą mikroskopu i przetwarzanie za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.
2. Aktywność metaboliczna
   UWAGA: Aktywność metaboliczną chondrocytów w chrząstce stawowej bada się za pomocą testu toksykologicznego ex vivo opartego na XTT.
   1. Przepłukać czop kostno-chrzęstny za pomocą PBS i umieścić próbkę na szalce Petriego.
   2. Umieść 24-dołkową płytkę na wadze i wyzeruj wagę.
   3. Odetnij chrząstkę z przeszczepu kostno-chrzęstnego skalpelem w jednym kawałku.
   4. Przeciąć chrząstkę na dwie równe części, tak aby powierzchnia styku była równomiernie rozłożona na obu kawałkach chrząstki i zmielić od połowy do 1 mm³ kawałków. Druga połowa służy do analizy ekspresji genów.
   5. Przenieść zmieloną chrząstkę do jednego dołka przygotowanej płytki 24-dołkowej i określić masę tkanki.
   6. Powtórz czynności wymienione powyżej dla każdej próbki i dodaj 1 ml pożywki wzrostowej do każdego dołka płytki.
   7. Dodać roztwór XTT (490 μl odczynnika do znakowania XTT i 10 μl odczynnika aktywacyjnego) zgodnie z instrukcją producenta i wymieszać.
   8. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 4 godziny.
   9. Po inkubacji usunąć supernatant i przenieść go do probówki o pojemności 5 ml.
   10. Ekstrahować produkt tetrazolowy przez dodanie 0,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do tkanki chrzęstnej w płytce 24-dołkowej i stosować ciągłe mieszanie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   11. Usuń rozwiązanie DMSO i połącz je z wcześniej zebranym roztworem XTT.
   12. Przenieść 100 μl próbki w trzech egzemplarzach na 96-dołkową płytkę na czytniku płytek i zmierzyć absorbancję przy długości fali 492 nm i referencyjnej długości fali przy 690 nm.
   13. Znormalizować uzyskane wartości absorbancji do mokrej masy każdej próbki i przeprowadzić analizę za pomocą oprogramowania.
3. Analiza ekspresji genów
   1. Izolacja RNA
      UWAGA: Izolację RNA przeprowadza się za pomocą komercyjnego zestawu (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta z niewielkimi poprawkami.
      1. Drugą połowę tkanki chrzęstnej uzyskanej z czopa kostno-chrzęstnego należy rozdrobnić na małe kawałki.
      2. Przenieś je do probówki zawierającej kulki ceramiczne i 300 μl buforu do lizy (zawierającego 1% β-merkaptoetanolu).
         UWAGA: Próbki można zamrozić w ciekłym azocie do czasu dalszej obróbki.
      3. Rozmrażać próbki przez 2 minuty i używać dostępnego w handlu lizera do homogenizacji tkanki. Stosować 6500 obr./min przez 20 s (etap homogenizacji) cztery razy z 2-minutową fazą chłodzenia po każdym przebiegu (w temperaturze 4 °C przy użyciu komercyjnego urządzenia chłodzącego lizer), aby całkowicie rozbić tkankę.
      4. Do każdej probówki dodać 20 μl proteinazy K i 580 μl wody wolnej od RNaz i inkubować w temperaturze 55 °C przez 30 minut.
      5. Odwirować próbki przez 3 minuty przy 10 000 x g i przenieść supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml.
      6. Dodaj 0,5 objętości 90% etanolu do każdej probówki i wymieszaj.
      7. Przenieść 700 μl próbki do kolumny wiążącej RNA umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i odwirować przy 8 000 x g przez 15 s.
      8. Odrzucić przepływ i powtórzyć etap wirowania dla pełnego lizatu.
      9. Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny, odwirować przy 8 000 x g przez 15 s i odrzucić przepływ.
      10. Zmieszać 10 μl roztworu podstawowego DNazy i 70 μl buforu RDD. Dodaj roztwór do membrany oczyszczającej RNA i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
      11. Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny i odwirować przy 8 000 x g przez 15 s. Odrzucić przepływ.
      12. Dodać 500 μl buforu RPE i odwirować przy 8 000 x g przez 15 s. Wyrzucić przepływ.
      13. Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny oczyszczającej RNA i odwirować przy 8 000 x g przez 2 minuty.
      14. Umieść kolumnę w probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml i dodaj 30 μl wody wolnej od RNaz. Wirować przy 8 000 x g przez 1 min.
      15. Wyizolowany RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu syntezy cDNA.
   2. Synteza cDNA
      UWAGA: Do syntezy komplementarnego DNA (cDNA) z informacyjnego RNA (mRNA) użyto komercyjnego zestawu (Tabela materiałów). RNA z bakteriofaga MS2 dodano w celu stabilizacji wyizolowanego RNA podczas syntezy cDNA.
      1. Rozmrozić i wymieszać odczynniki. Skład pojedynczej reakcji przedstawiono w tabeli 1.
      2. Dodać 16 μl próbki RNA do objętości dla pojedynczej reakcji (14 μL).
      3. Przeprowadzić syntezę cDNA w termocyklerze przy użyciu następujących parametrów: 10 min w temperaturze 25 °C (wyżarzanie startera), 60 min w temperaturze 50 °C (synteza DNA), 5 min w temperaturze 85 °C (denaturacja) i 5 min w temperaturze 20 °C (faza chłodzenia).
      4. Przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C do czasu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR).
   3. RT-qPCR
      UWAGA: Do RT-qPCR próbek bydlęcych zaprojektowano startery i sondy przy użyciu komercyjnego oprogramowania Real-Time qPCR (np. IDT) dla genów GAPDH (dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego), COL2A1 (kolagen typu 2), ACAN (Aggrekan), COL1A1 (kolagen typu 1), MMP-1 (metaloproteinaza macierzy-1) i MMP-13 (metaloproteinaza macierzy-13). Spłonki bydlęce i sondy podwójnie hartowane zostały dostarczone przez IDT. Odczynniki użyte w pojedynczej reakcji do oceny skuteczności i ekspresji genów przedstawiono w tabeli 2.
      1. Dozować główną mieszaninę pojedynczej reakcji (9 μl) do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR i dodać 1 μl cDNA do każdej reakcji. Wykonać badania dla każdej próbki w trzech egzemplarzach.
      2. Zamknąć płytkę PCR za pomocą oleju uszczelniającego i odwirować przy 877 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      3. Wykonać RT-qPCR przy użyciu precyzyjnego termocyklera o następującym protokole: 95 °C przez 10 min, 45 cykli amplifikacji (95 °C przez 10 s, wyżarzanie przez 30 s, synteza cDNA) i 37 °C przez 30 s.
         UWAGA: Dla każdego podkładu wymagane są określone temperatury wyżarzania.
      4. Użyj GAPDH wraz z genami docelowymi, aby potwierdzić skuteczność.
      5. Użyj dostarczonego oprogramowania, aby obliczyć wydajność każdego genu.
      6. Znormalizować wartości progu cyklu (CT) do ekspresji genu referencyjnego GAPDH i użyć metody ΔΔCT do oceny ilościowej.

Wyniki

Obszar kontaktu i nacisk musi być potwierdzony za pomocą filmu do pomiaru ciśnienia (Rysunek 1). Fizjologiczny stan obciążenia można potwierdzić poprzez porównanie z odciskami referencyjnymi dla zdefiniowanych nacisków kontaktowych. Podczas testów współczynnik tarcia jest stale monitorowany. Przy migrującym obszarze styku niski współczynnik tarcia może być utrzymany przez co najmniej 1 godzinę (Rysunek 2). Za pomocą barwienia Safraniną O można określić skład i strukturę macierzy ze...

Dyskusja

Ogniskowe implanty metalowe stanowią procedurę ratunkową w przypadku wad kostno-chrzęstnych, zwłaszcza u pacjentów w średnim wieku i po nieudanym leczeniu podstawowym. Chociaż badania kliniczne wykazały obiecujące wyniki krótkoterminowe, jednym z zaobserwowanych powikłań jest uszkodzenie przeciwstawnej, rodzimej chrząstki¹⁰. Badania zwłok i badania biomechaniczne pokazują wyraźne dowody na to, że prawidłowa implantacja z płaskim lub lekko wklęsłym ustawieniem utrzymuje naturalne naciski kontaktowe...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Amfoterycyna B	Sigma? Aldrich Chemie GmbH	A-2942-100ML
buforowany roztwór formaldehydu 4%	VWR	97131000
II (XTT)	Roche Diagnostics	11465015001	Test toksykologiczny ex vivo oparty na XTT
Surowiec CoCrMo	Acnis International		Pręty CoCrMo o średnicy 6 mm
CryoStar NX70 Cryostat	Thermo Fischer Scientific		urządzenie do kriosekcji
dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sidma-Aldrich Chemie	D 2438-10ML
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średnia	Sigma? Aldrich Chemie GmbH		średnia
płodowa surowica bydlęca	Gibco
Kwas hialuronowy	Anika Therapeutics Inc.		składnik roztworu smarującego
iCycler	BioRad		termocykler
Mikroskop Leica DM?1000	Leica		do histologii
Folia uszczelniająca LightCycler 480	Diagnostics Termocykler
LightCycler 96	Roche Diagnostics		do PCR
MagNA Lyser Zielone Koraliki	Roche Diagnostics
System transferu autoprzeszczepu kostno-chrzęstnego (OATS)	Arthrex Inc.		Rura tnąca do zbioru cylindrów kostno-chrzęstnych
osteosoft	Merck	1017279010	roztwór odkamieniający
Penicylina / Streptomycyna	Sigma? Aldrich Chemie GmbH	P4333-100ML
sól fizjologiczna buforowana	Sigma? Aldrich Chemie GmbH		PBS
Prescale Niskociśnieniowa	folia wskazująca ciśnienie	Fujifilm
Zestaw tkanek włóknistych RNeasy	QIAGEN	74404
Synergy 2	Czytnik płytek	BioTek Instruments
Tetra? Falex MUST	Falex Tribology		Tribometer
Tissue? Tek O.C.T.	SAKURA	4583	preparat do zatapiania
Transkryptor Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA Roche	Diagnostics	40897030001
β-merkaptoetanol	Sidma-Aldrich Chemie	M3148