Artykuł metodologiczny

Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans

DOI:

10.3791/61315

⸱

2 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1ITAV-CNRS, Université de Toulouse, CNRS, Toulouse, France, 2LAAS-CNRS, Université de Toulouse, CNRS, Toulouse, France, 3ENCB, Instituto Politécnico Nacional (IPN), Mexico City, Mexico, 4TBI, Université de Toulouse, CNRS, INRA, INSA, Toulouse, France, 5CIC, Instituto Politécnico Nacional (IPN), Mexico City, Mexico

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu automatyzację pomiarów AFM na setkach komórek mikrobiologicznych. Najpierw drobnoustroje są unieruchamiane w mikrostrukturach stemplowych PDMS, a następnie pomiary spektroskopii sił są wykonywane automatycznie na setkach unieruchomionych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda przedstawiona w tym artykule ma na celu automatyzację eksperymentów Bio-AFM i rejestrowania krzywych siły. Za pomocą tej metody możliwe jest automatyczne rejestrowanie krzywych sił na 1000 ogniwach w ciągu 4 godzin. Aby utrzymać 4-godzinny czas analizy, liczba krzywych sił na komórkę jest zmniejszana do 9 lub 16. Metoda łączy w sobie program oparty na Jythonie i strategię składania komórek według zdefiniowanych wzorców. Program, zaimplementowany w komercyjnym Bio-AFM, może wyśrodkować końcówkę na pierwszej komórce tablicy, a następnie automatycznie przemieszczać się z komórki do komórki, rejestrując krzywe siły na każdej komórce. Korzystając z tej metodologii, możliwe jest uzyskanie dostępu do parametrów biofizycznych komórek, takich jak ich sztywność, właściwości adhezyjne itp. Dzięki automatyzacji i dużej liczbie analizowanych komórek można uzyskać dostęp do zachowania populacji komórek. Jest to przełom w dziedzinie bio-AFM, gdzie do tej pory dane zarejestrowano tylko na kilkudziesięciu komórkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca dostarcza metodologii do wykonywania automatycznych pomiarów siły na setkach żywych komórek za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Zapewnia również metodę unieruchamiania drobnoustrojów na mikrostrukturalnym stemplu PDMS, która jest kompatybilna z eksperymentami AFM prowadzonymi w środowisku płynnym.

Bio-AFM to wysoce wyspecjalizowana technologia opracowana do zastosowań w biologii, a następnie używana do badania żywych komórek. Wymaga to wyszkolonego inżyniera, który może analizować jedną komórkę na raz. W tych warunkach liczba różnych komórek, które można przeanalizować, jest raczej niewielka, typowo od 5 do 10 komórek w ciągu 4-5 godzin. Jednak ilość pomiarów siły rejestrowanych na pojedynczej komórce jest zwykle bardzo duża i może z łatwością osiągnąć 1000. Tak więc obecny paradygmat pomiarów siły AFM na żywych komórkach polega na rejestrowaniu setek krzywych sił (FC), ale na ograniczonej liczbie komórek.

Statystycznie rzecz biorąc, takie podejście jest wątpliwe i podnosi kwestię reprezentatywności próby. Rzeczywiście, trudno jest na przykład ocenić niejednorodność populacji komórek, mierząc tylko kilka komórek, nawet jeśli na tych kilku komórkach zarejestrowano setki pomiarów. Jednak to właśnie w oparciu o ten paradygmat poczyniono znaczne postępy w biofizyce, mikrobiologii i nanomedycynie1,2,3. Rzeczywiście, analiza nanometryczna w skali pojedynczych komórek dostarczyła nowych informacji na temat nanomechaniki komórkowej, organizacji białek transbłonowych lub mechanizmu działania leków przeciwbakteryjnych lub przeciwnowotworowych4,5,6,7. Ostatnio jednak pojawiło się kilka wysokoprzepustowych testów biomechanicznych przeprowadzonych na komórkach8, co świadczy o zainteresowaniu społeczności naukowej zmianą tego paradygmatu i uzyskaniem dostępu do heterogeniczności populacji komórek. Wszystkie te testy opierają się na układach mikroprzepływowych do deformacji komórek i optycznego pomiaru ich deformacji pod wpływem naprężeń, aby uzyskać pośrednią miarę ich ogólnej elastyczności powierzchni8. Jednak ważną kwestią związaną z tymi metodami jest to, że są one monoparametryczne: można badać tylko elastyczność komórek. Co więcej, nie pozwalają one na pomiar parametrów mechanicznych przylegających komórek, co może być ograniczające dla badań na przykład niekrążących komórek ssaków lub biofilmów.

Podejścia wykorzystujące AFM zostały opracowane przez zespoły S. Scheuring9 i M. Favre10. Scheuring i wsp. unieruchomili komórki na wzorcach fibronektyny9, zmuszając poszczególne komórki do przyjęcia kształtu wzorca9. Następnie zespół zmapował właściwości mechaniczne kilku komórek, aby zdefiniować średnie dane, reprezentatywne dla 14 do 18 komórek. Prace rozwojowe przeprowadzone przez Farve i wsp. miały na celu multipleksowanie pomiarów poprzez równoległość wsporników AFM10. O ile nam wiadomo, te prace w kierunku multipleksowania nie doprowadziły do pomiarów na żywych komórkach.

Interesujące podejście zaproponowane przez zespół Dujardina przedstawia zautomatyzowany AFM zdolny do identyfikacji komórek i obrazowania ich na dnie specjalnie wykonanych studni. Chociaż metoda ta nie pozwala na analizę dużej populacji komórek, pozwala na automatyczne testowanie różnych warunków w każdej studni11.

Nasz cel w tej pracy jest bardziej ambitny, ponieważ chcieliśmy zmierzyć co najmniej 1000 komórek, aby uzyskać dostęp nie do przeciętnej komórki, ale wręcz przeciwnie, do niejednorodności między komórkami. Opracowana przez nas strategia dostępu do niejednorodności populacji komórek za pomocą AFM opiera się na analizie setek komórek, na których zarejestrowana jest ograniczona liczba krzywych sił. W porównaniu z "klasycznym" podejściem polegającym na rejestrowaniu dużej liczby krzywych siły na ograniczonej liczbie komórek, podejście to należy uznać za uzupełniające, ponieważ nie dostarcza tych samych informacji. Rzeczywiście, podczas gdy typowa metoda pozwala na badanie niejednorodności powierzchni poszczególnych komórek, przy użyciu naszego podejścia jesteśmy w stanie uzyskać dostęp do niejednorodności całej populacji komórek. Aby osiągnąć ten cel, połączyliśmy metodę, która bezpośrednio unieruchamia drobnoustroje (w tym przypadku gatunek drożdży Candida albicans) do studzienek mikrostrukturalnego PDMS stamp12 i opracowujemy oryginalny program do automatycznego przesuwania końcówki AFM z komórki do komórki13 i pomiaru właściwości mechanicznych każdej komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórek drobnoustrojów

  1. Ożyw komórki z zapasu glicerolu.
    UWAGA: C. albicans są przechowywane w temperaturze -80 °C w zapasach glicerolu, na marmurach.
    1. Wybierz kulkę z bulionu o temperaturze -80 °C i wetrzyj ją w agar z dekstrozą peptonową (YPD) drożdżową. Hodować komórki przez 2 dni w temperaturze 30 °C, przed hodowlą płynną.
  2. Przygotuj płynne kultury.
    1. Napełnij probówkę hodowlaną 5 ml sterylnego bulionu YPD i dodaj pojedynczą kolonię komórek C. albicans, wyhodowanych na płytce agarowej YPD.
    2. Hodować kulturę w warunkach statycznych w temperaturze 30 °C przez 20 godzin przed zbiorem przez odwirowanie (4000 x g, 5 min). Usunąć sklarowany osad i wyeliminować go jako odpad stanowiący zagrożenie biologiczne.
    3. Przemyć granulki 2x 10 ml buforu octanowego (8 mM octanu sodu, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 5,2). Odwirować (4000 x g, 5 min) pomiędzy płukaniami.
    4. Zawiesić osad w 2 ml buforu octanowego i użyć tego roztworu do immobilizacji komórek na stemplu PDMS.
      UWAGA: Zawiesina ta nie może być przechowywana i powinna być przygotowana w stanie świeżym zgodnie z punktem 3.

2. Przygotowanie pieczęci PDMS

  1. Przygotowanie formy silikonowej
    1. Narysuj żądane mikrostruktury za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD).
      UWAGA: Zaprojektowane studnie powinny mieć podobną wielkość do mikrobów do pułapki. Projekt powinien przewidywać dużą matrycę studni 100 x 100 na liście. Najlepiej jest wykonać kilka tablic o nieco różnych rozmiarach wokół średniej wielkości drobnoustroju.
    2. Jeśli pomieszczenie czyste jest dostępne, wykonaj kroki od 2 do 12 z wcześniej opublikowanego protocol12. W przeciwnym razie silikonową formę wzorcową można nabyć z komercyjnych pomieszczeń czystych.
  2. Formowanie stempla PDMS
    1. Przygotować 55 g roztworu prepolimeru PDMS zawierającego mieszaninę oligomerów PDMS i utwardzacza w stosunku masowym 10 do 1 (tabela materiałów).
    2. Wymieszaj i odgazuj ten roztwór w próżni (w zakresie 10-1-10-2 barów), aż wszystkie uwięzione pęcherzyki zostaną usunięte z roztworu PDMS (5-10 min).
    3. Wlać 20 g odgazowanego roztworu na formę silikonową i ponownie odgazować (w zakresie 10-1-10-2 barów).
      UWAGA: Grubość stempla powinna wynosić około 2−3 mm.
    4. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków należy siatkować PDMS w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę.
    5. Wytnij stempel mikrostrukturalny PDMS skalpelem (0,5 x 1,5 cm2) w kierunku równoległym do widocznych układów mikrostruktury.
    6. Oderwij stempel od silikonowej formy wzorcowej.
    7. Zwróć stempel, aby pokazać mikrostruktury na jego górnej stronie i umieść go na szkiełku podstawowym. Upewnij się, że mikrostruktury są skierowane do góry, z dala od szkiełka. Wyrównaj mikrostruktury widoczne na stemplu z bokiem szkiełka podstawowego, które później posłuży jako odniesienie dla procedury automatyzacji AFM.
      UWAGA: Na tym etapie stempel PDMS jest gotowy do unieruchomienia komórki. Stemple PDMS mogą być przechowywane na silikonowej formie wzorcowej przez kilka miesięcy. Gdy cały PDMS zostanie usunięty z formy wzorcowej, nowy stempel PDMS może zostać ponownie odlany na formę wzorcową (aby zapewnić bezpieczeństwo formy wzorcowej, można ją powielić w poliuretanie)14.

3. Przygotowanie próbki

  1. Unieruchomienie komórek
    1. Odwirować (500 x g, 5 min) 600 μl zawieszonego roztworu komórkowego w celu oddzielenia buforu od komórek.
    2. Odpipetować 200 μl supernatantu z kroku 3.1.1 na stempel PDMS i odgazować pod próżnią (w zakresie 10-1-10-2 barów) przez około 40 minut.
      UWAGA: Ten krok jest ważny, aby poprawić unieruchomienie komórek wewnątrz studzienek. Cząsteczki ze ściany komórkowej drożdży, obecne w supernatancie, są prawdopodobnie osadzane na powierzchni PDMS podczas tego etapu wstępnego zwilżania. Cząsteczki te najprawdopodobniej zwiększają adhezję komórek i przyczyniają się do wzrostu szybkości wypełniania stempla.
    3. Po 40 minutach za pomocą pipety usunąć bufor z powierzchni PDMS i nałożyć pipetą 200 μl roztworu komórkowego z kroku 1.2.4 na 15 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umieść komórki w mikrostrukturach stempla przez montaż konwekcyjny/kapilarny. W tym celu należy ręcznie rozprowadzić 200 μl zawiesiny komórek na stemplu za pomocą szkiełka w obu kierunkach pod kątem od 30 do 50°. Może być konieczne kilkakrotne przełożenie szkiełka na stemplu, aby uzyskać wysoki współczynnik napełniania.
      UWAGA: Pełny opis tej metody jest dostępny13.
    5. Usunąć zawiesinę komórek za pomocą pipety. Umyj stempel 3x 1 ml buforu octanowego o pH 5,2, aby usunąć komórki, które nie zostały uwięzione.
    6. Wysuszyć tylną część stempla za pomocą przepływu azotu, aby upewnić się, że stempel przylega do suchej szalki Petriego.
    7. Na koniec umieścić stempel PDMS wypełniony komórkami na szalce Petriego (Tabela Materiałów) i napełnić go 2 ml buforu octanowego w celu utrzymania komórek w płynnym podłożu.
  2. Ustawianie stempla na stoliku AFM
    1. Wyśrodkuj scenę przy 0:0 podczas rozpoczynania operacji AFM.
    2. Skalibruj czułość i stałą sprężystości wspornika na szkle i w wodzie, jak opisano w Unsay et al.15
    3. Weź szalkę Petriego ze stemplem i umieść ją w uchwycie szalki Petriego AFM.
    4. Wyrównaj krawędź stempla prostopadle do osi Y uchwytu szalki Petriego.
      UWAGA: Dopuszczalny kąt nachylenia wynosi poniżej 5°, jak pokazano na rysunku Rysunek 1.
    5. Umieść głowicę AFM na stage i uważaj, aby silniki krokowe były wystarczająco wysunięte, aby uniknąć rozbicia końcówki o stempel.

4. Uruchamianie programu AFM

UWAGA: Program AFM jest dostarczany jako Materiał Uzupełniający (AutomatipSoftware2019.pdf). Wymaga JPK-Bruker AFM Nanowizard II lub III wyposażonego w zmotoryzowany stolik i oprogramowanie komputerowe JPK w wersji 4.3. Program został opracowany pod Jython (wersja oparta na pythonie 2.7)

  1. Akwizycja danych
    1. Wyśrodkuj końcówkę AFM w lewym rogu dołków 4.5 x 4.5 μm2 (odpowiadających rozmiarowi komórki) za pomocą mikroskopu optycznego AFM. Jeśli potrzebny jest inny rozmiar studzienki, wyśrodkuj w lewym górnym rogu żądanych studzienek.
    2. Wykonaj mapę sił 64 x 64 (zakres Z = 4 μm, prędkość końcówki = 90 μm·s-1, przyłożona siła 3 do 5 nN) na obszarze 100 x 100 μm². Wybierz tryb mapowania siły z listy rozwijanej Tryb pomiaru. W panelu mapowania sterowania siłą wprowadź następujące parametry: Rel. Wartość zadana = 3 do 5 nN; Długość z 4 μm; Ruch Z: stały czas trwania; wydłużenie czasu: 0,01 s; opóźnienie zewnętrzne:0; Opóźnienie wycofania: 0, Tryb opóźnienia: Stała siła, Częstotliwość próbkowania 2048 Hz; Z odznacz zamkniętą pętlę; Siatka: sprawdź Kwadratowy obraz, Szybki 100 μm, Wolny: 100 μm, Przesunięcie X: 0 μm; Przesunięcie Y: 0 μm; kąt siatki: 0 stopni; Piksele: 64x64; Proporcje pikseli: 1:1
      UWAGA: Typowy wynik jest pokazany w Rysunek 2. Ten obraz pomoże zmierzyć i zweryfikować skok między dwiema studniami.
    3. Zwróć uwagę na współrzędne środka lewego górnego dołka (W1) i lewego dolnego dołka (określanego jako W2 na Rysunek 2). Aby to zrobić, zrób kwadratowe pudełko wokół studni. Współrzędna środka pola pojawia się w lewym panelu oprogramowania AFM w polach współrzędnych x,y.
    4. Aby otworzyć oprogramowanie do automatyzacji (Automatip_scan.py): w programie komputerowym JPK kliknij na Zaawansowane w menu na górnym pasku i wybierz Otwórz skrypt. W oknie, które zostanie otwarte, wybierz ścieżkę do pliku skryptu podanego w sekcji Dane uzupełniające (Automatip_scan.py).
    5. Zaimplementuj wartości współrzędnych W1 i W2 w sekcji Inputs (Wejścia) skryptu Jython (Rysunek 3). Wprowadź współrzędne W1 w wierszu zmiennej P1 239 skryptu, a współrzędne W2 w wierszu zmiennej P2 241.
      UWAGA: Studzienki wybrane jako współrzędne początkowe (W1 i W2) nie powinny znajdować się zbyt blisko krawędzi obszaru skanowania. W przeciwnym razie algorytm centrowania nie zostanie wykonany poprawnie, ponieważ musi zmierzyć wysokość na powierzchni PDMS po każdej stronie studni. Aby zapoznać się z przykładem, zobacz Rysunek 4.
    6. Przypisz wartość wysokości dźwięku do wiersza 245 zmiennej wysokości dźwięku w skrypcie.
    7. Wprowadź wymiar studni w wierszu zmiennej Ws 248. Jest to znane z projektu wzorów studni i można je sprawdzić na tym samym obrazie, który został użyty do weryfikacji wysokości dźwięku (Rysunek 2).
    8. Wpisz ścieżkę do katalogu zapisu w wierszu 251, aby zapisać dane w żądanym miejscu.
    9. Ustaw zmienną totalArea w wierszu 254 na żądaną wielokrotność "n" równą 100 μm (jest to maksymalny obszar skanowania używanego AFM). Całkowitą liczbę studzienek, które zostaną zbadane, można obliczyć przy użyciu tej wartości i skoku: maksymalny obszar skanowania/skok*n2,
      UWAGA: W przykładzie Rysunek 3, analizowanych będzie 9 obszarów o wymiarach 100 x 100μm2.
    10. Ustawić macierz, wiersz i kolumnę krzywych siły (3, 3 lub 4, 4), rejestrowane dla każdego dołka w wierszu zmiennej numScans 257.
      UWAGA: W przykładzie na rysunku 3 dla każdej studzienki zostanie zarejestrowana matryca 3 x 3 = 9 FC.
    11. Uruchom program. Kliknij przycisk Start.
      UWAGA: Program najpierw automatycznie wykonuje algorytm centrowania, aby lepiej określić środek studni W1 i W2 (krok 1). Następnie automatycznie pobiera matrycę krzywych siły (FCs) na każdym dołku pierwszego obszaru skanowania (krok 2). Gdy wszystkie studzienki w tym obszarze zostaną zbadane, skrypt automatycznie przesuwa końcówkę AFM do pierwszego dołka następnego obszaru skanowania. Końcówka jest chowana, stolik mikroskopu przesuwa się do następnego obszaru, końcówka jest ponownie zbliżana do stempla i algorytm centrowania jest ponownie wykonywany, aby automatycznie ponownie wyśrodkować się na pierwszym dołku (1') tego obszaru (krok 3). Pierwszy obszar jest definiowany przez użytkownika, drugi znajduje się po prawej stronie itd., aż do osiągnięcia n. Obszar n+1 znajduje się pod n, n+2 na lewo od n+1 itd., aż do osiągnięcia 2n. 2n+1 znajduje się pod 2n, a 2n+2 jest po prawej stronie na 2n itd. Globalnie końcówka wije się serpentynami przez całą powierzchnię. Kroki 2 i 3 są powtarzane automatycznie, aż do zmierzenia całkowitej liczby "n2" skanowanych obszarów. Rysunek 5 przedstawia schemat blokowy programu. Ukończenie programu zajmuje ~4 godziny.
  2. analiza danych
    1. Wykonaj skrypt Pythona "Kopiuj pliki" (Copy_files_L.py, podany w danych uzupełniających), aby uporządkować pliki FC w jednym folderze. Ten skrypt został opracowany przy użyciu Pythona 2.7 i modułu SciPy. Użyj oprogramowania Visual Studio Code, aby otworzyć skrypt języka Python. Wprowadź ścieżkę do folderu general (wiersz 67 skryptu podany w danych uzupełniających) i miejsca, w którym będzie on przechowywany (wiersz 73).
    2. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania danych producenta AFM, aby przeanalizować krzywe siły. W górnym menu Plik wybierz otwartą partię krzywych spektroskopowych.
    3. W oknie przetwarzania wsadowego wybierz proces podany w Dane uzupełniające (StiffnessProcess.jpk-proc-force). Wybierz ostatni krok procesu i kliknij Zachowaj i Zastosuj do wszystkich. Wszystkie krzywe siły będą traktowane w ten sam sposób.
      UWAGA: Proces wykorzystuje kalibrację z plików FCs do przekształcenia krzywych ugięcia na krzywe siły skalibrowane w niutonach; stosowany jest algorytm wygładzania danych (średnia z 3 kolejnych punktów); linia bazowa jest przekształcana tak, aby spoczywała na osi zerowej; punkt kontaktowy ekstrapoluje się, a punkt kontaktowy przesuwa się w celu umieszczenia punktu kontaktowego na współrzędnych (0,0); zginanie wspornika jest odejmowane do FCs, dopasowane jest nachylenie cofania. Na końcu przetwarzania danych oprogramowanie generuje plik, który zawiera tabelę podającą dla każdego FC: jego nazwę, moduł Younga, punkt kontaktu, siłę przyczepności, nachylenia itp.
    4. Powtórz kroki od 4.2.1 do 4.2.3 dla wszystkich eksperymentów. Zachowaj ostrożność, aby zapisać dane w różnych folderach (np.: "...\TREATED\" i "...\UNTREATED\")
    5. Użyj skryptu języka R dostępnego w danych uzupełniających, aby wykreślić histogramy i wykresy pudełkowe oraz wykonać zabiegi statystyczne ANOVA.
      1. Aby otworzyć skrypt języka R (DataAnalisys.R), użyj oprogramowania R studio i załaduj pliki zawierające informacje wyodrębnione za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych (tsv).
      2. W oknie środowiska użyj przycisku Importuj zestaw danych, z wyświetlonej listy wybierz z tekstu (readr) i w nowym oknie wybierz przycisk Przeglądarka i znajdź plik tsv.
      3. Po załadowaniu pliku wybierz kolumny (sztywność i przyczepność), które mają zostać uwzględnione w analizie. Aby uruchomić cały kod, naciśnij Ctrl+Alt+R.
        UWAGA: Skrypt działa z 4 zestawami danych, rozważ dwa eksperymenty, zarówno z komórkami nieleczonymi, jak i leczonymi. Możliwe jest wykonanie bloków skryptu i zobaczenie, jak zmienne zmieniają się w zależności od wykonywanych funkcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy opisanego protokołu do analizy wpływu kaspofunginy na właściwości biofizyczne oportunistycznego ludzkiego patogenu C. albicans w jego drożdżowej formie. Kaspofungina jest cząsteczką przeciwgrzybiczą ostatniej szansy stosowaną, gdy inne leki są nieskuteczne ze względu na mechanizmy oporności komórek na leki przeciwgrzybicze. Jego mechanizm działania opiera się na hamowaniu podjednostki Fks2 kompleksu fks1/Fks2 odpowiedzialnej za syntezę ß glukanu. Ponieważ ß glukany są głównym składnikiem ściany komórkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Główną poprawą zapewnioną przez tę metodologię jest znaczny wzrost liczby mierzonych komórek w określonym czasie. Odpowiednikiem jest zmniejszenie liczby punktów mierzonych na komórkę. Oznacza to, że ta metoda nie jest przeznaczona do zapewnienia szczegółowej analizy pojedynczej komórki. Metoda ma zastosowanie tylko do komórek, które mogą zmieścić się w studzienkach stempla PDMS. Stempel jest dość wszechstronny, a jednocześnie zawiera studzienki o wymiarach od 1,5 x 1,5 μm2 do 6 x 6 μm2. Nadal nie j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pragniemy podziękować FONCYCYT z CONACYT (Meksyk), ministerstwu spraw zagranicznych Francji i Université Paris 13, poprzez wsparcie finansowe międzynarodowego projektu ECOS-NORD o nazwie Nano-palpation for diagnosis, No. 263337 (Meksyk) i MI5P02 (Francja). AMR dziękuje za wsparcie finansowe SIP-IPN w ramach projektu nr 20195489. SPC jest wspierany przez stypendium doktoranckie CONACYT (nr 288029) oraz IPN na podstawie umowy cotutelle o uzyskanie podwójnego dyplomu doktora (IPN-UPS). ED i CFD są naukowcami w Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wspornik AFMSondy AFM Bruker MLCTZastosowane wsporniki były oznaczone " C” o częstotliwości rezonansowej od 7 do 10 kHz i k: 0,01 N/m
Analiza danych AFMJPK-BrukerJPK Wersja przetwarzania danych minimum 5.1.8Można pobrać z konta użytkownika JPK-Bruker
AFM szalki PetriegoWPIFluoroDish FD35-100Grzałka służyła do monitorowania zmian temperatury podczas eksperymentu
Mikroskop sił atomowych (AFM)JPK-BrukerNanowizard II lub IIIAFM powinien być zamontowany na odwróconym mikroskopie optycznym z zmotoryzowanym stolikiem
KaspofunginaSigma-AldrichSML0425-5MGZastosowano kaspofunginę o stężeniu 4 MIC (minimalne stężenie inhibitora)
Edytor koduMicrosoftVisual Studio Code wersja 1.40.1https://code.visualstudio.com/
CryobeadsIFUCB12
Desykator / Odgazowywanie komoraFisherbrand15594635Sprzęt służy do odgazowywania stempli PDMS przez około 50 minut, wystarczy każdy eksykator sprzężony z pompą próżniową.
Podgrzewacz do szalek PetriegoJPK-BrukerPetriDishHeaterJest to dodatek do JPK/Bruker AFM. Grzałka służyła do monitorowania zmian temperatury podczas eksperymentu
Bufor octanu sodu pH 5,2Sigma-AldrichS7899Roztwór zawiera 18 mM octanu sodu, 1 mM CaCl2 i 1 mM MnCl2. Dostosuj pH za pomocą lodowatego kwasu octowego. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez 2 miesiące
Język analizy statystycznejhttps://www.r-project.orgR wersja 3.6.1R to język i środowisko do obliczeń statystycznych i grafiki. Jest to projekt GNU, który jest podobny do języka i środowiska S
Oprogramowanie do analizy statystycznejhttps://rstudio.comR studio w wersji 1.1.463współpraca między R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP i innymi. RStudio i Shiny są projektami afiliowanymi Fundacji Statystyki Otwartego Dostępu
Sylgard 184Sigma-Aldrich761028Polidimetylosiloksan (PDMS) i utwardzacz w jednym zestawie
Drożdże Pepton D RosółDifco242820
YPD AgarDifcoDF0427-17-6

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  2. Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
  3. Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
  4. Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
  5. Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
  6. Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
  7. Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
  8. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  9. Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
  10. Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
  11. Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853(2019).
  12. Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
  13. Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
  14. Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
  15. Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867(2015).
  16. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  17. Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
  18. El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
  19. Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikroskopia si atomowychautomatyzacja Bio AFMrejestracja krzywych siprzygotowanie stempla z PDMSanaliza populacji kom rekpomiar sztywno citraktowanie kaspofungintryb mapowania sioprogramowanie do przetwarzania danych

Powiązane artykuły