Kurtyny DNA rzucają światło na złożone układy molekularne podczas rekombinacji homologicznej

Podsumowanie

Zasłony DNA prezentują nowatorską metodę wizualizacji setek, a nawet tysięcy białek wiążących DNA w czasie rzeczywistym, gdy oddziałują one z cząsteczkami DNA ustawionymi na powierzchni mikroprzepływowej komory próbnej.

Streszczenie

Rekombinacja homologiczna (HR) jest ważna dla naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) i zatrzymanych widełek replikacyjnych we wszystkich organizmach. Defekty HR są ściśle związane z utratą integralności genomu i transformacją onkogenną w komórkach ludzkich. HR obejmuje skoordynowane działania złożonego zestawu białek, z których wiele pozostaje słabo poznanych. Kluczowym aspektem opisywanych tu badań jest technologia zwana "kurtynami DNA", technika, która pozwala na składanie wyrównanych cząsteczek DNA na powierzchni mikroprzepływowej komory na próbki. Następnie można je uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM). Kurtyny DNA zostały zapoczątkowane przez nasze laboratorium i umożliwiają bezpośredni dostęp do informacji czasoprzestrzennych w milisekundowych skalach czasowych i rozdzielczości w skali nanometrowej, których nie można łatwo ujawnić za pomocą innych metodologii. Główną zaletą kurtyn DNA jest to, że upraszczają zbieranie statystycznie istotnych danych z eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach. Badania te dostarczają nowych informacji na temat tego, w jaki sposób komórki regulują i zachowują integralność genomu.

Wprowadzenie

Utrzymanie integralności genomu jest kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania wszystkich żywych komórek¹. Defekty integralności genomu mogą prowadzić do poważnych schorzeń, w tym różnych rodzajów raka i chorób zwyrodnieniowych związanych z wiekiem². Rekombinacja homologiczna (HR) wykorzystuje syntezę DNA zależną od matrycy do naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (DSB), luk w jednoniciowym DNA (ssDNA) i międzyniciowych wiązań krzyżowych DNA³. HR jest również niezbędny do odzyskiwania zablokowanych i zwiniętych widełek replikacji^3,4. Co więcej, HR jest niezbędny do dokładnej segregacji chromosomów podczas mejozy^5,6.

HR obejmuje skoordynowane działania złożonego zestawu białek, z których wiele pozostaje słabo poznanych¹. Przykłady obejmują między innymi białko replikacyjne A (RPA), Rad51 i Rad54⁷. Reakcje HR zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych obejmują produkt pośredni ssDNA, który jest szybko pokryty białkami wiążącymi ssDNA (SSB u prokariontów i RPA u eukariontów)⁸. Białka te chronią ssDNA przed nukleazami, eliminują strukturę drugorzędową i promują rekrutację czynników następczych^8,9. Rad51 należy do wysoce konserwatywnej, zależnej od ATP rodziny rekombinaz DNA Rad51/RecA, które są obecne we wszystkich organizmach żywych¹. Rad51 sprzyja inwazji nici DNA homologicznego dawcy dsDNA. Biorąc pod uwagę jego znaczenie, Rad51 jest wysoce regulowany, a defekty w tych procesach regulacyjnych są często związane z utratą integralności genomu i transformacją onkogenną⁷. Rad54 należy do rodziny translokazów dsDNA i remodelerów chromatyny Swi2/Snf2^10,11. Białka te służą jako niezbędne czynniki regulacyjne Rad51. Co ważne, Rad54 usuwa Rad51 z produktu dsDNA inwazji nici i jest również niezbędny, aby zapobiec niewłaściwej akumulacji Rad51 na chromatynie¹¹. Aktywność molekularna białek zaangażowanych w HR, zarówno w komórkach drożdży, jak i bakterii, rzuciła światło na ich funkcję w HR, ale dokładny sposób, w jaki ich aktywność przyczynia się do HR, pozostaje słabo poznany ¹².

Zasłony DNA stały się unikalną platformą zapewniającą bezpośredni dostęp do mechanizmów molekularnych i dynamiki makromolekularnej, które w przeciwnym razie pozostałyby niedostępne^13,14. Aby przygotować kurtyny DNA, powierzchnia komory mikroprzepływowej jest pokryta dwuwarstwą lipidową, a cząsteczki DNA są połączone z dwuwarstwą za pomocą połączenia biotyna-streptawidyna. Dwuwarstwa sprawia, że powierzchnia jest obojętna, naśladując naturalne błony komórkowe. Siła hydrodynamiczna wyrównuje DNA wzdłuż nanowytwarzanych barier, umożliwiając wizualizację setek cząsteczek w jednym polu widzenia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM). Bariery są wytwarzane metodą litografii wiązką elektronów, a różnice w konstrukcji bariery pozwalają na precyzyjną kontrolę nad dystrybucją i geometrią wiązania DNA. Podejścia te można łatwo zastosować zarówno z ssDNA, jak i dsDNA^{13,14,15,16,17,18}. Cokoły mogą być również nanowytwarzane (wraz z barierami), aby umożliwić przywiązanie obu końców DNA do powierzchni komory próbki, tak aby można było przeprowadzać eksperymenty w stanie ustalonym przy braku przepływu buforowego.

Zależne od czasu zmiany w poszczególnych kompleksach białkowo-nukleinowych są ujawniane przez inspekcję filmów w czasie rzeczywistym i są reprezentowane w druku za pomocą kymogramów, które prezentują zmieniające się położenie białek na DNA w czasie. Ważnym aspektem podejścia opartego na kurtynach DNA jest to, że niekoniecznie wymaga ono modeli a priori lub założeń dotyczących mechanizmów molekularnych, ponieważ zachowanie poszczególnych składników reakcji można obserwować w czasie rzeczywistym. Pozwala to na bezpośrednią obserwację zachowań molekularnych. W niniejszym protokole opisano, w jaki sposób przygotować kurtyny DNA z substratami dsDNA, a także jego zastosowanie do badania produktów pośrednich w rekombinacji homologicznej.

Protokół

1. Przygotowanie zapasu lipidów

1. Rozpuścić 1 g 18:1 (Δ9-Cis) PC, 100 mg 18:1 PEG2000 PE i 5 mg 18:1 biotynylowej czapy PE w 10 ml chloroformu.
   UWAGA: Zarówno DOPC, jak i DPPE są dobrze scharakteryzowane i (wraz z modyfikacją PEG) wybrane ze względu na ich zdolność do minimalizowania niespecyficznej adsorpcji na powierzchni komory przepływowej. Rozpuszczoną główną mieszaninę lipidów można porcjować i przechowywać w temperaturze -20 °C do 12 miesięcy.
2. Użyć chloroformu do oczyszczenia szklanej strzykawki z rozpuszczalnikiem organicznym, a następnie przenieść 200 μl (10% końcowej pożądanej objętości) głównej mieszanki lipidów do szklanej fiolki.
3. Odparować chloroform ze szklanej fiolki za pomocą bardzo delikatnego strumienia sprężonego azotu. Nieznacznie zwiększyć ciśnienie pod koniec parowania, aby upewnić się, że wszystkie ślady chloroformu zostały usunięte.
   UWAGA: Podczas procesu parowania należy przechylić i obrócić fiolkę tak, aby lipidy wyschły jako jednolita warstwa białego filmu na ściance.
4. Umieścić fiolkę bez korka pod próżnią na noc.
5. Dodać 2 ml buforu lipidowego (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 100 mM NaCl) do wysuszonego filmu lipidowego i zakryć fiolkę. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 1 godzinę i wirować aż do rozpuszczenia.
6. Przenieść roztwór do probówki okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 5 ml i poddać sonikacji na lodzie za pomocą mikrokońcówki o następujących parametrach: amplituda = 50, czas procesu = 1,5 min, puls = 15 s, czas wyłączenia = 2 min. Roztwór będzie klarowny po sonikacji (energia całkowita = 1,500-2,000 J).
7. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy PVDF 0,22 μm i przechowywać zapas lipidów w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.

2. Przygotowanie substratu dsDNA

1. Podgrzać materiał λ-DNA (500 μg/ml) do temperatury 65 °C.
2. Przygotować mieszaninę do wyżarzania/ligacji zawierającą: 1,6 pM λ-DNA, 100x molowy nadmiar (160 pM) każdego oligonukleotydu (BioL: 5'Phos-AGG TCG CCG CCC-3Bio i DigR: 5'Phos-GGG CGG CGA CCT-3Dig_N) oraz 60 μL 10x buforu reakcyjnego ligazy T4 (w całkowitej objętości 600 μL).
   UWAGA: Oligonukleotydy BioL i DigR są odpowiednio biotynylowane (Bio) i modyfikowane digoksygeniną (Dig). Biotynylacja umożliwia przyłączanie cząsteczek DNA do biotynylowanych lipidów poprzez wiązania streptawidyny. Modyfikacja Dig umożliwia podwójne wiązanie poprzez wiązanie przeciwciał anty-Dig, które są pokryte na cokołach z ugrupowaniami Dig.
3. Wyżarzać oligonukleotydy do ko-końców λ-DNA przez inkubację reakcji w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie pozostawić do powolnego ostygnięcia do temperatury słonecznej.
4. Dodać 5 μl ligazy DNA T4 i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc.
   UWAGA: Etapy wyżarzania i podwiązywania można również przeprowadzać w termocyklerze.
5. Wytrącić λ-DNA przez dodanie 300 μL roztworu PEG-8000 (30% w/v PEG-8000 i 10 mM MgCl₂). Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę.
6. Wirować przy 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu. Opcjonalnie umyj pellet 1x 500 μL schłodzonego 70% etanolu.
7. Zawiesić osad w 40 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA [pH 8,0]).

3. Nanowytwarzanie wzorów chromu

1. Wywierć dwa otwory w środku szkiełka mikroskopowego kwarcowego o wymiarach 1" x 3" (~ 3 cm od siebie) za pomocą wiertła 1.4 mm pokrytego diamentem na wiertarce stołowej (patrz Rysunek 1 dla geometrii pozycji wiercenia).
2. Wyczyść wywiercone szkiełka, zanurzając je w 200 ml roztworu Piranha (75% kwasu siarkowego [97%] i 25% nadtlenku wodoru). Inkubować przez 30 min.
   UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć wszelkiego kontaktu z odsłoniętą skórą. Przygotować roztwór, bardzo powoli mieszając zimny nadtlenek wodoru z kwasem siarkowym. Odpady piranii należy odpowiednio zutylizować w przeznaczonym do tego pojemniku na odpady.
3. Wypłucz szkiełka, zanurzając je w 200 ml podwójnie destylowanej wody. Powtórz 2x, aby wyeliminować resztki Piranii. Osuszyć szkiełka delikatnym strumieniem sprężonego azotu.
4. Za pomocą powlekarki wirowej (4 000 obr./min przez 45 s, prędkość narastania 300 obr./min/s), pokryj czyste szkiełka fotorezystem i przewodzącym polimerem w następujący sposób:
   1. Szkiełka pokryte warstwą 3% (w/v) polimetakrylanu metylu (PMMA; 24,3 tys. MW; rozpuszczony w anizolu).
   2. Szkiełka pokryte warstwą 1,5% (w/v) polimetakrylanu metylu (PMMA; 495K MW; rozpuszczony w anizolu).
   3. Szkiełka powleczone warstwą środka antystatycznego do litografii wiązką elektronów.
5. Pisz niestandardowe wzory barier i cokołów na powlekanych szkiełkach za pomocą litografii wiązką elektronów za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w oprogramowanie systemu generowania nanowzorów.
6. Rozwinąć szkiełka, najpierw spłukując środek antystatyczny do litografii wiązką elektronów wodą podwójnie destylowaną. Następnie umieścić je w probówkach o pojemności 50 ml zawierających roztwór do wywoływania (75% ketonu metylowo-izobutylowego [MIBK] i 25% izopropanolu; przechowywać w stanie schłodzonym w temperaturze -20 °C) i poddać sonikacji w łaźni lodowej na małej mocy przez 1 minutę.
7. Spłucz rozwijający się roztwór izopropanolem i osusz delikatnym strumieniem sprężonego azotu.
8. Za pomocą parownika wiązki elektronów nałóż warstwę chromu o grubości 250 A na wzorzystą powierzchnię z prędkością 0,5 A/s.
9. Usuń chrom i pozostały PMMA za pomocą acetonu z butelki do spryskiwania, a następnie poddaj szkiełka sonikacji w kąpieli acetonowej przez 10 minut. Ponownie umyj acetonem z butelki ze spryskiwaczem.
10. Aby zapobiec powstawaniu osadów z pozostałego acetonu, spłucz szkiełka alkoholem izopropylowym i osusz delikatnym strumieniem sprężonego azotu.

4. Montaż komory przepływowej

1. Umieść prostokątny szablon papierowy o wymiarach 35 mm x 5 mm (zakrywający chromowany wzór oraz wstępnie wywiercone otwory wlotowe/wylotowe) nad szkiełkiem kwarcowym, wzorzystą stroną skierowaną do góry ( Rysunek 1A).
2. Nałóż kawałek taśmy dwustronnej (o grubości 1 mm) na szkiełko kwarcowe, zakrywając szablon papierowy, a następnie użyj żyletki, aby wyciąć prostokątny szablon papieru ( Rysunek 1A).
3. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na taśmie dwustronnej i delikatnie dociśnij, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe do taśmy ( Rysunek 1A). Przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem, uszczelniona taśmą dwustronną, tworzy komorę mikroprzepływową.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby uszczelka między szkiełkiem nakrywkowym a suwakiem była wystarczająco bezpieczna, aby zapobiec wyciekom podczas eksperymentu.
4. Umieść szkiełko nakrywkowe pomiędzy szkiełkami szklanymi i przymocuj klipsy do segregatora ze wszystkich czterech stron, aby równomiernie rozłożyć nacisk. Umieść zespół w piecu próżniowym na 60 minut w temperaturze 135 °C, aby stopić taśmę dwustronną i uszczelnić komorę.
5. Wyjmij go z piekarnika, a następnie odczep spinki do segregatora i szkiełka podstawowe.
6. Przymocuj porty mikroprzepływowe do wstępnie wywierconych otworów wlotowych/wylotowych za pomocą gorącego pistoletu do klejenia, umieszczając sklejony zespół na bloku grzewczym (220 °C) na 1 minutę, zdejmując go i ostrożnie delikatnie dociskając, aby prawidłowo uszczelnić porty mikroprzepływowe. Poczekaj, aż klej całkowicie stwardnieje przed kontynuowaniem.
   UWAGA: Zmontowane komory przepływowe można umieścić w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w próżni.

5. Montaż kurtyny dsDNA

1. Podłącz rurkę wlotową/wylotową do portów mikroprzepływowych komory przepływowej i umyj komorę 20 ml podwójnie destylowanej wody za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 10 ml.
2. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej podwójnie destylowaną wodą podłączoną po obu stronach komory przepływowej, należy użyć siły, aby wepchnąć/wciągnąć wodę między strzykawki wlotowe i wylotowe. Ten krok usuwa wszystkie pęcherzyki powietrza z komory przepływowej.
3. Przemyć komorę 3 ml buforu lipidowego (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 100 mM NaCl).
   UWAGA: Upewnij się, że wszystkie połączenia z komórkami przepływowymi są wykonane od kropli do kropli, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do komory przepływowej.
4. Wymieszaj 40 μl roztworu liposomu z 1 ml buforu lipidowego. Wstrzyknąć 300 μl roztworu lipidowego do komory przepływowej i inkubować przez 5 minut. Powtórzyć wstrzykiwanie i inkubację 2x,
   UWAGA: Naprzemiennie stosować stronę wlotową/wylotową do wstrzykiwań za każdym razem, gdy strzykawka jest podłączona do kuwety przepływowej.
5. Przemyć komorę 3 ml buforu lipidowego i inkubować przez 15 min.
   UWAGA: Ten okres inkubacji może wynosić od 5 min do 2 h, w zależności od harmonogramu eksperymentów, bez zauważalnych różnic w końcowym montażu kurtyny.
6. Zmieszać 40 μl roztworu podstawowego anty-digoksygeniny o stężeniu 1 mg/ml z 200 μl buforu lipidowego. Wstrzyknąć 100 μl roztworu i inkubować przez 10 minut. Powtórzyć wstrzyknięcie i inkubację 1x przed przemyciem 3 ml buforu lipidowego.
   UWAGA: Ten krok jest potrzebny tylko w przypadku zasłon dsDNA z podwójnym uwięzią. Pomiń ten krok w przypadku zasłon dsDNA na uwięzi.
7. Przemyć komorę 3 ml buforu BSA (40 mM Tris-HCl [pH 8,0], 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT i 0,2 mg/ml BSA).
8. Zmieszać 10 μl 1 mg/ml roztworu podstawowego streptawidyny z 990 μl buforu BSA. Wstrzyknąć w dwóch oddzielnych wstrzyknięciach o objętości 400 μl w 10-minutowej inkubacji po każdym wstrzyknięciu.
9. Przemyć komorę 3 ml buforu BSA w celu usunięcia nadmiaru streptawidyny.
10. Rozcieńczyć 25 ng substratu dsDNA w 1 ml buforu BSA. Powoli wstrzykiwać roztwór DNA po 200 μl na raz, a następnie po każdym wstrzyknięciu wykonywać 5-minutową inkubację. Ilość potrzebnego DNA może być zoptymalizowana dla określonych typów eksperymentów.
11. Zamontuj komórkę przepływową na stoliku mikroskopu i w razie potrzeby wyreguluj ostrość.
12. Podłączyć porty wejściowe i wyjściowe do systemu wstrzykiwania próbki składającego się z pompy strzykawkowej i zaworu przełączającego wysokie ciśnienie.
13. Podwójnie przywiąż DNA do cokołów (długość uwięzi 12 μm) poprzez ciągłe płukanie komory buforem BSA o stężeniu 0,8 ml/min przez 5 min.
    UWAGA: Może być konieczne dostosowanie natężeń i czasów przepływu w celu optymalizacji dla różnych długości podwójnej linki. Ten krok jest potrzebny tylko w przypadku podwójnie uwiązanych zasłon DNA. Pomiń ten krok w przypadku zasłon dsDNA na uwięzi.
14. Zasłony są teraz gotowe do eksperymentów.

6. Recykling komórek przepływowych

1. Zanurz szkiełka w etanolu na co najmniej 30 minut, a następnie użyj żyletki, aby ostrożnie usunąć porty mikroprzepływowe i szkiełko nakrywkowe. Prawidłowo zutylizuj szkiełko nakrywkowe i usuń pozostały klej z portów mikroprzepływowych, aby można je było ponownie wykorzystać. Wyszoruj wszelkie pozostałości kleju na szkiełku.
   UWAGA: Uważaj, aby nie zarysować wzorzystego obszaru na środku slajdu.
2. Dokładnie spłucz szkiełka podwójnie destylowaną wodą i zanurz na noc w 2% alkalicznym płynnym koncentracie do czyszczenia kwarcu, mieszając.
3. Dokładnie spłukać szkiełka wodą podwójnie destylowaną i zanurzyć w 2% alkalicznym płynnym roztworze kwarcowego koncentratu czyszczącego na 1 godzinę z mieszaniem w temperaturze 80 °C, a następnie sonikować przez 15 minut w temperaturze 45 °C.
4. Dokładnie spłukać szkiełka wodą podwójnie destylowaną i zanurzyć w 1 M NaOH na 30-60 minut, mieszając.
5. Dokładnie spłukać szkiełka wodą podwójnie destylowaną, a następnie zanurzyć w alkoholu izopropylowym i poddać sonikacji na 15 minut w temperaturze 45 °C.
6. Dokładnie spłukać szkiełka alkoholem etylowym i zanurzyć w etanolu na 1 godzinę, mieszając.
7. Umieść szkiełka w piecu próżniowym na 1 godzinę do wyschnięcia w temperaturze 135 °C. Prowadnice są teraz gotowe do ponownego złożenia w komory przepływowe.

Wyniki

Powyżej opisano przygotowanie, montaż i obrazowanie pojedynczych i podwójnie uwiązanych kurtyn dsDNA w kontekście badania interakcji białko-DNA w produktach pośrednich naprawy DNA. Rysunek 1A pokazuje wszystkie komponenty w komórce przepływu, ułożone warstwowo w kolejności, w jakiej są złożone. Rysunek 1B przedstawia schemat pojedynczej lub podwójnej kurtyny DNA. Dwuwarstwa lipidowa służy do pasywacji powierzchni komory przepływowej. Kurtyna DNA składa się z równoległego układu cząsteczek DNA połączonych na jednym końcu z lipidem i ustawionych na barierze chromowej, zorientowanych prostopadle do kierunku przepływu. W przypadku podwójnie uwięzionych kurtyn DNA, drugi koniec DNA jest przywiązany do cokołu poprzez oddziaływania digoksygeniny i anty-digoksygeniny, tak że obrazowanie można przeprowadzić przy braku przepływu, podczas gdy DNA pozostaje wydłużone. dsDNA można barwić barwnikiem fluorescencyjnym YoYo1 i wizualizować za pomocą mikroskopii TIRF. Rysunek 2A pokazuje reprezentatywny obraz szerokokątny podwójnie uwiązanej kurtyny DNA barwionej YoYo1.

Serie zdjęć poklatkowych zebrane z eksperymentów z kurtyną DNA są zazwyczaj analizowane poprzez wygenerowanie najpierw kimografu, który przedstawia pozycję wzdłuż cząsteczki DNA na osi pionowej w stosunku do czasu na osi poziomej dla każdej cząsteczki DNA będącej przedmiotem zainteresowania w ImageJ. Rysunek 2B to reprezentatywne kimografy pokazujące resekcję pojedynczo uwiązanego λ-DNA (zielone) barwionego YoYo1 przez maszyny do resekcji drożdży GFP-Sgs1 (niewidoczne), Top3-Rmi1 i Dna2 w obecności jednoniciowego białka wiążącego DNA RPA-mCherry (magenta) i ATP. Sygnał YoYo1 jest tracony z czasem, gdy dsDNA jest wycinany z wolnego końca przez Sgs1-Dna2. Jednocześnie sygnał mCherry kolokalizuje się z końcami DNA, na których w wyniku resekcji powstaje ssDNA. Biofizycznie istotne cechy resekcji, takie jak prędkość i procesywność, można wyodrębnić, określając ilościowo nachylenia trajektorii utraty sygnału YoYo1. Rysunek 2C,D pokazuje rozkład prędkości i procesywności, odpowiednio, resekcji przez Sgs1-Dna2.

Rysunek 1: Schematy montażu komór przepływowych i kurtyn DNA. (A) Ilustracja krok po kroku montażu komór przepływowych. Taśma dwustronna jest umieszczana na górze szkiełka kwarcowego, a papierowy szablon służy do wycinania prostokątnego kanału od środka, który jest uszczelniony szkiełkiem nakrywkowym na górze, tworząc komorę. (B) Schematy w pełni zmontowanych kurtyn DNA. Środkowy panel przedstawia pojedynczą komórkę przepływu na uwięzi, podczas gdy dolny panel przedstawia podwójnie przewodną komórkę przepływową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wizualizacja i analiza kurtyny DNA pojedynczej cząsteczki. (A) Reprezentatywny obraz szerokokątny kurtyny λ-DNA na uwięzi zabarwionej YoYo1 (zielony). (B) Reprezentatywne kimografie przedstawiające resekcję dDNA barwionego YoYo1 (kolor zielony) w obecności wstępnie związanego GFP-Sgs1 (niewidocznego) podczas pościgu za Dna2, w obecności RPA-mCherry (magenta) i 2 mM ATP. Rozkład prędkości (C) i wykres procesywności (D) resekcji dsDNA przez Sgs1-Dna2, uzyskany przez ilościowe określenie szybkości i zakresu utraty sygnału YoYo1 w czasie. Panele (B), (C) i (D) są zaczerpnięte z Xue et al.¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Kurtyny DNA okazały się wszechstronną platformą do badania różnych procesów naprawy DNA 13,14,15,16. Cząsteczki DNA, które pozostają rozciągnięte blisko powierzchni przez cały czas trwania eksperymentu, poprzez ciągły przepływ bufora lub podwójne przywiązanie do cokołu, pozwalają na obrazowanie TIRFM interakcji białko-DNA na produktach pośrednich naprawy na poziomie pojedynczej cząsteczki. Metoda ta zapewnia poprawę przepustowości i przewidywalności eksperymentów, ponieważ setki cząsteczek DNA są uporządkowane na nanowytwarzanych barierach, a nie niespecyficznie przymocowane do powierzchni, co dodatkowo korzystnie wpływa na przetwarzanie dużych zbiorów danych.

Dokładna analiza powstałej serii zdjęć poklatkowych dostarcza ilościowych pomiarów interakcji białko-DNA (tj. czasu życia wiązania, pozycji, stechiometrii, kinetyki dysocjacji, szybkości translokacji, procesywności białek motorycznych oraz kolokalizacji i interakcji między białkami i/lub DNA). W porównaniu z innymi technikami obrazowania pojedynczych cząsteczek, które albo wiążą cząsteczki DNA bezpośrednio z powierzchnią, albo łączą obrazowanie konfokalne z manipulacją siłą w instrumentach komercyjnych, głównym kompromisem kurtyny DNA dla wyższej przepustowości jest ustanowienie technik niezbędnych do początkowej konfiguracji 13,14,15,16. Jednak po ustaleniu, możliwość jednoczesnego gromadzenia danych o setkach cząsteczek w jednej komórce przepływowej prowadzi do znacznych oszczędności czasu poświęcanego na gromadzenie danych.

Podobnie jak w przypadku wielu innych metod obrazowania pojedynczych cząsteczek, zdolność do przygotowania czystej powierzchni w dużej mierze decyduje o zdolności użytkownika do niezawodnego montażu zasłon DNA. W tym przypadku czyste powierzchnie wymagają nie tylko rozpoczęcia od czystego szkiełka, ale także upewnienia się, że podczas wykonywania któregokolwiek z połączeń płynnych nie wprowadzają do komory mikroskopijnych pęcherzyków powietrza. Po pierwsze, jeśli chodzi o czystość szkiełek, kroki opisane powyżej w sekcji 6 powinny wystarczyć jako rutynowy proces czyszczenia. Zaleca się również stosowanie przefiltrowanych roztworów i. Po drugie, wykonywanie połączeń typu drop-to-drop podczas podłączania komory przepływowej do systemu wtrysku bufora jest niezbędne, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków. Pomocne może być odgazowanie podwójnie destylowanej wody używanej do sporządzania. Zaleca się również uważną obserwację procesu wstrzykiwania, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli mikroskopijny pęcherzyk zostanie wprowadzony, zanim dotrze do środkowego obszaru wzoru, można temu zaradzić, wstrzykując bufor z portu mikroprzepływowego po przeciwnej stronie, aby wypchnąć pęcherzyk z powrotem.

Innym ważnym punktem do rozważenia we wszelkich eksperymentach opartych na fluorescencji jest zamiana sygnału na szum. Klucz do obserwacji pojedynczych białek fluorescencyjnych (tj. GFP) znajduje się również w czystych powierzchniach. Po dłuższym użytkowaniu agregaty białkowe zwykle gromadzą się na chromowanych barierkach i cokołach. Dlatego, jeśli przed dodaniem białek fluorescencyjnych zaobserwuje się silny sygnał fluorescencyjny na barierach, zaleca się traktowanie szkiełek 10-minutowym zanurzeniem w roztworze Piranha. Okres ten jest krótki, aby uniknąć erozji chromowanych elementów. Po myciu Piranha należy regularnie czyścić.

Nanowytwarzanie z wykorzystaniem litografii wiązką elektronów może być wyzwaniem ze względu na wymagania dotyczące sprzętu i obiektów, a także istniejącą wiedzę specjalistyczną w dziedzinie materiałoznawstwa. Jako alternatywę opracowano opartą na litografii UV metodę wytwarzania cech chromu do kurtyn DNA²⁰. Do tego protokołu dołączony jest również podstawowy wzór podwójnego wiązania DNA lambda przy 12 μm (patrz informacje dodatkowe). Kilka aspektów projektu tego wzoru może być dostosowanych do różnych potrzeb eksperymentalnych. Obejmują one odległość między barierami a cokołami, odstępy między sąsiednimi studzienkami w barierze w celu kontrolowania gęstości DNA oraz kształt i rozmiar cokołów w celu optymalizacji wydajności podwójnego wiązania i zminimalizowania niepewności co do długości podwójnego wiązania. Inne praktyczne wyzwania mogą obejmować wybór strategii znakowania fluorescencyjnego białek, minimalizację stronniczości w ręcznej analizie danych oraz opracowanie skryptów usprawniających przetwarzanie danych.

Podczas gdy opisany tutaj protokół obejmuje substraty dsDNA, kurtyny DNA oparte na ssDNA były również szeroko stosowane 13,14,15,16. Przygotowanie substratów ssDNA wykorzystuje replikację plazmidu ssDNA M13 za pomocą biotynylowanych starterów¹³. Montaż kurtyny ssDNA wymaga również użycia mocznika i białka wiążącego ssDNA RPA w celu wyeliminowania struktury drugorzędowej i przedłużenia substratu ssDNA¹³. Możliwe jest również rozszerzenie kurtyn DNA o wykorzystanie RNA lub hybryd DNA/RNA do badań białek oddziałujących z RNA. W obecnym kształcie platforma kurtyn DNA może skorzystać z automatyzacji procesu montażu, jak opisano w sekcji 5, z czego większość to powtarzalne wstrzykiwanie standardowego zestawu. Może to prowadzić do poprawy efektywności w przeprowadzaniu wielu eksperymentów jednocześnie. Ponadto ujednolicony i potencjalnie oparty na uczeniu maszynowym zestaw skryptów analitycznych jeszcze bardziej przyspieszyłby przetwarzanie danych przy minimalnym odchyleniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
oprogramowanie systemu generowania nano	patternów JC Nabity Lithography Systems	N/A	NPGS
Rurki PFA, naturalne 1/16" OD x .020" ID	IDEX	1512L
Poli(metakrylan metylu), Ataktyka (24,3 tys. MW)	Polimer Source Inc.	P9790-MMA Szkiełko
mikroskopu kwarcowego	G. Finkenbeiner Inc.	Nie dotyczy	grubości 1 "x 3" x 1 mm
	FEI	N/A	Nova Nano SEM 450
Taśma dwustronna szkocka, 3/4 x 300 cali	3M	N/A
Sonicator	Misonix	S-4000	Do przygotowania lipidów
Sonicator	Branson	1800	Do sonikacji preparatów
Streptawidyna ze Streptomyces avidinii	Sigma-Aldrich	S4762	rozpuszczony w 1X PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml
Kwas siarkowy	Avantor - J.T.Baker	9681-01
Pompa strzykawkowa	KD Scientific	78-0200
Strzykawka, 500 &mikro; L, Model 750 RN SYR, Duży wymienny NDL, 22 ga, 2 cale, styl punktowy 2	Hamilton	80830	Rezerwa do użytku tylko z
lipidami Ligaza DNA T4 (400 000 jednostek/ml)	NEB	M0202S