Artykuł metodologiczny

Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61325

⸱

30 lipca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College, 3Department of Experimental Hematology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawione tutaj są dwa protokoły enkapsulacji oocytów świń w warunkach hodowli 3D. W pierwszym kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są zamknięte w kulkach fibrynowo-alginianowych. W drugim są one otoczone cząstkami fluorowanego proszku etylenu i propylenu (mikrobioreaktory). Oba systemy zapewniają optymalne warunki do utrzymania ich organizacji 3D.

Streszczenie

W biologii rozrodu, rewolucja biotechnologiczna, która rozpoczęła się od technologii sztucznego zapłodnienia i transferu zarodków, doprowadziła do rozwoju technik wspomaganego rozrodu, takich jak dojrzewanie komórek jajowych in vitro (IVM), zapłodnienie in vitro (IVF) i klonowanie zwierząt domowych poprzez transfer jądrowy z komórki somatycznej. IVM jest metodą o szczególnym znaczeniu. Jest to technologia platformowa do dostarczania dojrzałych, dobrej jakości oocytów do zastosowań takich jak skrócenie odstępu pokoleniowego u gatunków ważnych komercyjnie lub zagrożonych, badania nad rozrodem człowieka in vitro oraz produkcja zwierząt transgenicznych do terapii komórkowych. Termin jakość oocytów obejmuje jego zdolność do pełnego dojrzewania, zapłodnienia, co skutkuje zdrowym potomstwem. Oznacza to, że dobrej jakości oocyty mają kluczowe znaczenie dla udanego zapłodnienia, w tym procedur IVF. Stwarza to wiele trudności w opracowaniu niezawodnej metody hodowli, która wspierałaby wzrost nie tylko ludzkich oocytów, ale także innych dużych gatunków ssaków. Pierwszym krokiem w IVM jest hodowla komórek jajowych in vitro. W pracy opisano dwa protokoły hodowli 3D oocytów świń. W pierwszym, modelowym 3D kompleksy wzgórko-oocytów (COC) są zamknięte w przenikającej się sieci kulek fibrynowo-alginianowych, w której mieszanina fibryny i alginianu jest żelowana jednocześnie. W drugim COC są zawieszane w kropli pożywki i otaczane cząstkami proszku fluorowanego etylenu propylenu (FEP; kopolimer heksafluoropropylenu i tetrafluoroetylenu) w celu utworzenia mikrobioreaktorów zdefiniowanych jako płynne kulki (LM). Oba systemy 3D utrzymują gazowe środowisko hodowli in vitro. Utrzymują również organizację COC 3D, zapobiegając ich spłaszczeniu i wynikającemu z tego przerwaniu połączeń szczelinowych, zachowując w ten sposób funkcjonalny związek między oocytem a otaczającymi komórkami pęcherzykowymi.

Wprowadzenie

Rozwój różnych systemów hodowli, w tym trójwymiarowych (3D), ma na celu zapewnienie optymalnych warunków do wzrostu i dojrzewania oocytów wyizolowanych z pęcherzyków nawet na najwcześniejszych etapach rozwoju. Ma to ogromne znaczenie dla technik wspomaganego rozrodu (ART), zwłaszcza w obliczu rosnącej liczby kobiet, które zmagają się z niepłodnością po leczeniu onkologicznym1. Dojrzewanie oocytów w warunkach in vitro (IVM) jest już dobrze znaną techniką stosowaną głównie do wytwarzania zarodków in vitro w celu reprodukcji zwierząt gospodarskich2. Jednak u większości gatunków ssaków, nawet jeśli uda się osiągnąć wysokie tempo dojrzewania kompleksów wzgórek-oocyty (COC) (zakres od 60 do 90 %)3, ich kompetencje rozwojowe są nadal nieadekwatne do potrzeb. Dzieje się tak dlatego, że rozwój tak uzyskanych zygot nawet do stadium blastocysty jest niski, a po przeniesieniu do zwierząt zastępczych ich zdolność do donoszenia terminu jest zmniejszona. W związku z tym istnieje potrzeba zwiększenia kompetencji rozwojowych zarodków pozyskanych z oocytów, które zostały poddane procedurze IVM4. W związku z tym opracowywane są nowe podłoża do dojrzewania5 i testowane są różne okresy hodowli in vitro6,7 wraz z suplementacją pożywek hodowlanych różnymi czynnikami wzrostu i cząsteczkami8,9.

Pierwszym krokiem każdego kompletnego systemu IVM jest stworzenie optymalnych warunków dla zrównoważonego wzrostu oocytów podczas hodowli in vitro. Wzrost oocytów jest jednym ze specyficznych wskaźników zdolności oocytu do wznowienia mejozy10,11. Ponadto odpowiedni system hodowli komórek jajowych in vitro musi być w stanie wspierać ich dojrzewanie jądrowe i różnicowanie cytoplazmatyczne12. Morfologia kompleksu wzgórek-oocyt jest kolejnym ważnym wskaźnikiem wykorzystywanym w klinikach ART do wyboru najlepszego oocytu do kolejnych etapów procedury zapłodnienia in vitro (IVF) u ludzi i zwierząt gospodarskich12,13. Wśród cech morfologicznych COC branych pod uwagę są: średnica oocytu, jego granulacja cytoplazmy i pierwsza integralność ciała polarnego14,15. Poza tym potencjał rozwojowy oocytów jest skorelowany z pojawieniem się i zagęszczeniem komórek wzgórka oraz liczbą ich warstw otaczających oocyt. Bardzo ważne dla prawidłowego systemu hodowli oocytów in vitro jest również utrzymanie prawidłowych interakcji między komórkami oocyt-wzgórek oraz stabilności cytoszkieletu16,17,18,19. Do tej pory wykazano wzrost oocytów in vitro w ludzkich COC20. Stosowanie COC krów skutkowało również żywymi porodami. Zostały one wyizolowane z niedojrzałych pęcherzyków jajnikowych, a następnie hodowane przez 14 dni, aż oocyt będzie wystarczająco duży, aby przejść procedurę IVF21. Podobnie, COC wyizolowane z pęcherzyków antralnych pawiana, poddane IVM po hodowli in vitro, dały oocyty zdolne do ponownego zainicjowania mejozy do etapu metafazy II z normalnie wyglądającą strukturą wrzeciona22. Jednak w tym badaniu autorzy nie próbowali ich nawozić. Wyniki te wskazują jednak, że podobną procedurę można zastosować nie tylko w odniesieniu do tych konkretnych gatunków ssaków, ale także do ludzkich kompleksów wzgórko-oocytów pozyskiwanych z pęcherzyków, co powinno pozwolić na uzyskanie oocytów dobrej jakości, odpowiednich do udanej techniki zapłodnienia in vitro.

Wyżej opisane wyniki uzyskano przy użyciu konwencjonalnych protokołów IVM, podczas których oocyty były hodowane w systemach dwuwymiarowych (2D). Rutynową procedurą w systemach hodowli 2D jest pokrywanie oocytów, zanurzonych w kropli odpowiedniej pożywki hodowlanej, olejem mineralnym23,24. Zakłada się, że nakładka olejowa podczas hodowli oocytów in vitro służy zapobieganiu parowaniu cieczy, zapewniając tym samym utrzymanie odpowiedniego pH i ciśnienia osmotycznego w hodowli. Mimo, że taki system hodowli 2D pozwala na uzyskanie nawet do 87% dojrzałych oocytów świńskich25, udowodniono, że nakładka oleju mineralnego powoduje znaczną dyfuzję substancji rozpuszczalnych w tłuszczach, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju oocytów26. Dodatkowo, ze względu na dyfuzję steroidów (progesteronu i estrogenów) do oleju mineralnego podczas hodowli oocytów, zaobserwowano opóźnienie dojrzewania jądrowego i obniżenie osiągania kompetencji rozwojowych przez oocyty świń. Może to skutkować uzyskaniem niewielkiej liczby zygot, które dodatkowo charakteryzują się niską zdolnością rozwojową do stadium blastocysty oraz słabą żywotnością po przeniesieniu do zwierząt biorców27. W związku z tym podejmowane są próby zwiększenia kompetencji rozwojowych zarodków pochodzących z oocytów otrzymanych po zabiegu IVM, poprzez stworzenie optymalnych warunków do osiągnięcia zarówno cytoplazmatycznej, jak i jądrowej dojrzałości oocytów hodowanych razem z CC jako kompleksami, zwłaszcza z wykorzystaniem układów trójwymiarowych (3D). W ciągu ostatnich dwóch dekad opracowano różne innowacyjne systemy hodowli 3D in vitro28,29. Zostały one zaprojektowane w celu utrzymania naturalnej organizacji przestrzennej komórek i uniknięcia ich spłaszczenia w szalkach hodowlanych, czego nie można osiągnąć w tradycyjnych kulturach 2D. Strukturalna i funkcjonalna aktywność hodowanych COC może być zapewniona poprzez utrzymanie ich właściwej architektury i niezakłóconą komunikację poprzez połączenia szczelinowe między różnymi przedziałami30. Przydatność biorusztowań do hodowli 3D in vitro kompleksów wzgórek–oocyty została oceniona przy użyciu naturalnych biomateriałów, takich jak różne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM; kolagen i kwas hialuronowy)31 lub polimery obojętne (alginian)32. Próby te, przetestowane na kilku gatunkach, przyniosły obiecujące wyniki w zakresie wznowienia mejozy oocytów i osiągnięcia pełnej ich kompetencji33,34,35. Jednak do tej pory nie opracowano systemu 3D odpowiedniego do dojrzewania COC wyizolowanego od dużych zwierząt domowych, w tym świń.

Ta praca opisuje dwa protokoły, które mogą być użyte do hodowli 3D świń COC. Pierwszy protokół opisuje enkapsulację w kulkach fibrynowo-alginianowych (FAB). FAB może być tworzony przez jednoczesne mieszanie roztworu alginianu i fibryny, które poddawane są synchronicznemu procesowi żelowania. Ta kombinacja zapewnia dynamiczne środowisko mechaniczne, ponieważ oba komponenty przyczyniają się do sztywności matrycy. Podobne rozwiązanie zostało wcześniej użyte do hodowli pęcherzyków jajnikowych myszy i dojrzewania36. W przypadku przedstawionego protokołu, w celu uniknięcia przedwczesnej degradacji sieci alginian-fibryna, stosuje się odpowiednio wyższe stężenia roztworu chlorku wapnia, zapewniające szybki i stabilny proces żelowania. Dynamiczne środowisko mechaniczne stwarza warunki podobne do tych w naturalnym środowisku wewnątrzpęcherzykowym, w którym COC znajdują się i zwiększają swoje rozmiary. Ponadto w pracy przedstawiono reprezentatywne wyniki badań nad systemami hodowli COC 3D, w których są one zawieszone w kropli pożywki i otoczone cząstkami proszku fluorowanego etylenu propylenu (FEP; kopolimer heksafluoropropylenu i tetrafluoroetylenu), tworząc mikrobioreaktory (Liquid Marbles, LM). LM to forma bioreaktora 3D, w przypadku których, jak wykazano wcześniej, wspiera m.in. wzrost żywych mikroorganizmów37, sferoidy nowotworowe38 oraz embrionalne komórki macierzyste39. LM są również z powodzeniem stosowane do hodowli oocytów owiec40. W większości eksperymentów z użyciem LM bioreaktory przygotowano przy użyciu złoża proszkowego z politetrafluoroetylenu (PTFE) o wielkości cząstek 1 μm41. W prezentowanym protokole zastosowano FEP, który jest bardzo podobny pod względem składu i właściwości do fluoropolimerów PTFE. Ale FEP jest łatwiejszy w formowaniu i bardziej miękki niż PTFE i, co szczególnie ważne, jest wysoce przezroczysty.

Oba systemy 3D utrzymują gazowe środowisko hodowli in vitro. Utrzymują również organizację COC 3D, zapobiegając ich spłaszczeniu i w konsekwencji przerwaniu połączeń szczelinowych, zachowując ich funkcjonalny związek między oocytem a otaczającymi komórkami pęcherzykowymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Następujące procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt w Instytucie Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego.

1. Izolacja kompleksów cumulus-oocyty świń

  1. Aby pobrać materiał do izolacji pęcherzyków jajnikowych, należy wyciąć jajniki świń od loszek przed okresem dojrzewania (w wieku około 6-7 miesięcy, o wadze od 70 do 80 kg) w lokalnej rzeźni. Wybierz około 20 jajników świni z 10 zwierząt do izolacji COC w każdym doświadczeniu.
    UWAGA: Zakładając, że każdy jajnik daje 3–5 pęcherzyków, całkowita liczba pęcherzyków waha się od 60 do 100.
  2. Umieść jajniki w termosie ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; pH 7,4; 38 °C) zawierającym 1% AAS. Zapewnić, że materiał doświadczalny zostanie przetransportowany do laboratorium w ciągu 1 godziny, gdzie zostanie dwukrotnie przepłukany sterylnym PBS zawierającym antybiotyki.
  3. Po wypłukaniu jajników przenieść je do zlewki wypełnionej pożywką HM i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 38 °C na czas wszystkich manipulacji.
    UWAGA: W celu uzyskania optymalnych wyników podczas obchodzenia się z oocytami, wszystkie procedury należy przeprowadzić w pożywce DMEM/F12 (pożywce manipulacyjnej, HM) z dodatkiem 2,5% roztworu antybiotyku/antybiotyku (AAS) i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i kontrolować pH na poziomie CO2 w otoczeniu, na stole grzewczym z regulacją temperatury (38 °C) i pod okapem z przepływem laminarnym, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne.
  4. Z dużych pęcherzyków wieprzowych (o średnicy 6-8 mm) zebrać płyn pęcherzykowy (FF) przez aspirację i odwirowanie w dawce 100 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przefiltrować supernatant za pomocą sterylnej strzykawki podłączonej do filtrów membranowych 0,2 μm i zamknąć w temperaturze -80 ° C.
    UWAGA: Użyj strzykawki insulinowej (u-40) do aspiracji płynu pęcherzykowego.
  5. Upewnij się, że tylko zdrowe, średniej wielkości pęcherzyki (o średnicy 4-6 mm) są wybrane do izolacji COCs42.
    UWAGA: COC stopnia I, posiadające nienaruszony i okrągły oocyt z jednorodnym ooplazmą i wielowarstwowymi (co najmniej 3-4) zwartymi wzgórkami są uważane za odpowiednie do dalszej procedury 3D IVM43.
  6. Aby wyizolować COC, przenieś 2-3 jajniki na sterylną szalkę Petriego o średnicy 10 cm wypełnioną HM. Wyizoluj COC ze średniej wielkości pęcherzyków, postępując zgodnie z jedną z poniższych procedur.
    1. Delikatnie przeciąć powierzchnię wystających pęcherzyków jajnikowych sterylnym ostrzem chirurgicznym 15C. Spowoduje to, że płyn pęcherzykowy wraz z COC wypłynie na szalkę Petriego.
    2. Odessać zawartość pęcherzyków za pomocą igły 28 G o rozmiarze 5/8" dołączonej do jednorazowej strzykawki i przenieść ją na szalkę Petriego.
      UWAGA: Wyrzuć resztki tkanki jajnikowej. Kolejne etapy izolacji przeprowadzane są pod mikroskopem stereoskopowym.
  7. Przygotuj 3–5 szalek Petriego IVF o średnicy 60 mm.
    1. Dodaj 1 ml HM do studzienek centralnych i umieść 3-4 krople HM (50 μl na kroplę) w ich zewnętrznych pierścieniach.
    2. Następnie, za pomocą mikropipety poliwęglanowej, przenieś nieuszkodzone COC do kropli HM w pierścieniach zewnętrznych, aby krótko je przepłukać 3-4 razy.
    3. Na koniec pojedynczo przenieś je do centralnej studni. Przechowuj te płytki IVF w inkubatorze do dalszych zabiegów.
  8. Po zebraniu COC wykonaj ostatni krok selekcji, przypisując je losowo do dwóch różnych protokołów enkapsulacji IVM wymienionych poniżej.

2. Enkapsulacja w kulkach hydrożelowych fibrynowo-alginianowych

  1. Przygotować 1 ml 50 j.m./ml trombiny w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS; pH 7,4) ze 100 mM CaCl2 w sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml.
  2. Przygotować roztwór podstawowy fibrynogenu (50 mg/ml w TBS) i przechowywać w stanie zamrożonym.
    UWAGA: Aby uniknąć zbrylania się podczas rozpuszczania fibrynogenu w TBS, podgrzej TBS do 37 °C.
    1. W dniu zabiegu rozmrażać go powoli na lodzie i tuż przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej.
  3. Tuż przed użyciem wymieszać w stosunku 1:1 0,5% roztwór alginianu i 50 mg/ml roztworu fibrynogenu, aby uzyskać ostatecznie 2 ml (FA). W sterylnej probówce do mikrowirówek delikatnie wymieszaj mieszaninę. Unikaj robienia bąbelków.
  4. Aby przygotować "komory inkubacyjne", nałóż cienkie paski folii parafinowej na szklane szkiełka mikroskopowe.
    UWAGA: Przed użyciem przetrzeć szkiełka 70% EtOH. Jedna komora inkubacyjna składa się z dwóch szkiełek. Aby je rozdzielić, umieść dystanse 3 mm na jednym z nich.
  5. Odpipetować 7,5 μl kropli mieszaniny FA na to szkiełko pokryte folią parafinową, które posiada również przekładki rozdzielające. Na jednej zjeżdżalni umieść 8-10 kropli ułożonych w dwóch rzędach.
  6. Przenieś, za pomocą mikropipety, 3-5 COC wraz z minimalną objętością (do 5 μl) pożywki dojrzewającej (MM) i umieść je dokładnie w środku kropli FA. Zabieg ten wymaga dobrych zdolności manualnych i precyzji.
    UWAGA: Pożywka dojrzewająca (MM) składa się z DMEM/F12, uzupełnionego 10 j.m./ml PMSG, 10 j.m./ml hCG, 10% FBS i 50% płynu pęcherzykowego świń (FF) pobranych w kroku 1.4.
  7. Dodaj 7,5 μl roztworu trombiny/Ca2+ na każdą kroplę FA, tylko po to, aby je przykryć. Nie ma potrzeby ich mieszania, ponieważ żel tworzy się niemal natychmiast.
  8. Przykryć komorę inkubacyjną poprzez nałożenie na kapsułki FA drugiego, wcześniej przygotowanego szkiełka podstawowego. Bardzo ostrożnym, ale zdecydowanym ruchem odwróć komorę do góry nogami i umieść ją na 100-milimetrowej szalce Petriego wyłożonej wilgotną bibułą filtracyjną, aby uniknąć wysuszenia.
  9. Następnie przenieść szalkę Petriego do inkubatora z 5% CO2 (38 °C) na około 5-7 minut. Po tym czasie kapsułki FA staną się mętne z powodu jednoczesnego żelowania fibryny i alginianu.
  10. Przenieść kapsułki FA do 96 płytek dołkowych (jedna kapsułka na studzienkę) zawierających 100 μl MM na studzienkę.
    UWAGA: Aby nie uszkodzić uformowanych kapsułek FA, należy wykonać ten krok ostrożnie przy użyciu kleszczy chirurgicznych.
  11. Co 2 dni wymieniaj połowę MM (50 μL) na świeżą, wstępnie zrównoważoną. Obrazuj COC za pomocą mikroskopu światła odwróconego (przy 10-krotnym powiększeniu).
    UWAGA: Warunki hodowli dla COC FA hodowla: 38 °C, w atmosferze 5% CO2 i wilgotności względnej 95%. Po 4 dniach IVM hydrożele wydają się prawie przezroczyste z powodu postępującej degradacji składnika fibryny. Pozostały alginian powinien zostać rozłożony enzymatycznie - przez liazę alginianową, enzym pochodzenia roślinnego, który specyficznie rozkłada alginian i nie wpływa na komórki zwierzęce.
    1. Usunąć MM z dołków zawierających kapsułki i dodać 100 μl 10 j.m./ml liazy alginianowej w DMEM. Pozostaw płytkę hodowlaną w inkubatorze na 25-30 minut.
    2. Usunąć COC z rozpuszczonych kapsułek.
      UWAGA: Można to zrobić za pomocą wyciętej końcówki pipety.
    3. Po kilku myciach w świeżym DMEM, przenieś COC do wewnętrznego pierścienia naczynia IVF (5-10 COC na naczynie) zawierającego PBS. Teraz użyj ich do dalszej analizy morfologicznej lub biochemicznej.

3. Enkapsulacja w superhydrofobowych mikrobioreaktorach z fluorowanym etylenem propylenem (FEP).

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie procedury IVM są przeprowadzane na stole kontrolowanym termostatycznie, a COC są utrzymywane na poziomie 38 °C przez cały czas ich obsługi.

  1. Przygotować szalkę Petriego o średnicy 30 mm zawierającą 5 g proszku FEP o średniej wielkości cząstek 1 μm.
    UWAGA: Ważne jest, aby używać świeżego proszku FEP. Ponownie wykorzystany FEP ma tendencję do agregacji i tworzenia grudek.
  2. Rozprowadzić pojedynczą kroplę MM (~ 30 μl objętości) zawierającą 3-5 COC wyizolowanych w kroku 1.6 na łożu proszku FEP. Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząstki te całkowicie pokryły powierzchnię kropli cieczy i utworzyły się płynne kulki (LM).
  3. Uformowany LM pobrać za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 000 μl.
    UWAGA: Przyciąć końcówkę pipety na krawędzi, aby dopasować ją do średnicy LM (4-5 mm). Przybliżona średnica tak przygotowanej końcówki powinna być nieco większa niż średnica LM.
  4. Przygotuj kilka 60-milimetrowych szalek Petriego do zapłodnienia in vitro. Dodaj 3-4 ml sterylnej wody do zewnętrznych pierścieni, aby przygotować komorę wilgotności. Następnie umieść jeden LM w centralnej studzience.
    UWAGA: Zabieg ten wymaga dobrych zdolności manualnych i precyzji - jeśli kulka zostanie ułożona nieostrożnie lub spadnie nawet z niewielkiej wysokości, zostanie zniszczona.
  5. Inkubować kulki przez 4 dni w temperaturze 38 °C w inkubatorze o stężeniu 5 % CO2 .
    1. Codziennie po zabiegu należy zmieniać pożywkę: nanieść 30 μl MM na każdy LM, co spowoduje ich rozprowadzenie, ponieważ bezpośredni kontakt z cieczą zaburza hydrofobowość powlekanych proszków FEP. Gdy zawartość marmuru się rozpuści, przenieś COC uwolnione z bioreaktora do kropli świeżego MM na szalce Petriego.
      UWAGA: Aby precyzyjnie przenieść uwolnione COC, należy użyć mikropipety z poliwęglanu.
    2. Po kilku płukaniach w MM (3-4 razy) w celu usunięcia cząstek FEP, przenieś je wraz z 30 μl świeżego MM na złoże proszku FEP. Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząsteczki proszku całkowicie pokryły powierzchnię kropli cieczy i utworzyły nowy LM.
    3. Następnie postępuj zgodnie z procedurą z kroków 3.3-3.4.
      UWAGA: Przezroczysta powłoka proszku FEP pozwala na monitorowanie zawartości LM za pomocą mikroskopu świetlnego.

4. Charakterystyka COC po 96-godzinnej procedurze IVM przy użyciu dwóch systemów 3D

UWAGA: Aby określić skuteczność stosowanych systemów IVM, należy ocenić morfologicznie COC pod mikroskopem świetlnym. Dodatkowo użyj podwójnego znakowania fluorescencyjnego barwnikami kalceiny AM i homodimerem etydyny (EthD-1) do analizy żywotności COCs44.

  1. Badanie morfologiczne oocytów po IVM za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej.
    1. Umyć COC (zarówno te pochodzące z hodowli przy użyciu FAB, jak i te z LM) w temperaturze 38 °C 1x PBS.
      UWAGA: Aby ułatwić obchodzenie się z COC i nie uszkodzić ich podczas procedury barwienia, należy użyć płytki 96 lub 48-dołkowej i wykonać każdy etap barwienia, przenosząc COC do kolejnych dołków.
    2. Inkubować je w 100 μl 1,6 mM kalceiny AM i 5,5 mM EthD-1 przez 30–45 minut w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć obie substancje w 1x PBS.
      UWAGA: Ponieważ jest to dwukolorowy test fluorescencyjny, wykonaj ten krok w ciemności.
    3. Po inkubacji umyj COC dwukrotnie w PBS, a następnie zanurz go w pożywce zapobiegającej blaknięciu, zaprojektowanej tak, aby zapobiec szybkiemu fotowybielaniu białek fluorescencyjnych i barwników fluorescencyjnych (tabela materiałów).
      UWAGA: Zabezpiecz krawędzie szkła nakrywkowego przed wyschnięciem dowolnym lakierem do paznokci.
    4. Wizualizacja barwionych próbek pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym.
      UWAGA: Aby wzbudzić fluorescencję obu sond (tj. kalceiny i homodimeru etydyny-1, EthD-1), należy dostroić laser argonowy do 488 nm. Emitowana fluorescencja jest oddzielana przez potrójny filtr dichroiczny 488/561/633, a następnie mierzona przy 505−570 nm dla zielonej (kalceina) i przy 630−750 nm dla czerwonej (EthD-1).
    5. Klasyfikuj COC na cztery kategorie, używając zmodyfikowanej klasyfikacji, która jest stosowana do pęcherzyków jajnikowych w hodowli w oparciu o konfokalne obrazowanie fluorescencyjne w zależności od procentu martwych komórek ziarnistych35. V1: COC z szacowanymi 100% żywotnymi CC; V2: COC z 10% martwych CC; V3: COC z 10–50% martwych CC; V4: COC z 50% martwymi CCs.
      UWAGA: Z technicznego punktu widzenia trudno jest ocenić żywotność oocytu za pomocą testu żywego zgonu; W związku z tym należy ją oszacować np. poprzez analizę ultrastruktury lub aktywności mitochondriów.
  2. Badanie ultrastruktury oocytów po IVM metodą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
    1. Utrwal COC w 100 μl 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,2, temperatura pokojowa) przez 2 godziny.
    2. Zanurzyć COC w 100 μl 0,1 M buforu kakodylanu sodu (na noc w temperaturze 4 °C) i wypłukać w tym samym buforze.
    3. Postfix COC z 1% tetratlenkiem osmu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (temperatura pokojowa) przez 1 godzinę.
    4. Po zabarwieniu octanem uranylu (1%), COC należy odwodnić w rosnącej serii rozcieńczeń etanolu (50%, 60%, 70%, 90% i 100%), naciekać je przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie dwie krótkie wymiany żywicy i na koniec zatopić je w LR White.
    5. Następnie, w celu orientacji i oceny próbek, wybarwić półcienkie skrawki (1 μm) błękitem metylenowo-lazurowym II.
    6. Na koniec zbadaj ultracienkie, podwójnie wybarwione skrawki na poziomie ultrastrukturalnym za pomocą TEM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W kompleksach cumulus-oocyta (COC) w obu systemach IVM komórki ziarniste ściśle przylegały do siebie, a większość odzyskanych COC posiadała nienaruszone warstwy komórek cumulusu (Rysunek 1A,B). Ponadto zachowano znaczną proporcję komórek cumulusu.

Wyniki analizy żywotności kompleksów cumulus-oocyt (COC) potwierdziły, że oba systemy zastosowane do enkapsulacji oocytów świńskich w warunkach 3D in vitro zapewniły optymalne warunki wzrostu (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zdolność do utrzymania wzrostu in vitro nie tylko oocytu, ale także otaczających go komórek wzgórka i jednocześnie wspomagających jego dojrzewanie jest niezwykle istotna dla skutecznych technologii wspomaganego rozrodu oraz dla lepszego zrozumienia interakcji między komórką somatyczną a oocytami, zwłaszcza u gatunków poddawanych wydłużonemu wzrostowi pęcherzyków, takich jak ludzie lub świnie. Stale ulepszane techniki IVM stają się użytecznym narzędziem do zachowania opcji reprodukcyjnych w przypadkach zespołu policystycz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są bardzo wdzięczni: dr Wacławowi Tworzydło (Zakład Biologii Rozwoju i Morfologii Bezkręgowców, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego) za zaplecze techniczne w TEM; Pani Beacie Snakowskiej (Zakład Endokrynologii, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego) za pomoc techniczną; Zarządowi Biologii Komórki i Obrazowania, Instytutowi Zoologii i Badań Biomedycznych, Uniwersytet Jagielloński, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokio, Japonia). Praca została sfinansowana z grantu 2018/29/N/NZ9/00983 Narodowego Centrum Nauki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
General
Antybiotyk Antybiotyk Grzybiczy (100x) 100mlThermo Fisher152400622,5% stężenie końcowe do podłoża manipulacyjnego. 1% w PBS (krok 1.2)
DMEM/F12 (500ml)Sigma-AldrichD8062Podłoże do obsługi i dojrzewania
DPBS (bez Ca, Mg), 1x, 500mlThermo Fisher14190144
FCS (100 ml)Thermo Fisher1614006310% stężenie końcowe zarówno dla podłoża manipulacyjnego, jak i podłoża do dojrzewania. (kroki: 1.5. 2.6.)
PBS (1x, pH 7,4) 500mlThermo Fisher10010023
TBS roztwór podstawowy (10x, pH 7,4) 500 mlCayman Chemicals6002321x stężenie końcowe. Inna marka może być stosowana
Maturation Medium
hCG (1 fiolka 10 000 U)Sigma-AldrichCG10
PMSGBioVendorRP1782721000
Fibrin-alginate beads
Alginate LyaseSigma-AldrichA1603(krok 2.11.1)
TrombinaSigma-AldrichT9326-150UN(Krok 2.1)
Chlorek wapniaSigma-AldrichC5670(Krok 2.1)
Fibrynogen (250 mg)Sigma-AldrichF3879(Krok 2.2)
Alginian soduSigma-AldrichW201502(Krok 2.3) Użyj do roztworu alginianu
< mocny > Płynny marmur < / mocny>
FEPDyneon GmbH 3M AdMDA-66670
Badanie morfologiczne
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, dla komórek ssakówThermo FisherL3224(Krok 4.1.) Emitowana fluorescencja: 494 nm dla kalceiny, 528 nm dla EthD-1; miara: 517 nm dla kalceiny, 617 nm - EthD-1
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000medium montażowe
Badanie ultrastrukturalne
Roztwór aldehydu glutarowegoSigma-AldrichG58822,5% końcowe zagęszczenie (Krok 4.2.1.)
LR Biała żywicaSigma-AldrichL9774(krok 4.2.4.)
Błękit metylenowySigma-AldrichM9140(krok 4.2.5.)
Tetratlenek osmuSigma-AldrichO5500(krok 4.2.3.)
Kakodylan sodu trójwodnySigma-AldrichC0250Służy do przygotowania 0,1 M buforu kakodylanu sodu (pH 7,2)
Octan uranyluPOCH868540111(Krok 4.2.4.)
Specjalistyczne narzędzia
30 mm Szalka PteriTPP93040
60 mm IVF Szalka PetriegoFalcon353653
Ez-Grid Premium Pipeta do obsługi komórekRI Life Sciences8-72-288
Ez-TipRI Life Sciences8-72-4155/20
Stół grzewczySEMICMożna używać innych marek
InkubatorPanasonicMCO-170AIC-PEMożna używać innych marek
Sterylna szalka Petriego (10 cm)NEST Biotechnology704002
Sterylne filtry strzykawkowe z 0,2 i mikro; mGOOGLAB SCIENTIFICGB-30-022PES
TermosQuechua5602589Można stosować inne marki

Bibliografia

  1. Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
  2. Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
  3. Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
  4. Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
  5. Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
  6. You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613(2012).
  7. Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
  8. Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
  9. Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
  10. Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
  11. Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
  12. Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
  13. de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
  14. Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
  15. Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
  16. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
  17. Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
  18. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  19. Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
  20. Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
  21. Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
  22. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
  23. Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
  24. Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
  25. Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
  26. Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
  27. Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
  28. Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
  29. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
  30. Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
  31. Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
  32. Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
  33. Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
  34. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  35. Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
  36. Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709(2015).
  37. Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
  38. Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
  39. Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
  40. Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  41. Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
  42. Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
  43. Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
  44. Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
  45. Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
  46. Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695(2011).
  47. Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
  48. Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
  49. Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
  50. Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kuleczki z alginianu i fibrynytworzenie ciek ego marmurukompleks kumulacyjno oocytarnydojrzewanie in vitrotransmisyjna mikroskopia elektronowafluoretylenopropylendegradacja hydro elu alginianowegosystem hodowli w mikrobioreaktorzezachowanie po cze szczelinowych

Powiązane artykuły