Artykuł metodologiczny
Przedstawione tutaj są dwa protokoły enkapsulacji oocytów świń w warunkach hodowli 3D. W pierwszym kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są zamknięte w kulkach fibrynowo-alginianowych. W drugim są one otoczone cząstkami fluorowanego proszku etylenu i propylenu (mikrobioreaktory). Oba systemy zapewniają optymalne warunki do utrzymania ich organizacji 3D.
W biologii rozrodu, rewolucja biotechnologiczna, która rozpoczęła się od technologii sztucznego zapłodnienia i transferu zarodków, doprowadziła do rozwoju technik wspomaganego rozrodu, takich jak dojrzewanie komórek jajowych in vitro (IVM), zapłodnienie in vitro (IVF) i klonowanie zwierząt domowych poprzez transfer jądrowy z komórki somatycznej. IVM jest metodą o szczególnym znaczeniu. Jest to technologia platformowa do dostarczania dojrzałych, dobrej jakości oocytów do zastosowań takich jak skrócenie odstępu pokoleniowego u gatunków ważnych komercyjnie lub zagrożonych, badania nad rozrodem człowieka in vitro oraz produkcja zwierząt transgenicznych do terapii komórkowych. Termin jakość oocytów obejmuje jego zdolność do pełnego dojrzewania, zapłodnienia, co skutkuje zdrowym potomstwem. Oznacza to, że dobrej jakości oocyty mają kluczowe znaczenie dla udanego zapłodnienia, w tym procedur IVF. Stwarza to wiele trudności w opracowaniu niezawodnej metody hodowli, która wspierałaby wzrost nie tylko ludzkich oocytów, ale także innych dużych gatunków ssaków. Pierwszym krokiem w IVM jest hodowla komórek jajowych in vitro. W pracy opisano dwa protokoły hodowli 3D oocytów świń. W pierwszym, modelowym 3D kompleksy wzgórko-oocytów (COC) są zamknięte w przenikającej się sieci kulek fibrynowo-alginianowych, w której mieszanina fibryny i alginianu jest żelowana jednocześnie. W drugim COC są zawieszane w kropli pożywki i otaczane cząstkami proszku fluorowanego etylenu propylenu (FEP; kopolimer heksafluoropropylenu i tetrafluoroetylenu) w celu utworzenia mikrobioreaktorów zdefiniowanych jako płynne kulki (LM). Oba systemy 3D utrzymują gazowe środowisko hodowli in vitro. Utrzymują również organizację COC 3D, zapobiegając ich spłaszczeniu i wynikającemu z tego przerwaniu połączeń szczelinowych, zachowując w ten sposób funkcjonalny związek między oocytem a otaczającymi komórkami pęcherzykowymi.
Rozwój różnych systemów hodowli, w tym trójwymiarowych (3D), ma na celu zapewnienie optymalnych warunków do wzrostu i dojrzewania oocytów wyizolowanych z pęcherzyków nawet na najwcześniejszych etapach rozwoju. Ma to ogromne znaczenie dla technik wspomaganego rozrodu (ART), zwłaszcza w obliczu rosnącej liczby kobiet, które zmagają się z niepłodnością po leczeniu onkologicznym1. Dojrzewanie oocytów w warunkach in vitro (IVM) jest już dobrze znaną techniką stosowaną głównie do wytwarzania zarodków in vitro w celu reprodukcji zwierząt gospodarskich2. Jednak u większości gatunków ssaków, nawet jeśli uda się osiągnąć wysokie t....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Następujące procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt w Instytucie Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego.
1. Izolacja kompleksów cumulus-oocyty świń
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W kompleksach cumulus-oocyta (COC) w obu systemach IVM komórki ziarniste ściśle przylegały do siebie, a większość odzyskanych COC posiadała nienaruszone warstwy komórek cumulusu (Rysunek 1A,B). Ponadto zachowano znaczną proporcję komórek cumulusu.
Wyniki analizy żywotności kompleksów cumulus-oocyt (COC) potwierdziły, że oba systemy zastosowane do enkapsulacji oocytów świńskich w warunkach 3D in vitro zapewniły optymalne warunki wzrostu (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zdolność do utrzymania wzrostu in vitro nie tylko oocytu, ale także otaczających go komórek wzgórka i jednocześnie wspomagających jego dojrzewanie jest niezwykle istotna dla skutecznych technologii wspomaganego rozrodu oraz dla lepszego zrozumienia interakcji między komórką somatyczną a oocytami, zwłaszcza u gatunków poddawanych wydłużonemu wzrostowi pęcherzyków, takich jak ludzie lub świnie. Stale ulepszane techniki IVM stają się użytecznym narzędziem do zachowania opcji reprodukcyjnych w przypadkach zespołu policystycz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Autorzy są bardzo wdzięczni: dr Wacławowi Tworzydło (Zakład Biologii Rozwoju i Morfologii Bezkręgowców, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego) za zaplecze techniczne w TEM; Pani Beacie Snakowskiej (Zakład Endokrynologii, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego) za pomoc techniczną; Zarządowi Biologii Komórki i Obrazowania, Instytutowi Zoologii i Badań Biomedycznych, Uniwersytet Jagielloński, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokio, Japonia). Praca została sfinansowana z grantu 2018/29/N/NZ9/00983 Narodowego Centrum Nauki.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| General | |||
| Antybiotyk Antybiotyk Grzybiczy (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2,5% stężenie końcowe do podłoża manipulacyjnego. 1% w PBS (krok 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Podłoże do obsługi i dojrzewania |
| DPBS (bez Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% stężenie końcowe zarówno dla podłoża manipulacyjnego, jak i podłoża do dojrzewania. (kroki: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7,4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS roztwór podstawowy (10x, pH 7,4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x stężenie końcowe. Inna marka może być stosowana |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 fiolka 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (krok 2.11.1) |
| Trombina | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Krok 2.1) |
| Chlorek wapnia | Sigma-Aldrich | C5670 | (Krok 2.1) |
| Fibrynogen (250 mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Krok 2.2) |
| Alginian sodu | Sigma-Aldrich | W201502 | (Krok 2.3) Użyj do roztworu alginianu |
| < mocny > Płynny marmur < / mocny> | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Badanie morfologiczne | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, dla komórek ssaków | Thermo Fisher | L3224 | (Krok 4.1.) Emitowana fluorescencja: 494 nm dla kalceiny, 528 nm dla EthD-1; miara: 517 nm dla kalceiny, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | medium montażowe |
| Badanie ultrastrukturalne | |||
| Roztwór aldehydu glutarowego | Sigma-Aldrich | G5882 | 2,5% końcowe zagęszczenie (Krok 4.2.1.) |
| LR Biała żywica | Sigma-Aldrich | L9774 | (krok 4.2.4.) |
| Błękit metylenowy | Sigma-Aldrich | M9140 | (krok 4.2.5.) |
| Tetratlenek osmu | Sigma-Aldrich | O5500 | (krok 4.2.3.) |
| Kakodylan sodu trójwodny | Sigma-Aldrich | C0250 | Służy do przygotowania 0,1 M buforu kakodylanu sodu (pH 7,2) |
| Octan uranylu | POCH | 868540111 | (Krok 4.2.4.) |
| Specjalistyczne narzędzia | |||
| 30 mm Szalka Pteri | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Szalka Petriego | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Pipeta do obsługi komórek | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Stół grzewczy | SEMIC | Można używać innych marek | |
| Inkubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Można używać innych marek |
| Sterylna szalka Petriego (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterylne filtry strzykawkowe z 0,2 i mikro; m | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Termos | Quechua | 5602589 | Można stosować inne marki |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie