Ten protokół określa wychwyt równowagi, głębokość penetracji i szybkość dyfuzji nierównowagowej dla nośników peptydów kationowych w chrząstce. Charakterystyka właściwości transportowych ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia skutecznej odpowiedzi biologicznej. Metody te mogą być stosowane do projektowania optymalnie naładowanych nośników leków do celowania w ujemnie naładowane tkanki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Charakterystyka właściwości transportowych wewnątrz chrząstki kationowych nośników peptydowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kilka ujemnie naładowanych tkanek w ciele, takich jak chrząstki, stanowią barierę dla docelowego dostarczania leków ze względu na ich duże zagęszczenie ujemnie naładowanych agrekanów i dlatego wymagają ulepszonych metod celowania, aby zwiększyć ich reakcję terapeutyczną. Ponieważ chrząstka ma wysoką ujemną stałą gęstość ładunku, leki mogą być modyfikowane za pomocą dodatnio naładowanych nośników leków, aby wykorzystać oddziaływania elektrostatyczne, co pozwala na zwiększony transport leków wewnątrz chrząstki. Badanie transportu nośników leków ma zatem kluczowe znaczenie dla przewidywania skuteczności leków w wywoływaniu odpowiedzi biologicznej. Pokazujemy projekt trzech eksperymentów, które mogą określić ilościowo wychwyt równowagowy, głębokość penetracji i nierównowagę dyfuzji nośników peptydów kationowych w eksplantatach chrząstek. Eksperymenty z wychwytem równowagowym dostarczają pomiaru stężenia substancji rozpuszczonej w chrząstce w porównaniu z otaczającą ją kąpielą, co jest przydatne do przewidywania potencjału nośnika leku w zwiększaniu terapeutycznego stężenia leków w chrząstce. Badania głębokości penetracji z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej pozwalają na wizualną reprezentację dyfuzji substancji rozpuszczonej 1D z powierzchownej do głębokiej strefy chrząstki, co jest ważne dla oceny, czy substancje rozpuszczone docierają do swoich macierzy i komórkowych miejsc docelowych. Badania nierównowagowej szybkości dyfuzji przy użyciu specjalnie zaprojektowanej komory transportowej umożliwiają pomiar siły oddziaływań wiązania z macierzą tkankową poprzez scharakteryzowanie szybkości dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych substancji rozpuszczonych w tkance; Jest to korzystne dla projektowania nośników o optymalnej sile wiązania z chrząstką. Łącznie wyniki uzyskane w trzech eksperymentach transportowych stanowią wytyczne do projektowania optymalnie naładowanych nośników leków, które wykorzystują słabe i odwracalne interakcje ładunków w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków. Te metody eksperymentalne mogą być również stosowane do oceny transportu leków i koniugatów lek-nośnik leku. Co więcej, metody te można dostosować do stosowania w celowaniu w inne ujemnie naładowane tkanki, takie jak łąkotka, rogówka i ciało szkliste.
Wprowadzenie
Dostarczanie leków do ujemnie naładowanych tkanek w organizmie pozostaje wyzwaniem ze względu na niezdolność leków do głębokiego przenikania do tkanki w celu dotarcia do docelowych miejsc w komórkach i macierzy1. Wiele z tych tkanek składa się z gęsto upakowanych, ujemnie naładowanych aggrekanów, które tworzą wysoką ujemną gęstość ładunku stałego (FCD)2 wewnątrz tkanki i stanowią barierę dla dostarczania większości makrocząsteczek3,4. Jednak przy pomocy dodatnio naładowanych nośników leków, ta ujemnie naładowana bariera tkankowa może zostać przekształcona w depot leku poprzez oddziaływania ładunków elektrostatycznych w celu przedłużonego uwalniania leku1,5,6,7(Rycina 1).
Rycina 1: Dostarczanie CPC do wnętrza chrząstki oparte na ładunku. Wstrzyknięcie CPC do przestrzeni stawu kolanowego. Oddziaływania elektrostatyczne między dodatnio naładowanymi CPC a ujemnie naładowanymi grupami agrekanu umożliwiają szybką penetrację chrząstki na pełną głębokość. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Vedadghavami et al4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Niedawno zaprojektowano krótkie kationowe nośniki peptydowe (CPCs), których celem było stworzenie małych domen kationowych zdolnych do transportu większych cząsteczek terapeutycznych do ujemnie naładowanej chrząstki4. Aby skutecznie dostarczać leki do chrząstki w celu leczenia powszechnych8,9 i zwyrodnieniowych schorzeń, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów (OA)10, kluczowe jest, aby stężenia terapeutyczne leków penetrowały głęboko w tkankę, w której znajduje się większość komórek chrząstki (chondrocytów)11. Choć dostępnych jest kilka potencjalnych leków modyfikujących przebieg choroby, żaden z nich nie uzyskał zatwierdzenia FDA, ponieważ nie są one w stanie skutecznie dotrzeć do chrząstki12,13. Dlatego ocena właściwości transportowych nośników leków jest niezbędna do przewidzenia skuteczności leków w wywoływaniu odpowiedzi terapeutycznej. W niniejszej pracy zaprojektowaliśmy trzy oddzielne eksperymenty, które mogą być wykorzystane do oceny równowagowego poboru, głębokości penetracji oraz nierównowagowej szybkości dyfuzji CPCs4.
Aby zapewnić wystarczające stężenie leku w chrząstce, które może przynieść optymalną odpowiedź terapeutyczną, zaprojektowano eksperymenty z pobieraniem w celu ilościowego oznaczenia stężenia równowagowego CPC w chrząstce4. W tym modelu, po osiągnięciu stanu równowagi między chrząstką a otaczającą ją kąpielą, całkowitą ilość substancji rozpuszczonej wewnątrz chrząstki (zarówno związanej z macierzą, jak i wolnej) można określić za pomocą współczynnika pobierania. Współczynnik ten oblicza się poprzez normalizację stężenia substancji rozpuszczonej wewnątrz chrząstki względem stężenia w kąpieli równowagowej. W zasadzie substancje rozpuszczone obojętne, których dyfuzja przez chrząstkę nie jest wspomagana przez oddziaływania ładunkowe, miałyby współczynnik pobierania mniejszy niż 1. Z kolei substancje rozpuszczone kationowe, których transport jest zwiększony poprzez oddziaływania elektrostatyczne, wykazują współczynnik pobierania większy niż 1. Jednakże, jak pokazano w przypadku CPC, zastosowanie optymalnego ładunku dodatniego może skutkować znacznie wyższymi współczynnikami pobierania (powyżej 300)4.
Chociaż wysokie stężenie leku w chrząstce jest istotne dla osiągnięcia korzyści terapeutycznej, krytyczne jest również to, aby leki dyfundowały przez pełną grubość tkanki chrzestnej. Dlatego konieczne są badania wykazujące głębokość penetracji, aby upewnić się, że leki docierają głęboko do chrząstki, umożliwiając dotarcie do macierzy oraz komórkowych miejsc docelowych, co zapewnia skuteczniejszą terapię. Niniejszy eksperyment został zaprojektowany w celu oceny jednokierunkowej dyfuzji substancji rozpuszczonych przez chrząstkę, symulując dyfuzję leków do chrząstki po wewnątrzstawowym wstrzyknięciu in vivo. Obrazowanie fluorescencyjne z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej pozwala na ocenę głębokości penetracji do chrząstki. Sumaryczny ładunek cząsteczki odgrywa kluczową rolę w regulowaniu głębokości dyfuzji leków przez macierz. Optymalny ładunek sumaryczny, oparty na gęstości ładunku tkanki (FCD), jest wymagany, aby umożliwić słabe, odwracalne oddziaływania wiążące między cząsteczkami kationowymi a anionową macierzą tkankową. Oznacza to, że każde oddziaływanie musi być na tyle słabe, aby cząsteczki mogły odłączyć się od macierzy, ale jednocześnie odwracalne, aby mogły one wiązać się z innym miejscem wiązania w macierzy położonym głębiej w tkance4. I odwrotnie, nadmierny dodatni ładunek sumaryczny cząsteczki może utrudniać dyfuzję, ponieważ zbyt silne wiązanie z macierzą zapobiega odczepieniu się cząsteczek z początkowego miejsca wiązania w strefie powierzchownej chrząstki. Mogłoby to doprowadzić do niewystarczającej odpowiedzi biologicznej, ponieważ większość miejsc docelowych znajduje się głęboko w tkance11.
Aby dokładniej określić siłę oddziaływań wiążących, korzystna jest analiza szybkości dyfuzji leków przez chrząstkę. Badania dyfuzji poza stanem równowagi pozwalają na porównanie szybkości dyfuzji różnych substancji rozpuszczonych w czasie rzeczywistym. W miarę jak leki dyfundują przez strefy powierzchowną, środkową i głęboką chrząstki, obecność oddziaływań wiążących może znacząco zmienić szybkość dyfuzji. Gdy między lekami a macierzą chrząstki występują oddziaływania wiążące, określa się to jako dyfuzyjność efektywną (DEFF). W takim przypadku, po zajęciu wszystkich miejsc wiązania, szybkość dyfuzji leków jest określana przez dyfuzję w stanie stacjonarnym (DSS). Porównanie DEFF różnych substancji rozpuszczonych pozwala określić względną siłę wiązania tych substancji z macierzą. W przypadku danej substancji, jeśli DEFF i DSS znajdują się w tym samym rzędzie wielkości, oznacza to, że podczas dyfuzji występuje minimalne wiązanie między lekiem a macierzą. Jednakże, jeśli DEFF jest większe od DSS, istnieje znaczne wiązanie cząstek z macierzą.
Zaprojektowane eksperymenty pozwalają indywidualnie na charakterystykę transportu substancji rozpuszczonej przez chrząstkę, jednak do zaprojektowania optymalnie naładowanego nośnika leku wymagana jest całościowa analiza wszystkich wyników. Słaby i odwracalny charakter oddziaływań ładunkowych kontroluje szybkość dyfuzji cząsteczek i umożliwia wysokie pobranie w stanie równowagi oraz szybką penetrację przez pełną grubość chrząstki. W eksperymentach dotyczących pobrania w stanie równowagi należy poszukiwać nośników wykazujących wysokie pobranie w wyniku oddziaływań ładunkowych, co można zweryfikować za pomocą badań szybkości dyfuzji w stanie nierównowagi. Oddziaływania wiążące te powinny być jednak z natury słabe i odwracalne, aby umożliwić penetrację substancji rozpuszczonej przez pełną grubość chrząstki. Idealny nośnik leku posiadałby optymalny ładunek, który umożliwia wiązanie wystarczająco silne, by zapewnić pobranie i wysokie stężenia leku wewnątrz chrząstki, ale nie na tyle silne, by utrudniać dyfuzję przez pełną grubość tkanki4. Przedstawione eksperymenty pomogą w określeniu cech projektowych dla nośników leków ukierunkowanych na tkanki w oparciu o ładunek. Protokoły te zostały wykorzystane do charakterystyki transportu CPC przez chrząstkę4, jednak mogą one zostać zastosowane również do różnych leków i nośników leków przenikających przez chrząstkę oraz inne tkanki naładowane ujemnie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uzyskano zgody uniwersyteckie na przeprowadzenie eksperymentów z wykorzystaniem martwych tkanek. Stawy bydlęce pozyskano komercyjnie z rzeźni.
1. Wyizolowanie eksplantów chrząstki
- Za pomocą skalpela (ostrze nr 10) wyciąć i usunąć tłuszcz, mięśnie, więzadła, ścięgna oraz całą pozostałą tkankę łączną, aby odsłonić chrząstkę w bruździe rzepkowo-udowej stawów kolanowych bydlęcych.
- Za pomocą trepanów skórnych o średnicach 3 mm i 6 mm wykonać prostopadłe nakłucia w chrząstce, aby pobrać cylindryczne wycinki. Wycinki natychmiast umieścić w oddzielnych studzienkach płytki 48-dołkowej zawierającej 500 μL 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) uzupełnionej o 1% v/v antybiotyk-antymykotyk.
- Umieścić stronę powierzchowną wycinka chrząstki skierowaną w dół w uchwycie do krojenia (Rysunek 2). Za pomocą żyletki przeciąć wycinek wzdłuż powierzchni uchwytu do krojenia, aby uzyskać eksplant chrząstki o grubości 1 mm, obejmujący strefę powierzchowną. Powtórzyć czynność dla każdego wycinka chrząstki.
- Przechowywać eksplanty chrząstki pojedynczo w probówkach polipropylenowych zawierających 500 μL 1x PBS uzupełnionej o inhibitory proteaz (PBS-PI, 1 mini-tabletka PI na 50 mL 1x PBS) w temperaturze -20 °C.
- Przed przeprowadzeniem każdego z poniższych eksperymentów transportowych rozmrażać fiolki z eksplantami przez 30 min w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
Rysunek 2: Specjalnie zaprojektowany uchwyt do krojenia.Parametry konstrukcyjne stalowego uchwytu do krojenia stosowanego do krojenia eksplantów chrząstki o średnicy 3 i 6 mm. Wewnątrz otworów umieszczono plastikowe wkładki o różnej grubości, aby dostosować grubość krojonych eksplantów. Do wypychania eksplantu z uchwytu użyto stalowego cylindrycznego pinu o średnicy <1 mm. Wszystkie wartości liczbowe podano w mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
2. Równowagowe pobieranie CPC przez chrząstkę
- Delikatnie osusz wycinki chrząstki (śr. 3 mm x grubość 1 mm) za pomocą miękkiej chusteczki analitycznej, aby usunąć nadmiar 1x PBS z powierzchni wycinków. Używając wagi, szybko zmierz masę mokrą każdego wycinka, a następnie natychmiast umieść go w kąpieli z 1x PBS, aby zapobiec odwodnieniu.
- Przygotuj roztwory 30 μM (300 μL na wycinek) fluorescencyjnie znakowanych CPC w 1x PBS-PI. Do rekonstytucji użyj polipropylenowych probówek wolnych od RNazy.
- W płytce 96-dołkowej pipetuj 300 μL każdego roztworu CPC o stężeniu 30 μM do oddzielnych dołków. Unikaj używania dołków znajdujących się przy krawędzi płytki, aby zapobiec parowaniu. Za pomocą szpatułki przenieś każdy wycinek do dołków zawierających roztwór.
- Wypełnij sąsiednie dołki 300 μL 1x PBS i przykryj płytkę pokrywką. Uszczelnij krawędzie płytki elastyczną folią, aby zminimalizować parowanie.
- W inkubatorze o temperaturze 37 °C umieść płytkę na wstrząsarku do płytek, aby ograniczyć sedymentację cząstek. Inkubuj przez 24 h przy łagodnej rotacji (50 rpm z orbitą 15 mm), aby umożliwić równowagowe pobranie CPC przez chrząstkę (Rysunek 3).
- Stwórz krzywą wzorcową dla korelacji fluorescencji ze stężeniem CPC
- Przygotuj szereg rozcieńczeń roztworów CPC od 30 μM do 0 μM (10 dwukrotnych rozcieńczeń) w 1x PBS-PI w probówkach polipropylenowych. Upewnij się, że objętość każdego rozcieńczenia wynosi co najmniej 500 μL.
- Dodaj 200 μL każdego rozcieńczenia do kolejnych dołków w czarnej płytce 96-dołkowej. Powtórz czynność w innym rzędzie, aby zwiększyć liczebność próbek.
- Odczytaj fluorescencję każdej próbki za pomocą czytnika płytek przy długościach fal wzbudzenia i emisji charakterystycznych dla zastosowanego znacznika fluorescencyjnego.
- Wykreśl zależność odczytu fluorescencji od stężenia CPC i wyznacz równanie dla liniowej części krzywej.
UWAGA: Aby ograniczyć zmienność odczytów fluorescencji, przed stworzeniem krzywej wzorcowej inkubuj roztwór zapasowy CPC w tych samych warunkach, co płytkę z próbkami.
- Po 24 h inkubacji pobierz ciecz z kąpieli równowagowej z każdego dołka do oddzielnych probówek polipropylenowych.
- Przenieś 200 μL każdego roztworu do oddzielnych dołków czarnej płytki 96-dołkowej. Odczytaj fluorescencję każdej próbki przy tych samych ustawieniach fluorescencji, co w przypadku krzywej wzorcowej. Jeśli to konieczne, rozcieńcz próbkę w 1x PBS-PI, aby upewnić się, że odczyty mieszczą się w liniowej części krzywej wzorcowej.
Rycina 3: Schemat eksperymentów dotyczących poboru równowagowego. Eksplanty chrząstki (śr. 3 mm x 1 mm grubości) umieszczono w poszczególnych dołkach płytki 96-dołkowej zawierającej roztwór CPC znakowany fluorescencyjnie. Po 24 h CPC zostały pobrane przez chrząstkę, co doprowadziło do zmniejszenia fluorescencji otaczającego medium. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
3. Głębokość penetracji CPC w chrząstce
- Przygotować roztwory 30 μM (300 μL na eksplant) znakowanych fluorescencyjnie CPC w 1x PBS-PI. Do rozpuszczania należy użyć polipropylenowych probówek wolnych od RNaz.
- Za pomocą skalpela przeciąć eksplanty chrząstki (średnica 6 mm x grubość 1 mm) na pół, aby otrzymać półdyski. Podczas cięcia należy utrzymywać eksplant w nawilżeniu, stosując warstwę 1x PBS-PI.
- Przykleić półdyskowy eksplant do środka jednej studzienki specjalnie zaprojektowanej jednowymiarowej komory transportowej, używając żywicy epoksydowej (Rysunek 4, Rysunek 5). Należy upewnić się, że żywica została naniesiona na obwodową (zakrzywioną) stronę eksplantu. Usunąć nadmiar kleju ze studzienki, aby zapobiec jego kontaktowi z powierzchnią dyfuzyjną chrząstki, i zaznaczyć stronę powierzchowną eksplantu.
- Dodać 80 μL 1x PBS-PI po obu stronach eksplantu. Pipetować ciecz w górę i w dół po jednej stronie eksplantu, aby sprawdzić, czy nie dochodzi do przeciekania na drugą stronę. W przypadku przecieku należy skorygować położenie eksplantu i w razie potrzeby nanieść dodatkową żywicę epoksydową.
- Zastąpić 1x PBS-PI po stronie skierowanej ku powierzchni powierzchownej chrząstki (strumień górny) 80 μL roztworu CPC o stężeniu 30 μM. Po stronie skierowanej ku strefie głębokiej chrząstki (strumień dolny) należy pozostawić 80 μL 1x PBS-PI.
- Ostrożnie umieścić komorę transportową w pojemniku z pokrywą. Dno pojemnika pokryć warstwą 1x PBS, aby zapobiec odparowywaniu roztworów. Należy upewnić się, że nie ma bezpośredniego kontaktu między roztworami z komory górnej i dolnej.
- Umieścić zamknięty pojemnik na wytrząsarce płytkowej, aby ograniczyć sedymentację cząstek. Inkubować przez 4 lub 24 h w temperaturze pokojowej przy łagodnej rotacji (50 rpm z orbitą 15 mm).
- Po inkubacji wyjąć eksplant z komory i wyciąć plasterek o grubości ~100 μm z centrum eksplantu.
UWAGA: Ten przekrój obejmuje strefę powierzchowną, środkową i głęboką chrząstki. - Umieścić plasterek pomiędzy szkiełkiem przedmiotowym a nakryweksem. Nawilżyć plasterek warstwą 1x PBS-PI.
- Przy powiększeniu 10x wykonać obrazowanie przez pełną grubość plasterka, aby uzyskać stos obrazów fluorescencyjnych (z-stack) za pomocą mikroskopu konfokalnego.
- Używając programu ImageJ, rzutować średnią intensywność obrazów w stosie z, aby określić głębokość penetracji CPC w chrząstce.
- Otworzyć stos obrazów, klikając File | Open.
- Kliknąć zakładkę „Image” na pasku zadań, a następnie wybrać Image | Stacks | Z Project z menu rozwijanego.
- Wpisać numery plastrów od 1 do ostatniego plastra. W sekcji Projection Type wybrać „Average Intensity”. Kliknąć „OK”.
Rycina 4: Specjalnie zaprojektowana jednowymiarowa komora transportowa. Parametry konstrukcyjne jednowymiarowej komory transportowej z PMMA z 6 oddzielnymi dołkami. Wszystkie wartości liczbowe podano w mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Schemat badań nad głębokością penetracji. Eksplanty chrząstki (średnica 6 mm x grubość 1 mm) przecięto na pół i przymocowano do centrum studni do jednowymiarowego transportu dyfuzyjnego. Fluorescencyjnie znakowany roztwór CPC dodano do strony studni stykającej się ze strefą powierzchowną (SZ) chrząstki. 1x PBS-PI dodano do strony studni stykającej się ze strefą głęboką (DZ) chrząstki. Po dyfuzji wykonano obrazowanie przekroju chrząstki (3 mm x 1 mm) przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Rysunek zmodyfikowany na podstawie prac Vedadghavami i wsp.4 oraz Bajpayee i wsp.3 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
4. Nieustalony współczynnik dyfuzji CPC w chrząstce
- Połączyć dwie połówki specjalnie zaprojektowanej komory transportowej (Rycina 6), aby złożyć i zamknąć urządzenie. Użyć podkładek, nakrętek i śrub, aby szczelnie zamknąć komorę za pomocą klucza.
UWAGA: Komora transportowa musi być półprzezroczysta, aby nie zakłócać odczytów fluorescencji. Komory transportowe użyte w tym protokole są wykonane z polimetakrylanu metylu (PMMA). - Pokryć wewnętrzną przestrzeń komory 0,5% w/v roztworem odtłuszczonego mleka bydlęcego w 1x PBS (2 mL na każdą komorę) przez 15 min, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu CPC do ścianek komory. Następnie przepłukać komorę 1x PBS (2 mL na każdą komorę).
- Używając specjalnie zaprojektowanej przystawki do krojenia (Rycina 2) i żyletki, wykroić eksplant chrząstki o średnicy 6 mm (płaszczyzna poprzeczna) o grubości 500-800 μm, obejmujący strefę powierzchowną. Utrzymywać eksplant w nawilżeniu za pomocą 1x PBS.
- Używając wybijaków do skóry i młotka, wykonać uszczelki z arkuszy gumowych, jak pokazano na Rycynie 7.
- Złożyć każdą połówkę komory transportowej, umieszczając w niej jedną dużą uszczelkę gumową, jedną wkładkę z PMMA i jedną małą uszczelkę gumową. Umieścić eksplant w otworach plastikowej wkładki, tak aby strefa powierzchowna była skierowana w stronę komory dopływowej. Złączyć obie połówki, aby dokończyć montaż, i mocno dokręcić za pomocą klucza (Rycina 7).
- Wypełnić komorę dopływową 2 mL 1x PBS-PI i sprawdzić, czy w komorze odpływowej nie występuje wyciek cieczy z komory dopływowej. W przypadku stwierdzenia wycieku należy ponownie złożyć komorę, korygując położenie uszczelek i siłę dokręcenia śrub. Jeśli wyciek nie występuje, wypełnić również komorę odpływową 2 mL 1x PBS-PI.
- Dodać mini-mieszadło magnetyczne do obu komór (dopływowej i odpływowej) i umieścić komorę na mieszadle magnetycznym. Ustawić komorę tak, aby laser ze spektrofotometru był skupiony na środku komory odpływowej. Umieścić odbiornik sygnału spektrofotometru za komorą odpływową (Rycina 8).
UWAGA: Laser i odbiornik spektrofotometru muszą być wyposażone w odpowiednie filtry w celu wzbudzenia, emisji i transmisji sygnałów z białka znakowanego fluorescencyjnie. Podczas eksperymentu chronić komorę transportową przed światłem, używając czarnej skrzynki, aby uniknąć zakłóceń sygnału fluorescencji. Dobrą praktyką jest uszczelnienie otworów na górze komory elastyczną folią, aby zapobiec parowaniu. - Zbierać odczyty emisji fluorescencji w czasie rzeczywistym z komory odpływowej i upewnić się, że sygnał jest stabilny przez co najmniej 5 min.
UWAGA: Jeśli specjalnie zaprojektowany spektrofotometr lub półprzezroczysta komora transportowa nie są dostępne, można pobrać alikwoty z komory odpływowej i ocenić fluorescencję za pomocą czytnika płytek. - Pipetować uprzednio obliczoną objętość roztworu zapasowego CPC znakowanych fluorescencyjnie do komory dopływowej, aby zapewnić końcowe stężenie 3 μM wewnątrz komory dopływowej. Obserwować sygnał fluorescencji w komorze odpływowej i poczekać, aż transport substancji rozpuszczonej osiągnie stały wzrost nachylenia krzywej.
UWAGA: Grubszy eksplant chrząstki będzie wymagał więcej czasu do osiągnięcia stanu stacjonarnego. - Po osiągnięciu stanu stacjonarnego pobrać 20 μL z komory dopływowej i dodać do komory odpływowej („test spike”).
UWAGA: Zaobserwowany zostanie skok fluorescencji w komorze odpływowej. Pozwoli to na korelację między odczytami fluorescencji a stężeniem CPC. - Zbierać odczyty fluorescencji w czasie rzeczywistym z komory odpływowej.
Rysunek 6: Projektowana komora transportu dyfuzyjnego stanu niestacjonarnego.Parametry konstrukcyjne komory transportu dyfuzyjnego stanu niestacjonarnego wykonanej z PMMA. Komora musi być półprzezroczysta, aby nie zakłócać odczytów fluorescencji. Kompletna komora transportowa składała się z dwóch identycznych połówek przedstawionego elementu. Do zapewnienia wyrównania i całkowitego zamknięcia połówek komory wymagane były dwa cylindryczne bolce ze stali nierdzewnej (średnica ~2,94 mm, długość ~18 mm). W każdym narożniku komory wykonano cztery identyczne gniazda na śruby z gwintem 6-32 w celu zapewnienia szczelnego montażu śrubowego. Wszystkie wartości liczbowe podano w milimetrach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 7: Montaż komory transportowej do dyfuzji nieustalonej.Parametry konstrukcyjne (A) czarnych wkładek z PMMA oraz (B) dużych i małych uszczelek gumowych. Grubość uszczelek gumowych dostosowano tak, aby zapewnić szczelne zamknięcie komory. Wszystkie wartości liczbowe podano w mm. (C) Schemat przedstawiający kolejność montażu dwóch połowy komory transportowej z eksplantem chrząstki umieszczonym w centrum. SZ oznacza strefę powierzchowną chrząstki, która była skierowana w stronę komory dopływowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 8: Schemat eksperymentów z dyfuzją nierównowagową. Wycięcia chrząstki (średnica 6 mm x grubość 1 mm) umieszczono w centrum komory transportowej, powierzchnią powierzchowną skierowaną w stronę komory dopływowej. Zarówno stronę dopływową, jak i odpływową komory wypełniono 1x PBS-PI i wymieszano za pomocą mini magnesa do mieszania. Przy laserze skierowanym w stronę komory odpływowej w celu zbierania odczytów fluorescencyjnych, do komory dopływowej dodano roztwór CPC znakowany fluorescencyjnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po osiągnięciu równowagi absorpcji CPC przez chrząstkę fluorescencja kąpieli spada, gdy substancja rozpuszczona zostanie pobrana przez tkankę. Jednakże, jeśli wartość fluorescencji końcowej kąpieli pozostaje zbliżona do początkowej, wskazuje to na brak lub minimalne pobranie substancji rozpuszczonej. Innym potwierdzeniem pobrania substancji rozpuszczonej jest widoczna zmiana koloru tkanki na kolor barwnika fluorescencyjnego. Ilościowe pobranie substancji rozpuszczonych w chrząstce określono za pomocą współczynnika pobran...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane tutaj metody i protokoły mają znaczenie dla dziedziny celowanego dostarczania leków do ujemnie naładowanych tkanek. Ze względu na duże zagęszczenie ujemnie naładowanych agrekanów obecnych w tych tkankach, tworzy się bariera, zapobiegając w ten sposób przedostawaniu się leków do ich docelowych miejsc komórkowych, które leżą głęboko w macierzy. Aby sprostać temu wyjątkowemu wyzwaniu, leki mogą być modyfikowane w taki sposób, aby zawierały dodatnio naładowane nośniki leków, które mogą zwiększyć szybkość transportu
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Departament Obrony Stanów Zjednoczonych poprzez Kongresowo Kierowane Programy Badań Medycznych (CDMRP) na podstawie umowy W81XWH-17-1-0085, oraz National Institute of Health R03 EB025903-1. AV został sfinansowany przez stypendium dziekana College of Engineering na Northeastern University.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 316 Podkładka SAE ze stali nierdzewnej | McMaster-Carr | 91950A044 | Do rozmiaru numer 5, 0,14 "ID, 0,312" OD |
| 96-dołkowa płyta polistyrenowa | Fisherbrand | 12566620 | |
| akrylowy gruby arkusz | Reynolds Polymer | N/A | Do dyfuzji nierównowagowej i komory transportowej dyfuzji 1-D |
| Antybiotykowo-przeciwgrzybiczo | Gibco | 15240062 | 100x |
| chrząstki bydlęcej | 87 | N/A | 2-3 tygodnie, rowek udowo-rzepkowy |
| Surowica bydlęca Albumina | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Specjalnie zaprojektowany peptyd |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Specjalnie zaprojektowany peptyd |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Niestandardowy zaprojektowany peptyd |
| Delikatne wycieraczki do zadań | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dziurkacz skórny | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 i 6 mm |
| Ekonomiczne szkiełka mikroskopowe ze zwykłego szkła | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Płaskie płytki do hodowli komórkowych | Corning Costar | 3595 | Clear, 96-dołkowa |
| elastyczna folia do pakowania | Bemis Parafilm M Laboratoryjna | ||
| Nauki | 6378701 | # 1,5, 18x18 mm | |
| Dziurkacz napędzany młotkiem | McMaster-Carr | 3427A15 | Dziurkacz o średnicy 1/2 " |
| McMaster-Carr | 3427A19 | Średnica 3/4 " | |
| Laserowa technologia chrominancji | AT480 / 30m | Spektrofotometr laserowy | |
| Lekka nakrętka sześciokątna ze stali o niskiej wytrzymałości | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Rozmiar gwintu |
| LSM 700 Mikroskop konfokalny | Zeiss | LSM 700 | |
| Mikro magnetyczne pręty mieszające | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 mm |
| Uniwersalny arkusz gumy neoprenowej | McMaster-Carr | 1370N12 | /32 "Grubość |
| beztłuszczowego suszonego mleka krowiego | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Szalka Petriego | Chemglass Nauki przyrodnicze | CGN1802145 | średnicy 150 mm |
| Corning | 21-040-CMR | 1x | |
| Wytrząsarka płytkowa | VWR | 89032-088 | |
| Inhibitory proteazy | Thermo Scientific | A32953 | |
| Żyletki | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Akrylowy cienki arkusz | Reynolds Polymer | N/A | Czarne wkłady komory transportowej |
| RTV Silikon | Loctite | 234323 | Epoksyd, niekorozyjny, przezroczysty |
| Skalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 ostrza |
| Odbiornik sygnału | Chroma Technology | ET515lp | Spektrofotometr Odbiornik sygnału laserowego |
| Mikrowirówka zatrzaskowa Probówki | Eppendorf | 22363204 | 1,5 ml |
| TedPella | 13508 | ||
| Synergy H1 Czytnik mikropłytek | Biotek | H1M | |
| Śruba z walcowym ze stali stopowej | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Rozmiar gwintu, 1" długości |
Bibliografia
- Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
- Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, Pt 2 335-347 (1976).
- Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
- Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
- Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238(2019).
- Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898(2020).
- Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
- Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
- Martel-Pelletier, J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
- Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125(2011).
- Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. Progress in intra-articular therapy. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).
- He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
- Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
- Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882(2020).
- Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
- Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
- Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
- Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
- Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
- Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683(2013).
- Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
