Method Article

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

DOI:

10.3791/61342

⸱

December 18th, 2020

 , 
1Department of Chemistry, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Memory & Alzheimer's Center, Vanderbilt University Medical Center, 3Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt University Medical Center, 4Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona strategia multipleksowania próbek, która jest w stanie zwiększyć liczbę próbek, które mogą być analizowane jednocześnie z dostępnymi znacznikami izobarycznymi. Zastosowanie platformy robotycznej znacznie zwiększyło przepustowość eksperymentalną, powtarzalność i dokładność ilościową.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadziliśmy wysokoprzepustowy ilościowy przepływ pracy proteomiki, połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) zdolne do multipleksowania do 22 lub 24 próbek z tandemowymi znacznikami masowymi lub izobarycznymi znacznikami N,N-dimetyloleucyny izobarycznej, odpowiednio, w jednym eksperymencie. To ulepszone multipleksowanie próbek znacznie skraca czas akwizycji spektrometrii mas i zwiększa użyteczność drogich komercyjnych odczynników izobarycznych. Jednak ręczny proces obsługi próbek i etapów pipetowania w ramach strategii może być pracochłonny, czasochłonny i powodować utratę próbki oraz błąd ilościowy. Ograniczenia te można przezwyciężyć poprzez włączenie automatyzacji. W tym przypadku przenieśliśmy ręczny protokół cPILOT do zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy, które może równolegle przygotowywać duże liczby próbek (tj. 96 próbek). Ogólnie rzecz biorąc, automatyzacja zwiększa wykonalność i powtarzalność cPILOT oraz pozwala na szerokie zastosowanie przez innych badaczy z porównywalnymi urządzeniami do automatyzacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) jest niezbędnym narzędziem badawczym w identyfikacji biomarkerów specyficznych dla choroby, zrozumieniu postępu choroby i tworzeniu wskazówek dla rozwoju terapii. Można to osiągnąć na podstawie szeregu próbek klinicznych związanych z chorobą, takich jak surowica/osocze krwi, płyny proksymalne i tkanki1,2. Odkrywanie i walidacja biomarkerów proteomicznych zyskały ostatnio duże zainteresowanie ze względu na moc strategii multipleksowania próbek3,4. Multipleksowanie próbek to technika, która umożliwia jednoczesne porównanie i kwantyfikację dwóch lub więcej warunków próbki w ramach jednego wstrzyk5,6. Multipleksowanie próbek uzyskuje się poprzez kodowanie kreskowe peptydów lub białek z wielu próbek ze znacznikami chemicznymi, enzymatycznymi lub metabolicznymi i uzyskiwanie informacji o MS ze wszystkich próbek w jednym eksperymencie MS lub MS/MS. Wśród dostępnych znaczników izobarycznych znajdują się odczynniki do znakowania izobarycznego (iTRAQ), komercyjne tandemowe znaczniki masowe (TMT) oraz syntetyzowane w domu odczynniki izobaryczne N,N-dimetyloleucyny (DiLeu) o możliwościach odpowiednio do 16-plex7 i 21-plex8.

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona technologia multipleksowania próbek. cPILOT łączy znakowanie izotopowe N-końców peptydu z lekkimi [−(CH3)2] i ciężkimi [−(13C2H3)2] izotopami o niskim pH (∼2,5), co utrzymuje dostępność reszty lizyny do późniejszego znakowania izobarycznego o wysokim pH (8,5) za pomocą TMT, DiLeu, lub iTRAQ tagging3,9,10,11,12,13,14. Schemat podwójnego znakowania w ramach strategii cPILOT przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1 z dwiema próbkami przy użyciu przykładowego peptydu. Dokładność i precyzja kwantyfikacji opartej na TMT na poziomie MS2 może być zagrożona ze względu na obecność zanieczyszczających jonów współizolowanych i współfragmentowanych, określanych jako efekt interferencji15. To ograniczenie w niedokładnych proporcjach jonów reporterowych można przezwyciężyć za pomocą tribrydowych spektrometrów masowych Orbitrap. Na przykład efekt interferencji można przezwyciężyć poprzez wyizolowanie piku w dimetylowanej parze na poziomie MS1 w spektrometrze masowym, poddanie lekkiego lub ciężkiego piku fragmentacji MS2 w liniowej pułapce jonowej, a następnie poddanie najbardziej intensywnego fragmentu MS2 HCD-MS3 w celu uzyskania informacji ilościowych. W celu zwiększenia szans na wybór peptydów bez amin lizynowych dostępnych do generowania jonów reporterowych, można również zastosować selektywną akwizycję MS3 na podstawie fragmentu y-1 i jest to podejście, które może skutkować wyższym procentem peptydów kwantyfikowalnych za pomocą cPILOT9. Połączenie lekkiego i ciężkiego znakowania zwiększa możliwości multipleksowania próbek 2-krotnie w porównaniu z indywidualnymi znacznikami izobarycznymi. Ostatnio użyliśmy cPILOT do połączenia do 24 próbek w jednym eksperymencie za pomocą odczynników DiLeu16. Dodatkowo cPILOT został wykorzystany do badania oksydacyjnych modyfikacji potranslacyjnych14, w tym nitrowania białek17, innych globalnych proteomów9, i zademonstrował zastosowania w wielu próbkach tkanek w mysim modelu choroby Alzheimera11.

Solidne przygotowanie próbki jest kluczowym krokiem w eksperymencie cPILOT i może być czasochłonne, pracochłonne i rozległe. Ulepszone multipleksowanie próbek wymaga intensywnego pipetowania i wysoko wykwalifikowanego personelu laboratoryjnego, a ponadto istnieje kilka czynników, które mogą mieć duży wpływ na odtwarzalność eksperymentu. Na przykład konieczne jest ostrożne obchodzenie się z próbkami, aby zapewnić podobny czas reakcji dla wszystkich próbek i utrzymać odpowiednie pH buforu dla lekkich i ciężkich próbek dimetylowanych. Co więcej, ręczne przygotowanie dziesiątek do setek próbek może wprowadzić wysoki błąd eksperymentalny. W związku z tym, aby zmniejszyć zmienność przygotowania próbek, poprawić dokładność ilościową i zwiększyć przepustowość eksperymentów, opracowaliśmy zautomatyzowany przepływ pracy cPILOT. Automatyzację osiąga się za pomocą zrobotyzowanego urządzenia do obsługi cieczy, które może wykonywać wiele aspektów przepływu pracy (ilustracja 1). Przygotowanie próbki, od kwantyfikacji białka do znakowania peptydów, przeprowadzono na zautomatyzowanym urządzeniu do obsługi cieczy. Zautomatyzowana maszyna do obsługi cieczy jest zintegrowana z aparatem nadciśnieniowym (PPA) do wymiany między płytkami do ekstrakcji do fazy stałej (SPE), wytrząsarką orbitalną i urządzeniem grzewczym/chłodzącym. Platforma robotyczna zawiera 28 miejsc na pokładzie, w których można umieścić płyty i zderzaki. Znajdują się tam dwie saszetki z chwytakiem do przenoszenia płytek w miejscach pokładu: 96-kanałowa głowica pipetująca o stałej objętości (5-1100 μl) i 8-kanałowa sonda o zmiennej objętości (1-1000 μl). Sterowanie platformą robotyczną odbywa się za pomocą oprogramowania. Użytkownik musi zostać profesjonalnie przeszkolony przed rozpoczęciem korzystania ze zrobotyzowanej ładowarki do cieczy. Niniejsze badanie koncentruje się na automatyzacji ręcznego przepływu pracy cPILOT, który może być pracochłonny w przypadku przetwarzania więcej niż 12 próbek w jednej partii. Aby zwiększyć wydajność podejścia cPILOT11, przenieśliśmy protokół cPILOT do zrobotyzowanego urządzenia do obsługi cieczy, aby przetwarzać ponad 10 próbek równolegle. Automatyzacja pozwala również na podobne reakcje dla każdej próbki równolegle na różnych etapach procesu przygotowania próbki, co wymagało wysoko przeszkolonych użytkowników podczas ręcznego cPILOT. Protokół ten koncentruje się na wdrożeniu zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy w celu przeprowadzenia cPILOT. Niniejsze badanie opisuje protokół korzystania z tego zautomatyzowanego systemu i demonstruje jego działanie za pomocą 22-pleksowej analizy "proof-of-concept" homogenatów wątroby myszy.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie w Pittsburghu. Jeden samiec myszy kontrolnej (C57/BLJ) został zakupiony komercyjnie i umieszczony w Wydziale Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie w Pittsburghu. Myszy karmiono standardową karmą laboratoryjną dla gryzoni ad libitum i trzymano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Tkanka wątroby została pobrana i przechowywana w temperaturze -80 °C.

1. Ekstrakcja białka

UWAGA: Te kroki są wykonywane ręcznie.

  1. Przemyć wątrobę myszy (100 mg) solą fizjologiczną i homogenizować 500 μl 8 M mocznika za pomocą homogenizatora mechanicznego z użyciem kulek A matrycy lizującej A przez 4 m/s przez 20 s.
    UWAGA: W tym badaniu inhibitory proteazy lub fosfatazy nie zostały dodane, ale w razie potrzeby można je dodać do buforu, na podstawie eksperymentu. Ponadto etapy ekstrakcji białek można odpowiednio dostosować do różnych typów próbek.
  2. Przenieść homogenat tkankowy do nowej probówki do mikrowirówki, przepłukać i połączyć probówki do lizy ze 100-500 μl PBS z 8 M mocznikiem.
  3. Odwirować homogenizowane tkanki (12 800 x g, 4 °C i 15 min) i zebrać supernatant.
    UWAGA: Pozostałe kroki wykonywane są na zrobotyzowanej ładowarce do cieczy dostępnej w laboratorium użytkownika. Osoba zajmująca się obsługą cieczy musi być zdolna do zasysania i dozowania z i do określonych typów płytek ANCI, przy minimalnym udziale operatora.
  4. Oznaczyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Włącz PPA, urządzenie grzewcze/chłodzące oraz pompy próżniowe i podłącz wszystkie akcesoria do obsługi cieczy. Urządzenie do obsługi cieczy świeci niebieskim światłem, gdy jest podłączone do komputera i gotowe do pracy.
  6. Do płytki odczynnika 1 (płytki 96-dołkowej) dodać 30 μl 25 mM 1,4-ditiotreitolu (DTT), 25 mM 30 μl cysteiny i 25 mM 30 μl jodoacetamidu (IAA) odpowiednio do rzędów 1, 2 i 3.
  7. Dodać 8 M mocznika i 20 mM Tris z 10 mM CaCl2 (pH 8,2) do płytki zbiornika. Dodać 500 μl 5% kwasu mrówkowego do 2 ml płytki z dużą studzienką, 20 μl trypsyny do rzędu 1 płytki trypsynowej i umieścić w miejscu pokładu zgodnie z metodą.
    UWAGA: IAA i trypsyna zostały dodane do płytki 96-dołkowej przed dodaniem do próbki.
  8. Porcję 300 μl wątroby homogenate rozlać do probówki o pojemności 500 μl, umieścić na płytce o pojemności 2 ml i umieścić w temperaturze 4 °C do rozpoczęcia protokołu. W tym eksperymencie wygenerowano 22 podwielokrotności z pojedynczego homogenatu wątroby.
    UWAGA: Dodać wzorzec wewnętrznej kontroli jakości (np. alfakazeina bydlęca lub inne białko egzogenne) o stosunku 1 μg wzorzec do 100 μg próbki białka.
  9. Określ objętość, które mają być dodane do próbek, za pomocą nazw zmiennych i wartości zgodnie z tabelą 1. Na podstawie BCA wprowadzić objętość próbki i bufor normalizacyjny (8 M mocznika) do arkusza kalkulacyjnego i dołączyć do oprogramowania (Tabela 2).
    UWAGA: Dalsze rozcieńczanie buforem może być konieczne, jeśli stężenie białka jest zbyt wysokie. Uzyskane stężenia dla próbki z tkanki wątroby wynosiły 10 μg/μl. Objętość zoptymalizowano dla 100 μg białka.
  10. Wyjąć probówki z próbkami o temperaturze 4 °C, umieścić je w określonym miejscu na pokładzie automatycznego urządzenia do obsługi cieczy i pozostawić do ogrzania na 10 minut.
  11. Otwórz metodę i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby umieścić wymagane końcówki (1070, 90 i 230 μl) oraz sprzęt laboratoryjny w żądanych pozycjach. Gdy wszystkie materiały laboratoryjne i wskazówki są na swoim miejscu, sprawdź je z ostatecznym układem talii i kliknij Dalej, aby kontynuować protokół.
    UWAGA: Konfiguracja z przewodnikiem informuje użytkownika o konieczności dodania wymaganej objętości bufora do określonego sprzętu laboratoryjnego w zależności od protokołu i lokalizacji pokładu, który ma być przechowywany.

2. Redukcja próbki, alkilacja i trawienie

  1. Załadować końcówki o pojemności 230 μl i odessać 90 μl 8 M mocznika ze zbiornika i dozować do rzędu 1 czarnej płytki głębinowej o pojemności 2 ml. Rozładuj końcówki. Powtarzać ten etap do momentu dodania 8 M mocznika do wszystkich studzienek odpowiadających 22 próbkom.
    UWAGA: Bufor denaturacyjny rozwija trójwymiarową strukturę białka, aby uzyskać pierwotną strukturę, dzięki czemu trypsyna może działać i skutecznie rozbijać białko. Pipeta 8-kanałowa może zasysać różne objętości dla 8 kanałów i może dozować do różnych miejsc w sprzęcie laboratoryjnym. W tym kroku wszystkie kanały zasysały tę samą głośność, która została zdefiniowana w oprogramowaniu.
  2. Po dodaniu buforu denaturacyjnego załadować końcówki o pojemności 90 μl i odessać 10 μl (co odpowiada 100 μg) homogenatu wątroby myszy za pomocą pipety 8-kanałowej do czarnej płytki z 2 ml dołka głębokiego. Rozładuj końcówki. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie 22 próbki zostaną przeniesione.
  3. Po każdym przeniesieniu należy wykonać etap mieszania, aby zassać i trzykrotnie dozować 50 μl zawartości studzienki, aby zapewnić wymieszanie białka z buforem w celu wykazania stosunku 1:1.
    UWAGA: Wyjąć podstawową próbkę homogenatu i umieścić w temperaturze -80 °C.
  4. Aby zredukować zdenaturowane białka, załaduj jeden rząd końcówek o pojemności 90 μl i odessaj 3 μl DTT z płytki odczynnika 1. Dozuj naziemną telewizję cyfrową do rzędów 1 i 2 czarnej płytki głębinowej o pojemności 2 ml i rozładuj końcówki.
    UWAGA: Stosunek molowy białka do DTT jest utrzymywany na poziomie 1:40 w celu redukcji wiązań dwusiarczkowych. Obliczenie stosunku molowego opiera się na masie białkowej albuminy surowicy bydlęcej (BSA), która wynosi 66,5 x 103 g/mol.
  5. Uszczelnić płytkę z próbką folią aluminiową i inkubować w temperaturze 37 °C przez 600 s przy 300 obr./min.
  6. Dodać 30 μl 0,25 M IAM do rzędu 3 płytki odczynnika 1 tuż przed użyciem i umieścić na pokładzie. Rozszczelnić płytkę z próbką i wrócić do pokładu.
    UWAGA: IAM jest wrażliwy na światło.
  7. Załadować jeden rząd końcówek o pojemności 90 μl, zassać 6 μl IAM z płytki odczynnikowej 1 w rzędzie 3 i dozować do rzędu 1 płytki z próbką. Rozładuj końcówki.
    UWAGA: Stosunek molowy białka do IAM utrzymuje się na poziomie 1:80 dla każdej próbki. Ta reakcja musi być wykonana w ciemności.
  8. Uszczelnić płytkę z próbką i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut przy 300 obr./min na urządzeniu grzewczo-chłodzącym.
    UWAGA: Uszczelnienie płytki wykonuje się, aby zapobiec prześwietleniu próbki, parowaniu i rozlaniu się ze studni.
  9. Rozszczelnić płytkę z próbką i załadować jeden rząd końcówek o pojemności 90 μl i odessać 5 μl cysteiny z płytki odczynnika 1 w rzędzie 2. Dozować do rzędów 1 i 2 płytki z próbką i rozładować końcówki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    UWAGA: Stosunek molowy białka do L-cysteiny utrzymuje się na poziomie 1:40.
  10. Umieść płytkę próbki na wytrząsarce orbitalnej, aby wykonać czasowe wstrząsy z prędkością 1800 obr./min przez 30 minut.
  11. Dodać 800 μl 20 mM buforu Tris z 10 mM CaCl2 (pH 8,2) do każdego dołka płytki z próbką, aby rozcieńczyć stężenie mocznika do 2 M. Rozładować końcówki.
    UWAGA: Aktywność trypsyny jest utrudniona przy wyższych stężeniach mocznika i dlatego musi być zmniejszona do mniej niż 2 M. Badanie to przeprowadzono ze stosunkiem molowym białka do trypsyny wynoszącym 50: 1 przez 14 godzin.
  12. Dodać 20 μl trypsyny do rzędu 1, kolumny 1-12 płytki 96-dołkowej i umieścić w określonym miejscu na pokładzie.
  13. Załadować jeden rząd końcówek o pojemności 90 μl, zassać 2 μl trypsyny z rzędu 1 płytki trypsyny i dozować do rzędów 1 i 2 płytki do próbki. Rozładuj końcówki.
  14. Uszczelnić płytkę i inkubować przez 14 godzin w temperaturze 37 °C przy 600 obr./min na urządzeniu ogrzewającym/chłodzącym.
  15. Po inkubacji rozszczelnić płytkę z próbką i dodać 5% kwasu mrówkowego do rzędu 3, kolumny 1-12 płytki do pobierania próbek ze studni głębinowej i umieścić ją na określonym pokładzie.
  16. Zatrzymać trawienie, dodając 150 μl 5% kwasu mrówkowego z rzędu 3 płytki z kwasem mrówkowym i dozować do płytki próbki w rzędach 1 i 2. Rozładuj końcówki.

3. Odsalanie krok 1

  1. Odsolić peptydy płytką SPE zawierającą 20 mg materiału C-18. Ustal objętość dla każdej wymiany buforu na 600 μl i ustal ciśnienie na 100 mbar.
  2. Załaduj końcówki o pojemności 1070 μl i odessaj 600 μl acetonitrylu i dozuj do rzędów 1 i 2 płytki SPE. Umieść płytkę SPE na PPA i dociśnij.
  3. Za pomocą tych samych końcówek odessać 600 μl acetonitrylu i dozować do rzędów 1 i 2 płytki SPE. Umieść płytkę SPE na PPA i dociśnij.
    UWAGA: Przepływ można odprowadzić do odpadów za pomocą pompy ssącej.
  4. Załaduj końcówki o pojemności 1070 μl i odessaj 600 μl buforu A (100 % wody w 0,1 % kwasie mrówkowym) i dozuj do rzędów 1 i 2 płytki SPE. Umieść płytkę SPE na PPA i dociśnij.
    UWAGA: Jeśli objętość bufora nie zmniejsza się znacząco, spróbuj zwiększyć ciśnienie lub czas.
  5. Załadować 2 rzędy końcówek o pojemności 1070 μl, odessać 534 μl strawionych próbek i dozować do rzędów 1 i 2 płytki SPE. Umieść płytkę SPE na PPA i dociśnij. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie próbki zostaną załadowane.
    UWAGA: Ponieważ całkowita objętość po dodaniu kwasu mrówkowego wyniesie 1068 μL, a próbki zostały dodane w dwóch przejściach.
  6. Załaduj 2 rzędy zużytych końcówek o pojemności 1070 μl, odessaj 600 μl buforu A i dozuj do rzędów 1 i 2 płytki SPE. Umieść płytkę SPE na PPA i dociśnij.
  7. Powtórz powyższy krok raz, aby wyczyścić próbkę.
  8. Załaduj 1 rząd końcówek o pojemności 1070 μl, odessaj 600 μl ACN: Woda (60:40) i dozuj do rzędów 1 i 2 płytki SPE. Umieść płytkę SPE na wierzchu płytki zbiorczej, aby wymyć peptydy za pomocą PPA i przyłożyć ciśnienie.
  9. Powtórz powyższy krok, aby wymyć peptydy na płytce zbiorczej. Wysuszyć płytkę zbiorczą do wyschnięcia i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu dalszej obróbki.

4. Etykietowanie dimetylacji (N-końce peptydu)

  1. Umieść wymagane końcówki (1070, 90 i 230 μl) i sprzęt laboratoryjny w żądanych pozycjach w oprogramowaniu. Gdy wszystkie przybory laboratoryjne i wskazówki znajdą się na miejscu, sprawdź ostateczny układ talii i kliknij Dalej, aby kontynuować protokół.
  2. Do płytki odczynnika 2 dodać 450 μl 1% kwasu octowego, 50 μl jasnego formaldehydu (CH2O), 50 μL ciężkiego formaldehydu (13CD2O) i 150 μl kwasu mrówkowego odpowiednio do rzędów 1, 2, 3 i 4.
  3. Na płytkę odczynnika 3 dodać 50 μl lekkiego CB, 50 μL ciężkiego CB do rzędów 1 i 2 oraz 50 μL amoniaku do wiersza 3 i 4.
  4. Załadować 2 rzędy końcówek o pojemności 230 μl i zassać 100 μl 1% kwasu octowego z rzędu 1 płytki odczynnikowej 2 i dozować do wysuszonych peptydów puchowych na płytce próbki 2 (płytka zbiorcza z etapu odsalania) w rzędach 1 i 2 i wykonać wytrząsanie z czasem przez 5 minut przy 1800 obr./min.
  5. Załadować końcówki o pojemności 90 μl i zassać 16 μl 60 mM (4%) CH2O (37% wag./v) z rzędu 2 płytki odczynnika 2 i dozować do rzędu 1 płytki z próbką. Rozładuj końcówki.
  6. Załadować 1 rząd końcówek o pojemności 90 μl i zassać 16 μl 60 mM (4%) 13CD2O (20% wag./v) z rzędu 3 płytki odczynnikowej 2 i dozować do rzędu 2 płytki z próbką. Rozładuj końcówki.
    UWAGA: W tym badaniu rząd 1 odpowiada lekkim, a rząd 2 odpowiada ciężkim próbkom dimetylowym (patrz rysunek 1).
  7. Załadować 2 rzędy końcówek o pojemności 90 μl i zassać 16 μl 24 mM NaBH3CN i 24 mM NaBD3CN z rzędu 1 i 2 płytki odczynnikowej 3 i dozować odpowiednio do rzędów 1 i 2 płytki z próbką.
  8. Rozładuj końcówki i wykonuj czasowe wstrząsy przez 15 minut przy 1800 obr./min za pomocą wytrząsarki orbitalnej.
    UWAGA: Dodanie cyjanoborowodorku sodu inicjuje reakcję, dlatego w celu zmniejszenia zmienności między eksperymentami ten etap wykonuje się raz na partię.
  9. Załaduj 2 rzędy końcówek o pojemności 90 μl i odessaj 32 μl 1% amoniaku (~28-30% v/v) z rzędów 3 i 4 płytki odczynnika 3 i dozuj odpowiednio do rzędów 1 i 2 płytki próbki 2. Rozładuj końcówki.
    UWAGA: Dodanie amoniaku zatrzymuje reakcję, dlatego w celu zmniejszenia zmienności między eksperymentami ten krok jest wykonywany raz na partię.
  10. Połączyć równe objętości lekkich i ciężkich (1:1) dimetylowanych peptydów na nowej płytce głębinowej o pojemności 2 ml w celu odsalania.
    UWAGA: W tym badaniu 90 μl zawartości studzienki z rzędu 1 połączono z 90 μl z rzędu 2 z płytki próbki 2 na nową płytkę zbiorczą o pojemności 2 ml (płytka próbki 3). Stosunek mieszania lekkiego do ciężkiego zależy od protokołu eksperymentalnego, w tym badaniu zastosowano stosunek 1:1.
  11. Załadować 2 rzędy końcówek o pojemności 230 μl i zassać 32 μl 5% kwasu mrówkowego do połączonych próbek i przeprowadzić wytrząsanie w określonym czasie przez 30 s przy 1800 obr./min.
    UWAGA: Skuteczność dimetylacji zależy od pH mieszaniny reakcyjnej, a każda zmiana pH buforu spowoduje niepełne znakowanie N-końców peptydu. Skuteczność dimetylacji powinna być większa niż 97%, gdy jest poszukiwana jako dynamiczna modyfikacja na N-końcach peptydu. W tym badaniu skuteczność znakowania lekkich i ciężkich peptydów wynosiła odpowiednio 99,7% i 99,5%.

5. Odsalanie krok 2

  1. Odsalanie próbki należy przeprowadzić w sposób podobny do etapu odsalania 1 dla połączonych próbek.
  2. Wysuszyć próbki na płytce z próbką za pomocą odkurzacza o dużej prędkości i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.

6. Znakowanie izobaryczne (pozostałości Lys)

  1. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi konfiguracji sprzętu laboratoryjnego i umieść wymagane końcówki (1070, 90 i 230 μl) w odpowiednich. Gdy wszystkie przybory laboratoryjne i wskazówki znajdą się na miejscu, sprawdź ostateczny układ talii i kliknij Dalej, aby kontynuować protokół.
  2. Dodać 250 μl 100 mM wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB), 30 μl hydroksyloaminy (10% w/v) do wierszy 1 i 2 płytki odczynnika 4. Umieść probówki TMT na płytce głębinowej o pojemności 2 ml zgodnie z arkuszem kalkulacyjnym w tabeli 3.
  3. Przechowuj pustą probówkę o pojemności 1,5 ml w uchwycie na probówki, aby zebrać oznaczone peptydy. Umieść wysuszoną płytkę do pobierania próbek w P9, a płytkę do przetwarzania TMT w P14.
  4. Aby rozpuść peptydy, załaduj końcówki o pojemności 230 μl i odessaj 100 μl buforu 100 mM wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB) (pH ~ 8,5) z rzędu 1 na płytce TEAB i dozuj do wysuszonych peptydów w rzędzie 3 płytki z próbką 3. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 30 s przy 1800 obr./min.
    UWAGA: Rozpuścić 100 μg dimetylonowych peptydów w stężeniu 1 μg/μl.
  5. Załadować końcówki o pojemności 90 μl i odessać 10 μl bezwodnego acetonitrylu z H12 płytki TMT i dozować do każdej z wysuszonych probówek TMT.
  6. Wyjmij rurki TMT, odwiruj i szybko odkręć rurki i wróć na pokład w głębokiej płycie studziennej.
  7. Załadować 1 rząd końcówek o pojemności 90 μl i odessać 12,5 μl połączonych peptydów dimetylowanych i dozować do rzędu 1 płytki roboczej TMT. Rozładuj końcówki.
    UWAGA: W tym eksperymencie stosunek TMT: peptyd został utrzymany na poziomie 1:8.
  8. Załaduj 1 rząd końcówek o pojemności 90 μl i odessaj 10 μl TMT i dozuj do rzędu 1 płytki do przetwarzania TMT. Rozładuj końcówki, wykonuj potrząsanie na czas przez 1 godzinę przy 1800 obr./min.
  9. Załadować 1 rząd końcówek o pojemności 90 μl i odessać 8 μl hydroksyloaminy (10% w/v) z rzędu 2 na płytce TEAB i dozować do rzędu 1 płytki do przetwarzania TMT. Rozładuj końcówki, wykonuj czasowe wytrząsanie przez 15 minut przy 1800 obr./min.
  10. Połącz 30,5 μl peptydów znakowanych TMT z płytki technologicznej TMT z probówką o pojemności 1,5 ml. Rozładowuj napiwki po każdym transferze.
  11. Wyjąć probówkę z zebranymi próbkami i wysuszyć w celu odparowania acetonitrylu. Rozpuść peptydy w 0,2 ml wody w 0,1% kwasie mrówkowym i wróć na pokład.
    UWAGA: Skuteczność znakowania izobarycznego jest również zależna od pH, a skuteczność etykietowania powinna wynosić powyżej 98% zgodnie z instrukcjami producenta. W tym badaniu skuteczność znakowania TMT lekkich i ciężkich peptydów zakończonych lizyną wynosiła odpowiednio 99,4% i 99,5%.

7. Etap odsalania

  1. Przeprowadzić odsalanie próbki podobne do odsalania 1 dla jednej próbki.
  2. Wysuszyć próbki i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.

8. Chromatografia cieczowa – tandemowa spektrometria mas (LC-MS/MS) i MS3

  1. Rozpuść peptydy w wodzie klasy MS z 0,1% FA, aby uzyskać stężenie ~1 μg/μL. Próbki należy filtrować za pomocą probówek mikrowirówkowych zawierających filtr 0,65 μm. Odwirować peptydy przy 12 000 x g przez 3 minuty i umieścić przepływ w fiolce z automatycznym samplerem.
    UWAGA: W razie potrzeby stężenie peptydu można potwierdzić na tym etapie. Peptydy musiałyby zostać rozpuszczone w wodzie klasy LC-MS i poddane testowi peptydowemu BCA. W tym badaniu nie przeprowadzono testu BCA peptydów, a wszystkie ilości peptydów oparto na początkowym teście BCA białka.
  2. Przygotować fazy ruchomej w następujący sposób: 100% (v/v) wody z 0,1% FA (A) i 100% ACN z 0,1% FA (B).
  3. Wstrzyknąć 1 μl próbki do kolumny pułapki wypełnionej 2 cm materiału C18 (3 μm, 100 A wielkości porów).
    UWAGA: Czyszczenie próbki na syfon przebiega następująco: 10 min, 100% A; 2 μl/min przy użyciu systemu chromatografii cieczowej 2D.
  4. Uruchom metodę separacji analitycznej. Użyj kolumny kapilarnej o średnicy wewnętrznej 100 μm x 26 cm z laserową końcówką wypełnioną materiałem C18 (2.5 μm, 100 A). Nachylenie wynosi: 0-10 min, 10% B; 10-30 min, 10-15% B; 30-75 min, 15-30% B; 75-88 min, 30-60% B; 88-92 min, 60-90% B; 92-99 min, 90% B; 99-100 min, 90-10% B, 100-120 min, 10% B; 300 nL/min, 120 min.
  5. Uruchom akwizycję danych dla spektrometru mas, gdy uruchomiona jest metoda separacji analitycznej.
    1. Do skanowania ankiety MS należy użyć następujących parametrów: 375-1 500 m/z, rozdzielczość 120 000, czas cyklu 3 s (prędkość maksymalna), automatyczna kontrola wzmocnienia (AGC) cel 4.0e5, maksymalny czas wtrysku 50 ms.
    2. Użyj następujących parametrów dla CID-MS/MS z pułapką jonową: skany zależne od danych (DDA) na wynik, szerokość izolacji 2 m/z, 35% znormalizowana energia zderzenia (NCE), 0,25 q aktywacji, czas aktywacji 10 ms, 1,0e4 AGC, maksymalny czas wstrzykiwania 100 ms.
    3. Dla HCD–MS3 SPS 10 należy użyć następujących parametrów: Zakres skanowania 100-400 m/z, liczba zależnych skanów 10, AGC 5.0e4, maksymalny czas wstrzyknięcia 118 ms, energia zderzenia HCD 55%, okno izolacji MS2 2.

9. Analiza danych

  1. Przeszukaj wygenerowane pliki RAW w celu uzyskania listy białek i peptydów za pomocą oprogramowania do analizy białek w odpowiedniej bazie danych.
    UWAGA: Pliki RAW wygenerowane w tym badaniu zostały przeszukane w mysiej bazie danych Unprot .
  2. Ponieważ w jednym pliku RAW znajdują się zarówno lekkie, jak i ciężkie etykiety, przeszukaj każdy plik za pomocą dwóch przepływów pracy dla lekkich i ciężkich peptydów dimetylowanych.
  3. Przeszukaj pliki RAW w mysiej bazie danych Uniprot (13.07.2019) z sekwencją 53035 o następujących parametrach: rozszczepienie trypsyny z maksymalnie dwoma pominiętymi cięciami, peptyd o długości minimum 6 aminokwasów, tolerancja masy macierzystej 15 ppm, tolerancja fragmentacji 1 Da Modyfikacje statyczne: dimetylacja światła (+28,031, N-koniec peptydu) lub ciężka dimetylacja (+36,076 Da, N-koniec peptydu), karbamidomtyl (+57,021 Da, C), Modyfikacje dynamiczne: utlenianie (+15,995 Da, M), znacznik izobaryczny 11-plex (229,163 Da, K), 1% FDR, kwantyfikacja jonów reporterowych z tolerancją całkowania piku 30 ppm, najpewniejszy środek ciężkości dla metody całkowania.
    UWAGA: Ciężki dimetylowany pik zawiera również inną modyfikację, która wynosi ~7 Da (+35.069 Da, N-koniec peptydu) od lekkiego dimetylowanego piku i dlatego należy włączyć inny węzeł poszukiwawczy, aby uwzględnić również tę modyfikację.
  4. Przeprowadzić kwantyfikację jonów reporterowych w oparciu o intensywność, 65% zgodność masy SPS, średni stosunek S/N 10, korekcję izotopową, normalizację i skalowanie nie zostały wykonane.
    UWAGA: Normalizację i skalowanie można przeprowadzić na podstawie całkowitej ilości peptydu lub określonego białka dodanego do próbki. Próbki QC mogą być również włączane do kanałów w celu normalizacji międzystronicowej lub wewnątrzwsadowej w oparciu o dwustronne wewnętrzne odniesienie scaling18. Zanieczyszczenia izotopowe różnych kanałów TMT nie zostały podane w wyszukiwaniu, użytkownikom zaleca się dodanie zanieczyszczenia izotopowego różnymi jonami reporterowymi.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne dane MS peptydu zidentyfikowanego we wszystkich 22 kanałach jonów reporterowych z eksperymentu cPILOT 22-plex, w tym repliki przepływu pracy. Rysunek 2 (u góry) przedstawia podwójnie naładowaną parę pików oddzieloną odstępami 4 Da m/z, co wskazuje na pojedynczą grupę dimetylową wbudowaną w peptyd. Lekkie i ciężkie pary pików dimetylowanych zostały wyizolowane i rozdrobnione niezależnie, aby uzyskać sekwencję peptydu. Sekwencja peptydu to G(dimetylo)AAELMQQK(TMT-11plex) i odpowiada białku betainy-homocysteiny S-metylotransferazy. Najintensywniejsze jony fragmentacyjne zarówno dla lekkich, jak i ciężkich pików dimetylowanych (nie pokazane) zostały dodatkowo wyizolowane dla fragmentacji MS3, a jony reporterowe (m/z 126-131) pokazano na rysunku 2 (na dole). Intensywność jonów reporterowych jest wprost proporcjonalna do obfitości peptydów w próbce. Obfitość peptydów w próbkach sugeruje, że zdolność pipetowania platformy robotycznej jest dość jednolita we wszystkich 22 próbkach. Ogólnie rzecz biorąc, ten 22-pleksowy eksperyment cPILOT doprowadził do identyfikacji 1326 (1209-lekkich / 1181-ciężkich) białek wynikających z 3098 (6137-lekkich / 5872-ciężkich) peptydów (Tabela 4). Rysunek 3 przedstawia wykres pudełkowy obfitości log10 w funkcji całkowitej intensywności jonów reporterowych we wszystkich 22 kanałach, wykazując mniejszą zmienność między studzienkami/między próbkami. Ocenę całkowitej automatyzacji przeprowadzono poprzez zbadanie błędu w obfitości jonów reporterowych w każdym białku w 22 próbkach. Rysunek 4 pokazuje, że przetwarzanie próbek za pomocą platformy robotycznej skutkowało bardzo niskimi wartościami CV. W szczególności w 3098 zidentyfikowanych peptydach średni CV w obfitości jonów reporterowych wynosił 12,36% i 15,03% odpowiednio dla lekkich i ciężkich peptydów dimetylowanych. Spośród tych peptydów 2032 z tych peptydów miało sygnał jonów reporterowych powyżej minimalnego progu i uznano je za kwantyfikowalne.

figure-results-1
Rysunek 1. Eksperymentalny przepływ pracy do równoległego przetwarzania 22 próbek za pomocą zautomatyzowanego protokołu cPILOT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Oznaczanie ilościowe peptydów w 22 próbkach. Przykładowe widma MS (na górze) i MS3 (na dole) peptydu G(dimetylo)AAELMQQK(TMT-11plex) określone ilościowo w 22-pleksowym zautomatyzowanym eksperymencie cPILOT dla lekkich dimetylowanych (na dole po lewej) i ciężkich dimetylowanych (na dole po prawej) pików. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Wykres pudełkowy całkowitej intensywności jonów reporterowych w funkcji obfitości log10 22 próbek przy użyciu wykrywacza proteomu 2.3. Plik RAW był dwukrotnie przeszukiwany pod kątem lekkich i ciężkich peptydów, identyfikatorów białek oddzielnie z TMT jako modyfikacją dynamiczną, lekką (+28,031 Da) i ciężką (+36,076 i +35,069 Da) dimetylacją na N-końcach peptydu jako modyfikacją statyczną. Połączone wyszukiwanie ze wszystkimi powyższymi modyfikacjami zostało przeprowadzone przy użyciu Proteome Discover 2.3 w celu uzyskania Log 10 obfitości intensywności peptydów we wszystkich kanałach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Wykresy skrzypcowe współczynnika zmienności obfitości peptydów od zsumowanych intensywności jonów reporterowych w kanałach 126-131 m/z. Peptyd oznaczono ilościowo ze średnią wartością CV wynoszącą 12,36 i 15,03 dla lekkich (2373) i ciężkich (2533) peptydów kwantyfikowalnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1. Ilustracja cPILOTA z pojedynczym peptydem. Pokazując znakowanie izotopowe dwóch różnych próbek i znakowanie izobaryczne za pomocą TMT126, otrzymaną mieszaninę wstrzyknięto do MS dla LC-MS3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

powiedział: szt. powiedział: TGL powiedział: szt. szt. szt. szt.
Nazwa zmiennejwartośćopis
DesaltSamp11065Objętość, która ma być użyta do odsalania kroku 1
DesaltSamp2Okręg wyborczy 392Objętość, która ma być użyta do odsalania kroku 2
DesaltSamp3100Objętość, która ma być użyta do odsalania kroku 3
Tryb deweloperskifałszywyFalse skróci czas inkubacji do 30 sekund - True będzie podążać za czasem inkubacji w protokole.
Telewizja cyfrowa3Wolumen naziemnej telewizji cyfrowej
Płyta filtracyjnaPłyta używana do odsalania
Płyta filtraVol600Objętość do odsalania
HAWaterWashesfałszywyLiczba myć wodą na płycie SPE
IAMVol (Biblioteka)cyfra arabskaObjętość jodoacetamidu
PeptydTMTVolRozdział 12,5Objętość peptydu do znakowania TMT
ciśnienie100ciśnienie mbar w PPA
Przesunięcie temperatury1Zmiana temperatury
TMTVol10Objętość znacznika izobarycznego, który ma zostać dodany
TrisVol800Objętość do rozcieńczenia próbki przed mineralizacją
TrypsynaVolcyfra arabskaObjętość trypsyny
Korzystanie z licznika czasuprawdziwyWartość Prawda wyświetla opcje wywierania nacisku na blachę, jeśli jest to wymagane

Tabela 1. Lista zmiennych używanych w zautomatyzowanym protokole cPILOT.

Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział
Źródło wodyDilWell (Studnia)DestDestWell (Studnia)Objętość DilVolumeŹródło akcjiStockwellWolumin próbkiIdentyfikator próbki
8M_Urea1PróbkiKlasa A190Stock_SamplesKlasa A1101
8M_Urea1PróbkiKlasa A290Stock_SamplesKlasa A110cyfra arabska
8M_Urea1PróbkiKlasa A390Stock_SamplesKlasa A1103
8M_Urea1PróbkiFormat A490Stock_SamplesKlasa A1104
8M_Urea1PróbkiKlasa A590Stock_SamplesKlasa A1105
8M_Urea1PróbkiKlasa A690Stock_SamplesKlasa A1106
8M_Urea1PróbkiKlasa A790Stock_SamplesKlasa A1107
8M_Urea1PróbkiCiąg A890Stock_SamplesKlasa A1108
8M_Urea1PróbkiA990Stock_SamplesKlasa A1109
8M_Urea1PróbkiA1090Stock_SamplesKlasa A11010
8M_Urea1PróbkiAutostrada A1190Stock_SamplesKlasa A11011
8M_Urea1PróbkiCiąg A1290Stock_SamplesKlasa A11012
8M_Urea1PróbkiKlasa B190Stock_SamplesKlasa A11013
8M_Urea1PróbkiKlasa B290Stock_SamplesKlasa A11014
8M_Urea1PróbkiKlasa B390Stock_SamplesKlasa A11015
8M_Urea1PróbkiKlasa B490Stock_SamplesKlasa A11016
8M_Urea1PróbkiKlasa B590Stock_SamplesKlasa A11017
8M_Urea1PróbkiZobacz materiał B690Stock_SamplesKlasa A110Rozdział 18
8M_Urea1PróbkiKlasa B790Stock_SamplesKlasa A110Rozdział 19
8M_Urea1PróbkiZobacz materiał B890Stock_SamplesKlasa A11020
8M_Urea1PróbkiZobacz materiał B990Stock_SamplesKlasa A11021
8M_Urea1PróbkiZobacz materiał B1090Stock_SamplesKlasa A11022 Rozdział 22
8M_Urea1PróbkiZobacz materiał B1190Stock_SamplesKlasa A11023
8M_Urea1PróbkiZobacz materiał B1290Stock_SamplesKlasa A11024

Tabela 2. Objętość homogenatu wątroby myszy i 8 M mocznika.

)
Studnia źródłowaŹródłoWell2Reporter IonDestWell1DestWell2 (Studnia2głośnośćIdentyfikator próbki
Klasa A1Klasa C1126 Rozdział 126Klasa A1Klasa E1101
Klasa A3Zobacz materiał C3Zobacz materiał 127NKlasa A2Klasa E210cyfra arabska
Klasa A5Zobacz materiał C5Zobacz materiał 127CKlasa A3Targi E3103
Klasa A7Zobacz materiał C7128NFormat A4E4104
A9Zobacz materiał C9Zobacz materiał 128CKlasa A5E5105
Autostrada A11Zobacz materiał C11129NKlasa A6E6106
Klasa B2Zobacz materiał D2129CKlasa A7E7107
Klasa B4Klasa D4130NCiąg A8E8108
Zobacz materiał B6Zobacz materiał D6130CA9E9109
Zobacz materiał B8Zobacz materiał D8131NA10E101010
Zobacz materiał B10Zobacz materiał D10Zobacz materiał 131CAutostrada A11E111011

Tabela 3. Całkowita liczba peptydów, białek i dopasowań widmowych peptydów (PSM).

SZT. SZT.
Zautomatyzowany cPILOT
światłociężki
białka1209Numer katalogowy 1181
peptydyNumer katalogowy: 61375872
Moduły PSMNumer katalogowy: 14948Numer katalogowy: 16762

Tabela 4. Kodowanie kreskowe znaczników izobarycznych z lekkimi i ciężkimi oznakowanymi próbkami.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT to ulepszona strategia multipleksowania, która może analizować do 24 próbek w jednym eksperymencie. Zdolność multipleksowania zależy od liczby dostępnych kombinacji znakowania izotopowego i izobarycznego. Wprowadzenie TMTpro7, który jest w stanie oznaczyć 16 próbek w jednym eksperymencie, może przesunąć granice cPILOT do 32-plex. cPILOT składa się z wielu etapów pipetowania, a przygotowanie próbki wymaga dużej staranności i umiejętności użytkownika. Nawet w przypadku doświadczonego użytkownika błędy ręczne są nieuniknione, co zachęca do korzystania z platform robotycznych do przetwarzania próbek w strategii cPILOT. Ponieważ cPILOT wykorzystuje znakowanie peptydów w zależności od pH, pH musi być utrzymane dla lekkiego i ciężkiego zestawu próbek dimetylowanych. Łagodnie kwaśno-zasadowe pH może powodować dimetylację zarówno reszt N-końców, jak i lizyny. Zaletą cPILOT jest to, że wymaga tylko połowy znaczników izobarycznych, ponieważ N-końce peptydów są zajęte przez grupy dimetylowe. Pozwala to na etykietowanie większej liczby próbek przy kosztach o połowę niższych. Obsługa większej liczby próbek wymaga, aby czasy ekspozycji na odczynniki były podobne dla pierwszej i ostatniej próbki w partii. Dozownik do pipet, który może pomieścić do 32 próbek równolegle, można najlepiej osiągnąć przy użyciu zrobotyzowanych urządzeń do obsługi cieczy.

W celu przetwarzania wielu próbek przez cPILOT, ręczny przepływ pracy został zmodyfikowany w celu uwzględnienia automatyzacji. Zrobotyzowana maszyna do obsługi cieczy wykorzystana w tym badaniu jest wyposażona w dwie saszetki z 96-kanałową i 8-kanałową możliwością pipetowania, z chwytakiem do umieszczania płytek w dostępnych 28 lokalizacjach pokładu. Ciecz jest zintegrowana z aparatem nadciśnieniowym, wytrząsarką orbitalną oraz urządzeniem do podgrzewania/chłodzenia próbek w płytce 96-dołkowej. Aparat nadciśnieniowy pomaga w przeprowadzaniu wymiany w płytkach SPE podczas czyszczenia, podczas gdy wytrząsarka orbitalna pomaga w wirowaniu/mieszaniu próbek. Platforma robotyczna została zaprogramowana do zasysania i dozowania i próbek na płytki 96-dołkowe, inkubacji, próbek wirowych i płytek transferowych. Ciecze o różnej lepkości, takie jak acetonitryl i woda, wymagają szczególnych zasad pipetowania, które można również zaprogramować w tej metodzie.

Przebieg pracy w ramach projektu cPILOT, począwszy od kwantyfikacji białka za pomocą BCA, a skończywszy na znakowaniu peptydów znacznikami izobarycznymi (tj. TMT), został przeprowadzony w systemie obsługi cieczy. Cały protokół został przeskalowany tak, aby zawierał 96 płytek z głębokimi dołkami, które mogą pomieścić 2 ml na studzienkę. przygotowano przed rozpoczęciem eksperymentu i dodano do płytki 96-dołkowej, aby umożliwić równoległe przetwarzanie próbki. W niniejszym badaniu 22 powtórzenia przepływu pracy homogenatu wątroby myszy dodano do płytek głębokich i pobrano za pomocą protokołu cPILOT. Na koniec pojedynczą próbkę składającą się z 22-pleksowych peptydów oznaczonych równomolową wątrobą myszy wstrzyknięto do spektrometru mas. Natężenia jonów reporterowych odpowiadające obfitości peptydów w próbkach wykazały, że próbki przetwarzane za pomocą urządzenia do obsługi cieczy mają niższe CV niż w protokole ręcznym (dane nie pokazane). Platforma robotyczna znacznie poprawiła również odtwarzalność przetwarzania próbek. Powtarzalność i wytrzymałość są bardzo ważnymi czynnikami podczas przetwarzania dużej liczby próbek. Błędy pipetowania mogą prowadzić do całkowicie błędnej interpretacji danych, a w tym przypadku platforma robotyczna zapewniła niską zmienność między próbkami. Również zastosowanie platformy robotycznej do projektu cPILOT skróciło czas potrzebny na przygotowanie próbek. Na przykład, po opracowaniu metody automatycznej, przetworzenie 22 próbek zajęło 2,5 godziny w porównaniu do 7,5 godziny w przypadku ręcznego cPILOT. W naszym laboratorium prowadzone są eksperymenty mające na celu dalszą ocenę porównań ręcznych i zautomatyzowanych przepływów pracy cPILOT. Opierając się na wcześniejszych raportach z naszego laboratorium, CV% intensywności jonów reporterowych białka w ręcznym cPILOT wynosiły średnio 20%, przy czym niektóre wartości odstające przekraczały tę wartość12.

cPILOT to strategia derywatyzacji chemicznej na poziomie peptydów, którą można zastosować do dowolnego rodzaju próbki, takiej jak komórki, tkanki i płyny ustrojowe. cPILOT oferuje ulepszone multipleksowanie próbek, a dzięki zastosowaniu automatyzacji może ułatwić multipleksowanie próbek o wysokiej przepustowości w proteomice. Ta przepustowość jest niezbędna do dalszego pogłębiania wiedzy o chorobach i biologii oraz odkrywania biomarkerów.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Vanderbilt University Start-up Funds i nagrodzie NIH (R01GM117191) dla RASR.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki eppendorf 0,6 ml, 500 sztFisher Scientific05-408-120Probówki eppendorfa 0,6 ml są dowolna marki 0,6 ml
0,65 &mikro; m Ultrafree MC DV filtry odśrodkoweEMD MilliporeUFC30DV00
1,5 ml probówki eppendorfa, 500 sztFisher Scientific05-408-129Wystarczą probówki eppendorf dowolnej marki
ml płytka głębinowaAnalytical Sales and Services, Inc.59623-23BKGCWystarczy dowolna marka czarnej płytki 96-dołkowej
2 ml przezroczystej płytki głębinowejVWR75870-796
Kwas octowyJ.T. Baker9508-01
Acetonitryl - MS GradeFisher ScientificA955-4Ilość 4 L nie jest konieczna
Agilent 500µ Płytka LAgilent203942-100Płytka odczynnikowa do dodawania
Mrówczan amonuAcros Organics208-753-9
Roztwór wodorotlenku amonu (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Waga analitycznaBCA Mettler ToledoAL54
Pierce Thermo Fisher Scientific23227
Biomek i7 hybridBeckmannDowolne urządzenie do obsługi cieczy z możliwością stosowania nadciśnienia, ogrzewania/chłodzenia i wirowania próbek.
Materiał opakowaniowy C18 (2,5 i mikro; m, 100 & Aring ;)BrukerTen przedmiot nie jest już dostępny w firmie Bruker. Alternatywny materiał opakowaniowy o podanych specyfikacjach będzie wystarczający
Wirówka z wirnikiem płytowymThermo Scientific69720
Micro 21R WirówkaSorval5437
Dionex 3000 UHPLCThermo ScientificTen model nie jest już dostępny. Wystarczy dowolny nano LC z automatycznym samplerem.
Dithiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Roztwór formaldehydu (13CD2O); 20 % wag. w D2O, 98 atomów % D, 99 atomów % 13CSigma Aldrich, Chemia596388-1G
Roztwór formaldehydu (CH2O); 36,5 - 38% w H2OSigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
Kwas mrówkowyFluka Analityczny94318-250ML-F
Fusion Lumos Mass SpektrometrThermo ScientificTen model nie jest już dostępny. Można używać innych instrumentów o wysokiej rozdzielczości (np. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion lub Orbitrap Fusion Lumos).
Chlorowodorek hydroksyloaminySigma Aldrich, Chemia255580-100G
Jodoacetamid (IAM)Acros Organics144-48-9
Zestaw do znakowania izobarycznego (TMT 11-plex)Thermo Fisher Scientific90061
Trypsyna z trzustki bydlęcej traktowana L-1-tozyloamido-2 fenyloetyloketonem cholormetylowym (TPCK)Sigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
L-cysteinaSigma Aldrich, Chemia168149-25G
Homogenizator mechaniczny (tj. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
bufor pH 10Fisher Scientific06-664-261Wystarczy bufor pH 10 dowolnej marki
Bufor pH 7Fisher Scientific06-664-260Wystarczy
pH-metr dowolnej marki 7 (Tris kompatybilny)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Wystarczy pH-metr dowolnej marki
Oprogramowanie białkowe (np. Proteome Discoverer)Thermo Scientific
Płytka rezerwowa 200mlAgilent204017-100
Cyjanoborodeuterek sodu; 96 atomów % D, 98% CPSigma Aldrich, Chemia190020-1G
Cyjanoborowodorek sodu; odczynnik gatunek, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Speed-vacThermo ScientificSPD1010wystarczy każda marka szybkostrzelnego odkurzacza, która może pomieścić płytkę z głęboką studnią Płytka
mieszającaVWR12365-382Wystarczy każda marka płytek mieszających
20 mg SPENest Group, Inc.HNS S18VSą to wkłady C18
Bufor wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB)Sigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
TrisBiorad161-0716
Biomek 24-miejscowy uchwyt na probówkiBeckmann373661
MocznikBiorad161-0731
Woda - MS GradeFisher ScientificW6-4Ilość 4 L nie jest konieczna
. . 2 Zestaw do oznaczania białek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
  2. Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).
  3. Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
  4. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  5. Shiio, Y., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Thompson, A., et al. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
  8. Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).
  9. Evans, A. R., Robinson, R. A. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  10. Robinson, R. A., Evans, A. R. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  11. King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406(2017).
  12. King, C. D., Robinson, R. A. S. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).
  13. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  14. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).
  15. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  16. Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).
  17. Gu, L., Robinson, R. A. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  18. Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Automated Sample MultiplexingCombined Precursor Isotopic LabelingIsobaric TaggingHigh Throughput ProteomicsTandem Mass TagsLiquid Handling AutomationPeptide DesaltingDimethylation LabelingTMT ProcessingReporter Ion Analysis

Related Articles